Genomic MRI – publiczny zasób do badania wzorców sekwencji w obrębie genomowego DNA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie średniozakresowej nierandomości, nazywanej również niejednorodnością, określonej przez użytkownika sekwencji genomowej. Osiąga się to poprzez uprzednie zbadanie składu oligonukleotydowego sekwencji wejściowej i wygenerowanie tabeli częstotliwości oligonukleotydów tworzących tę sekwencję. Cel ten jest realizowany poprzez uruchomienie programu SRI Analyzer.

Drugim krokiem jest wygenerowanie losowych sekwencji o dokładnie takim samym składzie oligonukleotydowym jak sekwencja wejściowa. Osiąga się to poprzez uruchomienie programu generatora SRI. Trzecim krokiem procedury jest zlokalizowanie w sekwencjach wejściowych i zrandomizowanych fragmentów, w których występuje istotne wzbogacenie o konkretny nukleotyd lub kombinację nukleotydów, na przykład GC lub ag.

Cel ten jest realizowany za pomocą programu MRI Analyzer. Końcowym etapem procedury jest pobranie plików zawierających sekwencje wszystkich regionów MRI wykrytych przez program. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że większość regionów genomowych wielokomórkowych arias jest znacząco wzbogacona o segmenty zawierające ekstrema składu zasad wykryte dla każdego z czterech nukleotydów lub dowolnej ich kombinacji.

Obszary te, w regionach jednorodnych, wiążą się z nietypowymi konformacjami DNA lub specyficznymi właściwościami DNA. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki, takie jak identyfikacja potencjalnie funkcjonalnych elementów DNA w rozległych obszarach sekwencji niekodujących, w tym w regionach międzygenowych lub intronach. Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat genomów ssaków, można ją również zastosować do innych organizmów, takich jak bezkręgowce, rośliny, grzyby i bakterie.

Otwórz stronę główną pakietu online do analizy homogeniczności genomowej w średnim zakresie (genomic mid-range in homogeneity lub G GM I) pod adresem www.bioinfo.utoledo. edu/gri/the web resource. Szczegółowe informacje na temat programów znajdują się również w linku Readme w sekcji pomocy (help).

Podczas gdy wszystkie opublikowane materiały dotyczące genomicznego MRI i podobnych algorytmów znajdują się w linku do odpowiednich zasobów, utwórz plik z sekwencją w formacie „fastq”, aby rozpocząć sesję analizy A-G-M-R-I. Sekwencja w formacie „fastq” rozpoczyna się od znaku wielkości lub symbolu większości, po którym następuje unikalny identyfikator lub nazwa, a w kolejnych liniach znajduje się sekwencja. Przez genomiczne MRI przetwarzane będą tylko nukleotydy T, G i C, choć dopuszczalne jest wprowadzanie innych znaków.

Użyto pliku sekwencji genu PKD1. Aby rozpocząć pokaz sesji, należy nacisnąć przycisk start. Otworzy to nową stronę internetową, która umożliwia skopiowanie i wklejenie sekwencji wejściowej w dostępnym oknie lub wgranie pliku, jeśli jest on duży.

Aby przesłać plik, kliknij przycisk wyboru pliku, aby go załadować. Przejdź do żądanego pliku. Następnie kliknij przycisk rozpoczęcia sesji z tym plikiem. Potwierdzenie pomyślnego przesłania pliku zostanie wyświetlone u góry strony. Poniżej.

Ten komunikat jest identyfikatorem bieżącej sesji, która w tym przypadku ma numer C eight EP oh six. Aby przeanalizować niejednorodność krótkiego zakresu sekwencji wejściowej, kliknij przycisk analyze short range in homogeneity. Program otworzy nową stronę, zaprojektowaną specjalnie do uruchomienia programu SRI Analyzer.

W tym miejscu należy wybrać maksymalną długość oligonukleotydów do analizy. Ponieważ nasze sekwencje wejściowe są średniej wielkości i mają około 50 000 nukleotydów, wybieramy k-mery o największej długości, dla których obliczane będą częstotliwości. Na koniec należy niezwłocznie kliknąć przycisk analizy pliku.

Program oblicza częstotliwości występowania wszystkich oligonukleotydów o wybranej długości oraz o długościach mniejszych w obrębie wprowadzonej sekwencji. Aby wyświetlić częstotliwości wszystkich oligonukleotydów, należy kliknąć łącze pobierz plik składu. Plik ten nazywany jest plikiem użytkownika.

com przedstawia tabelę z trzema kolumnami. Pierwsza kolumna określa oligonukleotydy, druga ich częstotliwość względną, a trzecia liczbę wystąpień oligonukleotydów w sekwencji wejściowej.

Aby wygenerować zrandomizowane sekwencje o takim samym składzie oligonukleotydowym niż w pliku wejściowym, kliknij kartę generatora SRI. Na nowej stronie wybierz liczbę próbek losowych sekwencji do wygenerowania. Każda z tych próbek będzie zawierać losowe sekwencje o takiej samej liczbie i długości, co sekwencje wejściowe w pliku użytkownika.

W tym przykładzie plikiem użytkownika jest sekwencja genu PKD1. Następnie wybierz najdłuższą długość oligonukleotydów, dla których częstotliwości będą przybliżane w sekwencjach randomizowanych, zaznaczając przycisk opcji dla tetramerów, co oznacza oligonukleotydy czterozakładnikowe. Następnie wybierz liczbę dwóch dla liczby próbek generowanych sekwencji randomizowanych.

Na koniec uruchom program, klikając przycisk generowania pliku dla sekwencji wejściowych obejmujących setki tysięcy nukleotydów. Wygenerowanie losowych sekwencji może zająć kilka minut. Należy zatem poczekać, aż na dole strony pojawią się niebieskie linki do pobierania.

Aby przeanalizować jednorodność w średnim zakresie dla sekwencji wejściowych i randomizowanych, kliknij kartę analizatora MRI. Na nowej stronie wybierz sekwencję do analizy z listy rozwijanej plików do analizy. Następnie wybierz zawartość GC z listy siedmiu typów zawartości.

Zawartość GC (GC content) oznacza skład G plus C. Pole rozmiaru okna (window size) umożliwia wybór długości okna, dla którego analizowane będą sekwencje bogate i ubogie w te zasady. Pozostaw domyślny rozmiar okna wynoszący 50 nukleotydów.

Na koniec należy wybrać odpowiednio górny i dolny próg dla obszarów bogatych i ubogich w treść. Progi te mogą być zdefiniowane przez liczbę konkretnych nukleotydów w aktualnym oknie lub przez procentowy udział tych nukleotydów w oknie. W tym przypadku wybierzmy początkowo przypadkowe wartości 60% dla progu górnego i 30% dla progu dolnego.

Następnie należy nacisnąć przycisk analizy pliku. Po tej czynności pojawi się link do pliku wynikowego oraz zostanie wyświetlona graficzna reprezentacja wyników. Wszystkie regiony bogate w treść wzdłuż sekwencji wejściowej są oznaczone niebieskimi kolcami skierowanymi w górę, a regiony ubogie w treść czerwonymi kolcami skierowanymi w dół. Wykres pokazuje, że występuje zbyt wiele niebieskich kolców wskazujących regiony bogate w GC oraz znacznie mniej czerwonych kolców wskazujących regiony ubogie w GC.

Oznacza to, że wybrane parametry nie są optymalne. W następnej iteracji należy zastosować górny próg 75% oraz dolny próg 32%. Ponownie uruchom analizator MRI, klikając przycisk analyze file.

Nowy wykres pokazuje, że nawet przy nowych, znacznie bardziej rygorystycznych parametrach, występuje setki niebieskich szczytów. W związku z tym należy zwiększyć górny próg do 80% i powtórzyć obliczenia. Nowy wykres wykazuje, że 62 regiony bogate w GC mają zawartość GC większą lub równą 80%, a 28 regiony ubogie w GC mają zawartość GC poniżej 32%. Następnie należy porównać wyniki dla pliku wejściowego z dwiema zrandomizowanymi sekwencjami o takim samym składzie oligonukleotydowym co gen PKD1.

Aby to zrobić, należy zmienić sekwencję z genu PKD1 na losową, korzystając z listy wyboru pliku do analizy, zachowując te same parametry dla regionów bogatych w GC oraz ubogich w GC. Nowo wygenerowany wykres dla pierwszej zrandomizowanej sekwencji ilustruje, że sekwencja losowa ta posiada tylko jeden region ubogi w GC i 31 regionów bogatych w GC. Inna zrandomizowana sekwencja może wykazywać pewne wahania w liczbie regionów bogatych i ubogich w GC, jednak trend powinien pozostać taki sam.

Zrandomizowanych sekwencji dla genu PKD1 jest kilkukrotnie mniej. Regiony bogate w GC występują ponad 10 razy rzadziej niż regiony ubogie w GC. Kolejna demonstracja wykorzystuje inny rodzaj treści MRI.

W tym samym pakiecie introny jednego genu ludzkiego zawierają kilka regionów bogatych w puryny, które są powiązane ze strukturami DNA. Na stronie analizatora MRI zmień zawartość DNA na nukleotydy ag, które reprezentują puryny. Utrzymaj rozmiar okna na poziomie 50 zasad i zmień górny próg na 80% oraz dolny próg na 10%. Następnie naciśnij przycisk analizuj plik, aby uruchomić program.

Wyświetlony wykres pokazuje, że gen ten posiada sześć regionów bogatych w AG, zaznaczonych niebieskimi pionowymi skokami, oraz 14 regionów ubogich w AG, zaznaczonych czerwonymi skokami. Następnie należy porównać te wyniki uzyskane dla genu PKD1 z danymi z sekwencji zrandomizowanych, które mają taki sam skład oligonukleotydowy jak badany gen; najpierw przełącz na sekwencję zrandomizowaną, na przykład numer dwa, i zachowaj te same parametry co w poprzednim teście. Wykres dla tej sekwencji losowej pokazuje, że zawiera ona tylko jeden region bogaty w AG i żadnych regionów ubogich w AG.

Wszystkie dane wygenerowane podczas sesji są zapisywane w specjalnych plikach, do których dostęp jest możliwy poprzez kartę pobierania plików w prawym górnym rogu każdej strony internetowej. Po otwarciu tego łącza pobierz sekwencję wejściową oraz wszystkie wygenerowane sekwencje zrandomizowane. Poniżej tej listy plików znajduje się link do tabeli częstotliwości oligonukleotydów wygenerowanej przez program analizatora SRI.

Następnie znajdują się odnośniki do wszystkich wyników wygenerowanych przez program analizatora MRI podczas sesji. Na przykład, kliknij plik o nazwie RAND one four AGCO 50 32 14, który reprezentuje wyniki uzyskane dla sekwencji zrandomizowanej numer jeden z następującymi parametrami: zawartość AG 50, okno o długości nucleotide, górny próg 32 nucleotides i dolny próg 14 nucleotides.

W tym pliku wszystkie segmenty sekwencji nukleotydowej, które spełniają kryteria wysokiej lub niskiej zawartości, wraz z ich współrzędnymi są dostępne w formie listy zgodnie z ich kolejnymi pozycjami w sekwencji wejściowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak nawigować po zasobie obliczeniowym genomic MRI.