Name: Genomiczny rezonans magnetyczny - publiczny zasób do badania wzorców sekwencji w genomowym DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Poznaj metodę analizy nieprzypadkowości sekwencji genomowych przy użyciu zasobu obliczeniowego Genomic MRI. Narzędzie identyfikuje wzbogacone regiony nukleotydowe w DNA ssaków, roślin i innych organizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Samuelowi Shepardowi, Peterowi Bazeleyowi i Johnowi Davidowi Bellowi za administrację stronami internetowymi Genomic MRI. Praca ta była wspierana przez grant National Science Foundation Career award „Investigation of intron cellular roles” [numer grantu MCB-0643542].

Wszystkie programy wykorzystane w pracy zostały napisane w języku perl, a wszystkie strony internetowe zostały stworzone przy użyciu PHP.
1. Punkt wyjścia:
Otwórz stronę główną internetowego pakietu Genomic MRI pod adresem http://mco321125.meduohio.edu/~jbechtel/gmri/. Zasób sieciowy zawiera również instrukcje i wyjaśnienia dotyczące programów w linku „Help (How-to/README)”, natomiast wszystkie opublikowane materiały na temat Genomic MRI oraz podobnych algorytmów wymienione są w linku „Links to relevant resources”.
2. Przygotowanie i przesyłanie sekwencji wejściowej/sekwencji wejściowych.
Aby rozpocząć sesję analizy GMRI, należy utworzyć plik zawierający sekwencję lub sekwencje w formacie FASTA. Każdej sekwencji nukleotydowej w tym formacie powinna poprzedzać pojedyncza linia zaczynająca się od znaku „&gt;”, który służy jako identyfikator, a następnie krótki opis tej sekwencji w tej samej linii. Sekwencje nukleotydowe przeznaczone do analizy GMRI mogą zawierać również znaki takie jak R, Y, N, X itd. Jednak znaki inne niż A, T, C, G nie będą przetwarzane przez program i zostaną pominięte. Jako dane wejściowe można wykorzystać sekwencje, w których elementy powtarzalne zostały „zamaskowane” (zastąpione znakami „N”). Należy pamiętać, że znaki sekwencji nie są rozróżniane ze względu na wielkość liter.
<ol>
	<li>Rozpocznij sesję GMRI, klikając przycisk „Start or Resume” na stronie głównej Genomic MRI. Spowoduje to przejście do strony, na którą można przesyłać sekwencje nukleotydowe.</li>
	<li>Skopiuj i wklej sekwencje w formacie FASTA lub prześlij plik zawierający sekwencje z lokalnego komputera, korzystając z przycisku „choose file”.</li>
	<li>Kliknij przycisk „start new session with this file”. Nad oknem wprowadzania danych powinna pojawić się wiadomość potwierdzająca: „Your sequence has been successfully uploaded”. Otrzymasz również alfanumeryczny „identyfikator GMRI” [strona określa go jako „session label”] dla danej sesji (np. b16yMj), który można wykorzystać do odzyskania i kontynuowania sesji do dwóch tygodni po pierwszym użyciu.</li>
</ol>
UWAGA: Od tego momentu sekwencje wejściowe określane są jako „userfile”.
3. Wyznacz rozkład częstotliwości oligonukleotydów dla sekwencji wejściowych (opcjonalnie).
Kliknij kartę „SRI Analyzer” (górny rząd), aby otrzymać rozkład częstotliwości oligonukleotydów dla całego zestawu sekwencji wejściowych. Akronim SRI oznacza krótkozasięgową niejednorodność (short-range inhomogeneity). W tym momencie użytkownik może określić maksymalną długość oligonukleotydów (od 2 do 9 nukleotydów, domyślnie 6 nts), dla których obliczone zostaną częstotliwości. Wybór ten dokonuje się poprzez kliknięcie żądanej opcji w liście rozwijanej „Maximum oligomer size”. Następnie należy nacisnąć przycisk „Analyze File”, aby rozpocząć obliczenia. Przybliżone przedstawienie składu sekwencji wejściowej pojawi się natychmiast w formie krótkiej tabeli na środku strony internetowej i będzie dostępne do pobrania jako „userfile.comp.tbl”. Tabela ta przedstawia jedynie najczęściej i najrzadziej występujące oligonukleotydy w sekwencjach wejściowych.
Pełna tabela częstotliwości dla wszystkich możliwych oligonukleotydów jest generowana jako plik o nazwie „userfile.comp”, który można pobrać za pomocą łącza „Pobierz plik składu”.
UWAGA: Analizator SRI zlicza cały zestaw wszystkich nakładających się oligonukleotydów.
4. Generowanie losowych sekwencji o tym samym składzie oligonukleotydów co w sekwencjach wejściowych (opcjonalnie).
(Do wykonania tego zadania wymagane jest ukończenie kroku 3 protokołu).
<ol>
	<li>Kliknij kartę „SRI Generator” (górny rząd), aby otworzyć nową stronę internetową służącą do tworzenia losowych sekwencji. Za pomocą listy rozwijanej na tej stronie wybierz liczbę próbek losowych sekwencji do wygenerowania. Każdy z tych plików próbek będzie zawierał losowe sekwencje o takiej samej liczbie i długości, jak sekwencje wejściowe w pliku „userfile”. Ponadto, jeśli sekwencja wejściowa zawiera znaki inne niż A, T, C lub G, sekwencja losowa będzie posiadać litery „N” dokładnie w tych samych pozycjach, co w sekwencji wejściowej.</li>
	<li>Wybierz maksymalną długość oligonukleotydów, dla których częstotliwości będą przybliżane w sekwencjach losowych. Można to zrobić, zaznaczając przycisk radiowy dla pożądanego poziomu oligomerów (np. „4-mers” dla oligonukleotydów czterozasadowych) w tabeli w centrum ekranu. Należy odnotować, że sekwencje losowe będą składać się nie tylko z przybliżonych częstotliwości na wybranym poziomie oligomerów, ale także z odpowiadających im częstotliwości dla krótszych poziomów oligomerów, analogicznie jak w sekwencjach wejściowych. Ze względu na zastosowanie modelu Markowa w procesie generowania sekwencji losowych możliwe są niewielkie wahania częstotliwości oligonukleotydów w sekwencjach wejściowych i losowych.</li>
	<li>Uruchom program, klikając przycisk „Generate File”. W przypadku dużych sekwencji wejściowych generowanie sekwencji losowych może potrwać kilka minut. Użytkownik powinien zatem poczekać, aż na dole strony pojawią się niebieskie łącza „Download”. Losowe zestawy są zapisywane w plikach o nazwach takich jak „userfile.randX_Y”, gdzie X oznacza numer zestawu losowego, a Y wybrany poziom oligomerów (np. „userfile_rand2_4”).</li>
</ol>
5. Analiza niejednorodności średniego zakresu (MRI) sekwencji wejściowych i losowych.
<ol>
	<li>Kliknij w „Analizator MRIzakładka (górny rząd), która otwiera nową stronę internetową służącą do analizy średniomieszkaniowej niejednorodności składu nukleotydowego sekwencji.</li>
	<li>Wybierz sekwencję do analizy z „Plik do analizypole wyboru (tutaj można dokonać wyboru pomiędzy sekwencją wejściową a wygenerowanymi zestawami sekwencji losowych).</li>
	<li>Wybierz typ treści obrazów MRI, które zostaną przeanalizowane za pomocą dostarczonego pola listy. (Dostępnych jest siedem opcji zawartości: G+C; G+A; G+T; A; G; C lub T).</li>
	<li>Należy wybrać długość okna, dla którego sekwencje bogate w treść i ubogie w treść zostaną przeanalizowane za pomocą Wielkość okna pole wyboru (domyślnie 50 nukleotydów; dopuszczalny zakres wynosi od 30 do 1000).</li>
	<li>Wybierz górna granica i niższy próg odpowiednio dla regionów bogatych i ubogich w treść. Progi te mogą być zdefiniowane przez dokładną liczbę konkretnych nukleotydów w aktualnym oknie (wykorzystując) według numeru opcja w polu listy) lub według procentowej zawartości tych nukleotydów w oknie (używając procentowo opcja)</li>
	<li>Po dokonaniu wszystkich pięciu wyborów (na przykład: Sekwencja = "**Tytuł: Oznaczanie aktywności enzymatycznej peroksydazy chrzanowej (HRP) w próbkach białka**

**Opis**
Peroksydaza chrzanowa (HRP) jest powszechnie stosowanym enzymatem w badaniach biomedycznych, pełniąc rolę znacznika w testach immunoenzymatycznych (ELISA), immunocytochemii i western blotingu. Pomiar aktywności enzymatycznej HRP jest kluczowy dla zapewnienia optymalnej czułości i powtarzalności tych analiz. W niniejszym protokole przedstawiono metodę ilościowego oznaczania aktywności HRP z wykorzystaniem substratu kolorystycznego, TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny), w obecności nadtlenku wodoru ($\text{H}_2\text{O}_2$). Reakcja katalizowana przez HRP prowadzi do utlenienia TMB, co skutkuje powstaniem niebieskiego produktu, który po zatrzymaniu reakcji kwasem staje się żółty i może być mierzony spektrofotometrycznie przy długości fali 450 nm. Metoda ta pozwala na precyzyjne określenie jednostek aktywności enzymatycznej w próbkach białka oczyszczonego lub ekstraktach tkankowych.

**Słowa kluczowe**
peroksydaza chrzanowa, HRP, aktywność enzymatyczna, TMB, spektrofotometria, test kolorystyczny, kinetyka enzymatyczna, analiza białek; Treść = GC; Rozmiar okna = 50; Górny próg = 35; Dolny próg = 15), uruchom program, naciskając Analiza pliku przycisk. Program skanuje kolejno wszystkie sekwencje z wybranego pliku wejściowego. Na każdym etapie program pobiera segment aktualnej sekwencji o długości odpowiadającej określonej wielkości okna i oblicza, czy liczba lub procent nukleotydów o wybranej zawartości przekracza górny próg lub znajduje się poniżej progu dolnego. Jeśli okno nie spełnia żadnego z tych kryteriów, do analizy wybierane jest następne nakładające się okno (przesunięte o jeden nukleotyd). Po znalezieniu okna, w którym sekwencja spełnia jeden z wymogów progowych dla składu bogatego lub ubogiego w daną zawartość, program zapisuje sekwencję tego okna w pliku wyjściowym i generuje pik na wykresie. Następnie program przeskakuje do kolejnego, niezakładającego się okna sąsiedniego i wznawia proces skanowania aż do osiągnięcia końca sekwencji.</li>
	<li>Po zakończeniu programu pojawi się link do pliku wyjściowego (o nazwie "Plik użytkownika GC_50_35..15(dla powyższego przykładu) pojawia się, a graficzna reprezentacja wyników jest wyświetlana na środku strony internetowej (patrz: Rysunek 1). Na tym wykresie wszystkie wprowadzone sekwencje z Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. zostają połączone w jeden ciąg i przedstawione jako pozioma czarna linia na osi X, z podaną poniżej długością w kilobazach (kb). Wszystkie regiony bogate w treść wzdłuż sekwencji wejściowych są oznaczone niebieskimi „w górę” kolcami, a regiony ubogie w treść – czerwonymi „w dół” kolcami. Całkowita liczba okien bogatych i ubogich w treść jest podana w nawiasach w legendzie u dołu tej ryciny (odpowiednio 32 i 19). Rycina ta służy do zilustrowania względnej liczności i rozmieszczenia regionów MRI. Tymczasem szczegółowe dane są przedstawione w pliku wyjściowym (patrz rycina 3). W pliku tym wszystkie segmenty sekwencji nukleotydowej spełniające kryteria bogatości lub ubóstwa treści wraz z ich współrzędnymi są dostępne dla użytkownika w formie listy zgodnie z ich kolejnością w pliku wejściowym.</li>
	<li>Po zakończeniu analizy MRI dla wybranej sekwencji użytkownik może rozpocząć nowy proces na tej samej stronie internetowej, zmieniając parametry i/lub pliki wejściowe. Na przykład, aby przebadać wcześniej wygenerowaną próbkę losową nr 1 z tymi samymi parametrami MRI, użytkownik musi jedynie zmienić Plik do analizyopcja i wybierz „userfile_rand1_4" plik, a następnie naciśnij Analiza pliku przycisk ponownie. Nowy plik i wyświetlacz graficzny zastąpią poprzednie. Wyniki i ryciny ze WSZYSTKICH badań przypisanych do każdej „etykiety sesji” (identyfikatora GMRI) zostaną zapisane i będą dostępne przez dwa tygodnie od ostatniej aktywności. Aby na stałe zapisać wyniki/ryciny, użytkownik powinien wybrać „Pobierz plikizakładka (górny rząd) i pobierz całą sesję lub poszczególne pliki, zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Z tym Analizator MRI strona internetowa, którą użytkownik może przestudiować
	<ul>
		<li>regiony bogate w (G+C) i regiony bogate w (A+T)</li>
		<li>Regiony bogate w puryny (A+G) i regiony bogate w pirymidyny (C+T)</li>
		<li>Regiony bogate w keto (G+T) oraz regiony bogate w amino (A+C)</li>
		<li>regiony bogate w A i ubogie w A</li>
		<li>Regiony bogate w G i ubogie w G</li>
		<li>Regiony bogate i ubogie w tyminę</li>
		<li>Obszary bogate w C i ubogie w C</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Najnowsza wersja Genomowe MRI oferuje nową możliwość badania regionów bogatych w wzorce naprzemienne puryn(R)/pirymidyn(Y), które mogą tworzyć konformacje Z-DNA. Obecnie opcja ta jest dostępna pod linkiem „Z-DNAi działa ono na tej samej zasadzie, co pozostałe wspomniane obszary MRI. Użytkownik powinien wybrać górny i dolny próg dla liczby nakładających się dinukleotydów (RY+YR) w oknie skanującym. Program generuje podobny wynik graficzny oraz plik z segmentami DNA wzbogaconymi i zubożonymi w naprzemienne puryny i pirymidyny. Domniemane regiony Z-DNA muszą być silnie wzbogacone w naprzemienne zasady R/Y (patrz przegląd F&amp;F 2011).</li>
</ol>
6. Dodatkowe programy w pakiecie Genomic MRI (opcjonalnie).
Zasób Genomic MRI oferuje również dwie zaawansowane opcje generowania bardzo specyficznych sekwencji losowych. Są one dostępne w zakładkach „MRI Generator” oraz „CDS Generator” w górnym rzędzie.
<ol>
	<li>generator obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) tworzy zrandomizowane sekwencje o takim samym składzie oligonukleotydowym jak w pliku wejściowym (podobnie do generator SRI). Jednak ponadto zrandomizowane sekwencje naśladują określony wzorzec MRI wskazany przez użytkownika. Na tej stronie internetowej użytkownik powinien wybrać z rozwijanej listy konkretny wzorzec MRI, który ma zostać naśladowany. Lista rozwijana zawiera wszystkie wzorce, które zostały zbadane w tej sesji przez Analizator MRI (np. „userfile_GC_50_35..15")Losowa sekwencja wygenerowana przy użyciu tej opcji będzie miała taki sam skład oligonukleotydowy jak wybrany plik wejściowy, a także te same wzorce regionów bogatych i ubogich w GC, jakie widoczne są w „userfile_GC_50_35..15".</li>
	<li>generator CDS służy do randomizacji sekwencji kodujących białka. Zachowuje ona taką samą sekwencję aminokwasów, jak ta zakodowana w określonej przez użytkownika sekwencji wejściowej. Ponadto program zachowuje te same preferencje kodonów i dikodonów, które określono w wybranej przez użytkownika tabeli wejściowej. Wersja online programu Generator CDS program przyjmuje również sekwencję białkową jako dane wejściowe. Wszystkie pozostałe opcje programu są oferowane wyłącznie w formie samodzielnych skryptów Perl, dostępnych do pobrania z głównej strony internetowej Genomic MRI.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Niniejszy protokół umożliwia badanie niejednorodności składu sekwencji nukleotydowych. Co istotne, wspiera on również generowanie różnorodnych sekwencji zrandomizowanych, których skład oligonukleotydowy jest zbliżony do składu sekwencji wejściowych. Zazwyczaj sekwencje genomiczne złożonych eukariontów nie są jednorodne pod względem składu, lecz stanowią złożoną mozaikę segmentów sekwencji wzbogaconych w konkretne nukleotydy (na przykład bogatych w puryny, bogatych w (G+T), bogatych w (A+T) itd.). Wzorce te w skali średniej (30–1000 bp) są wizualizowane za pomocą graficznego wyniku analizator MRI co obrazuje wybrane segmenty bogate w treść jako górne niebieskie piki oraz segmenty ubogie w treść jako dolne czerwone piki (patrz Rycina 1 i 2). Zazwyczaj liczba regionów bogatych i ubogich w treść w sekwencji naturalnej (Rycina 1) jest o rzędy wielkości większa niż liczba regionów tego samego typu w odpowiadających im sekwencjach randomizowanych (Rycina 2) o takim samym składzie oligonukleotydowym. Te segmenty sekwencji o średnim stopniu niejednorodności składu nukleotydowego mogą być interesujące dla użytkownika. Są one dostępne z Genomowy rezonans magnetyczny (MRI) pliki wyjściowe do dalszych analiz.
<img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig1.jpg" alt="Wykres analizy zawartości GC; pozycja okna względem procentowej zawartości; badanie sekwencji DNA." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przykład graficznego wyniku z analizatora MRI z kroku 5.7. Wyniki uzyskano na próbce 44 ludzkich intronów. Niebieskie słupki reprezentują pozycje regionów bogatych w GC wzdłuż tych intronów. Czerwone słupki reprezentują regiony MRI ubogie w GC (lub bogate w AT). Oś y zawiera górne i dolne progi dla danego typu zawartości.
<img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig2.jpg" alt="Rozkład zawartości GC, diagram, analiza sekwencji DNA, pozycja okna, badanie genetyczne." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2.Wynik analizy MRI dla losowej sekwencji „userfile.rand1_4”. Graficzna reprezentacja MRI w obrębie losowo wygenerowanej sekwencji z zastosowaniem programu generatora SRI.
<img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig3.jpg" alt="Plik składu MRI przedstawiający analizę zawartości GC; regiony bogate w sekwencje pierwotne i komplementarne, schemat z adnotacjami." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3.Przykład początku tekstowego pliku wyjściowego z programu MRI analyzer. Wszystkie sekwencje bogate w treść i ubogie w treść wykryte przez program są przedstawione w ostatniej (czwartej) kolumnie. Ich względne położenia, mierzone w liczbie okien, pokazano w pierwszej kolumnie. Druga i trzecia kolumna stanowią wskaźniki odpowiednio dla regionów bogatych w treść i ubogich w treść.

<ol><li>Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mid-range+inhomogeneity+correlates+with+an+abundance+of+RNA+secondary+structures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures.</a> BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).</li>
<li>Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+forces+shaping+human+genomic+sequence+at+mid-range+scales%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales.</a> BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).</li>
<li>Fedorov, A., Fedorova, L. Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedorov%2C+A+%22Advances+in+Genomic+Sequence+Analysis+and+Pattern+Discovery%22">Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery</a>. , 65-91 (2010).</li>
<li>Shepard, S. S. Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+characterization+and+utilization+of+middle-range+sequence+patterns+within+human+genome+%5B%5D%22">The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]</a>. , The University of Toledo. 57-157 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Regiony o niejednorodnym składzie nukleotydowym w skalach średniego zasięgu (30-1000 nukleotydów) występują obficie w genomach złożonych eukariotów i mogą znajdować się w dowolnym miejscu (regiony międzygenowe, introny, niekodyjące regiony egzonów, elementy repetytywne). Regiony te są często powiązane z nietypowymi konformacjami DNA. Na przykład sekwencje bogate w puryny/pirymidyny mają tendencję do tworzenia potrójnych helis DNA (H-DNA); sekwencje z naprzemiennymi zasadami purynowymi i pirymidynowymi są powiązane z konformacjami Z-DNA; regiony bogate w (G+C) wykazują nieprawidłowości strukturalne w B-DNA i mogą być podatne na pękanie szkieletu cukrowo-fosforanowego; regiony bogate w (A+T) mogą tworzyć nietypową strukturę – element rozplatania DNA; itd. (przegląd Fedorov &amp; Fedorova 2010). Niektóre z tych wzorców średniego zasięgu (np. regiony bogate w (G+T)) są słabo zbadane i wciąż oczekują na szczegółową eksplorację i rozpoznanie. Głównym celem naszego zasobu internetowego Genomic MRI jest pomoc użytkownikom w identyfikacji tych regionów MRI w celu ich dalszej analizy eksperymentalnej oraz badania ich potencjalnych funkcji. Wiedza o regionach MRI mogłaby zostać włączona do nowej generacji programów do predykcji genów (Shepard 2010), co usprawniłoby ich działanie i poszerzyło nasze zrozumienie funkcji oraz właściwości genomu.

<table><tbody><tr><td>Komputer z dostępem do Internetu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pliki z sekwencjami nukleotydowymi do analizy</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genomic mri – publiczny zasób do badania wzorców sekwencji w obrębie genomowego dna

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Niekodujące regiony genomiczne u złożonych eukariontów, w tym obszary międzygenowe, introny oraz nietranslacyjne segmenty egzonów, wykazują głęboki brak przypadkowości w składzie nukleotydowym i składają się ze złożonego mozaiki wzorów sekwencji. Wzory te obejmują tak zwane regiony niejednorodności średniego zasięgu (MRI) – sekwencje o długości od 30 do 10 000 nukleotydów, które są wzbogacone w konkretną zasadę lub kombinację zasad (np. bogate w (G+T), bogate w puryny itp.). Regiony MRI są powiązane z nietypowymi strukturami DNA (innymi niż forma B), które często biorą udział w regulacji ekspresji genów, rekombinacji oraz innych procesach genetycznych (Fedorova &amp; Fedorov 2010). Istnienie silnego błędu fiksacji w regionach MRI przeciwko mutacjom, które mają tendencję do zmniejszania niejednorodności ich sekwencji, dodatkowo potwierdza funkcjonalność i znaczenie tych sekwencji genomicznych (Prakash et al. 2009).
W niniejszym materiale prezentujemy ogólnodostępny zasób internetowy — pakiet programistyczny Genomic MRI — zaprojektowany do obliczeniowej analizy sekwencji genomicznych w celu znalezienia i scharakteryzowania w nich różnorodnych wzorców MRI (Bechtel et al. 2008). Pakiet ten umożliwia również generowanie zrandomizowanych sekwencji o różnych właściwościach i różnym stopniu zgodności z naturalnymi wejściowymi sekwencjami DNA. Głównym celem tego narzędzia jest ułatwienie badania rozległych obszarów niekodującego DNA, które są wciąż słabo poznane i wymagają szczegółowej eksploracji oraz rozpoznania.

Przedstawiamy publiczną stronę internetową służącą do obliczeniowej analizy sekwencji genomicznych. Pozwala ona na wykrywanie wzorców sekwencji DNA o różnych nieprzypadkowych składach nukleotydowych. Zasób ten generuje również sekwencje zrandomizowane o różnym stopniu złożoności.

Genomic MRI – publiczny zasób do badania wzorców sekwencji w obrębie genomowego DNA

Niekodujące regiony genomu u złożonych eukariotów, w tym obszary międzygenowe, introny oraz nietranslowane fragmenty eksonów, wykazują głęboki brak przypadkowości w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie średniozakresowej nierandomości, nazywanej również niejednorodnością, określonej przez użytkownika sekwencji genomowej. Osiąga się to poprzez uprzednie zbadanie składu oligonukleotydowego sekwencji wejściowej i wygenerowanie tabeli częstotliwości oligonukleotydów tworzących tę sekwencję. Cel ten jest realizowany poprzez uruchomienie programu SRI Analyzer.Drugim krokiem jest wygenerowanie losowych sekwencji o dokładnie takim samym składzie oligonukleotydowym jak sekwencja wejściowa. Osiąga się to poprzez uruchomienie programu generatora SRI. Trzecim krokiem procedury jest zlokalizowanie w sekwencjach wejściowych i zrandomizowanych fragmentów, w których występuje istotne wzbogacenie o konkretny nukleotyd lub kombinację nukleotydów, na przykład GC lub ag.Cel ten jest realizowany za pomocą programu MRI Analyzer. Końcowym etapem procedury jest pobranie plików zawierających sekwencje wszystkich regionów MRI wykrytych przez program. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że większość regionów genomowych wielokomórkowych arias jest znacząco wzbogacona o segmenty zawierające ekstrema składu zasad wykryte dla każdego z czterech nukleotydów lub dowolnej ich kombinacji.Obszary te, w regionach jednorodnych, wiążą się z nietypowymi konformacjami DNA lub specyficznymi właściwościami DNA. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki, takie jak identyfikacja potencjalnie funkcjonalnych elementów DNA w rozległych obszarach sekwencji niekodujących, w tym w regionach międzygenowych lub intronach. Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat genomów ssaków, można ją również zastosować do innych organizmów, takich jak bezkręgowce, rośliny, grzyby i bakterie.Otwórz stronę główną pakietu online do analizy homogeniczności genomowej w średnim zakresie (genomic mid-range in homogeneity lub G GM I) pod adresem www.bioinfo.utoledo. edu/gri/the web resource. Szczegółowe informacje na temat programów znajdują się również w linku Readme w sekcji pomocy (help).Podczas gdy wszystkie opublikowane materiały dotyczące genomicznego MRI i podobnych algorytmów znajdują się w linku do odpowiednich zasobów, utwórz plik z sekwencją w formacie „fastq”, aby rozpocząć sesję analizy A-G-M-R-I. Sekwencja w formacie „fastq” rozpoczyna się od znaku wielkości lub symbolu większości, po którym następuje unikalny identyfikator lub nazwa, a w kolejnych liniach znajduje się sekwencja. Przez genomiczne MRI przetwarzane będą tylko nukleotydy T, G i C, choć dopuszczalne jest wprowadzanie innych znaków.Użyto pliku sekwencji genu PKD1. Aby rozpocząć pokaz sesji, należy nacisnąć przycisk start. Otworzy to nową stronę internetową, która umożliwia skopiowanie i wklejenie sekwencji wejściowej w dostępnym oknie lub wgranie pliku, jeśli jest on duży.Aby przesłać plik, kliknij przycisk wyboru pliku, aby go załadować. Przejdź do żądanego pliku. Następnie kliknij przycisk rozpoczęcia sesji z tym plikiem. Potwierdzenie pomyślnego przesłania pliku zostanie wyświetlone u góry strony. Poniżej.Ten komunikat jest identyfikatorem bieżącej sesji, która w tym przypadku ma numer C eight EP oh six. Aby przeanalizować niejednorodność krótkiego zakresu sekwencji wejściowej, kliknij przycisk analyze short range in homogeneity. Program otworzy nową stronę, zaprojektowaną specjalnie do uruchomienia programu SRI Analyzer.W tym miejscu należy wybrać maksymalną długość oligonukleotydów do analizy. Ponieważ nasze sekwencje wejściowe są średniej wielkości i mają około 50 000 nukleotydów, wybieramy k-mery o największej długości, dla których obliczane będą częstotliwości. Na koniec należy niezwłocznie kliknąć przycisk analizy pliku.Program oblicza częstotliwości występowania wszystkich oligonukleotydów o wybranej długości oraz o długościach mniejszych w obrębie wprowadzonej sekwencji. Aby wyświetlić częstotliwości wszystkich oligonukleotydów, należy kliknąć łącze pobierz plik składu. Plik ten nazywany jest plikiem użytkownika.com przedstawia tabelę z trzema kolumnami. Pierwsza kolumna określa oligonukleotydy, druga ich częstotliwość względną, a trzecia liczbę wystąpień oligonukleotydów w sekwencji wejściowej.Aby wygenerować zrandomizowane sekwencje o takim samym składzie oligonukleotydowym niż w pliku wejściowym, kliknij kartę generatora SRI. Na nowej stronie wybierz liczbę próbek losowych sekwencji do wygenerowania. Każda z tych próbek będzie zawierać losowe sekwencje o takiej samej liczbie i długości, co sekwencje wejściowe w pliku użytkownika.W tym przykładzie plikiem użytkownika jest sekwencja genu PKD1. Następnie wybierz najdłuższą długość oligonukleotydów, dla których częstotliwości będą przybliżane w sekwencjach randomizowanych, zaznaczając przycisk opcji dla tetramerów, co oznacza oligonukleotydy czterozakładnikowe. Następnie wybierz liczbę dwóch dla liczby próbek generowanych sekwencji randomizowanych.Na koniec uruchom program, klikając przycisk generowania pliku dla sekwencji wejściowych obejmujących setki tysięcy nukleotydów. Wygenerowanie losowych sekwencji może zająć kilka minut. Należy zatem poczekać, aż na dole strony pojawią się niebieskie linki do pobierania.Aby przeanalizować jednorodność w średnim zakresie dla sekwencji wejściowych i randomizowanych, kliknij kartę analizatora MRI. Na nowej stronie wybierz sekwencję do analizy z listy rozwijanej plików do analizy. Następnie wybierz zawartość GC z listy siedmiu typów zawartości.Zawartość GC (GC content) oznacza skład G plus C. Pole rozmiaru okna (window size) umożliwia wybór długości okna, dla którego analizowane będą sekwencje bogate i ubogie w te zasady. Pozostaw domyślny rozmiar okna wynoszący 50 nukleotydów.Na koniec należy wybrać odpowiednio górny i dolny próg dla obszarów bogatych i ubogich w treść. Progi te mogą być zdefiniowane przez liczbę konkretnych nukleotydów w aktualnym oknie lub przez procentowy udział tych nukleotydów w oknie. W tym przypadku wybierzmy początkowo przypadkowe wartości 60% dla progu górnego i 30% dla progu dolnego.Następnie należy nacisnąć przycisk analizy pliku. Po tej czynności pojawi się link do pliku wynikowego oraz zostanie wyświetlona graficzna reprezentacja wyników. Wszystkie regiony bogate w treść wzdłuż sekwencji wejściowej są oznaczone niebieskimi kolcami skierowanymi w górę, a regiony ubogie w treść czerwonymi kolcami skierowanymi w dół. Wykres pokazuje, że występuje zbyt wiele niebieskich kolców wskazujących regiony bogate w GC oraz znacznie mniej czerwonych kolców wskazujących regiony ubogie w GC.Oznacza to, że wybrane parametry nie są optymalne. W następnej iteracji należy zastosować górny próg 75% oraz dolny próg 32%. Ponownie uruchom analizator MRI, klikając przycisk analyze file.Nowy wykres pokazuje, że nawet przy nowych, znacznie bardziej rygorystycznych parametrach, występuje setki niebieskich szczytów. W związku z tym należy zwiększyć górny próg do 80% i powtórzyć obliczenia. Nowy wykres wykazuje, że 62 regiony bogate w GC mają zawartość GC większą lub równą 80%, a 28 regiony ubogie w GC mają zawartość GC poniżej 32%. Następnie należy porównać wyniki dla pliku wejściowego z dwiema zrandomizowanymi sekwencjami o takim samym składzie oligonukleotydowym co gen PKD1.Aby to zrobić, należy zmienić sekwencję z genu PKD1 na losową, korzystając z listy wyboru pliku do analizy, zachowując te same parametry dla regionów bogatych w GC oraz ubogich w GC. Nowo wygenerowany wykres dla pierwszej zrandomizowanej sekwencji ilustruje, że sekwencja losowa ta posiada tylko jeden region ubogi w GC i 31 regionów bogatych w GC. Inna zrandomizowana sekwencja może wykazywać pewne wahania w liczbie regionów bogatych i ubogich w GC, jednak trend powinien pozostać taki sam.Zrandomizowanych sekwencji dla genu PKD1 jest kilkukrotnie mniej. Regiony bogate w GC występują ponad 10 razy rzadziej niż regiony ubogie w GC. Kolejna demonstracja wykorzystuje inny rodzaj treści MRI.W tym samym pakiecie introny jednego genu ludzkiego zawierają kilka regionów bogatych w puryny, które są powiązane ze strukturami DNA. Na stronie analizatora MRI zmień zawartość DNA na nukleotydy ag, które reprezentują puryny. Utrzymaj rozmiar okna na poziomie 50 zasad i zmień górny próg na 80% oraz dolny próg na 10%. Następnie naciśnij przycisk analizuj plik, aby uruchomić program.Wyświetlony wykres pokazuje, że gen ten posiada sześć regionów bogatych w AG, zaznaczonych niebieskimi pionowymi skokami, oraz 14 regionów ubogich w AG, zaznaczonych czerwonymi skokami. Następnie należy porównać te wyniki uzyskane dla genu PKD1 z danymi z sekwencji zrandomizowanych, które mają taki sam skład oligonukleotydowy jak badany gen; najpierw przełącz na sekwencję zrandomizowaną, na przykład numer dwa, i zachowaj te same parametry co w poprzednim teście. Wykres dla tej sekwencji losowej pokazuje, że zawiera ona tylko jeden region bogaty w AG i żadnych regionów ubogich w AG.Wszystkie dane wygenerowane podczas sesji są zapisywane w specjalnych plikach, do których dostęp jest możliwy poprzez kartę pobierania plików w prawym górnym rogu każdej strony internetowej. Po otwarciu tego łącza pobierz sekwencję wejściową oraz wszystkie wygenerowane sekwencje zrandomizowane. Poniżej tej listy plików znajduje się link do tabeli częstotliwości oligonukleotydów wygenerowanej przez program analizatora SRI.Następnie znajdują się odnośniki do wszystkich wyników wygenerowanych przez program analizatora MRI podczas sesji. Na przykład, kliknij plik o nazwie RAND one four AGCO 50 32 14, który reprezentuje wyniki uzyskane dla sekwencji zrandomizowanej numer jeden z następującymi parametrami: zawartość AG 50, okno o długości nucleotide, górny próg 32 nucleotides i dolny próg 14 nucleotides.W tym pliku wszystkie segmenty sekwencji nukleotydowej, które spełniają kryteria wysokiej lub niskiej zawartości, wraz z ich współrzędnymi są dostępne w formie listy zgodnie z ich kolejnymi pozycjami w sekwencji wejściowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak nawigować po zasobie obliczeniowym genomic MRI.

genomic-mri-public-resource-for-studying-sequence-patterns-within

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

MRI genomowe – zasoby publiczne do badania wzorców sekwencji w DNA genomowym

Niniejsze wideo jest demonstracją techniczną protokołu hybrydyzacji dla zestawu CGH z płytkami o gęstym pokryciu całego genomu (whole genome tiling path array CGH), który pozwala na przeskanowanie całego ludzkiego genomu przy użyciu zaledwie 25-100 ng DNA, które można wyizolować z różnych źródeł, w tym z archiwalnego materiału utrwalonego w formalinie.

Demonstracja techniczna porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu z wykorzystaniem macierzy (array CGH)

W tym filmie opisujemy technikę topnienia PCR o wysokiej rozdzielczości, aby określić polimorfizm długości fragmentów DNA o różnych długościach sekwencji, na podstawie analizy temperatury topnienia.

PCR z topnieniem w wysokiej rozdzielczości w celu określenia zmian sekwencji w zmutowanych sekwencjach DNA

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

W przeciwieństwie do danych o sekwencjach DNA, dane epigenomiczne nie są łatwo poddawane wyszukiwaniom tekstowym. Poniżej przedstawiono procedury korzystania z ulepszonej wersji GeNemo, internetowego narzędzia bioinformatycznego, do przeprowadzania opartych na wzorcach poszukiwań podobieństw w danych epigenomicznych, porównując dostępne internetowe bazy danych, w tym Encyklopedię Elementów DNA, z danymi użytkownika.

Wyszukiwanie danych epigenomicznych w oparciu o wzorce za pomocą GeNemo

Opisujemy technikę łączenia cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji późno replikujących się regionów genomu.

G2-seq: Wysokoprzepustowa technika oparta na sekwencjonowaniu do identyfikacji późno replikujących się regionów genomu

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych

Celem tego protokołu jest wykorzystanie kombinacji badań obliczeniowych i laboratoryjnych do znalezienia nowych sekwencji, które nie mogą być łatwo oddzielone od sekwencji współoczyszczającej, która może być tylko częściowo znana.

Odkrycie nowych sekwencji za pomocą genomiki subtraktywnej

Długie sekwencje znacznie ułatwiają tworzenie złożonych genomów i charakteryzację zmienności strukturalnej. Opisujemy metodę generowania ultradługich sekwencji za pomocą platform sekwencjonowania opartych na nanoporach. Podejście to wykorzystuje zoptymalizowaną ekstrakcję DNA, a następnie zmodyfikowane przygotowania biblioteczne w celu wygenerowania setek odczytów kilobazowych z umiarkowanym pokryciem z komórek ludzkich.

Sekwencjonowanie z bardzo długim odczytem do analizy całego genomu DNA

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający efektywny dostęp i analizę wielu baz danych organizmów ludzkich i modelowych. Protokół ten demonstruje wykorzystanie MARRVEL do analizy potencjalnych wariantów wywołujących chorobę zidentyfikowanych w wyniku sekwencjonowania nowej generacji.

Poruszanie się po MARRVEL, narzędziu internetowym, które integruje informacje z genomiki człowieka i genetyki organizmów modelowych

Poznaj metodę analizy nieprzypadkowości sekwencji genomowych przy użyciu zasobu obliczeniowego Genomic MRI. Narzędzie identyfikuje wzbogacone regiony nukleotydowe w DNA ssaków, roślin i innych organizmów.

Genomic MRI – publiczny zasób do badania wzorców sekwencji w obrębie genomowego DNA

Przeglądaj więcej filmów