Name: Test immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych dla tkanek przy użyciu zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metodę ChIP do badania aktywacji genów specyficznych dla tkanek w zarodkach myszy E 8.5. Technika ta pozwala identyfikować interakcje białek z sekwencjami regulacyjnymi podczas embriogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez NIH R01 GM56244 dla ANI, co obejmuje fundusze przyznane w ramach American Recovery and Reinvestment Act z 2009 roku, oraz przez NIH R01 GM87130 dla JARP

1. Izolacja zarodków
Uwaga: Wszystkie operacje z udziałem myszy powinny być przeprowadzane zgodnie z odpowiednimi zasadami i protokołami dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania
<ol>
	<li>Następnego dnia rano po kojarzeniu sprawdź obecność czopa kopulacyjnego u samicy myszy i oddziel samice po kopulacji od samców hodowlanych, umieszczając je w osobnej klatce. Południe dnia, w którym zaobserwowano czop kopulacyjny, uznaje się za dzień embrionalny 0,5 (E0.5) rozwoju.</li>
	<li>W dniu E8.5 (lub w innym pożądanym stadium) uśmierć mysz zgodnie z zatwierdzonym protokołem.</li>
	<li>Zwilż brzuch uśmiergniętego zwierzęcia 70% etanolem i otwórz jamę brzuszną. Miejsca implantacji wskazujące na obecność rozwijających się embrionów widoczne są jako układ „koralików na sznurku” wzdłuż każdego rogu macicy (Rysunek 1A). Za pomocą nożyczek usuń oba rogi macicy, przetnij pojedynczo każde miejsce implantacji, aby je oddzielić (Rysunek 1B), a następnie umieść je w 10 mm szalce Petriego zawierającej medium do mikrodysekcji w temperaturze pokojowej (RT) (DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 20 mM HEPES pH 7.4, 60 μg/ml penicyliny, 2 mM streptomycyny).</li>
	<li>Za pomocą pęsety usuń każdy embrion wraz z otaczającymi go błonami z tkanki macicy (Rysunek 1C) i umieść je w świeżym medium do mikrodysekcji.</li>
	<li>Wyizoluj poszczególne embriony pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą pęsety. Na tym etapie rozwoju embriony są otoczone przez parietatyczny worek żółtkowy, który styka się z tkanką decyduą, trzewny worek żółtkowy oraz błoną owodni. Błona owodni to przezroczysta membrana znajdująca się w bezpośrednim kontakcie z embrionem. Trzewny worek żółtkowy znajduje się pomiędzy błoną owodni a parietatycznym workiem żółtkowym; w embrionach E8.5-E9.5 jest on łatwo rozpoznawalny dzięki obecności wyraźnych naczyń krwionośnych odżywiających embrion. Usuń każdy embrion z otaczających go błon i przenieś go pojedynczo do nowej płytki z medium do mikrodysekcji, aby usunąć nadmiar krwi. Stadium rozwoju może się różnić między poszczególnymi embrionami oraz miotami; reprezentatywne embriony E8.5 oraz reprezentatywny embrion E9.5 przedstawiono na Rysunku 1D.</li>
	<li>Przenieś każdy embrion do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 20 μl medium do mikrodysekcji (opisanego w kroku 4 powyżej).</li>
</ol>
2. Homogenizacja wyizolowanego zarodka
<ol>
	<li>Do każdej probówki typu Eppendorf dodać 20 jednostek kolagenazy typu II w objętości 20 ul (rozcieńczonej w 1X roztworze DPBS – Dubbecco's Phosphate Buffered Saline).</li>
	<li>Próbki delikatnie wstrząsać w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37°C przy 10 rpm przez 20 min.</li>
	<li>Starannie resuspendować za pomocą pipetowania, aby rozbić skupiska komórek.</li>
	<li>Nanieść zawiesinę komórkową na wierzch sterylnego sita komórkowego (rozmiar oczek 40 μm) umieszczonego nad probówką typu Eppendorf o objętości 1,5 ml.</li>
	<li>Aby dokończyć proces oddzielania, natychmiast nanieść 60 μl 1X DPBS o temperaturze pokojowej na wierzch sita komórkowego. Sito usunąć.</li>
	<li>Wirować próbki w temperaturze 4°C przy 40 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odpić supernatant.</li>
	<li>Resuspendować osad w 1 ml 1X DPBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować próbki przy 40 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odpić supernatant.</li>
	<li>Resuspendować osad w 20 μl pożywki do sekcji w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Policzyć komórki embrionalne. Średnio uzyskuje się 3-5 x 106 komórek z jednego zarodka E8.5.</li>
</ol>
3. Sieciowanie chromatyny
<ol>
	<li>Do 200 μl próbek dodać 5,6 μl 37% formaldehydu, aby uzyskać końcowe stężenie formaldehydu 1%.</li>
	<li>Próbki inkubować przez 10 min w RT.</li>
	<li>Próbki wirować przy 4°C z prędkością 400 x g przez 3 min.</li>
	<li>Odlać supernatant.</li>
	<li>Komórki resuspendować w zimnym 1X DPBS zawierającym 80 μl/ml koktajl inhibitorów proteaz (PIC).</li>
	<li>Próbki wirować przy 4°C z prędkością 40 x g przez 3 min.</li>
	<li>Odlać supernatant. Na tym etapie próbki można zamrozić w temperaturze -80°C. Zamrożone, sieciowane próbki są stabilne przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
4. Sonikacja
<ol>
	<li>Resuspender osad komórkowy w 10 μl buforu lizującego RT SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 10 mM EDTA i 1% SDS z dodatkiem świeżo przygotowanego PIC w proporcji 1 μl PIC/80 μl całkowitej objętości). W przypadku trudności z resuspensją dodać kolejne 100 ul buforu lizującego RT SDS w celu ułatwienia procesu. Wymieszać dokładnie poprzez pipetowanie i odwracanie probówki.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 10 min.</li>
	<li>Poddać zlizowane komórki sonikacji w celu fragmentacji DNA do długości od 200 do 50 par zasad, używając urządzenia Diagenode Bioruptor™ UCD20 (5 min x 8 razy: ustawienie amplitudy 30 s włączone/30 s wyłączone przy wysokiej mocy (320 watów)). Próbki powinny być otoczone mieszaniną lodu z wodą. Nie dopuścić do ogrzania próbek powyżej 4°C ani do ich zamrożenia. Dostępnych jest wiele rodzajów sonikatorów. Warunki sonikacji należy zoptymalizować dla każdego urządzenia tak, aby uzyskać fragmentację sieciowanego DNA do długości około 50 bp.</li>
	<li>Wiryzować sonikowane próbki w temperaturze 4°C przy 140 x g przez 10 min.</li>
	<li>Przenieść nadsącz do nowej probówki eppendorf schłodzonej wcześniej na lodzie.</li>
	<li>Podzielić sonikowaną próbkę maksymalnie na 5 aliquotów. Empirycznie ustalono, że jeden embrion E8.5 można podzielić na 5 aliquotów. Mniejsze lub większe ilości materiału można skalować odpowiednio. Na tym etapie próbkę można przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.</li>
	<li>Odłożyć jeden aliquot jako próbkę wejściową (input) i przechowywać w -20°C do kroku 6, w którym nastąpi odwrócenie sieciowania. Pozostałe aliquoty rozcieńczyć 10-krotnie w buforze do rozcieńczania ChIP (16.7 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1.2 mM EDTA, 1.1% Triton X-10, 167 mM NaCl i 0.01% SDS) zawierającym świeżo dodany PIC w proporcji 1 μl/80 μl buforu.</li>
</ol>
5. Pre-oczyszczanie i immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Przeprowadź wstępne oczyszczanie rozcieńczonego supernatantu, dodając 75 μl 50% zawiesiny Salmon-Sperm DNA/Protein A lub G Agarose i inkubując w 4°C przez 1 hr przy jednoczesnym obracaniu. Wybór kulek Protein A lub Protein G powinien zależeć od przeciwciała stosowanego w badaniu ChIP. Na przykład kulki protein A są zalecane dla przeciwciał króliczych, natomiast kulki protein G dla przeciwciał kozich lub przeciwciał mouse IgG1. Szczegółowe informacje znajdują się w zaleceniach producenta kulek.</li>
	<li>Odwiruj w wirówce przy 4°C z prędkością 250 x g przez 1 min.</li>
	<li>Przenieś supernatant do nowej, schłodzonej wcześniej probówki typu eppendorf.</li>
	<li>Dodaj przeciwciało (4 μg/próbka) do wstępnie oczyszczonej porcji i inkubuj przez noc w 4°C przy jednoczesnym obracaniu.</li>
</ol>
6. Płukanie kompleksu chromatyna-białko-kuleczki
<ol>
	<li>Do każdej probówki dodać 60 μl zawiesiny Salmon Sperm DNA/Protein A lub G w agarozie i inkubować w temperaturze 4°C przez 1 h przy ciągłym mieszaniu rotacyjnym. Należy użyć tego samego rodzaju kulek, który został zastosowany do wstępnego oczyszczania w kroku 3 powyżej.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 4°C przy 100 x g przez 1 min.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz. Kompleks DNA-białko-kuleczki przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Resuspender i przemyć osad zgodnie z poniższymi instrukcjami, używając buforów do mycia 1, 2, 3 i 4. Bufory do mycia 1-3 powinny być schłodzone do 4°C, a płukanie nimi powinno odbywać się w temperaturze 4°C. Bufor do mycia 4 powinien mieć temperaturę pokojową i płukanie nim powinno być przeprowadzane w temperaturze pokojowej. Każde mycie trwa 5 minut przy mieszaniu rotacyjnym w odpowiedniej temperaturze. Po każdym myciu odwirować w temperaturze 4°C (lub w temperaturze pokojowej dla buforu do mycia 4) przy 10 x g przez 1 min, a następnie ostrożnie odessać lub usunąć nadsącz.</li>
</ol>
Bufor 1:Bufor do płukania o niskiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 
150 mM NaCl i 0,1% SDS), 1 ml x 2 płukania. 
Bufor 2:Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-10, 
50 mM NaCl i 0,1% SDS), 1 ml x 2 płukania. 
Bufor 3:Bufor do płukania solą LiCl (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630, 
0,25 M LiCl i 1% kwasu deoksycholowego (sól sodowa)), 1 ml x 1 płukanie. 
Bufor 4:Bufor TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 płukania.
7. Elucja kompleksu chromatyna-przeciwciało
<ol>
	<li>Resuspendowany kompleks chromatyna-białko-kuleczki w 250 μl świeżo przygotowanego buforu elucyjnego (1% SDS, 0,1 M NaHCO3). Próbkę intensywnie mieszaj wortexie przez 5 sec, a następnie inkubuj w RT przez 15 min przy stałym obracaniu.</li>
	<li>Wiruj przy 250 x g przez 1 min w RT i przenieś eluat do nowej probówki typu Eppendorf.</li>
	<li>Powtórz kroki 1 i 2, a następnie połącz eluaty w tej samej probówce typu Eppendorf. Eluaty należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu tego etapu eluaty można przechowywać w temperaturze -20°C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
8. Odwrócenie sieciowania i odzysk DNA
<ol>
	<li>Dodaj 20 μl 5 M NaCl na 50 μl eluatu (40 μl/ml dla kontroli wejściowej).</li>
	<li>Inkubuj eluaty w temperaturze 65°C w kąpieli wodnej przez 4 h lub przez noc.</li>
	<li>W celu sprawdzenia wielkości fragmentów DNA, 10 μl każdej próbki (w tym kontroli wejściowej) można nałożyć na 2% żel agarozowy obok markerów wielkości w zakresie od 0,1 do 1 kbp. DNA pojawi się w formie rozmycia (smear), a nie ostrego prążka. Pozostałe próbki mogą pozostać w temperaturze 65°C podczas elektroforezy.</li>
	<li>Odzyskaj DNA z każdej próbki za pomocą zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Aby zoptymalizować adsorpcję DNA do membrany krzemowej w kolumnie wiriówek QIAquick, dodaj 60 μl buforu QG (dołączonego do zestawu) oraz 20 μl izopropanolu do 50 μl próbki. Należy pamiętać, że bufor QG zawiera wskaźnik pH, co pozwala na łatwe określenie pH próbki. Jeśli po wymieszaniu kolor próbki zmieni się z żółtego na fioletowy (pH &gt; 7,5), dodaj do próbki 10 μl 3 M NaAcetate (pH 5,2) i wymieszaj. Obniża to pH mieszaniny, aby zmaksymalizować wiązanie DNA do kulek w kolumnie.</li>
	<li>Przed nałożeniem na kolumnę sprawdź, czy w mieszaninie nie występuje osad SDS. Jeśli doszło do wytrącenia SDS, próbkę należy ogrzać w kąpieli wodnej w temperaturze 42°C, aż osad zniknie.</li>
	<li>Nanieś 70 μl mieszaniny do kolumny wiriówek QIAquick (fioletowa kolumna w zestawie) i wiruj w temperaturze pokojowej przy 140 x g przez 1 min. Przed przejściem do kolejnego etapu odrzuć przefiltrowany roztwór i powtórz ten krok z pozostałą częścią próbki.</li>
	<li>Dodaj 50 μl buforu QG, aby wypłukać kolumnę. Wiruj w temperaturze pokojowej przy 140 x g przez 2 min. Przed przejściem do kolejnego etapu odrzuć przefiltrowany roztwór.</li>
	<li>Przemyj kolumnę 70 μl buforu do mycia PE (dołączonego do zestawu), do którego dodano etanol zgodnie z instrukcją producenta. Wiruj w temperaturze pokojowej przy 140 x g przez 1 min. Przed przejściem do kolejnego etapu odrzuć przefiltrowany roztwór.</li>
	<li>Powtórz etap wirowania, aby całkowicie usunąć resztki buforu PE z kolumny. Odrzuć przefiltrowany roztwór oraz probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Eluuj DNA z kolumny do nowej probówki Eppendorf, dodając 60 μl buforu EB (bufor do elucji dołączony do zestawu).</li>
	<li>Wiruj w temperaturze pokojowej przy 140 x g przez 1 min. Eluowane DNA można przechowywać w temperaturze -20°C do momentu detekcji. Odczyty A260 odzyskanego materiału zazwyczaj wskazują na stężenia 90-120 ng/ul, co daje całkowity odzysk ok. 6-7 ug na alikwot. Jednak stosunek A260/280 w tych próbkach zazwyczaj wynosi &gt;1,8, co sugeruje obecność RNA w próbce. Zatem rzeczywista ilość odzyskanego DNA może być niższa.</li>
</ol>
9. Analiza odzyskanego DNA
<ol>
	<li>SDS może zakłócać aktywność polimerazy Taq w reakcji PCR. Przed przeprowadzeniem PCR należy całkowicie usunąć SDS. Inkubować DNA w lodzie, aby wytrącić pozostałości SDS, a następnie centryfugować w temperaturze 4°C przy 140 x g przez 1 min. Przenieść supernatant do nowej probówki typu Eppendorf. Ten krok jest zdecydowanie zalecany.</li>
	<li> Eluaty DNA można wykryć za pomocą konwencjonalnego PCR lub ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (Q-PCR), stosując primery specyficzne dla każdej analizowanej sekwencji. Do jednej reakcji PCR lub Q-PCR można wykorzystać 5-10 μl całkowitego eluatu DNA. PCR z kontrolą wejściową można przeprowadzić przy 5-10 krotnym rozcieńczeniu DNA w porównaniu z ilością w pozostałych próbkach. Warunki PCR i Q-PCR będą się różnić, jednak ograniczona ilość materiału wyjściowego wymaga dodatkowych cykli PCR. W przypadku detekcji metodą konwencjonalnego PCR zalecamy rozpoczęcie od 40 cykli i dostosowanie ich w razie potrzeby.</li>
</ol>
10. Reprezentatywne wyniki
Niniejszy protokół został wykorzystany do przeprowadzenia analizy ChIP w zarodkach na etapie E8,5 oraz E9,5 (Rysunek 2). Wyniki wykazują, że miogenina występuje na promotorze miogeniny w zarodkach E8,5 i E9,5. DNA oczyszczone metodą ChIP analizowano za pomocą konwencjonalnego PCR (Rysunek 2A) oraz ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (Rysunek 2B). W przeciwieństwie do tego, nie stwierdzono wiązania miogeniny z promotorem miogeniny w worku żółtkowym, gdzie miogenina nie jest ekspresowana. Jako negatywna kontrola sekwencji wykorzystano promotor interferonu-γ (IFNγ), który zawiera sekwencje odpowiadające miejscu wiązania miogeniny. Zgodnie z oczekiwaniami, miogenina nie wiązała się z promotorem IFNγ w żadnej z badanych próbek tkanek. W zarodkach E8,5 i 9,5 miogenina jest specyficznie ekspresowana w somytach (Rysunek 3; 6,10), które są prekursorami mięśni szkieletowych. Wyniki te wskazują zatem, że miogenina wiąże się z promotorem miogeniny w somytach na etapach E8,5 i E9,5.
<img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="Disekcja rogu macicy i błony decidualnej, stadia rozwoju płodu E8,5-E9,5, wyniki mikroskopowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Disekcja zarodka w stadium E8.5. (A) Wyizolowany róg macicy (panel górny; w panelu dolnym pokazano większe powiększenie). (B) Róg macicy przecięty nożyczkami w celu oddzielenia poszczególnych miejsc implantacji zawierających poszczególne zarodki. (C) Zarodki wystające z tkanki macicy podczas disekcji. Strzałki wskazują zarodki wciąż pokryte tkanką pozazarodkową. (D) Dwa zarodki E8.5 z jednego miotu. Zarodek po lewej nie rozpoczął procesu obrotu. Zarodek po prawej znajduje się w trakcie obrotu. Po prawej stronie – reprezentatywny zarodek E9.5.
<img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="Diagram równowagi statycznej wyników konwencjonalnej i czasu rzeczywistego PCR; analiza ekspresji; wykres słupkowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Analiza ChIP wykazująca wiązanie miogeniny z promotorem miogeniny w zarodkach w stadiach E8.5 i E9.5. (Góra) Przeprowadzono konwencjonalną analizę PCR 5 µl DNA oczyszczonego w eksperymentach ChIP z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko miogeninie lub niespecyficznego IgG, stosując startery amplifikujące fragment promotora miogeniny od -79 do +69 względem miejsca rozpoczęcia transkrypcji, który zawiera miejsce wiązania miogeniny zlokalizowane w pozycji -12, lub startery amplifikujące fragment promotora IFNγ zawierający sekwencję odpowiadającą miejscu wiązania miogeniny, zlokalizowaną ok. 1075 bp powyżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji. Wykorzystane sekwencje starterów IFNγ to 5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3' oraz 5'-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3'. (Dół) Analiza ilościową za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) tych samych próbek, które wykorzystano w punkcie (A). Dane przedstawiono jako % input +/- odchylenie standardowe.
<img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="Etapy rozwoju zarodkowego od E8.5 do E9.5, obraz mikroskopowy, badanie z zakresu biologii rozwoju." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Miogenina jest specyficznie ekspresowana w somytach embrionów w dniach E8,5 i E9,5. Preparat całego zarodka in situ hybrydyzacja miogeniny wykazuje specyficzną ekspresję mRNA w somytach. Pasek skali na obrazie E8.5 - 200 μmPasek skali na obrazie E9.5 - 500 μm.

<ol><li>Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+epigenetic+alterations+to+chromatin+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development.</a> Genesis. 47, 559-572 (2009).</li>
<li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein%3ADNA+associations+in+a+chromatin+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19, 425-433 (1999).</li>
<li>Johnson, K. D., Bresnick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+long-range+transcriptional+mechanisms+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 27-36 (2002).</li>
<li>Yusuf, F., Brand-Saberi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eventful+somite%3A+patterning%2C+fate+determination+and+cell+division+in+the+somite%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite.</a> Anat Embryol (Berl). 211, Suppl 1. 21-30 (2006).</li>
<li>Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+skeletal+muscle%3A+from+somite+to+limb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">The formation of skeletal muscle: from somite to limb.</a> J Anat. 202, 59-68 (2003).</li>
<li>Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenin%2C+a+factor+regulating+myogenesis%2C+has+a+domain+homologous+to+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD.</a> Cell. 56, 607-617 (1989).</li>
<li>Edmondson, D. G., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+with+homology+to+the+myc+similarity+region+of+MyoD1+is+expressed+during+myogenesis+and+is+sufficient+to+activate+the+muscle+differentiation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program.</a> Genes Dev. 3, 628-640 (1989).</li>
<li>Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenin+gene+disruption+results+in+perinatal+lethality+because+of+severe+muscle+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect.</a> Nature. 364, 532-535 (1993).</li>
<li>Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+deficiency+and+neonatal+death+in+mice+with+a+targeted+mutation+in+the+myogenin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene.</a> Nature. 364, 501-506 (1993).</li>
<li>Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+two+myogenic+regulatory+factors+myogenin+and+MyoD1+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis.</a> Nature. 341, 303-307 (1989).</li>
<li>Brennan, T. J., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenin+resides+in+the+nucleus+and+acquires+high+affinity+for+a+conserved+enhancer+element+on+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization.</a> Genes Dev. 4, 582-595 (1990).</li>
<li>Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+conserved+enhancer+downstream+of+the+human+MLC1%2F3+locus+is+a+target+for+multiple+myogenic+determination+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).</li>
<li>Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-expressed+myogenic+determination+factors+require+E12+complex+formation+for+binding+to+the+myosin-light-chain+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer.</a> Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).</li>
<li>Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+trans-activation+of+a+muscle-specific+enhancer+by+myogenic+helix-loop-helix+proteins+is+separable+from+DNA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding.</a> J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).</li>
<li>French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimers+of+myogenic+helix-loop-helix+regulatory+factors+and+E12+bind+a+complex+element+governing+myogenic+induction+of+the+avian+cardiac+alpha-actin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter.</a> Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).</li>
<li>Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+the+myogenin+basic+region+identifies+an+ancient+protein+motif+critical+for+activation+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).</li>
<li>Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+activity+of+myogenic+HLH+proteins+requires+hetero-oligomerization+with+E12%2FE47-like+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo.</a> Cell. 66, 305-315 (1991).</li>
<li>Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+homooligomerization+contributes+to+the+dependence+of+myogenin+on+E2A+products+for+efficient+DNA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding.</a> Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).</li>
<li>Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenin+induces+the+myocyte-specific+enhancer+binding+factor+MEF-2+independently+of+other+muscle-specific+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products.</a> Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).</li>
<li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li>
<li>Serna, dela, L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li>
<li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li>
<li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li>
<li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenin+and+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li>
<li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li>
<li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered%2C+cyclical%2C+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li>
<li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez IACUC University of Massachusetts Medical School.

W opisanym protokole ChIP wykazujemy, że regulator miogenezy, miogenina, wiąże się z promotorem miogeniny w tkance prekursorowej mięśni szkieletowych obecnej w pojedynczych embrionach w stadiach E8.5 i E9.5. Wcześniejsze badania szczegółowo scharakteryzowały wiązanie miogeniny z sekwencjami zawierającymi pudełko E, począwszy od wstępnych eksperymentów przesunięcia elektroforetycznego in vitro z wykorzystaniem miogeniny translacjej in vitro lub produkowanej bakteryjnie oraz znakowanego radioaktywnie DNA ...

<table><tbody><tr><td>Zestaw do analizy ChIP</td><td>Upstate, Millipore</td><td>17-295</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>Rozcieńczenie w 1x PBS</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;pożywka DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12100-061</td><td>Wysoka zawartość glukozy</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;bufor fosforanowy z solą 1X (DPBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Wolny od chlorku wapnia, wolny od chlorku magnezu</td></tr><tr><td>Płytkowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji z żelu</td><td>QIAquick</td><td>28704</td><td>zestaw do 50 reakcji</td></tr><tr><td>Roztwór zapasowy penicyliny/streptomycyny</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td>5000 &amp;#x03BC;stężenie g/ml</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>DNA z plemni łososia / agaroza z białkiem A</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko miogeninie</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-576</td><td></td></tr><tr><td>Normalne IgG królika</td><td>EMD Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>mieszanka GoTaq Q-PCR master mix</td><td>Promega Corp.</td><td>A6001</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem służącym do identyfikacji oddziaływań białko:chromatyna zachodzących w kontekście żywych komórek 1-3. Technika ta była szeroko wykorzystywana w komórkach hodowli tkankowych, a w mniejszym stopniu w tkankach pierwotnych. Zastosowanie metody ChIP do embrionalnych tkanek gryzoni, zwłaszcza we wczesnych etapach rozwoju, jest utrudnione ze względu na ograniczoną ilość tkanki oraz heterogeniczność typów komórek i tkanek w embrionie. Przedstawiamy tutaj metodę przeprowadzania ChIP z wykorzystaniem zdysocjowanego embrionu z 8,5 doby embrionalnej (E8.5). Ścięta chromatyna z pojedynczego embrionu E8.5 może zostać podzielona na maksymalnie pięć alikwotów, co zapewnia badaczowi wystarczającą ilość materiału do kontroli oraz do badania specyficznych oddziaływań białko:chromatyna.
Wykorzystaliśmy tę technikę, aby rozpocząć dokumentowanie oddziaływań białko:chromatyna podczas specyfikacji programów ekspresji genów specyficznych dla tkanek. Heterogeniczność typów komórek w embrionie nieuchronnie ogranicza zastosowanie tej techniki, ponieważ wynikiem jest wykrycie oddziaływań białko:chromatyna bez rozróżnienia, czy oddziaływania te zachodzą we wszystkich, w podgrupie, czy w pojedynczym typie komórek. Jednakże badanie genów specyficznych dla tkanek podczas lub po rozpoczęciu specyficznej dla tkanek ekspresji genów jest możliwe z dwóch powodów. Po pierwsze, immunoprecypitacja czynników specyficznych dla tkanek nieuchronnie izoluje chromatynę z typu komórek, w których dany czynnik jest ekspresowany. Po drugie, immunoprecypitacja koaktywatorów i histonów zawierających modyfikacje potranslacyjne związane z aktywacją genów powinna prowadzić do wykrycia tych elementów wyłącznie przy genach i sekwencjach regulacyjnych genów w typie komórek, w których gen jest lub był aktywowany. Technika ta powinna być możliwa do zastosowania w badaniu większości zdarzeń aktywacji genów specyficznych dla tkanek.
W poniższym przykładzie wykorzystano embriony myszy w stadiach E8.5 i E9.5, aby zbadać wiązanie czynnika w obrębie promotora genu specyficznego dla mięśni szkieletowych. Somity, będące tkankami prekursorowymi, z których powstaną mięśnie szkieletowe tułowia i kończyn, występują w stadiach E8.5-9.54,5. Miogenina jest czynnikiem regulacyjnym niezbędnym do różnicowania mięśni szkieletowych 6-9. Dane wykazują, że miogenina wiąże się z własnym promotorem w embrionach E8.5 i E9.5. Ponieważ miogenina jest ekspresjonowana w somitach jedynie na tym etapie rozwoju 6,10, dane wskazują, że oddziaływania miogeniny z jej własnym promotorem zachodzą już w komórkach prekursorowych mięśni szkieletowych w embrionach E8.5.

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem służącym do identyfikacji oddziaływań białko-chromatyna, które zachodzą w kontekście żywych komórek 1-3. To...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja embrionów myszy w stadium E 8.5 do wykorzystania w analizach chromatyny, immunoprecypitacji lub testach ChIP. Osiąga się to najpierw poprzez izolację embrionów myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek. Drugim krokiem procedury jest chemiczne sieciowanie białek związanych z DNA z genomowym DNA, a następnie sonikacja w celu fragmentacji DNA.Trzecim krokiem procedury jest immunoprecypitacja kompleksów białkowo-chromatynowych i izolacja oczyszczonego DNA. Ostatnim krokiem procedury jest analiza oczyszczonego, immunoprecypitowanego DNA za pomocą konwencjonalnej PCR lub ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące interakcje białek z sekwencjami regulatorowymi genów specyficznych dla różnicowania podczas inicjacji programu różnicowania w rozwijających się tkankach i organach.Niniejszy semestr może pomóc w odpowiedzi na istotne pytanie dotyczące inicjacji programu różnicowania podczas embriogenezy poprzez identyfikację czynników regulacyjnych, które oddziałują z sekwencjami regulacyjnymi genów specyficznych dla różnicowania w momencie, gdy stają się one kompetentne transkrypcyjnie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy usunąć rogi macicy u myszy uśmierconej w 8,5 dniu embrionalnym. Zgodnie z zatwierdzonym protokołem, tkankę przenosi się nożyczkami do szalki Petriego zawierającej świeże medium do sekcji.Wyciąć pojedynczo każde miejsce implantacji i umieścić je w szalce Petri zawierającej świeże medium do sekcji, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Za pomocą pęsety usunąć warstwę macicy z każdego miejsca implantacji, aby odsłonić zarodki, a następnie wyizolować poszczególne embriony używając pęsety. Na tym etapie rozwoju embriony są otoczone przez kąpiel żółtkową ścienną, która styka się z tkanką decydującą, kąpiel żółtkową trzewną oraz błoną owodniową.Błona owodniowa to przezroczysta membrana będąca w bezpośrednim kontakcie z zarodkiem. Trzewna część pęcherzyka żółtkowego znajduje się pomiędzy błoną owodniową a ścienną częścią pęcherzyka żółtkowego; w zarodkach od 8,5 do 9,5 dnia jest ona łatwo rozróżnialna dzięki obecności wyraźnych naczyń krwionośnych odżywiających zarodek. Wyjmij każdy zarodek z otaczających go błon i przenieś go pojedynczo na nową płytkę zawierającą podłoże do sekcji, aby usunąć nadmiar krwi.Następnie przenieś każdy embrion do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 µl medium do sekcji. Homogenizację wyizolowanego embrionu rozpoczyna się poprzez dodanie 200 µL roztworu kolagenazy typu II do każdej probówki zawierającej embriony.Próbki delikatnie wstrząsać w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C przy 100 RPM przez 20 minut. Następnie ponownie resuspendować próbki, delikatnie je dotykając, aby rozbić skupiska komórek. Zawiesinę komórkową nanieść na sterylną sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 µm, umieszczone nad probówką typu eppendorf o pojemności 1,5 ml.Niebawem nanieś 600 µL 1X DPBS o temperaturze pokojowej na górną część sita do komórek, aby zakończyć proces oddzielania. Po przefiltrowaniu zawiesiny usuń sito, a następnie odwiruj próbki z prędkością 4 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu odlej nadsącz.Każdy osad zawiesić w 1 ml 1X DPBS o temperaturze pokojowej. Następnie próbki odwirować przy 4 000 g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po ponownym odlaniu nadsączu, każdy osad zawiesić w 200 µl pożywki do sekcji o temperaturze pokojowej; przeprowadzić sieciowanie chromatyny, dodając 5,6 µl 37% formaldehydu do 200 µl próbek, aby uzyskać stężenie końcowe 1% formaldehydu.Próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej; po inkubacji odwirować próbki przy 4,000 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić nadsącz. Komórki resuspender w zimnym 1X DPBS zawierającym 80 µL/mL koktajlu inhibitorów proteaz (PIC). Następnie odwirować próbki przy 4,000 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odlaniu supernatantu próbki można zamrozić w temperaturze -80 °C; pozostają one stabilne przez kilka miesięcy. Przed sonikacją rozmrozić zamrożony osad komórkowy na lodzie lub umieścić osad z poprzedniego kroku na lodzie. Resuspendować osad komórkowy w 100 µL buforu lizującego SDS o temperaturze pokojowej. Następnie dodać kolejne 100 µL buforu lizującego SDS o temperaturze pokojowej i resuspendować próbkę poprzez pipetowanie oraz odwracanie probówki.Inkubuj zawiesinę komórkową na lodzie przez 10 minut. Po inkubacji ustaw aparat do ścinania sieciowanego DNA do długości od 200 do 500 par zasad. W tym pokazie wykorzystano urządzenie DIO geno bio rupture UCD 200.Poddaj próbkę sonikacji w zawiesinie lodowej. Nie dopuść do jej ogrzania powyżej 4 °C ani do zamrożenia. Próbkę po sonikacji odwiruj przy 14 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C.Przenieś supernatant do nowej probówki DPH uprzednio schłodzonej na lodzie. Podziel sonicowaną próbkę na maksymalnie pięć aliquotów. Jeden aliquot przechowuj w temperaturze -20°C, aby zachować go jako materiał wejściowy do procesu odwracania sieciowania.Następnie pozostałe alikwoty należy rozcieńczyć dziesięciokrotnie w buforze do rozcieńczania na chipie zawierającym świeżo dodany PIC w ilości 1 µL na 800 µL buforu. Najpierw należy określić, jakie prędkości wirowania zostaną zastosowane do wstępnego oczyszczania, w zależności od przeciwciała użytego do białka w analizie na chipie. W tym przypadku zastosowano kuleczki A, ponieważ przeciwciało użyte do chipa jest królicze.Wstępnie oczyść rozcieńczony supernatant, dodając 75 µL 50% DNA i białka z plemników łososia. Inkubuj próbki w temperaturze 4 °C z rotacją przez jedną godzinę. Po inkubacji odwirowuj próbki przy 2 500 G przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Przenieś supernatranty do nowej, schłodzonej wcześniej probówki Eppendorf.Do uprzednio oczyszczonego preparatu Eloqua dodaj cztery µg przeciwciała na próbkę i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C przy jednoczesnym rotowaniu. Rozpocznij od dodania 60 µL zawiesiny kulek agarozowych z DNA białka plemników łososia do każdej próbki i inkubuj w temperaturze 4 °C z rotacją przez jedną godzinę. Odwiruj próbki przy 1000 ×g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu ostrożnie usuń nadlewki i je odrzuć, utrzymując kompleks DNA-białko-kuleczki w lodzie. Resuspenduj i przemyj osady zgodnie z opisem w protokole pisemnym, używając buforów od pierwszego do czwartego.Każde przemycie składa się z pięciominutowej inkubacji z rotacją, a następnie wirowania przy 1000 G przez jedną minutę i usunięcia nadsączu po przemyciu. Eluuj kompleks przeciwciało-chromatyna poprzez ponowne zawieszenie przemytego kompleksu koralików z białkiem chromatyny w 250 µL świeżo przygotowanego buforu do elucji. Każdą próbkę energicznie mieszaj w wirówce Vortex przez pięć sekund, a następnie inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 15 minut z rotacją, po czym wiruj przy 2 500 G przez jedną minutę. W temperaturze pokojowej przenieś każdy eluat do nowej probówki typu Eppendorf.Powtórz proces elucji i połącz eluaty dla każdej próbki w tej samej probówce Eppendorf. Aby odwrócić wiązania krzyżowe, dodaj 20 µL 5 M NaCl do każdego 500 µL eluatu. W przypadku wcześniej odstawionej kontroli wejściowej dodaj 40 µL 5 M NaCl na 1 mL.Podgrzewaj EIT w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C przez cztery godziny. Następnie nanieś 10 µL każdej próbki na kontrolę wejściową w 2% żelu agarozowym, obok markera wielkości obejmującego zakres od 0,1 do 1 kb, aby sprawdzić wielkość fragmentów DNA. DNA pojawi się w formie smugi, a nie ostrego prążka.Wyizoluj DNA z każdej próbki o objętości 500 µL, korzystając z zestawu kaya quick gel extraction. Rozpocznij od dodania 600 µL buforu qg w celu optymalizacji absorpcji DNA przez membranę krzemionkową w kolumnie kaya quick spin, a następnie dodaj 200 µL izopropanolu przed nałożeniem próbki na kolumnę. Sprawdź mieszaninę, aby ustalić, czy występuje osad SDS.Jeśli doszło do wytrącenia SDS, próbki należy ogrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C aż do momentu zaniku osadu. Następnie nanosi się próbki na kolumny i elui DNA zgodnie z instrukcją producenta. SDS może wpływać na aktywność polimerazy PCRT, dlatego powinien zostać całkowicie usunięty przed przeprowadzeniem PCR.Inkubować każdą próbkę DNA na lodzie, aby wytrącić pozostały SDS, a następnie centryfugować przy 14 000 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść SANE do nowych probówek typu Eppendorf. DNA EIT można wykryć za pomocą konwencjonalnej reakcji PCR lub ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) z wykorzystaniem starterów specyficznych dla każdej analizowanej sekwencji. Dla każdej reakcji PCR lub qPCR należy użyć od 5 do 10 µL całkowitego DNA IIT; warunki reakcji PCR i qPCR mogą się różnić.Jednakże ograniczona ilość materiału wyjściowego wymaga dodatkowych cykli PCR w przypadku konwencjonalnej detekcji PCR; należy rozpocząć od 40 cykli i dostosować tę liczbę w razie potrzeby. Zastosowanie tego protokołu pozwoliło na przygotowanie chipów z embrionów w stadium E 8.5 oraz E 9.5. DNA oczyszczone za pomocą chipów analizowano metodą konwencjonalnego PCR oraz ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.Wyniki wykazują, że czynnik miogenny i regulacyjny jest obecny na promotorze miogennym w zarodkach w stadiach E 8.5 oraz E 9.5. W przeciwieństwie do tego, nie stwierdzono wiązania miogennego z promotorem miogennym w worku dębowym, gdzie czynnik miogenny nie jest ekspresowany. Jako negatywną kontrolę sekwencji wykorzystano promotor interferonu gamma, który zawiera sekwencje odpowiadające miejscu wiązania miogennego; zgodnie z oczekiwaniami, czynnik miogenny nie wiązał się z promotorem interferonu gamma w żadnej z badanych próbek tkanek.Wyniki wskazują, że Myogenic wiąże się z promotorem Myogenic w somytach embrionów w dniach E 8.5 i E 9.5, ponieważ myo Genin wykazuje specyficzną ekspresję w somytach na tych etapach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat izolacji i przygotowania embrionów myszy w dniu EA 0.5 do analizy immunoprecypitacji chromatyny, która pozwoli zidentyfikować czynniki regulacyjne powiązane z genami specyficznymi dla tkanek w rozwijających się organizmach.

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych dla tkanek z wykorzystaniem wczesnych embrionów mysich

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych. <br...

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.

Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Tutaj opisujemy standardowy protokół wykrywania aktywności β-galaktozydazy we wczesnych zarodkach całych myszy oraz metodę sekcji parafiny i przeciwbarwienia. Jest to łatwa i szybka procedura monitorowania ekspresji genów podczas rozwoju, która może być również stosowana do skrawków tkanek, narządów lub hodowanych komórek.

Śledzenie ekspresji genów poprzez wykrywanie aktywności β-galaktozydazy w całych zarodkach myszy

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Poznaj metodę ChIP do badania aktywacji genów specyficznych dla tkanek w zarodkach myszy E 8.5. Technika ta pozwala identyfikować interakcje białek z sekwencjami regulacyjnymi podczas embriogenezy.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Przeglądaj więcej filmów