Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja embrionów myszy w stadium E 8.5 do wykorzystania w analizach chromatyny, immunoprecypitacji lub testach ChIP. Osiąga się to najpierw poprzez izolację embrionów myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek. Drugim krokiem procedury jest chemiczne sieciowanie białek związanych z DNA z genomowym DNA, a następnie sonikacja w celu fragmentacji DNA.

Trzecim krokiem procedury jest immunoprecypitacja kompleksów białkowo-chromatynowych i izolacja oczyszczonego DNA. Ostatnim krokiem procedury jest analiza oczyszczonego, immunoprecypitowanego DNA za pomocą konwencjonalnej PCR lub ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące interakcje białek z sekwencjami regulatorowymi genów specyficznych dla różnicowania podczas inicjacji programu różnicowania w rozwijających się tkankach i organach.

Niniejszy semestr może pomóc w odpowiedzi na istotne pytanie dotyczące inicjacji programu różnicowania podczas embriogenezy poprzez identyfikację czynników regulacyjnych, które oddziałują z sekwencjami regulacyjnymi genów specyficznych dla różnicowania w momencie, gdy stają się one kompetentne transkrypcyjnie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy usunąć rogi macicy u myszy uśmierconej w 8,5 dniu embrionalnym. Zgodnie z zatwierdzonym protokołem, tkankę przenosi się nożyczkami do szalki Petriego zawierającej świeże medium do sekcji.

Wyciąć pojedynczo każde miejsce implantacji i umieścić je w szalce Petri zawierającej świeże medium do sekcji, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Za pomocą pęsety usunąć warstwę macicy z każdego miejsca implantacji, aby odsłonić zarodki, a następnie wyizolować poszczególne embriony używając pęsety. Na tym etapie rozwoju embriony są otoczone przez kąpiel żółtkową ścienną, która styka się z tkanką decydującą, kąpiel żółtkową trzewną oraz błoną owodniową.

Błona owodniowa to przezroczysta membrana będąca w bezpośrednim kontakcie z zarodkiem. Trzewna część pęcherzyka żółtkowego znajduje się pomiędzy błoną owodniową a ścienną częścią pęcherzyka żółtkowego; w zarodkach od 8,5 do 9,5 dnia jest ona łatwo rozróżnialna dzięki obecności wyraźnych naczyń krwionośnych odżywiających zarodek. Wyjmij każdy zarodek z otaczających go błon i przenieś go pojedynczo na nową płytkę zawierającą podłoże do sekcji, aby usunąć nadmiar krwi.

Następnie przenieś każdy embrion do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 µl medium do sekcji. Homogenizację wyizolowanego embrionu rozpoczyna się poprzez dodanie 200 µL roztworu kolagenazy typu II do każdej probówki zawierającej embriony.

Próbki delikatnie wstrząsać w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C przy 100 RPM przez 20 minut. Następnie ponownie resuspendować próbki, delikatnie je dotykając, aby rozbić skupiska komórek. Zawiesinę komórkową nanieść na sterylną sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 µm, umieszczone nad probówką typu eppendorf o pojemności 1,5 ml.

Niebawem nanieś 600 µL 1X DPBS o temperaturze pokojowej na górną część sita do komórek, aby zakończyć proces oddzielania. Po przefiltrowaniu zawiesiny usuń sito, a następnie odwiruj próbki z prędkością 4 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu odlej nadsącz.

Każdy osad zawiesić w 1 ml 1X DPBS o temperaturze pokojowej. Następnie próbki odwirować przy 4 000 g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po ponownym odlaniu nadsączu, każdy osad zawiesić w 200 µl pożywki do sekcji o temperaturze pokojowej; przeprowadzić sieciowanie chromatyny, dodając 5,6 µl 37% formaldehydu do 200 µl próbek, aby uzyskać stężenie końcowe 1% formaldehydu.

Próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej; po inkubacji odwirować próbki przy 4,000 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić nadsącz. Komórki resuspender w zimnym 1X DPBS zawierającym 80 µL/mL koktajlu inhibitorów proteaz (PIC). Następnie odwirować próbki przy 4,000 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odlaniu supernatantu próbki można zamrozić w temperaturze -80 °C; pozostają one stabilne przez kilka miesięcy. Przed sonikacją rozmrozić zamrożony osad komórkowy na lodzie lub umieścić osad z poprzedniego kroku na lodzie. Resuspendować osad komórkowy w 100 µL buforu lizującego SDS o temperaturze pokojowej. Następnie dodać kolejne 100 µL buforu lizującego SDS o temperaturze pokojowej i resuspendować próbkę poprzez pipetowanie oraz odwracanie probówki.

Inkubuj zawiesinę komórkową na lodzie przez 10 minut. Po inkubacji ustaw aparat do ścinania sieciowanego DNA do długości od 200 do 500 par zasad. W tym pokazie wykorzystano urządzenie DIO geno bio rupture UCD 200.

Poddaj próbkę sonikacji w zawiesinie lodowej. Nie dopuść do jej ogrzania powyżej 4 °C ani do zamrożenia. Próbkę po sonikacji odwiruj przy 14 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

Przenieś supernatant do nowej probówki DPH uprzednio schłodzonej na lodzie. Podziel sonicowaną próbkę na maksymalnie pięć aliquotów. Jeden aliquot przechowuj w temperaturze -20°C, aby zachować go jako materiał wejściowy do procesu odwracania sieciowania.

Następnie pozostałe alikwoty należy rozcieńczyć dziesięciokrotnie w buforze do rozcieńczania na chipie zawierającym świeżo dodany PIC w ilości 1 µL na 800 µL buforu. Najpierw należy określić, jakie prędkości wirowania zostaną zastosowane do wstępnego oczyszczania, w zależności od przeciwciała użytego do białka w analizie na chipie. W tym przypadku zastosowano kuleczki A, ponieważ przeciwciało użyte do chipa jest królicze.

Wstępnie oczyść rozcieńczony supernatant, dodając 75 µL 50% DNA i białka z plemników łososia. Inkubuj próbki w temperaturze 4 °C z rotacją przez jedną godzinę. Po inkubacji odwirowuj próbki przy 2 500 G przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Przenieś supernatranty do nowej, schłodzonej wcześniej probówki Eppendorf.

Do uprzednio oczyszczonego preparatu Eloqua dodaj cztery µg przeciwciała na próbkę i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C przy jednoczesnym rotowaniu. Rozpocznij od dodania 60 µL zawiesiny kulek agarozowych z DNA białka plemników łososia do każdej próbki i inkubuj w temperaturze 4 °C z rotacją przez jedną godzinę. Odwiruj próbki przy 1000 ×g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu ostrożnie usuń nadlewki i je odrzuć, utrzymując kompleks DNA-białko-kuleczki w lodzie. Resuspenduj i przemyj osady zgodnie z opisem w protokole pisemnym, używając buforów od pierwszego do czwartego.

Każde przemycie składa się z pięciominutowej inkubacji z rotacją, a następnie wirowania przy 1000 G przez jedną minutę i usunięcia nadsączu po przemyciu. Eluuj kompleks przeciwciało-chromatyna poprzez ponowne zawieszenie przemytego kompleksu koralików z białkiem chromatyny w 250 µL świeżo przygotowanego buforu do elucji. Każdą próbkę energicznie mieszaj w wirówce Vortex przez pięć sekund, a następnie inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 15 minut z rotacją, po czym wiruj przy 2 500 G przez jedną minutę. W temperaturze pokojowej przenieś każdy eluat do nowej probówki typu Eppendorf.

Powtórz proces elucji i połącz eluaty dla każdej próbki w tej samej probówce Eppendorf. Aby odwrócić wiązania krzyżowe, dodaj 20 µL 5 M NaCl do każdego 500 µL eluatu. W przypadku wcześniej odstawionej kontroli wejściowej dodaj 40 µL 5 M NaCl na 1 mL.

Podgrzewaj EIT w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C przez cztery godziny. Następnie nanieś 10 µL każdej próbki na kontrolę wejściową w 2% żelu agarozowym, obok markera wielkości obejmującego zakres od 0,1 do 1 kb, aby sprawdzić wielkość fragmentów DNA. DNA pojawi się w formie smugi, a nie ostrego prążka.

Wyizoluj DNA z każdej próbki o objętości 500 µL, korzystając z zestawu kaya quick gel extraction. Rozpocznij od dodania 600 µL buforu qg w celu optymalizacji absorpcji DNA przez membranę krzemionkową w kolumnie kaya quick spin, a następnie dodaj 200 µL izopropanolu przed nałożeniem próbki na kolumnę. Sprawdź mieszaninę, aby ustalić, czy występuje osad SDS.

Jeśli doszło do wytrącenia SDS, próbki należy ogrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C aż do momentu zaniku osadu. Następnie nanosi się próbki na kolumny i elui DNA zgodnie z instrukcją producenta. SDS może wpływać na aktywność polimerazy PCRT, dlatego powinien zostać całkowicie usunięty przed przeprowadzeniem PCR.

Inkubować każdą próbkę DNA na lodzie, aby wytrącić pozostały SDS, a następnie centryfugować przy 14 000 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść SANE do nowych probówek typu Eppendorf. DNA EIT można wykryć za pomocą konwencjonalnej reakcji PCR lub ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) z wykorzystaniem starterów specyficznych dla każdej analizowanej sekwencji. Dla każdej reakcji PCR lub qPCR należy użyć od 5 do 10 µL całkowitego DNA IIT; warunki reakcji PCR i qPCR mogą się różnić.

Jednakże ograniczona ilość materiału wyjściowego wymaga dodatkowych cykli PCR w przypadku konwencjonalnej detekcji PCR; należy rozpocząć od 40 cykli i dostosować tę liczbę w razie potrzeby. Zastosowanie tego protokołu pozwoliło na przygotowanie chipów z embrionów w stadium E 8.5 oraz E 9.5. DNA oczyszczone za pomocą chipów analizowano metodą konwencjonalnego PCR oraz ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.

Wyniki wykazują, że czynnik miogenny i regulacyjny jest obecny na promotorze miogennym w zarodkach w stadiach E 8.5 oraz E 9.5. W przeciwieństwie do tego, nie stwierdzono wiązania miogennego z promotorem miogennym w worku dębowym, gdzie czynnik miogenny nie jest ekspresowany. Jako negatywną kontrolę sekwencji wykorzystano promotor interferonu gamma, który zawiera sekwencje odpowiadające miejscu wiązania miogennego; zgodnie z oczekiwaniami, czynnik miogenny nie wiązał się z promotorem interferonu gamma w żadnej z badanych próbek tkanek.

Wyniki wskazują, że Myogenic wiąże się z promotorem Myogenic w somytach embrionów w dniach E 8.5 i E 9.5, ponieważ myo Genin wykazuje specyficzną ekspresję w somytach na tych etapach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat izolacji i przygotowania embrionów myszy w dniu EA 0.5 do analizy immunoprecypitacji chromatyny, która pozwoli zidentyfikować czynniki regulacyjne powiązane z genami specyficznymi dla tkanek w rozwijających się organizmach.