Name: Wytwarzanie nerwowych komórek macierzystych z wyrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych z ludzkiej tkanki korowej płodu. Technika umożliwia hodowlę, różnicowanie i testowanie farmakologiczne w badaniach nad chorobami układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została częściowo sfinansowana przez National Institutes of Health: HD054347 oraz NS063997-01 dla VLS. Praca ta została również częściowo sfinansowana przez Empire State Stem Cell Fund za pośrednictwem kontraktu nr C024324 Departamentu Zdrowia Stanu Nowy Jork dla VLS. Opinie wyrażone w niniejszym opracowaniu są wyłącznie opiniami autora i niekoniecznie odzwierciedlają stanowisko Empire State Stem Cell Board, Departamentu Zdrowia Stanu Nowy Jork ani Stanu Nowy Jork. VLS jest laureatem Doris Duke Clinical Scientist Developmental Award. Dziękujemy również profesorowi Timothy'emu Vartanianowi za przekazanie przeciwciał Anti-O1 i Anti-O4.

1. Przygotowanie roztworów i materiałów do sekcji oraz utrzymania hodowli komórek macierzystych neuronów
<ol>
	<li>Przygotować wcześniej 10 ml pożywki do mikrodysekcji (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) i przechowywać w lodówce.</li>
<li>Przygotować 10 ml pożywki hodowlanej (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) i utrzymywać w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej.</li>
<li>Przygotować pożywkę do mrożenia komórek (KNOCKOUT DMEM/F12+10%FBS+ 5%DMSO) do długoterminowej kriosprzechowywania komórek.</li>
<li>W razie potrzeby przygotować 4% paraformaldehyd (PFA) do utrwalania tkanek.</li>
<li>Do mikrodysekcji należy użyć sterylnych, autoklawowanych pincet oraz ostrzy skalpela z uchwytami.</li>
<li>Przygotować pipetor automatyczny, pipety transferowe 10 ml oraz sitko do komórek 40 μM (BD Falcon 352340) do dysocjacji.</li>
<li>Przygotować kilka szalek hodowlanych 10 cm (BD) do mikrodysekcji, probówki wirówkowe 50 ml (BD) do dysocjacji, probówki wirówkowe 1,5 ml do przechowywania tkanek oraz kriotubki (BD) do mrożenia komórek.</li>
</ol>
2. Izolowanie ludzkich komórek macierzystych neuronów z ludzkiego mózgu płodowego
<ol>
<li>Kluczem do sukcesu procedury jest pobranie żywej tkanki natychmiast po terminacji płodu. W przypadku zabiegów planowych czas pobrania próbek można ustalić z wyprzedzeniem, aby zminimalizować czas po śmierci płodu. Produkty poczęcia są pobierane w ciągu 2 godzin po zabiegu, ale w przypadku procedur planowych idealnie można to osiągnąć w ciągu kilku minut. Tkanki płodowe są często pofragmentowane. Jednak zazwyczaj znaczna część mózgu pozostaje nienaruszona, co umożliwia identyfikację wizualną. Ograniczenia wieku ciążowego (GA) są określone przez prawo ustawowe, ale protokół ten był stosowany w okresie między 18. a 2. tygodniem GA.</li> 
<li>Mózg płodu umieszcza się w szalce Petriego o pojemności 10 ml zawierającej schłodzony do temperatury lodu roztwór KNOCKOUT DMEM/F12. Różne części kory identyfikuje się na podstawie punktów orientacyjnych anatomicznych. Granice kory czołowej oraz ciemieniowo-potylicznej wyznacza ekstrapolowana przecięcie bruzdy środkowej i szczeliny Sylwiusza. Tkankę z kory czołowej przedniej względem bruzdy środkowej i wzdłuż brzegu szczeliny Sylwiusza wycina się za pomocą skalpeli, dbając o to, aby komora pozostała nienaruszona i nieuszkodzona.</li>
<li>Z oddzielonego bloku kory czołowej usuwa się wszelką pozostałą krew i opony mózgowe. Jeśli próbka jest wystarczającej jakości, najlepiej podzielić blok na kilka mniejszych próbek do różnych celów: do przekrojów (utrwalonych w 4% paraformaldehydzie, PFA) oraz do analiz białek/mRNA (szybko zamrożonych w temperaturze -80°C).</li>
<li>Wybrany blok mózgu przenosi się do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaje schłodzony do temperatury lodu roztwór KNOCKOUT DMEM/F12 w ilości około 3-krotnej objętości tkanki. Tkankę delikatnie dysocjuje się poprzez mechaniczne pipetowanie pipetą transferową 10 ml, aż cała tkanka zostanie pofragmentowana (zazwyczaj 20-30 razy), a następnie komórki filtruje się przez sito komórkowe 40 μM (BD Falcon 352340), aby uzyskać zawiesinę pojedynczych lub prawie pojedynczych komórek.</li>
<li>Zawiesinę komórkową wiruje się przy 200 rpm w temperaturze pokojowej przez 5 min, osad komórkowy resuspenduje w 10 ml świeżego, ciepłego medium hodowlanego (Stem Pro NSC SFM), a liczbę komórek ocenia się za pomocą hemocytometru.</li>
<li>Do każdej kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm2 dodaje się 5 ml ciepłego medium hodowlanego i przenosi 2X106 komórek do każdej kolby. Hodowle utrzymuje się w inkubatorze 37°C/5% CO2 przez 1 tydzień przed analizą. Połowę medium wymienia się raz w tygodniu w przypadku dalszych hodowli lub eksperymentów.</li> 
</ol>
3. Manipulacja komórkami macierzystymi neuronów w celu ich dalszej charakterystyki lub przeprowadzenia eksperymentów
<ol>
	<li>Neurosfery zazwyczaj tworzą się w ciągu 1 do 2 tygodni w zalecanych warunkach hodowli, a średnica NSC waha się od 20 do 40 μm. Neurosfery na tym etapie można dysocjować za pomocą 0,2 g/L EDTA w pożywce Hanksa wolnej od wapnia i magnezu (Hanks) w temperaturze 37°C przez 15 min w celu uzyskania pojedynczych komórek. Zawiesinę komórkową wiruje się z prędkością 20 rpm, płucze w świeżej pożywce Hanks i ponownie wysiewa w ciepłym medium hodowlanym do subkultury.</li> 
<li>Aby zainicjować różnicowanie, zdysocjowane komórki wysiewa się na szkiełka cover-slip powlekane poli-D-lizyną/lamininą 1 z gęstością 1X105 komórek na szkiełko (24mmX24mm). Różnicowanie w kierunku oligodendrocytów osiąga się poprzez utrzymywanie komórek w KNOCKOUT DMEM/F12 (Invitrogen, Main, MD)+2% B27(50X, Invitrogen, Main, MD)+10ng/ml bFGF+10ng/ml SHH+ 10ng/ml PDGF-AA przez 2 dni, a następnie zmianę na to samo medium bez czynników wzrostu na kolejne 5 dni. Różnicowanie w kierunku neuronów osiąga się poprzez utrzymywanie komórek w KNOCKOUT DMEM/F12 +2% B27 (50X) przez 7 dni. Różnicowanie w kierunku astrocytów przeprowadza się poprzez hodowlę komórek w KNOCKOUT DMEM/F12 +1%FBS przez tydzień.</li>
<li>Transfekcja genów do komórek macierzystych neuronów może być przeprowadzona na zdysocjowanych komórkach z uprzednio utworzonych neurosfer. W tym przypadku przedstawiono komórki macierzyste neuronów transfekowane EGFP-C1 metodą elektroporacji. Elektroporacja konstruktu EGFP-C1 została przeprowadzona przy użyciu zestawów AMAXA Nucleofector Kits for Mouse Neural Stem Cells (VPG-104) z urządzeniem AMAXA Nucleofector (Lonza AAD-101), zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, 5 μg DNA oraz 1 X 106 komórek zmieszano ze 100 μl medium do transfekcji, a po impulsowej elektroporacji komórki resuspendowano w medium do utrzymania komórek macierzystych neuronów do dalszej hodowli. Różnicowanie transfekowanych komórek przeprowadzano poprzez dysocjację neurosfer 3-4 dni po elektroporacji, stosując te same procedury opisane w kroku 3.2.</li>
</ol>
4. Zamrażanie neuronalnych komórek macierzystych i subkultur
<ol>
<li>Rozdzielone zawiesiny komórek odwirowuje się i resuspenderuje w medium do mrożenia, osiągając stężenie 1X107 cells/vial/ml. Komórki powoli zamraża się w temperaturze -20°C, następnie w -80°C, a potem przenosi do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania.</li>
<li>Komórki szybko rozmraża się w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i resuspenderuje w ogrzanym DMEM/F12+10% serum w celu przemycia, po czym odwirowuje, aby usunąć medium do mrożenia, i resuspenderuje w ogrzanym medium hodowlanym.</li> 
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Neuralne komórki macierzyste pochodzące z prawidłowego płodu w 18. tygodniu wieku ciążowego hodowano zgodnie z opisanymi metodami; po tygodniu widoczne są neurosfery o okrągłych, gładkich krawędziach i dość jednorodnej wielkości (Ryc. 2A). Neurosfery te można transfekować EGFP-C1 lub innymi konstruktami i obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym (Ryc. 2B). Uformowane neurosfery dysocjowano następnie za pomocą EDTA i wysiano w formie pojedynczych komórek na powlekane szkiełka cover-slip. Komórki różnicowane zgodnie z odpowiednimi protokołami utrwalono 4% paraformaldehydem i barwiono markerami specyficznymi dla różnych typów komórek. Multipotencjalność zaobserwowano poprzez ekspresję markerów wskazujących na neurony (Ryc. 2C, D, rodamina), astrocyty (Ryc. 2E, F, rodamina) oraz oligodendrocyty (Ryc. 2G, H, rodamina). Komórki, które nie zostały poddane elektroporacji EGFP, również zróżnicowano na różne typy komórek i zabarwiono markerami specyficznymi dla poszczególnych komórek. Multipotencjalność zaobserwowano poprzez ekspresję markerów wskazujących na neurony (Ryc. 3A, B, fluoresceina), astrocyty (Ryc. 3C, rodamina oraz Ryc. 3D, fluoresceina) i oligodendrocyty (Ryc. 3E, F, rodamina).
<img src="/files/ftp_upload/2681/2681fig1.jpg" alt="Schemat hodowli neurosfer; wycinek kory mózgu, dysocjacja komórek, charakterystyka NSC, proces pasażowania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat procedury eksperymentalnej izolacji komórek macierzystych mózgu z odrzuconego ludzkiego płodu
<img src="/files/ftp_upload/2681/2681fig2.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe różnicowania komórek macierzystych; znakowanie GFP; obejmuje markery MAP2, DCX, GFAP, S10B, O1, O4." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Propagacja niezróżnicowanych i zróżnicowanych ludzkich komórek neuronalnych in vitro(A) Neurosfery ukazane w mikroskopii kontrastowej wykazują gładkie, okrągłe krawędzie i szybki wzrost po ponad tygodniowej hodowli. (B) Wprowadzanie różnych plazmidów i konstruktów można osiągnąć poprzez transfekcję. Trzy dni po transfekcji EGFP-C1 w wielu komórkach widoczna jest ekspresja zielonego białka fluorescencyjnego, co ukazano w immunobarwieniu fluoresceiną oraz w mikroskopii fluorescencyjnej. Transfekowane EGFP-C1 neurosfery poddano dysocjacji i różnicowaniu w różnych warunkach w kierunku neuronów (C, D), astrocytów (E, F) i oligodendrocytów (G, H), co ukazano w fluorescencji rodaminowej. Równocześnie transfectionarne komórki EGFP-dodatnie ukazano w fluorescencji fluoresceiny. Komórki transfekowane (białe groty strzałek) są nieodróżnialne od komórek nietransfekowanych (białe strzałki). Jądra komórkowe zabarwiono Hoechst342. Paski skali wynoszą 200 μm dla A, 100 μm dla B i 25 μm dla C-H.
<img src="/files/ftp_upload/2681/2681fig3.jpg" alt="Ekspresja markerów komórek neuronalnych, obrazy immunofluorescencyjne; analiza MAP2, DCX, GFAP, S10B, O1, O4." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Neurosfery bez transfekcji zostają rozproszone i poddane różnicowaniu w różnych warunkach w neurony (A, B, fluoresceina), astrocyty (C, rodamina, D, fluoresceina) oraz oligodendrocyty (E, F, rodamina). Jądra komórkowe wybarwiono barwnikiem Hoechst 342. Paski skali wynoszą 25 μm dla A-F.

<ol><li>Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+use+of+stem+cells+from+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS.</a> Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).</li>
<li>Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+properties+of+neural+stem+cell+clones%3A+plasticity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo.</a> Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).</li>
<li>Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O'Dowd, D., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
<li>Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+and+progenitor+cells%3A+in+vitro+and+in+vivo+properties%2C+and+potential+for+gene+therapy+and+cell+replacement+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).</li>
<li>Rajan, P., Snyder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+their+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and their manipulation.</a> Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).</li>
<li>Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+in+vitro+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cells as in vitro models of disease.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).</li>
<li>Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+proliferation+and+migration+in+human+Miller-Dieker+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors.</a> Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).</li>
<li>Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+target+genes+of+the+neuron-restrictive+silencer+factor+in+neurospheres+derived+from+fetuses+with+Down%27s+syndrome%3A+a+gene+expression+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down's syndrome: a gene expression study.</a> Lancet. 359, 310-315 (2002).</li>
<li>Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+neural+progenitors+along+the+ventricular+and+subventricular+zones+in+periventricular+heterotopia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia.</a> Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).</li>
<li>Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+functional+profiling+of+human+Down+syndrome+neural+progenitors+implicates+S100B+and+aquaporin+4+in+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury.</a> Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).</li>
<li>Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r, Sheen, V., Steardo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100B+induces+tau+protein+hyperphosphorylation+via+Dickopff-1+up-regulation+and+disrupts+the+Wnt+pathway+in+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells.</a> J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).</li>
<li>Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftable+human+neural+stem+cells+respond+to+developmental+cues%2C+replace+neurons%2C+and+express+foreign+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes.</a> Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).</li>
<li>Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+primitive+neuroectodermal+tumor+cell+line+from+the+cerebral+hemisphere%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).</li>
<li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+systems%3A+physiological+players+or+in+vitro+entities%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?</a> Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).</li>
<li>Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Istnieją różne podejścia do hodowli świeżej tkanki i wytwarzania ludzkich linii komórkowych. Historycznie świeżą tkankę pobierano i hodowano natychmiast w celu generowania różnych typów komórek ośrodkowego układu nerwowego. Podejście to jest jednak wyraźnie ograniczone liczbą próbek, które można uzyskać, a która w przypadku próbek ludzkich jest zazwyczaj niewielka. Ze względu na minimalny stopień manipulacji, świeżo hodowane komórki neuronalne stanowią najsolidniejszy system eksperymentalny, ograniczając potencjalne arte...

<table><tbody><tr><td>KNOCKOUT DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12660-012</td><td>Pożywka do dysocjacji</td></tr><tr><td>Stem Pro NSC SFM</td><td>Invitrogen</td><td>A10509-01</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodowa</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td>Pożywka do mrożenia</td></tr><tr><td>Roztwór Hanksa (-Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, -Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td>Pożywka do dysocjacji</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Pożywka do mrożenia</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>Pożywka do dysocjacji</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Roztwór utrwalający</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>234-FSE</td><td>Pożywka różnicująca</td></tr><tr><td>SHH</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1845-SH</td><td>Pożywka różnicująca</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>221-AA</td><td>Pożywka różnicująca</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Pożywka różnicująca</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2320</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało królicze anty-DCX</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4604s</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało królicze anty-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało królicze anty-S100B</td><td>Dako</td><td>Z0311</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało królicze anty-O1</td><td>dar profesora Timothy'ego Vartaniana*</td><td></td><td>1:50</td></tr><tr><td>Przeciwciało królicze anty-O4</td><td>Dar profesora Timothy'ego Vartaniana*</td><td></td><td>1:50</td></tr><tr><td>Sito komórkowe 40&amp;mu;m </td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Timothy Vartanian, MD, PhD, Katedra Neurologii i Neuronauk, Weill Cornell Medical College, Nowy Jork, USA</td></tr></tbody></table>

generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neuralne komórki macierzyste (NSCs) znajdują się wzdłuż neuroepithelium strefy komorowej podczas rozwoju blaszki korowej. Te wczesne progenitory dają ostatecznie początek progenitorom pośrednim, a później różnym podtypom komórek neuronalnych i glejowych, z których tworzy się kora mózgu. Zdolność do generowania i namnażania ludzkich NSCs (tzw. neurosfer) z odrzuconej normalnej tkanki płodowej umożliwia bezpośrednie badanie funkcjonalnych aspektów prawidłowego rozwoju ludzkich NSCs 1-5. Podejście to można również zastosować do generowania NSCs w przypadku znanych schorzeń neurologicznych, co stwarza możliwość zidentyfikowania procesów chorobowych zmieniających proliferację, migrację i różnicowanie progenitorów 6-9. Skupiliśmy się na identyfikacji mechanizmów patologicznych w ludzkich NSCs z zespołem Downa, które mogą przyczyniać się do przyspieszonego fenotypu choroby Alzheimera 10,11. Żadne modele mysie, ani in vivo, ani in vitro, nie są w stanie odtworzyć identycznego zestawu genów zlokalizowanych na ludzkim chromosomie 21.
W niniejszej pracy zastosowano prostą i niezawodną metodę izolacji NSC z kory płodów ludzkich z zespołem Downa oraz ich hodowli in vitro. Metodyka ta obejmuje szczegółowe aspekty pobierania tkanki, preparatyki przy ograniczonych punktach orientacyjnych anatomicznych, sortowania komórek, wysiewania i pasażowania ludzkich NSC. Przedstawiamy również podstawowe protokoły indukcji różnicowania ludzkich NSC w bardziej specyficzne podtypy komórek.

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Neuralne komórki macierzyste (NSCs) znajdują się wzdłuż neuroepitelium strefy komorowej podczas rozwoju płytki kory. Te wczesne komórki progenitorowe ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie ludzkich komórek macierzystych neuronów z odrzuconej tkanki kory czołowej. Osiąga się to poprzez wcześniejsze przygotowanie roztworów i materiałów przed przeprowadzeniem sekcji ludzkich mózgów płodowych. Następnie przechodzi się do hodowli wyizolowanych komórek macierzystych neuronów, obejmującej dalszą ekspansję, charakterystykę oraz eksperymenty.Możliwe jest długoterminowe przechowywanie, jak i tworzenie subkultur w celu różnicowania komórek progenitorowych w neuronalne i glejne typy komórek. Ostatecznie różnicowanie komórek z prawidłowego OUN może zostać scharakteryzowane i porównane z różnicowaniem komórek pochodzących z OUN z knowniymi zaburzeniami neurologicznymi. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę wszelkich zaburzeń OUN u ludzi.Technika ta zapewnia prostą i niezawodną platformę do oceny patologicznego S oraz do oceny skuteczności farmakologicznej nowych leków w danym schorzeniu. Ze względu na wyjątkową wartość komórek wielopotencjalnych, wszystkie materiały muszą być przygotowane przed rozpoczęciem protokołu. Aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia próbek, należy przygotować schłodzony zestaw do sekcji, kąpiel wodną z pożywką do hodowli ogrzaną do 37 °C oraz schłodzoną pożywkę do mrożenia komórek do długotrwałego przechowywania.Kriokonserwacja do sekcji; do dysocjacji komórek przygotować sterylne, autoklawowane pęsety oraz ostrza skalpela z uchwytami. Przygotować pistolet pipetujący, pipety transferowe 10 ml oraz sitko do komórek o rozmiarze 40 µm. Odstawić kilka 10 cm szalek hodowlanych do sekcji.Probówki do wirowania o pojemności 50 ml do dysocjacji. Probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml do przechowywania tkanek oraz krio-probówki do zamrażania komórek. Aby zapewnić sukces, żywa tkanka od osobników w wieku od 18 do 22 tygodni musi zostać pobrana w ciągu dwóch godzin od momentu jej udostępnienia.W idealnym przypadku tkankę płodową można pozyskać w ciągu kilku minut od momentu jej dostępności, ustalając odbiór po zabiegach planowych. Tkanki są często pofragmentowane, jednak znaczna część mózgu pozostaje nienaruszona. Pobierz mózg do 10 mililitrowej szalki Petriego wypełnionej lodowatym medium do sekcji.Zidentyfikuj poszczególne części kory, opierając się na punktach orientacyjnych anatomii. Granice kory czołowej, ciemieniowej i potylicznej wyznacza ekstrapolowane przecięcie bruzdy środkowej i szczeliny bocznej. Wyestrykuj tkankę z kory czołowej, znajdującą się przed bruzdą środkową i wzdłuż krawędzi szczeliny bocznej, używając skalpeli chirurgicznych.Należy upewnić się, że komora pozostaje nienaruszona i nieuszkodzona. Następnie należy usunąć pozostałości krwi oraz opon mózgowych z oddzielonego bloku kory przedczołowej. Jeśli próbka nie jest zbyt pofragmentowana i jest wystarczająco duża, należy podzielić blok na kilka mniejszych próbek, aby zachować część z nich do badań histologicznych oraz analiz białek lub mRNA.Następnie przenieś blok mózgu do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj trzykrotność objętości tkanki lodowatego medium do sekcji. Za pomocą pipety delikatnie rozdrabniaj tkankę, aż zostanie całkowicie pofragmentowana. Aby w pełni zawiesić komórki, przefiltruj je przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm.Następnie odwiruj zawiesinę komórkową i resuspender pellet komórek w 10 mililitrach świeżej, ogrzanej pożywki hodowlanej. Za pomocą hematocytometru policz liczbę komórek i oblicz objętość odpowiadającą 2 milionom komórek. Następnie przenieś objętość zawierającą 2 miliony komórek do kolby hodowlanej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych.Przygotowano z pięcioma mililitrami ciepłej pożywki hodowlanej. Komórki utrzymuj w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide przez jeden tydzień. W przypadku dłuższych hodowli wymieniaj połowę pożywki raz w tygodniu. Po jednym lub dwóch tygodniach hodowli zazwyczaj formują się neurosfery o średnicy NSC od 200 do 400 µm.W celu dysocjacji neurosfer do pojedynczych komórek inkubuj komórki z EDTA w podłożu Hank'a przez 15 minut. Aby przygotować zawiesinę komórek do pasażowania, odwiruj je, przemyj podłożem Hank'a i przenieś komórki do ogrzanego podłoża hodowlanego.Aby rozpocząć różnicowanie, wysiej zdysocjowane komórki na szkiełka nakrywkowe powlekane polilizyną oraz lamininą 1 z gęstością 100 000 komórek na szkiełko i inkubuj przez 30 minut. Komórki te mogą być łatwo różnicowane w oligodendrocyte, neurony lub astrocyty.W celu różnicowania neuronów należy utrzymywać komórki w pożywce z dodatkiem B 27 przez siedem dni. W przypadku różnicowania astrocytów komórki należy hodować w pożywce z FBS przez siedem dni. W celu różnicowania oligodendrocytów należy utrzymywać komórki w zmodyfikowanej pożywce z czynnikami wzrostu przez dwa dni, a następnie przez kolejne pięć dni stosować tę samą zmodyfikowaną pożywkę bez czynników wzrostu w celu przechowywania komórek macierzystych.Po odwirowaniu zawiesin rozproszonych komórek, ponownie zawieś komórki w medium do mrożenia w stężeniu 10 milionów komórek na fiolkę. Na mililitr, powoli zamrażaj komórki w temperaturze -20 °C, a następnie zamrażaj je w temperaturze -80 °C w celu długoterminowego przechowywania. Przenieś je do ciekłego azotu.Następnie komórki są szybko rozmrażane w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i resuspenderowane. W celu przemycia stosuje się ogrzane medium D-M-E-M-F 12 z dodatkiem 10% serum. Ogrzane komórki są następnie wirowane, aspirowane i resuspenderowane w ogrzanym medium hodowlanym.Neuralne komórki macierzyste pochodzące z normalnego płodu. W 18. tygodniu wieku ciążowego hodowano je w celu utworzenia neurosfer, które następnie przetransfekowano GFP. Neurosfery poddano różnicowaniu, aby uzyskać kilka typów komórek, które następnie utrwalono i zabarwiono markerami komórkowymi oraz rumiąrem.Wielopotencjalność obserwuje się poprzez ekspresję markerów charakterystycznych dla neuronów, astrocytów i oligodendrocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat izolacji, namnażania i manipulacji ludzkimi neuro幹stymiennymi komórkami z odrzuconej tkanki kory czołowej. Regiony te dają wyjątkową możliwość badania mechanizmów chorobowych w ludzkim środowisku korowym oraz testowania potencjalnej skuteczności środków farmakoterapeutycznych.

generation-neural-stem-cells-from-discarded-human-fetal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Generowanie komórek macierzystych nerwowych z odrzuconego ludzkiego płodowego tkanki korowej mózgu

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Ten film demonstruje metodę różnicowania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z neurosfer na progenitory neuronalne i astrocyty za pomocą leczenia enzymatycznego i hodowli w pożywce bogatej w czynniki wzrostu, co ostatecznie prowadzi do dojrzewania do wyspecjalizowanych komórek progenitorowych.

Różnicowanie ludzkich nerwowych komórek macierzystych w progenitory neuronów i astrocytów

Ten film opisuje metodę przygotowania szklanych szkiełek nakrywkowych pokrytych poliornityną i lamininą w celu zwiększenia adhezji i wzrostu nerwowych komórek macierzystych. Technika ta obejmuje sekwencyjne inkubacje i płukanie, ułatwiając tworzenie macierzy podporowej, która wspomaga wzrost i różnicowanie komórek neuronalnych, naśladując struktury znajdujące się w neuronach.

Generowanie neuronów piramidowych korowych z ludzkich nerwowych komórek macierzystych

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Ten protokół opisuje nowatorską metodę mechanicznego siekania, która pozwala na ekspansję sferycznych agregatów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych bez dysocjacji do zawieszenia pojedynczej komórki. Utrzymanie kontaktu komórka/komórka pozwala na szybki i stabilny wzrost przez ponad 40 przejść.

Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Rdzeń kręgowy dorosłego ssaka zawiera nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe (NSPC), które mogą być izolowane i rozwijane w hodowli. Protokół ten opisuje pobieranie, izolację, hodowlę i pasażowanie NSPC generowanych z obszaru okołokomorowego dorosłego rdzenia kręgowego od szczura i od dawców narządów po przeszczepie.

Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Prezentujemy metodę bez modyfikacji genetycznie (GMO) do uzyskania komórek z fenotypem neuronalnym z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej. Aktywacja szlaku sygnałowego powiązanego z nowym ludzkim białkiem połączonym z GPI ujawnia skuteczną, wolną od GMO metodę pozyskiwania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez GMO

Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych z ludzkiej tkanki korowej płodu. Technika umożliwia hodowlę, różnicowanie i testowanie farmakologiczne w badaniach nad chorobami układu nerwowego.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Przeglądaj więcej filmów