Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie ludzkich komórek macierzystych neuronów z odrzuconej tkanki kory czołowej. Osiąga się to poprzez wcześniejsze przygotowanie roztworów i materiałów przed przeprowadzeniem sekcji ludzkich mózgów płodowych. Następnie przechodzi się do hodowli wyizolowanych komórek macierzystych neuronów, obejmującej dalszą ekspansję, charakterystykę oraz eksperymenty.

Możliwe jest długoterminowe przechowywanie, jak i tworzenie subkultur w celu różnicowania komórek progenitorowych w neuronalne i glejne typy komórek. Ostatecznie różnicowanie komórek z prawidłowego OUN może zostać scharakteryzowane i porównane z różnicowaniem komórek pochodzących z OUN z knowniymi zaburzeniami neurologicznymi. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę wszelkich zaburzeń OUN u ludzi.

Technika ta zapewnia prostą i niezawodną platformę do oceny patologicznego S oraz do oceny skuteczności farmakologicznej nowych leków w danym schorzeniu. Ze względu na wyjątkową wartość komórek wielopotencjalnych, wszystkie materiały muszą być przygotowane przed rozpoczęciem protokołu. Aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia próbek, należy przygotować schłodzony zestaw do sekcji, kąpiel wodną z pożywką do hodowli ogrzaną do 37 °C oraz schłodzoną pożywkę do mrożenia komórek do długotrwałego przechowywania.

Kriokonserwacja do sekcji; do dysocjacji komórek przygotować sterylne, autoklawowane pęsety oraz ostrza skalpela z uchwytami. Przygotować pistolet pipetujący, pipety transferowe 10 ml oraz sitko do komórek o rozmiarze 40 µm. Odstawić kilka 10 cm szalek hodowlanych do sekcji.

Probówki do wirowania o pojemności 50 ml do dysocjacji. Probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml do przechowywania tkanek oraz krio-probówki do zamrażania komórek. Aby zapewnić sukces, żywa tkanka od osobników w wieku od 18 do 22 tygodni musi zostać pobrana w ciągu dwóch godzin od momentu jej udostępnienia.

W idealnym przypadku tkankę płodową można pozyskać w ciągu kilku minut od momentu jej dostępności, ustalając odbiór po zabiegach planowych. Tkanki są często pofragmentowane, jednak znaczna część mózgu pozostaje nienaruszona. Pobierz mózg do 10 mililitrowej szalki Petriego wypełnionej lodowatym medium do sekcji.

Zidentyfikuj poszczególne części kory, opierając się na punktach orientacyjnych anatomii. Granice kory czołowej, ciemieniowej i potylicznej wyznacza ekstrapolowane przecięcie bruzdy środkowej i szczeliny bocznej. Wyestrykuj tkankę z kory czołowej, znajdującą się przed bruzdą środkową i wzdłuż krawędzi szczeliny bocznej, używając skalpeli chirurgicznych.

Należy upewnić się, że komora pozostaje nienaruszona i nieuszkodzona. Następnie należy usunąć pozostałości krwi oraz opon mózgowych z oddzielonego bloku kory przedczołowej. Jeśli próbka nie jest zbyt pofragmentowana i jest wystarczająco duża, należy podzielić blok na kilka mniejszych próbek, aby zachować część z nich do badań histologicznych oraz analiz białek lub mRNA.

Następnie przenieś blok mózgu do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj trzykrotność objętości tkanki lodowatego medium do sekcji. Za pomocą pipety delikatnie rozdrabniaj tkankę, aż zostanie całkowicie pofragmentowana. Aby w pełni zawiesić komórki, przefiltruj je przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm.

Następnie odwiruj zawiesinę komórkową i resuspender pellet komórek w 10 mililitrach świeżej, ogrzanej pożywki hodowlanej. Za pomocą hematocytometru policz liczbę komórek i oblicz objętość odpowiadającą 2 milionom komórek. Następnie przenieś objętość zawierającą 2 miliony komórek do kolby hodowlanej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych.

Przygotowano z pięcioma mililitrami ciepłej pożywki hodowlanej. Komórki utrzymuj w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide przez jeden tydzień. W przypadku dłuższych hodowli wymieniaj połowę pożywki raz w tygodniu. Po jednym lub dwóch tygodniach hodowli zazwyczaj formują się neurosfery o średnicy NSC od 200 do 400 µm.

W celu dysocjacji neurosfer do pojedynczych komórek inkubuj komórki z EDTA w podłożu Hank'a przez 15 minut. Aby przygotować zawiesinę komórek do pasażowania, odwiruj je, przemyj podłożem Hank'a i przenieś komórki do ogrzanego podłoża hodowlanego.

Aby rozpocząć różnicowanie, wysiej zdysocjowane komórki na szkiełka nakrywkowe powlekane polilizyną oraz lamininą 1 z gęstością 100 000 komórek na szkiełko i inkubuj przez 30 minut. Komórki te mogą być łatwo różnicowane w oligodendrocyte, neurony lub astrocyty.

W celu różnicowania neuronów należy utrzymywać komórki w pożywce z dodatkiem B 27 przez siedem dni. W przypadku różnicowania astrocytów komórki należy hodować w pożywce z FBS przez siedem dni. W celu różnicowania oligodendrocytów należy utrzymywać komórki w zmodyfikowanej pożywce z czynnikami wzrostu przez dwa dni, a następnie przez kolejne pięć dni stosować tę samą zmodyfikowaną pożywkę bez czynników wzrostu w celu przechowywania komórek macierzystych.

Po odwirowaniu zawiesin rozproszonych komórek, ponownie zawieś komórki w medium do mrożenia w stężeniu 10 milionów komórek na fiolkę. Na mililitr, powoli zamrażaj komórki w temperaturze -20 °C, a następnie zamrażaj je w temperaturze -80 °C w celu długoterminowego przechowywania. Przenieś je do ciekłego azotu.

Następnie komórki są szybko rozmrażane w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i resuspenderowane. W celu przemycia stosuje się ogrzane medium D-M-E-M-F 12 z dodatkiem 10% serum. Ogrzane komórki są następnie wirowane, aspirowane i resuspenderowane w ogrzanym medium hodowlanym.

Neuralne komórki macierzyste pochodzące z normalnego płodu. W 18. tygodniu wieku ciążowego hodowano je w celu utworzenia neurosfer, które następnie przetransfekowano GFP. Neurosfery poddano różnicowaniu, aby uzyskać kilka typów komórek, które następnie utrwalono i zabarwiono markerami komórkowymi oraz rumiąrem.

Wielopotencjalność obserwuje się poprzez ekspresję markerów charakterystycznych dla neuronów, astrocytów i oligodendrocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat izolacji, namnażania i manipulacji ludzkimi neuro幹stymiennymi komórkami z odrzuconej tkanki kory czołowej. Regiony te dają wyjątkową możliwość badania mechanizmów chorobowych w ludzkim środowisku korowym oraz testowania potencjalnej skuteczności środków farmakoterapeutycznych.