Detekcja kolorymetryczna ampliPHOX w mikromacierzy DNA w kierunku grypy
9 czerwca 2011
ampliPHOX technologia detekcji kolorymetrycznej jest przedstawiona jako tania alternatywa dla detekcji fluorescencji dla mikromacierzy. Opierając się na fotopolimeryzacji, ampliPHOX wytwarza stałe plamki polimerowe widoczne gołym okiem w ciągu zaledwie kilku minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, ale wydajnego pakietu oprogramowania.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie nowej i szybkiej metody wzmacniania sygnału do wykrywania i charakteryzowania podtypów wirusa grypy na chipie grypy, platformie mikromacierzy o niskiej gęstości. Osiąga się to poprzez włączenie biotynylowanych DTP i użycie starterów z pięcioma głównymi końcami fosfoliowymi do amplifikacji segmentu genu macierzy i niestrukturalnego segmentu genu z ekstraktów RNA grypy. Po PCR następuje trawienie enzymatyczne i fragmentacja w celu wytworzenia krótkiego, jednoniciowego, biotynylowanego i amplifikowanego produktu wirusowego, który jest następnie hybrydyzowany z macierzą po hybrydyzacji.
Wykrywanie lisów wykorzystuje fotopolimeryzację do wyhodowania dużych plam polimerowych, w których zachodzi hybrydyzacja, a zróżnicowane wzorce hybrydyzacji są wykorzystywane do wykrywania podtypów wirusa grypy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowa detekcja fluorescencji, jest to, że jest raczej niedroga i zapewnia szybki wynik widoczny gołym okiem z podobną czułością analityczną do fluorescencji. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w charakterystykę wirusów grypy za pomocą chipa grypy, ponieważ jest to uniwersalna metoda wykrywania.
Ampl Fox może być również stosowany do wielu innych systemów, takich jak inne mikromacierze o niskiej gęstości oparte na DNA i białkach. Teoretycznie każdy produkt biotynylowany powinien być w stanie wykryć za pomocą amoxu. Procedurę zademonstrują Amber Taylor, naukowiec współpracujący, i Kevin Moulton, asystent naukowy w Endeavour, którzy odegrali kluczową rolę w rozwoju instrumentu Fox i chemii detekcji w ciągu ostatnich kilku lat.
Ekstrakcja wirusowego RNA z 200 mikrolitrów izolatu wirusa za pomocą zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA i protokołu producenta. Eluować 60 mikrolitrów końcowej objętości i przechowywać ekstrakty w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza lub niższej do późniejszego wykorzystania. Następnie przygotuj mieszankę główną R-T-P-C-R na ICE zgodnie z protokołem producenta.
Używając BIOTYNYLOWANEJ mieszaniny DNTP, dodaj mieszankę starterów do chipsów grypy, która zawiera stężenia pokazane w mieszance wzorcowej. Jeden starter z każdego zestawu powinien zawierać pięć głównych grup fosfoliowych, aby ułatwić trawienie enzymatyczne. Zestaw starterów przeciw grypie wytwarza produkt składający się z pary zasad 1032, a zestaw starterów grypy B wytwarza produkt z parą zasad 811.
Krótko zwirować i rozprowadzić 18 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do cienkościennych probówek PCR. Następnie dodaj dwa mikrolitry matrycy RNA do każdej probówki reakcyjnej. Przenieś probówki PCR do termocyklera i użyj profilu cyklicznego z odpowiednią temperaturą klęczenia.
Profil rowerowy zastosowany w tym teście przedstawiono tutaj. Przygotować mieszaninę do trawienia enzymatycznego, łącząc 2,2 mikrolitra buforu reakcji enzymatycznej, 0,8 mikrolitra wody wolnej od nukleaz i 1,0 mikrolitra enzymu egzonukleazy lambda na reakcję PCR. Wyjmij próbki z termocyklera i dodaj cztery mikrolitry do każdej probówki PCR.
Zwróć próbki do termocyklera i zaprogramuj termocykler zgodnie z ilustracją na 37 stopni Celsjusza na 15 minut, a następnie 95 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie zastosuj jednorazowe studzienki hybrydyzacyjne wokół mikromacierzy, które mają być zhybrydyzowane. Następnie umyj szkiełka w 110 mililitrach oczyszczonej wody na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut.
Osusz szkiełka, delikatnie dotykając chusteczką chusteczkę do krawędzi studzienki. Połączyć 22 mikrolitry dwóch x buforu hybrydyzacyjnego z każdym z rozdrobnionych produktów DNA jednoniciowego krótko zmieszanych i pipetować 40 mikrolitrów do dołków mikromacierzy. Po hybrydyzacji pozostawić szkiełka do hybrydyzacji przez godzinę w komorze wilgotnościowej, wyjąć szkiełka z komory wilgotnościowej i krótko przepłukać każde szkiełko dwoma mililitrami buforu do przemywania D. Umieść szkiełka w stojaku na szkiełka.
Następnie dodaj 110 mililitrów płuczących A i B do oddzielnych pojemników za pomocą wytrząsarki orbitalnej. Umyj ruszt szkiełkowy w buforze A z prędkością od 60 do 90 obr./min, przy prędkości używanej do wszystkich kolejnych myć przez jedną minutę. Następnie wyjąć ruszt szkiełkowy z buforu płuczącego A i krótko spłukać buforem do płukania D. Przenieść ruszt do szkiełka do płukania buforu B i myć na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut.
Po umyciu delikatnie osusz matryce na każdym szkiełku chusteczką i umieść wysuszone szkiełka w komorze wilgotnościowej. Przygotowując się do etapów wykrywania metrycznego fox color, połącz 10 mikrolitrów amplitudy, 20 mikrolitrów dwóch o amplitudzie x i 10 mikrolitrów oczyszczonej wody dla każdej matrycy, która ma być przetworzona, przenieś 40 mikrolitrów mieszaniny etykiet do każdej tablicy i pozwól, aby reakcja etykietowania przebiegała w zamkniętej komorze wilgotności Przez pięć minut Podczas hybrydyzacji, przygotować 110 mililitrów buforu do mycia C w pojemniku. Po oznakowaniu natychmiast przepłukać każdą matrycę buforem do przemywania D. Umieścić każde szkiełko w stojaku na szkiełka i umyć i umyć bufor C na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut po płukaniu morza buforem, krótko zanurzyć stojak na szkiełka trzy razy w pojemniku z oczyszczoną wodą.
Aby usunąć pozostałości soli, wysusz tablice, jak pokazano wcześniej. Przechowuj tablice w ciemnym pudełku na slajdy do czasu aktywacji zdjęcia i obrazowania, które powinno zostać zakończone w ciągu 24 godzin. Następnie włącz czytnik Amli Fox i upewnij się, że oprogramowanie Amli view jest gotowe do aktywacji zdjęcia przed wykryciem próbki macierzy.
Najpierw określ optymalny czas aktywacji zdjęcia dla wszystkich próbek, postępując zgodnie z krótką procedurą kalibracji. Raz na dzień podgrzej roztwór Amplify do temperatury pokojowej i krótko odwiruj, aby odpipetować trzy mikrolitry wzmacniacza amplify z fiolką amplify i dokładnie odwirować. Przez 10 sekund równomiernie nanosić 40 mikrolitrów roztworu Amplify tylko na jedno szkiełko na raz, upewniając się, że nie ma pęcherzyków.
Włóż szkiełko mikromacierzy do wnęki aktywacji zdjęć czytnika Amplify. Aktywację fotograficzną należy rozpocząć od wybrania, uruchomienia w oprogramowaniu PL view korzystając z czasu aktywacji zdjęcia określonego w procesie kalibracji. Po zakończeniu przepłucz mikromacierz dwoma mililitrami oczyszczonej wody, aby usunąć nadmiar, amplifikacja klarownego polimeru powstała teraz w miejscach zawierających docelowe DNA, ale jest lepiej uwidoczniona.
Po zabarwieniu pozostaw plamy polimerowe do wyschnięcia na dwie minuty. Następnie rozprowadź dwie krople obficie czerwonej czerwieni na matrycy i pozwól, aby barwienie postępowało przez dwie minuty Po barwieniu szybko spłucz szkiełko oczyszczoną wodą i wysusz, jak pokazano wcześniej, włóż szkiełko do wnęki obrazowania czytnika Amli Fox, aby zebrać obraz za pomocą oprogramowania amli do przetwarzania wyników. Zdjęcie po lewej pokazuje wykrycie nowego okazu H one N One z 2009 roku przez Amli Fox.
Podczas gdy obraz po prawej wykorzystuje tradycyjną fluorescencję generowaną przez konfokalny skaner fluorescencyjny z mikromatrycą, ten sam ogólny wzorzec detekcji można łatwo zobaczyć dla obu metod. Jednak wynik lisa Amli jest widoczny gołym okiem. Obrazy te pokazują wyniki chipa grypy pochodzenia ludzkiego, H trzy N dwa pochodzenia ludzkiego, H jednego N jednego, pochodzącego od świń, H jednego N i ujemnej matrycy lisów bez wykrywalnej grypy.
Sekwencje druga i trzecia zaznaczone na niebiesko dają sygnał dla całej grypy. Pokazano podtypy, ale sekwencje zaznaczone na czerwono w prawym dolnym rogu dają sygnał tylko dla pochodzenia trzody chlewnej, H jeden N jeden okaz. Próbka ujemna pokazuje sygnał w wewnętrznej sekwencji kontrolnej zaznaczonej na zielono, co wskazuje na brak zahamowania lub niepowodzenia reakcji R-T-P-C-R.
Po opanowaniu cały proces, od ekstrakcji fiolki, poprzez wykrywanie amox, i interpretację wyniku końcowego, można przeprowadzić w ciągu około sześciu godzin. Część procedury wykrywania Ampl Fox, w tym kalibracja przyrządu, może zostać zakończona w ciągu około 30 minut Po tej procedurze. Inne metody, takie jak częściowe lub pełne sekwencjonowanie genomu, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania.
Ten test grypy ma służyć jako wstępne badanie przesiewowe, szczególnie w przypadku próbek, które skutkują unikalnym wzorcem hybrydyzacji. Ponieważ detekcja jest testem ogólnym, mamy nadzieję, że naukowcy znajdą nowe i interesujące zastosowania mikromacierzy o niskiej gęstości, dla których detekcja może przynieść wartość dodaną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX stanowi przystępną cenowo alternatywę dla detekcji fluorescencyjnej w mikrotablicach. Metoda ta wykorzystuje fotopolimeryzację do tworzenia widocznych plamek polimerowych w ciągu kilku minut, co umożliwia szybką analizę podtypów wirusa grypy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Technologia mikromacierzy
- Wykrywanie wirusów
- Metody amplifikacji sygnału
Wstęp
- Wirusy grypy stanowią istotny problem w zakresie zdrowia publicznego.
- Tradycyjne metody detekcji mogą być kosztowne i czasochłonne.
- Detekcja kolorymetryczna oferuje szybką i widoczną alternatywę.
- Fotopolimeryzacja umożliwia szybką wizualizację wyników.
Cel badania
- Opracowanie metody szybkiej amplifikacji sygnału do wykrywania wirusa grypy.
- Charakterystyka podtypów wirusa grypy z wykorzystaniem platformy niskogęstościowych mikromacierzy.
- Zapewnienie niedrogiej i wydajnej alternatywy dla detekcji fluorescencyjnej.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie biotynylowanych DTP oraz specyficznych starterów do amplifikacji.
- Reakcja PCR, po której następuje trawienie enzymatyczne i fragmentacja ekstraktów RNA.
- Hybrydyzacja produktów amplifikacji z mikroarrayem.
- Detekcja poprzez fotopolimeryzację w celu wizualizacji wyników hybrydyzacji.
Główne wyniki
- Pomyślna amplifikacja i detekcja subtypów wirusa grypy.
- Widoczne plamki polimerowe utworzone w miejscach hybrydyzacji.
- Wyniki o czułości porównywalnej z tradycyjnymi metodami fluorescencyjnymi.
- Szybka analiza przeprowadzona w ciągu kilku minut.
Wnioski
- Technologia AmpliPHOX zapewnia kosztowo efektywne rozwiązanie w zakresie detekcji wirusów.
- Metoda ta zwiększa szybkość i dostępność charakterystyki wirusa grypy.
- Potencjał do szerszego zastosowania w różnych scenariuszach detekcji wirusów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Kolorymetryczna detekcja AmpliPHOX stanowi kosztowo efektywną alternatywę dla analizy mikromacierzy opartej na fluorescencji w celu charakterystyzacji podtypów wirusa grypy. Dzięki umożliwieniu szybkiego uzyskania wyników widocznych gołym okiem przy czułości porównywalnej z fluorescencją, rozwiązanie to wspiera procesy wczesnego wykrywania, w których szybkość i dostępność wpływają na decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań. Technologia ta obniża koszty instrumentacji i zwiększa mobilność, czyniąc analizy mikromacierzy bardziej praktycznymi w środowiskach badawczo-rozwojowych o ograniczonych zasobach lub w systemach zdecentralizowanych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celów
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez specyficzne wzorce hybrydyzacji na mikrotablicach o niskiej gęstości w celu rozróżnienia subtypów wirusa grypy.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego, zapewniając szybkie wizualne potwierdzenie obecności celu bez konieczności stosowania kosztownego sprzętu obrazującego.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez generowanie biotynylowanych amplikonów kompatybilnych z chemią detekcyjną ampliPHOX.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testu dzięki zdefiniowanemu czasowi fotoaktywacji oraz etapom barwienia polimerów, co pozwala na uzyskanie spójnych wyników wizualnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla przebiegu chorób, umożliwiając wykrywanie podtypów grypy z różnych źródeł (ludzkich, świńskich) w celu mechanistycznego ograniczania ryzyka związanego z kandydatami na leki przeciwwirusowe.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej dzięki przenośnej platformie detekcyjnej, którą można wykorzystać w różnych warunkach laboratoryjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda detekcji ampliPHOX wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, w szczególności wspierając działania w zakresie identyfikacji wiodących cząsteczek, w których szybki screening fenotypowy lub genotypowy pozwala na priorytetyzację związków.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez wykrywanie specyficznych segmentów genów grypy (macierzy i niestrukturalnych) za pomocą hybrydyzacji biotynylowanych celów.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy i wyniki gotowe do kwantyfikacji dzięki zdefiniowanym etapom hybrydyzacji i fotoaktywacji, które prowadzą do powstania mierzalnych plamek polimeru.
- Analityka: Generuje odczyty wizualne umożliwiające analizę porównawczą wzorów hybrydyzacji pomiędzy różnymi podtypami, co wspiera porównania warunków w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając specyficzne dla podtypu wykrywanie istotne dla badań nad skutecznością szczepionek i terapii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotna możliwość detekcji, którą można zastosować do każdego biotynylowanego celu na mikromacierzyach o niskiej gęstości, rozszerzając użyteczność poza grypę na inne systemy wykrywania patogenów lub białek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność predykcyjną w walidacji celu dzięki specyficznym, wizualnie rozróżnialnym wzorcom hybrydyzacji, które redukują niejednoznaczność mechanistyczną w identyfikacji podtypów wirusów.
- Wartość operacyjna: Oferuje standaryzację, powtarzalność i skalowalność dzięki określonym objętościom odczynników, kontroli czasu oraz kompaktowemu urządzeniu odczytującemu, odpowiedniemu do przetwarzania seryjnego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez skrócenie czasu uzyskania wyniku z godzin do mniej niż 30 minut w etapach detekcji, co obniża koszt utraconych możliwości w kampaniach przesiewowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie wczesnych, dostępnych danych o obecności podtypów wirusów, co pozwala na dalszy rozwój kandydatów z potwierdzonym mechanizmem działania.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości w technikach biologii molekularnej, w tym w protokołach RT-PCR, trawienia enzymatycznego i hybrydyzacji.
- Zależne od dostępu do urządzenia ampliPHOX Reader, koniugatu znaczników ampliTAG, roztworu monomeru ampliPHY oraz oprogramowania ampliVIEW do przechwytywania i analizy obrazów.
- Wymaga standaryzacji kalibracji fotoaktywacji i procedur barwienia pomiędzy zespołami, aby zapewnić spójność wyników u różnych użytkowników i w różnych ośrodkach.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania projektu macierzy, ponieważ gęstość plamek musi pozostać poniżej ~1800 spots/array, aby uwzględnić granice detekcji opartej na polimeryzacji.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak niekompatybilność z macierzami o wysokiej gęstości oraz mniejsza liniowość w porównaniu z fluorescencją, co sprawia, że metoda ta jest najlepiej dopasowana do jakościowych lub półilościowych zastosowań w detekcji patogenów.
