Name: Detekcja kolorymetryczna ampliPHOX w mikromacierzy DNA w kierunku grypy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę ampliPHOX do szybkiej detekcji wirusów grypy za pomocą mikromacierzy DNA. Ta technologia kolorymetryczna wykorzystuje fotopolimeryzację do tworzenia widocznych plam polimerowych w ciągu minut, oferując tanie i efektywne rozwiązanie alternatywne do fluorescencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

InDevR pragnie podziękować NIH/NIAID za sfinansowanie tych badań w ramach grantów U01AI070276 oraz R43AI077112.

1. Amplifikacja próbek metodą RT-PCR
<ol>
<li>Wyodrębnij wirusowe RNA z materiału klinicznego lub izolatu wirusa, używając zestawu Qiagen MinElute Virus Spin Kit wraz z zautomatyzowaną platformą do ekstrakcji kwasów nukleinowych QIAcube. Ekstrakcje przeprowadza się z 200 μl próbki przy końcowej objętości elucji wynoszącej 60 μl. Ekstrakty przechowuj w temperaturze -70°C lub niższej do późniejszego użycia.</li>
<li>W strefie wolnej od matrycy przygotuj na lodzie mieszaninę master mix do RT-PCR zgodnie z protokołem producenta. Aby wprowadzić biotynę podczas RT-PCR, użyj biotynilowanej mieszaniny dNTP zamiast mieszaniny dNTP dostarczonej przez producenta. Koszt zastosowania biotynilowanej mieszaniny dNTP jest niższy niż 1 USD/test. Można również stosować alternatywne metody wprowadzania biotyny, takie jak użycie biotynilowanej startera. Dodaj mieszaniny starterów w końcowych stężeniach 1,0 μM dla Flu A, 1,0 μM dla Flu B oraz 0,14 μM dla kontroli wewnętrznej. Zestaw starterów dla Flu A amplifikuje segment genu macierzy (produkt 1032 nt), a zestaw starterów dla Flu B amplifikuje niestrukturalny segment genu (produkt 811 nt). Każdy zestaw starterów FluChip zawiera jeden starter z grupą fosforanową na końcu 5', aby ułatwić generowanie jednoniciowego DNA poprzez trawienie enzymatyczne egzonukleazą lambda po PCR. Powstały produkt jednoniciowy wymaga znacznie krótszego czasu hybrydyzacji niż odpowiednik dwuniciowy, co znacząco skraca całkowity czas analizy. Przygotowana wcześniej mieszanina tych starterów, jak również matrycowe RNA kontroli wewnętrznej, są dostępne od InDevR dla zainteresowanych badaczy w ograniczonym zakresie.</li>
<li>Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex i rozdziel 18 μl master mixu do cienkościennych probówek PCR.</li>
<li>Przenieś probówki na lodzie do odpowiedniego obszaru roboczego w celu dodania matrycy, a następnie dodaj 2 μl matrycy do każdej probówki z reakcją.</li> 
<li>Przenieś probówki PCR do termocyklera i przeprowadź następujący profil termiczny: odwrotna transkrypcja w 50°C przez 30 min, inaktywacja/aktywacja enzymu w 95°C przez 15 min, 40 cykli PCR: 95°C przez 30 s, 55°C przez 30 s i 72°C przez 1 min oraz końcowa elongacja w 72°C przez 10 min.</li>
</ol>
2. Hybrydyzacja produktów RT-PCR z macierzami o niskiej gęstości
<ol>
<li>W celu wytworzenia jednoniciowego DNA do hybrydyzacji FluChip, przygotować mieszaninę do trawienia enzymatycznego, łącząc 1,0 μl enzymu egzonukleazy lambda, 2,2 μl dołączonego buforu reakcyjnego oraz 0,8 μl wody wolnej od nukleaz. Ilości te dotyczą jednej próbki, ale można je łatwo przeskalować dla całkowitej liczby próbek przeznaczonych do trawienia. Wyjąć próbki z termocyklera i dodać 4 μl przygotowanej mieszaniny do każdej reakcji, aby strawić fosforylowaną nić produktu PCR. Umieścić próbki z powrotem w termocyklerze i zaprogramować urządzenie na 37 °C przez 15 minut, a następnie na 95 °C przez 10 minut, aby zakończyć etapy trawienia enzymatycznego i fragmentacji termicznej.</li>
<li>Użyte niestandardowe mikromacierze grypy są naniesione na szklane slajdy funkcjonalizowane aldehydem przez firmę Applied Microarrays Inc. (Tempe, AZ). Sekwencje wychwytujące z końcem 5'-amino są łączone z zoptymalizowanym buforem do naniesienia i drukowane w końcowym stężeniu 20 μM (z wyjątkiem sekwencji kontroli pozytywnej, która posiada dodatkowo modyfikację 3'-biotyny i jest nanoszona w końcowym stężeniu 500 nM). Stosowana jest bezkontaktowa metoda naniesienia, z optymalną średnicą plamki 300 μm i rozstawem od środka do środka wynoszącym 700 μm.</li> 
<li>Wyjąć mikromacierze z pudełka do przechowywania i nałożyć jednorazowe studzienki do hybrydyzacji wokół mikromacierzy, zdejmując folię ochronną i mocno dociskając obwód studzienki.</li> 
<li>Umieścić slajdy w pojemniku do płukania zawierającym 110 ml oczyszczonej wody w celu przeprowadzenia 5-minutowego płukania przed hybrydyzacją przy użyciu wstrząsarki orbitalnej przy prędkości 60-90 rpm. Osuszyć macierz, delikatnie dotykając krawędzi studzienki chłonną chusteczką i pozwalając na odciągnięcie wody.</li>
<li>Połączyć 22 μl 2x Buforu do Hybrydyzacji z każdym z fragmentowanych produktów ssDNA, a następnie nanieść 40 μl roztworów do hybrydyzacji do studzienek mikromacierzy.</li>
<li>Pozostawić slajdy do hybrydyzacji w zamkniętej komorze wilgotnościowej przez 60 minut.</li> 
<li>Wyjąć slajdy z komory wilgotnościowej, krótko opłukać macierze Buforem do Płukania D za pomocą butelki z rozpylaczem przed umieszczeniem ich w statywie na slajdy. Zazwyczaj objętość płukania Buforem do Płukania D wynosi 2 ml na macierz. Umieścić statyw ze slajdami w pojemniku do płukania zawierającym 110 ml Buforu do Płukania A. Umieścić pojemnik na wstrząsarce orbitalnej przy prędkości 60-90 rpm przez 1 minutę.</li>
<li>Wyjąć statyw ze slajdami z Buforu do Płukania A, krótko opłukać Buforem do Płukania D, przenieść statyw do pojemnika zawierającego Bufor do Płukania B i wstrząsać przy prędkości 60-90 rpm przez 5 minut.</li>
<li>Delikatnie osuszyć macierz na każdym slajdzie i umieścić osuszone slajdy w komorze wilgotnościowej w przygotowaniu do etapów kolorymetrycznej detekcji ampliPHOX.</li>
</ol>
3. ampliPHOX: znakowanie produktów hybrydyzacji i chipów kalibracyjnych za pomocą ampliTAG
<ol>
<li>Dla każdego przetwarzanego macierzy połącz 10 μl ampliTAG, 20 μl buforu 2x ampliTAG oraz 10 μl wody oczyszczonej. Objętości odczynników można łatwo przeskalować zgodnie z całkowitą liczbą próbek. Należy przygotować odpowiednią ilość mieszaniny znakującej, aby objęła wszystkie macierze próbek i macierze kalibracyjne. Liczba wymaganych chipów kalibracyjnych zależy od tego, czy przeprowadzana jest pełna kalibracja (dla nowego urządzenia lub nowej partii odczynników), czy jedynie kontrola urządzenia. W przypadku pełnej kalibracji należy oznakować 3 chipy kalibracyjne, a w przypadku kontroli odczynników tylko jeden chip kalibracyjny. Należy pamiętać, że przed oznakowaniem macierzy kalibracyjnych powinny one przejść etap mycia przed hybrydyzacją, który został wcześniej opisany dla macierzy grypy.</li>
<li>Przenieś 40 μl mieszaniny znakującej na każdą macierz i pozwól reakcji znakowania przebiegać w zamkniętej komorze wilgotnościowej przez 5 minut.</li> 
<li>Natychmiast wypłucz macierze Buforem do Mycia D z butelki do płukania, przed umieszczeniem slajdów w statywie. Przenieś statyw do pojemnika zawierającego 110 ml Buforu do Mycia C i wstrząsaj przy 60-90 rpm przez 5 minut.</li> 
<li>Używając drugiego pojemnika do mycia wypełnionego wodą oczyszczoną, wykonaj trzy kolejne krótkie zanurzenia w wodzie, aby usunąć pozostałości soli. Osusz macierze, delikatnie dotykając krawędzi studni chusteczką.</li>
<li>Mikromacierze są teraz prawidłowo oznakowane ampliTAG i można przeprowadzić pozostałą część procedury detekcyjnej ampliPHOX. Fotoaktywacja i obrazowanie oznakowanych macierzy powinny zostać zakończone w ciągu 24 godzin; pozostałe macierze można przechowywać w ciemnym pudełku na slajdy do momentu użycia.</li>
</ol>
4. ampliPHOX: kalibracja, amplifikacja sygnału i obrazowanie
<ol>
<li>Włącz czytnik ampliPHOX i upewnij się, że oprogramowanie ampliVIEW jest gotowe do fotoaktywacji.</li>
<li>Wyznacz optymalny czas fotoaktywacji przy użyciu chipów kalibracyjnych. Oprócz poniższego krótkiego wprowadzenia, procedura ta została szczegółowo opisana w instrukcji obsługi ampliPHOX. Chipy kalibracyjne zawierają serię rozcieńczeń biotynilowanej sekwencji kontrolnej, które są wykorzystywane do optymalizacji czułości testu, w celu maksymalizacji liczby rzędów chipa kalibracyjnego generujących sygnał dodatni zgodnie z oceną oprogramowania.</li>
<li>Wyjmij ampliPHY z temperatury 4°C, pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej i krótko wymieszaj w wirówce typu vortex. Pipetuj 3 μl wzmacniacza ampliPHY do fiolki z ampliPHY, a następnie dokładnie mieszaj w wirówce typu vortex przez 10 sekund.</li>
<li>Równomiernie przenieś 40 μl roztworu ampliPHY do dołka mikroarray zawierającego matrycę znakowaną ampliTAG, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Zamykaj fiolkę ampliPHY po każdym naniesieniu. Wsuń szkiełko z mikroarray do komory fotoaktywacyjnej czytnika ampliPHOX.</li>
<li>W przypadku pierwszej matrycy kalibracyjnej użyj domyślnego czasu fotoaktywacji w polu „Time” w lewym panelu oprogramowania i kliknij zielony przycisk „Start”, aby rozpocząć fotoaktywację. Po zakończeniu wyjmij matrycę i wypłucz wodą oczyszczoną, aby usunąć nadmiar ampliPHY. Powinno być teraz widoczne tworzenie się przezroczystego polimeru w niektórych punktach.</li>
<li>Pozostaw polimerowe punkty do wyschnięcia na 2 minuty, a następnie nanieś dwie krople ampliRED na matrycę i pozostaw do barwienia na 2 minuty.</li>
<li>Następnie szybko wypłucz mikroarray wodą oczyszczoną i osusz chusteczką.</li>
<li>Wsuń mikroarray do komory obrazowania czytnika ampliPHOX i kliknij przycisk „Capture New Image” w karcie Imaging. Po wykonaniu zdjęcia dostosuj kadr i zapisz obraz.</li>
<li>W karcie Analysis wybierz maskę Calibration Chip i przycisk „Auto Placement”, aby rozpocząć analizę. Oprogramowanie automatycznie wygeneruje „Summary Record” z ilościowymi wynikami. Na podstawie tych wyników czas fotoaktywacji dla drugiej matrycy kalibracyjnej należy skorygować o 10 sekund i powtórzyć procedurę.</li>
<li>Po wyznaczeniu optymalnego czasu fotoaktywacji matryce z próbkami można przetworzyć zgodnie z tym samym protokołem wzmacniania sygnału i obrazowania, który zastosowano dla matryc kalibracyjnych.</li>
<li>Po wykonaniu zdjęć matryc z próbkami można utworzyć maskę dla konkretnego układu matrycy, np. dla układu matrycy grypy opisanego w niniejszym dokumencie. Oprogramowanie ampliVIEW umożliwia automatyczną analizę obrazu i generowanie wyników subtypów grypy dla każdej próbki.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="Schemat unieruchamiania DNA, konfiguracja PCR spotter, tworzenie mikromacierzy, proces sekwencjonowania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczny rysunek kolorymetrycznej metody detekcji ampliPHOX. (A) Biotynilowany docelowy DNA hybrydyzuje do każdego punktu w macierzy, a następnie (B) zostaje znakowany za pomocą ampliTAG. (C) Następnie dodaje się roztwór ampliPHY i (D) poddaje działaniu światła w celu utworzenia widocznych polimerowych plamek. (E) Powstałe plamki polimerowe są następnie barwione nietoksycznym barwnikiem w celu poprawy kontrastu.
<img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="Schemat układu FluChip; metoda detekcji DNA; obrazy ampliPHOX i fluorescencyjne; analiza danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. (A) Układ niskogęstościowej macierzy mikroarray dla grypy. Sekwencje 1-7 oraz 10-13 są ukierunkowane na grypę A, a sekwencje 8 i 9 na grypę B. (B) Obrazy ampliPHOX oraz (C) obrazy fluorescencyjne próbki nowego szczepu H1N1 z 2009 roku („grypa świńska”), wykazujące taki sam wzór detekcji obiema metodami.
<img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="Wykrywanie patogenów za pomocą techniki dot blot; schemat przedstawia wyniki testów H3N2, H1N1 oraz kontrolę." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Od lewej do prawej: reprezentatywne obrazy ampliPHOX dla grypy A H3N2, H1N1 pochodzenia ludzkiego, nowego szczepu H1N1 z 2009 roku (pochodzenia świńskiego) oraz próbki negatywnej. Wszystkie trzy podtypy wykazują wyraźnie odmienne wzory na macierzy. Zauważmy, że w próbce negatywnej widoczna jest tylko wewnętrzna kontrola MS2, co wskazuje, że amplifikacja RT-PCR nie została zahamowana.

<ol><li>Kumar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Widely+Used+Diagnostics+%22DNA-Microarray%22-A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Amer+J+Inf+Dis%22%5BJournal%5D)">The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review.</a> Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).</li>
<li>Miller, M. B., Tang, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Concepts+of+Microarrays+and+Potential+Applications+in+Clinical+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).</li>
<li>Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+microarrays+in+the+clinic%3A+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">DNA microarrays in the clinic: infectious diseases.</a> BioEssays. 30, 673-682 (2008).</li>
<li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+pathogen+detection+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays.</a> Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li>
<li>Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+the+future+hold+for+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">What does the future hold for clinical microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).</li>
<li>Dawson, E. D., Rowlen, K. L. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDawson%2C+ED+%22Influenza%3A+Molecular+Virology%22">Influenza: Molecular Virology</a>. Wang, Q., Tao, Y. J. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2010).</li>
<li>Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hemagglutinin+subtyping+and+pathotyping+of+avian+influenza+viruses+by+a+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray.</a> J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).</li>
<li>Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluChip%3A+Experimental+evaluation+of+a+diagnostic+influenza+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray.</a> J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).</li>
<li>Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+influenza+viruses+with+resequencing+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Inf+Dis%22%5BJournal%5D)">Identifying influenza viruses with resequencing arrays.</a> Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).</li>
<li>Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+DNA+Flow-Thru+Chip%2C+a+three-dimensional+biochip%2C+for+typing+and+subtyping+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses.</a> J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).</li>
<li>Kuck, L. R., Taylor, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+as+an+innovative+detection+technique+for+low-density+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays.</a> Biotechniques. 45, 179-186 (2008).</li>
<li>Avens, H. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fluorescent+polymerization-based+signal+amplification+for+sensitive+and+non-enzymatic+biodetection+in+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomat%22%5BJournal%5D)">Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays.</a> Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).</li>
<li>Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+detection+using+polymerization-based+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Antigen detection using polymerization-based amplification.</a> Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są pracownikami InDevR, Inc., podmiotu nastawionego na zysk. InDevR komercjalizuje opisaną w niniejszym opracowaniu technologię ampliPHOX.

Przedstawiona tutaj technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX stanowi szybką i niedrogą alternatywę dla detekcji fluorescencyjnej w jednym kolorze w zastosowaniach dla mikromacierzy o niskiej gęstości. Schematycznie przedstawiona na Rysunku 1 zasada detekcji opiera się na zastosowaniu znacznika fotoinicjatora (1B). W obecności roztworu zawierającego monomer (1C) ekspozycja na światło powoduje, że fotoinicjator (ampliTAG) wyzwala reakcję polimeryzacji wyłącznie w obszarach znakowanych (1D). Choć tec...

<table><tbody><tr><td>Zestaw Qiagen MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td>pojedyncza elucja 60 &amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>QIAcube</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>opcjonalnie</td></tr><tr><td>Szybki termocykler ABI 9800 Fast Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4441166</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Qiagen OneStep RT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>210210</td><td>dNTP z zestawu nieużywane</td></tr><tr><td>2x Bufor do nanoszenia (Spotting Buffer)</td><td>InDevR Inc.</td><td>MI-5007</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina biotynilowanych dNTP</td><td>InDevR Inc.</td><td>MI-5009</td><td></td></tr><tr><td>Egzonukleaza lambda</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>LE032K</td><td>2500 U, 10U/&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>Mieszanina starterów FluChip</td><td>InDevR Inc.</td><td>N/A</td><td>obecnie niedostępne w sprzedaży</td></tr><tr><td>Mieszadło orbitalne</td><td>Madell Technology</td><td>ZD-9556-A</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki do płukania</td><td>InDevR Inc.</td><td>MI-4002</td><td></td></tr><tr><td>Statywy do płukania</td><td>InDevR Inc.</td><td>MI-4003</td><td></td></tr><tr><td>2x Bufor do hybrydyzacji</td><td>InDevR Inc.</td><td>MI-5004</td><td></td></tr><tr><td>Chipy kalibracyjne</td><td>InDevR Inc.</td><td>AP-5006</td><td></td></tr><tr><td>Bufory do płukania A-D</td><td>InDevR Inc.</td><td>MI-5005</td><td></td></tr><tr><td>ampliRED</td><td>InDevR Inc.</td><td>AP-5004</td><td></td></tr><tr><td>ampliTAG</td><td>InDevR Inc.</td><td>AP-5001</td><td></td></tr><tr><td>2x Bufor ampliTAG</td><td>InDevR Inc.</td><td>AP-5002</td><td></td></tr><tr><td>ampliPHY, wzmacniacz ampliPHY</td><td>InDevR Inc.</td><td>AP-5003</td><td></td></tr></tbody></table>

kolorymetryczna detekcja ampliphox na mikrotablicy dna do wykrywania grypy

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

Mikromacierze DNA stały się potężnym narzędziem w detekcji patogenów.1-5 Wykazano na przykład wiele przykładów możliwości typowania i subtypowania wirusa grypy.6-11 Identyfikacja i subtypowanie grypy za pomocą mikromacierz DNA znajduje zastosowanie zarówno w zdrowiu publicznym, jak i w praktyce klinicznej w celu wczesnego wykrywania, szybkiej interwencji oraz minimalizacji skutków pandemii grypy. Tradycyjna fluorescencja jest obecnie najczęściej stosowaną metodą detekcji w mikromacierzach. Jednak w miarę jak technologia mikromacierzowa zmierza w stronę zastosowań klinicznych,1 zastąpienie kosztownej aparatury niskokosztową technologią detekcji, wykazującą podobne charakterystyki wydajności co fluorescencja, sprawi, że testy z wykorzystaniem mikromacierzy staną się bardziej atrakcyjne i opłacalne.
Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przeznaczona do zastosowań badawczych i posiada granicę wykrywalności w obrębie jednego rzędu wielkości w stosunku do tradycyjnej fluorescencji11, a jej główną zaletą jest około dziesięciokrotnie niższy koszt aparatury w porównaniu do konfokalnych skanerów mikroarrays wymaganych do detekcji fluorescencyjnej. Inną zaletą jest kompaktowy rozmiar urządzenia, który zapewnia przenośność i elastyczność, w przeciwieństwie do tradycyjnych instrumentów fluorescencyjnych. Ponieważ technologia polimeryzacji nie jest jednak tak z natury liniowa jak detekcja fluorescencyjna, najlepiej nadaje się ona do zastosowań w mikroarrays o niższej gęstości, w których pożądana jest odpowiedź tak/nie dotycząca obecności określonej sekwencji, na przykład w matrycach do wykrywania patogenów. Obecnie maksymalna gęstość plamek kompatybilna z detekcją ampliPHOX wynosi ˜1800 spots/array. Ze względu na ograniczenia dotyczące gęstości plamek, mikroarrays o wyższej gęstości nie nadają się do detekcji metodą ampliPHOX.
W niniejszej pracy prezentujemy technologię detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jako metodę wzmacniania sygnału na mikromacierzy o niskiej gęstości, opracowanej do detekcji i charakteryzacji wirusów grypy (FluChip). Chociaż niniejszy protokół wykorzystuje FluChip (mikromacierz DNA) jako jedną z konkretnych aplikacji detekcji ampliPHOX, każdą mikromacierz zawierającą biotynilowany cel można znakować i wykrywać w podobny sposób. Projekt mikromacierzy oraz biotynilacja celu do przechwycenia leżą po stronie użytkownika. Po przechwyceniu biotynilowanego celu na macierzy detekcję ampliPHOX można przeprowadzić, najpierw znakując macierz koniugatem z etykietą streptawidyny (ampliTAG). Po ekspozycji na światło przy użyciu urządzenia ampliPHOX Reader dochodzi do polimeryzacji roztworu monomeru (ampliPHY) wyłącznie w obszarach zawierających cele znakowane ampliTAG. Powstały polimer można następnie zabarwić nietoksycznym roztworem w celu poprawy kontrastu wizualnego, a następnie przeprowadzić obrazowanie i analizę za pomocą prostego pakietu oprogramowania (ampliVIEW). Cały test FluChip, od nieekstrahowanej próbki do uzyskania wyniku, można przeprowadzić w około 6 godzin, a opisane powyżej etapy detekcji ampliPHOX można ukończyć w około 30 min.

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Mikromacierze DNA stały się potężnym narzędziem w detekcji patogenów.1-5 Na przykład, wiele przykładów możliwości typowania i subtypowania wirusa grypy...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie nowej i szybkiej metody amplifikacji sygnału do detekcji i charakterystyzacji podtypów wirusa grypy na platformie chipa grypowego, będącej mikromacierzą o niskiej gęstości. Osiąga się to poprzez włączenie biotynilowanych DTP oraz zastosowanie starterów z końcem fosforanowym na pozycji 5' w celu amplifikacji segmentu genu macierzy oraz segmentu genu niestrukturalnego z ekstraktów RNA wirusa grypy. Po reakcji PCR następuje trawienie enzymatyczne i fragmentacja w celu wytworzenia krótkich, jednoniciowych, biotynilowanych i amplifikowanych produktów wirusowych, które następnie są hybrydyzowane z macierzą po przeprowadzeniu hybrydyzacji.Detekcja typu Fox wykorzystuje fotopolimeryzację do tworzenia dużych plamek polimerowych, w których zachodzi hybrydyzacja, a różnicowe wzory hybrydyzacji służą do wykrywania podtypów wirusa grypy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowa detekcja fluorescencyjna, jest jej stosunkowo niski koszt oraz szybki wynik widoczny gołym okiem, przy zachowaniu czułości analitycznej zbliżonej do fluorescencji. Metoda ta, dzięki swojej uniwersalności, pozwala na charakterystykę wirusów grypy z wykorzystaniem tzw. flu chip.Metodę Ampl Fox można zastosować również w wielu innych układach, takich jak inne mikromacierze o niskiej gęstości oparte na DNA i białkach. W teorii każdy produkt biotynilowany powinien być wykrywalny przy użyciu amox. Procedurę zaprezentują Amber Taylor, naukowiec współpracujący, oraz Kevin Moulton, asystent badawczy w Endeavor, którzy w ciągu ostatnich kilku lat odgrywali kluczową rolę w opracowaniu instrumentu Fox oraz chemii detekcyjnej.Wyizoluj viralne RNA z 200 µL izolatu wirusa, używając zestawu do ekstrakcji viralnego RNA zgodnie z protokołem producenta. Eluuj końcową objętość 60 µL i przechowuj ekstrakty w temperaturze -70 °C lub niższej do późniejszego użycia. Następnie przygotuj master mix do RT-PCR w warunkach chłodzenia (na lodzie) zgodnie z protokołem producenta.Używając mieszaniny BIOTYNYLOWANYCH dNTP, należy dodać do master mixu mieszaninę starterów do chipa flu w stężeniach przedstawionych na rysunku. Jeden starter z każdego zestawu powinien posiadać grupę fosforanową na końcu 5', aby ułatwić trawienie enzymatyczne. Zestaw starterów flu A generuje produkt o długości 1032 par zasad, a zestaw starterów flu B generuje produkt o długości 811 par zasad.Krótko wymieszać na wirówce typu vortex i rozdzielić 18 µL master mixu do cienkościennych probówek PCR. Następnie dodać 2 µL matrycy RNA do każdej probówki z reakcją. Przenieść probówki PCR do termocyklera i zastosować profil cykliczny z odpowiednią temperaturą przyłączania.Profil cykli zastosowany w tym teście przedstawiono tutaj. Przygotować mieszaninę do trawienia enzymatycznego, łącząc 2,2 µL buforu do reakcji enzymatycznej, 0,8 µL wody wolnej od nukleaz oraz 1,0 µL enzymu lambda egzonukleazy na jedną reakcję PCR. Wyjąć próbki z termocyklera i dodać cztery mikrolitry do każdej probówki PCR.Włóż próbki z powrotem do termocyklera i zaprogramuj urządzenie zgodnie z instrukcją na 37°C przez 15 minut, a następnie na 95°C przez 10 minut. Następnie umieść jednorazowe studzienki do hybrydyzacji wokół mikromacierzy przeznaczonych do hybrydyzacji. Po tym przemyj preparaty w 110 ml oczyszczonej wody na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut.Osusz slajdy, delikatnie dotykając krawędzi dołka chusteczką. Połącz 22 µL dwukrotnego buforu do hybrydyzacji z każdym z produktów fragmentowanych jednoniciowych DNA, krótko wymieszaj i nanieś 40 µL do dołków macierzy mikroarray. Pozostaw slajdy do hybrydyzacji na jedną godzinę w komorze wilgotnościowej; po hybrydyzacji wyjmij slajdy z komory i krótko przepłucz każdy z nich 2 mL buforu płuczącego D. Umieść slajdy w statywie.Następnie, używając wytrząsarki orbitalnej, wlej 110 mililitrów buforów piorących A i B do oddzielnych pojemników. Myj kasetkę z preparatami w buforze A przy prędkości od 60 do 90 RPM (prędkość ta będzie stosowana we wszystkich kolejnych etapach płukania) przez jedną minutę. Następnie wyjmij kasetkę z buforu piorącego A i krótko opłucz ją buforem piorącym D. Przenieś kasetkę do buforu piorącego B i myj na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut.Po przemyciu delikatnie osusz macierze na każdym preparacie za pomocą chusteczki i umieść wysuszone preparaty w komorze wilgotnościowej. W ramach przygotowania do etapów kolorymetrycznego wykrywania FOX, połącz 10 µL amplitudy, 20 µL buforu amplitudy 2x oraz 10 µL oczyszczonej wody dla każdej macierzy przeznaczonej do obróbki; przenieś 40 µL mieszaniny znakującej na każdą macierz i pozwól reakcji znakowania przebiegać w zamkniętej komorze wilgotnościowej przez pięć minut. W trakcie hybrydyzacji przygotuj 110 ml buforu płuczącego C w pojemniku. Po znakowaniu natychmiast wypłucz każdą macierz buforem płuczącym D. Umieść każdy preparat w statywie i płucz w buforze C na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut; po płukaniu buforem C zanurz krótko statyw z preparatami trzy razy w pojemniku z oczyszczoną wodą.Aby usunąć pozostałości soli, należy wysuszyć macierze zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Przechowywać macierze w ciemnej kasecie do momentu fotoaktywacji i obrazowania, które powinny zostać przeprowadzone w ciągu 24 h. Następnie włączyć czytnik Amli Fox i upewnić się, że oprogramowanie Amli view jest gotowe do fotoaktywacji przed wykryciem próbki z macierzy.Najpierw należy wyznaczyć optymalny czas fotoaktywacji dla wszystkich próbek, przeprowadzając krótką procedurę kalibracyjną. Raz dziennie przed użyciem należy ogrzać roztwór Amplify do temperatury pokojowej i krótko wymieszać go za pomocą wortexa, następnie pipetować 3 µL wzmacniacza Amplify do fiolki z roztworem Amplify i dokładnie wymieszać. Przez 10 sekund należy równomiernie nanieść 40 µL roztworu Amplify na tylko jedno szkiełko naraz, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.Włóż szkiełko z mikromacierzą do komory fotoaktywacji czytnika Amplify. Rozpocznij fotoaktywację, wybierając opcję „start” w oprogramowaniu PL view, stosując czas fotoaktywacji ustalony podczas procesu kalibracji. Po zakończeniu procesu przepłucz mikromacierz dwiema mililitrami oczyszczonej wody, aby usunąć nadmiar polimeru amplify clear; formowanie polimeru nastąpiło teraz w plamkach zawierających docelowe DNA, co zapewnia lepszą wizualizację.Po barwieniu pozostaw plamki polimerowe do wyschnięcia na dwie minuty. Następnie nanieś dwie krople barwnika amply red na macierz i pozwól, aby barwienie trwało przez dwie minuty. Po barwieniu szybko opłucz preparat wodą oczyszczoną i wysusz w sposób opisany wcześniej, a następnie umieść preparat w komorze obrazowania czytnika Amli Fox, aby zebrać obraz i przetworzyć wyniki za pomocą oprogramowania amli. Lewy obraz przedstawia detekcję nowej próbki H1N1 z 2009 roku za pomocą Amli Fox.Podczas gdy obraz po prawej stronie wykorzystuje tradycyjną fluorescencję generowaną przez konfokalny skaner mikroarray fluorescencyjnych, ten sam ogólny wzór detekcji jest łatwo widoczny dla obu metod. Jednak wynik Amli fox jest widoczny gołym okiem. Obrazy te przedstawiają wyniki z chipów fluorescencyjnych pochodzenia ludzkiego, H3N2 pochodzenia ludzkiego, H1N1 pochodzenia świńskiego oraz negatywny array z lisa, w którym nie wykryto grypy.Sekwencje A dwa i trzy zaznaczone na niebiesko generują sygnał dla wszystkich pokazanych podtypów grypy, natomiast sekwencje zaznaczone na czerwono w prawym dolnym rogu generują sygnał wyłącznie dla próbki H1N1 pochodzenia świńskiego. Próbka negatywna wykazuje sygnał dla sekwencji kontroli wewnętrznej zaznaczonej na zielono, co wskazuje na brak inhibicji lub błędu w reakcji RT-PCR.Po opanowaniu całego procesu, od ekstrakcji z fiolki, przez wykrywanie amoksycyliny, aż po końcową interpretację wyników, można go przeprowadzić w ciągu około sześciu godzin. Część procedury dotycząca detekcji Ampl Fox, wliczając kalibrację urządzenia, może zostać zrealizowana w około 30 minut po zastosowaniu tej procedury. W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania można zastosować inne metody, takie jak częściowe lub pełne sekwencjonowanie genomu.Niniejszy test grypy jest przeznaczony do wstępnego przesiewu, w szczególności w przypadku próbek, które wykazują unikalny wzór hybrydyzacji. Ponieważ metoda detekcji ma charakter ogólny, mamy nadzieję, że badacze znajdą nowe i interesujące zastosowania dla mikromacierzy o niskiej gęstości, w których ta metoda detekcji mogłaby przynieść dodatkową wartość.

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Deteksja kolorymetryczna ampliPHOX na mikroarray DNA dla grypy

Virochip to panwirulowa macierz mikroukładów zaprojektowana do jednoczesnego wykrywania wszystkich znanych wirusów, a także nowych wirusów, w oparciu o konserwatywną homologię sekwencji. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić badanie z użyciem Virochip w celu analizy próbek klinicznych pod kątem obecności wirusów znanych i nieznanych.

Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

W tym filmie pokazujemy proces wykrywania izotypów przeciwciał w wielu próbkach ludzkiej surowicy za pomocą szkiełka mikromatrycowego wydrukowanego z antygenowymi podtypami szczepów wirusa grypy.

Test mikromacierzy antygenu wirusowego do wykrywania izotypów przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi wirusowemu

Film demonstruje test do ilościowego oznaczania wirusów grypy A i B. Test ten wykorzystuje namnażanie endonukleazy za pomocą starterów specyficznych dla grypy i wykrywanie celów za pomocą sond molekularnych.

Test molekularny do ilościowego oznaczania wirusów grypy A i B

Zintegrowany mikroprzepływowy układ termoplastyczny został opracowany do użytku jako diagnostyka molekularna. Chip wykonuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkryptazę i PCR. Opisano metody wytwarzania i uruchamiania chipa.

Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Mikromacierz amplifikacyjna łączy asymetryczną amplifikację PCR i hybrydyzację mikromacierzy w jednej komorze, co znacznie usprawnia pracę z mikromacierzą dla użytkownika końcowego. Uproszczenie przepływu pracy z mikromacierzami jest niezbędnym pierwszym krokiem do stworzenia diagnostyki opartej na mikromacierzach, która może być rutynowo używana w środowiskach o niższych zasobach.

Demonstracja wielolekoopornej mikromacierzy amplifikacyjnej Mycobacterium tuberculosis

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Opisujemy szybki, molekularny test na grypę A i B. Test grypy wykrywa każdy cel w ciągu 15 minut, stosując amplifikację izotermiczną za pomocą starterów specyficznych dla grypy, a następnie wykrywanie celu za pomocą molekularnych sond ostrzegawczych. Test na grypę A i B jest przyjazny dla użytkownika i wymaga minimalnego czasu na wykonanie.

Szybkie wykrywanie molekularne i różnicowanie wirusów grypy A i B

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Przedstawiamy protokół użycia mikromatrycy białkowej zbudowanej przez drukowanie antygenów grypy na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą do jednoczesnego sondowania surowicy pod kątem wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 250 antygenom z różnych szczepów wirusa, umożliwiając w ten sposób pomiar szerokości przeciwciał w surowicy dla różnych podtypów wirusa.

Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Poznaj metodę ampliPHOX do szybkiej detekcji wirusów grypy za pomocą mikromacierzy DNA. Ta technologia kolorymetryczna wykorzystuje fotopolimeryzację do tworzenia widocznych plam polimerowych w ciągu minut, oferując tanie i efektywne rozwiązanie alternatywne do fluorescencji.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Przeglądaj więcej filmów