Name: Obrazowanie glikanów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą znakowania metabolicznego i bioortogonalnej chemii kliknięć (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj metodę znakowania glikanów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą bioortogonalnej chemii kliknięć. Technika umożliwia dynamiczne obrazowanie fukozylowanych glikanów in vivo z wysoką rozdzielczością czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana przez National Institutes of Health (GM093282 dla P.W.; 3U54AI057158-06S1 dla R.D.S.) oraz ze środków startowych z Albert Einstein College of Medicine.

1. Zbieranie jaj i dechorionizacja
<ol>
	<li>Zebrań i przenieś jaja zebrafish do szalki Petriego o średnicy 35 mm, usuń jak największą ilość wody, a następnie dodaj 1 mg/ml Pronease E w medium embrionalnym E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2·2H2O, 0.33 mM MgSO4, pH = 7.4), aby strawić otoczkę chorionową.</li>
	<li>Po 3-5 minutach zanurz szalkę w zlewce wypełnionej wodą dla ryb (60 mg „instant Ocean” na litr destylowanej H2O), delikatnie przenieś jaja do zlewki i pozwól im „opaść” do wody.</li>
	<li>Przepłucz jaja wodą dla ryb trzykrotnie. Większość jaj zostanie uwolniona z otoczek.</li>
	<li>Za pomocą wypalonej szklanej pipety Pasteura przenieś odchorionowane jaja do pokrytych agarozą szalek Petriego wypełnionych medium embrionalnym E3.</li>
</ol>
2. Mikrowstrzykiwanie z użyciem GDP-FucAl
<ol>
	<li>Przygotować płytki do iniekcji zgodnie z opisanym protokołem7.</li>
	<li>Przenieść zdechorionowane jaja do płytek do iniekcji wypełnionych pożywką E3 dla embrionów.</li>
	<li>Przygotować igłę i pobrać do niej 2 μL roztworu do iniekcji. Roztwór ten zawiera 20 mM GDP-FucAl syntetyzowanego chemoenzymatycznie8 oraz albo dekstran Alexa Fluor 594 (5% w/v) jako znacznik, albo barwnik ładunkowy czerwień fenolowa (0.1% w/v) w 0.2 M KCl. W ramach kontroli negatywnej GDP-FucAl w roztworze do iniekcji należy zastąpić GDP-fukozą.</li>
	<li>Odłamać igłę i dostosować ciśnienie oraz czas iniekcji tak, aby uzyskać kroplę o objętości 1 nL9.</li>
	<li>Wstrzyknąć do jaj 1 nL wybranego roztworu.</li>
	<li>Przenieść jaja do powlekonych agarozą płytek Petri wypełnionych pożywką E3 dla embrionów.</li>
	<li>Inkubować jaja w temperaturze 28 °C i usunąć jaja niezapłodnione w ciągu trzech do czterech godzin po zapłodnieniu.</li>
</ol>
3. Reakcja chemii klik katalizowana BTTES-Cu(I)
<ol>
	<li>Gdy embriony osiągną pożądane stadia rozwojowe (np. późna gastrula, segmentacja tkanek i wczesna larva), pokryj dno płytki 96-dołkowej agarozą.</li>
	<li>Do każdego dołka dodaj 92 μL pożywki dla embrionów E3, a następnie 4 μL azotku Alexa Fluor-488 (z roztworu stokowego 2,5 mM w H2O) oraz 2 μL kompleksu BTTES-CuSO4 w stosunku 6:1, a następnie delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Przenieś embriony do dołka zawierającego odczynnik do chemii klik (click chemistry), używając wypalonej szklanej pipety Pasteura. Każdy dołek powinien zawierać mniej niż pięć embrionów.</li>
	<li>Dodaj 2,5 μL świeżo przygotowanego askorbianu sodu (z roztworu stokowego 100 mM w H2O), aby zainicjować reakcję klik3. Końcowe stężenie każdego odczynnika: azotek Alexa Fluor-488: 100 μM; CuSO4: 50 μM; BTTES: 300 μM; askorbian sodu: 2,5 mM.</li>
	<li>Po 3 min dodaj 2 μL sulfonianu batokuproiny (roztwór stokowy 50 mM w H2O), który jest biokompatybilnym chelatorem miedzi, aby zatrzymać reakcję, a następnie natychmiast rozcieńcz całość 100 μL pożywki dla embrionów E3.</li>
	<li>Przenieś embriony do szklanej szalki Petriego i przemyj potraktowane embriony 2 razy 15 mL pożywki dla embrionów E3.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Nanieś kroplę agarozy o bardzo niskiej temperaturze topnienia (1,2% (w/v) w podłożu dla embrionów E3) na szklaną płytkę z mikrosodkami MatTek i umieść w kropli agarozy embrion.</li>
	<li>Ustaw embriony grzbietowo lub bocznie, a następnie pozostaw płytkę na lodzie przez 5 min, aby kropla agarozy stężała. Ostrożnie dolej do płytki podłoże dla embrionów E3, aż całkowicie przykryje kroplę agarozy.</li>
	<li>Obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu są pozyskiwane sekwencyjnie przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Wszystkie obrazy embrionów są pozyskiwane z interwałem kroków 5 μm. Ryciny kompozytowe są przygotowywane przy użyciu oprogramowania ImageJ.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia schemat naszej dwuetapowej strategii znakowania. Rysunek 2 ukazuje znakowanie zarodków rybek daniowatego za pomocą reakcji CuAAC wspomaganej przez BTTES w 9,5 godziny po zapłodnieniu (hpf). BTTES jest ligandem opartym na tris(triazolylometylo)aminie. Przyspiesza on gwałtownie reakcję CuAAC podczas koordynacji z generowanym in situ Cu(I) i promuje szybkie zachodzenie reakcji cykloaddycji w żywych systemach bez widocznej toksyczności. Bezpośrednio po 3-minutowej reakcji klik wykrywamy wyraźne znakowanie zarodków traktowanych GDP-FucAl (Rysunek 2, panele lewe). W przypadku zarodków kontrolnych, którym wstrzyknięto mikroigłą GDP-fukozę, wykrywana jest jedynie fluorescencja tła (Rysunek 2, panele prawe).
 <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="Schemat reakcji chemicznej: modyfikacja GDP-FucAl, sprzęganie BTTEs." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1.Strategia znakowania glikanów fukozylowanych w warstwie otaczającej embriony danio pręgowanego.
 <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna zarodka danio pręgowanego; ekspresja GDP-FucA1, porównawcza analiza fluorescencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obrazowanie in vivo fukozylowanych glikanów podczas embriogenezy danio pręgowanego za pomocą chemii klik prowadzonej w katalizie BTTES-Cu(I). Zarodki danio pręgowanego w stadium jednej komórki poddano mikroiniekcji pojedynczą dawką GDP-FucAl i inkubowano do 9,5 hpf. Następnie zarodki poddano reakcji z azydkiem Alexa Fluor 488 w obecności katalizatora BTTES-Cu(I). Obrazowanie zareagowanych zarodków wykonano przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obrazy z maksymalną projekcją intensywności w osi z dla fluorescencji Alexa Fluor 488 (panel górny); pole jasne (panel dolny). Pasek skali: 100 μm.

Rozwiązywanie problemów
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Problem</td>
			<td>Przyczyna</td>
			<td>Środek zaradczy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zarodki wyglądają na niezdrowe</td>
			<td>Roztwór wstrzykiwany mikroiniekcyjnie zawiera zanieczyszczenia</td>
			<td>Czystość cukrów nukleotydowych powinna wynosić powyżej 85%. Sprawdź źródło.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Po reakcji nie stwierdzono znakowania</td>
			<td>Stężenie miedzi jest poniżej 30 μM</td>
			<td>Należy uważać, aby nie rozcieńczyć roztworu reakcyjnego poprzez dodanie nadmiernej ilości medium do zarodków E3 podczas wprowadzania zarodków, ponieważ szybkość reakcji znacznie spada, gdy stężenie miedzi jest poniżej 30 μM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zarodki giną po reakcji</td>
			<td>Nieprawidłowa obsługa embrionów</td>
			<td>Należy upewnić się, że pipeta została wypalona, a naczynie reakcyjne pokryto bardzo cienką warstwą 0,5% agarozy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obrazy są ziarniste</td>
			<td>Odczynniki nie zostały odpowiednio wymieszane przed dodaniem embrionów</td>
			<td>Należy przestrzegać zalecanej kolejności dodawania odczynników i upewnić się, że odczynniki do chemii klikalnej zostały odpowiednio wymieszane przed dodaniem zarodków.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obrazy wykazują, że zarodki są uszkodzone</td>
			<td>Intensywne wstrząsanie uszkadza zarodki podczas reakcji</td>
			<td>Po umieszczeniu zarodków w roztworze delikatnie wstrząśnij przez mniej niż 10 sekund.</td>
		</tr>
		<tr>
		 <td> </td>
		 <td> </td>
		 <td> </td>
	 </tr>
	</tbody>
</table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Obrazowanie biomolekuł in vivo dostarcza kluczowych informacji na temat ich aktywności biologicznej w naturalnym środowisku. W niniejszym filmie demonstrujemy, w jaki sposób znakowanie fukozylowanych glikanów w warstwie osłony embrionów danio pręgowanego realizowane jest poprzez mikroiniekcję embrionów w stadium jednego komórki GDP-FucAl oraz drugi etap koniugacji z fluoroforem za pomocą biokompatybilnej reakcji CuAAC3 pośredniczonej przez BTTES. Skuteczne znakowanie można osiągnąć w ciągu 2-3 minut,...

<table><tbody><tr><td>Siarczan(II) miedzi(II) pięciowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203165</td><td></td></tr><tr><td>Azydek Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>dekstran, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>D-22913</td><td></td></tr><tr><td>(+)-L-askorbinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Kwas batokuproinedisulfonowy</td><td>Acros Organics</td><td>164060010</td><td></td></tr><tr><td>Szklana płytka z mikrodoodkami</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie glikanów w embrionach danio pręgowanego za pomocą znakowania metabolicznego i bioortogonalnej chemii klik

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Obrazowanie glikanów in vivo stało się ostatnio możliwe dzięki zastosowaniu strategii bioortogonalnego reportera chemicznego poprzez traktowanie komórek lub organizmów monosacharydami znakowanymi azydami lub alkynami1, 2. Zmodyfikowane monosacharydy, przetwarzane przez aparat biosyntezy glikanów, są włączane do glikokonjugatów powierzchni komórkowej. Bioortogonalne znaczniki azydowe lub alkynowe umożliwiają następnie kowalencyjne sprzężenie z sondami fluorescencyjnymi w celu wizualizacji lub z sondami powinowactwa w celu wzbogacenia i analizy glikoproteomicznej. Niniejszy protokół opisuje procedury typowo stosowane do nieinwazyjnego obrazowania glikanów fukozylowanych w embrionach danio pręgowanego, obejmujące: 1) mikroiniekcję embrionów w stadium jednej komórki GDP-5-alkinylfukozą (GDP-FucAl), 2) znakowanie glikanów fukozylowanych w warstwie otaczającej embriony danio pręgowanego fluoroforami sprzężonymi z azydami za pomocą biokompatybilnej cykloaddycji azydowo-alkinowej katalizowanej Cu(I) (CuAAC) oraz 3) obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej3. Opisaną tutaj metodę można łatwo rozszerzyć na wizualizację innych klas glikanów, np. glikanów zawierających kwas sialowy4 i N-acetylogalaktozaminę5, 6, w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego oraz w innych żywych organizmach.

Opisano metodę opartą na chemii klik, która umożliwia szybkie, nieinwazyjne i wiarygodne znakowanie glikanów z etykietą alkiniową w embrionach danio pręgowanego. W niniejszym badaniu obrazowano glikany fukozylowane w warstwie otaczającej embriony danio pręgowanego w późnej fazie gastrulacji.

Obrazowanie glikanów w embrionach danio pręgowanego za pomocą znakowania metabolicznego i bioortogonalnej chemii klik

Obrazowanie glikanów in vivo stało się ostatnio możliwe dzięki zastosowaniu strategii bioortogonalnego reportera chemicznego, polegającej na traktowaniu komórek lub organizmów azydkiem lub...

Niedawne demonstracje obrazowania glikanów in vivo wykorzystują strategię bioortogonalnego raportowania chemicznego, polegającą na traktowaniu komórek lub organizmów monosacharydami znakowanymi grupami alkinowymi lub azydowymi. Modyfikowane monosacharydy, przetwarzane przez aparat biosyntezy glikanów, są włączane do glikokonjugatów na powierzchni komórki jako bioortogonalne znaczniki alkinowe lub azydowe. Umożliwia to następnie kowalencyjne sprzęganie z sondami fluorescencyjnymi w celu wizualizacji lub z sondami powinowactwa w celu wzbogacenia i analizy glikoproteomicznej.Ta metoda oparta na chemii klik pozwala na szybkie, nieinwazyjne i niezawodne znakowanie glikanów posiadających grupę alkinową lub azydową w embrionach rybek danio oraz może być łatwo rozszerzona w celu wizualizacji innych klas glikanów w rozwijających się organizmach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykrywanie glikanów za pomocą lektyn lub przeciwciał, jest możliwość jej zastosowania w dynamicznym obrazowaniu in vivo. Metody obrazowania oparte na lektynach i przeciwciałach dostarczają jedynie obrazu glikanów w pojedynczym punkcie czasowym.Są one trudne do zastosowania w kontekście badań dynamicznych. Ponadto znakowanie glikanów lektynami lub przeciwciałami wymaga usunięcia badanych komórek lub tkanek z ich naturalnego środowiska i ich utrwalenia przed analizą. W przeciwieństwie do tego, znakowanie glikanów z wykorzystaniem strategii bioortogonalnego reportera chemicznego pozwala pokonać te ograniczenia i może być bezpośrednio stosowane do nieinwazyjnego obrazowania glikanów w żywych systemach, takich jak zarodki danio-pręgowanego oraz zarodki C. elegans.Wykorzystując reakcję cykloaddycji azotku z alkinem indukowaną przez BtT Es, która jest biokompatybilną wersją chemii typu „click”, można uzyskać trwałe znakowanie w czasie od jednej do pięciu minut. Postępując zgodnie z procedurą, należy zebrać jaja danio pręgowanego i przenieść je do szalki Petriego o średnicy 35 mm. Odessać jak największą ilość wody, a następnie dodać pronazę E w stężeniu 1 mg/ml w medium embrionalnym, aby strawić chorion. Po trzech do pięciu minutach, gdy może pojawić się pęcherzykowanie chorionu, zanurzyć szalkę w zlewce wypełnionej wodą dla ryb.Ostrożnie przenieś jaja do zlewki, pozwalając im opaść do wody. Obficie opłucz jaja wodą dla ryb, tak aby większość z nich uwolniła się z chorionu. Następnie, używając pipety wypalanej ogniowo, przenieś pokryte jaja do powlekanych agaroza szalek Petri wypełnionych pożywką embrionalną E3. Wypełnij przygotowane szalki do iniekcji pożywką embrionalną E3 i przenieś do nich pokryte jaja.Następnie przygotuj igłę i nabierz do niej 2 µL roztworu do iniekcji zawierającego 20 mM GDP Fuk all oraz albo 5% lor, 5 94 dekstryny jako znacznika, albo 0,1% czerwieni fenolowej jako barwnika ładującego w 0,2 M chlorku potasu w ramach kontroli negatywnej. Zastąp GDP FUCA związkiem GDP Fuco w roztworze do iniekcji. Teraz odłam igłę i dostosuj ciśnienie oraz czas trwania iniekcji, aż uzyskasz kroplę o objętości 1 nL.Następnie wstrzyknij do jaj jeden nanolitr roztworu. Na koniec przenieś wstrzyknięte jaja do powlekanych agarosem szalek Petriego wypełnionych pożywką E3 dla embrionów i inkubuj w temperaturze 28 °C w ciągu trzech do czterech godzin po zapłodnieniu. Usuń niezapłodnione jaja, gdy embriony osiągną pożądane stadia rozwoju, takie jak późna segmentacja tkanek gastruli i wczesne stadium larwalne.Pokryj dno płytki 96-dołkowej roztworem aros. Do każdego dołka dodaj 92 µL medium dla embrionów, a następnie dodaj 4 µL azydku 4 88 z zapasu 2,5 mM w wodzie oraz 2 µL kompleksu miedzi(II) B-T-T-E-S i siarczanu miedzi w stosunku 6:1 za pomocą pipety Pasteura z polerowanego ognia szkła. Przenieś mniej niż pięć embrionów do dołka.Kontynuując dodawanie odczynników do chemii klik, dodaj 2,5 µL świeżo przygotowanego 100 mM askorbinianu sodu. Aby zainicjować reakcję klik, inkubuj przez trzy minuty. Następnie dodaj 2 µL 50 mM bathosulphate copper, biokompatybilnego chelatora miedzi, aby zatrzymać reakcję, i natychmiast rozcieńcz 100 µL pożywki dla embrionów.Przenieś zarodki do szklanej szalki Petriego i przemyj poddane działaniu preparatu zarodki dwukrotnie 15 mililitrami embryo.Medium. Nanieś kroplę agarozy o ultraniskiej temperaturze topnienia na szklane dno naczynia z mikroprzestrzeniami typu matte tech i przenieś jeden zarodek do kropli agarozy. Ustaw zarodek w odpowiedniej pozycji i pozostaw naczynie na lodzie przez pięć minut.Aby utrwalić kroplę agros, należy ostrożnie dodać do szalki pożywkę dla embrionów, aż pokryje ona agros. Krople należy nanosić sekwencyjnie. Należy wykonać obrazy w fluorescencji i w polu jasnym przy użyciu mikroskopu konfokalnego z interwałem pięciu mikronów, a następnie stworzyć figury złożone.Wykorzystując obraz. J-B-T-T-E-S jest ligandem opartym na aminie, który dramatycznie przyspiesza reakcję miedzi(I) podczas koordynacji z generowanym NC-2 miedzią(I) i gwałtownie promuje reakcję cykloaddycji w żywych systemach bez widocznej toksyczności. W tym przypadku zarodki danio przeziernego zostały znakowane za pomocą miedzi z zastosowaniem B-T-T-E-S.A a C w 9,5 godziny po zapłodnieniu, bezpośrednio po trzyminiutowej reakcji klik. Wykryto oczekiwane silne znakowanie wszystkich embrionów traktowanych GDPF. W przypadku embrionów kontrolnych, mikroiniekcyjnych z GDP, wykryto jedynie fluorescencję tła. Znakowanie i obrazowanie Fuco można przeprowadzić w dowolnym czasie od 2,5 do 96 godzin po zapłodnieniu.Obrazy te uzyskano 24 i 48 godzin po zapłodnieniu. Metoda pulse-chase. Zastosowanie tej strategii umożliwia monitorowanie dynamicznej biosyntezy glikanów, w której fukany produkowane w różnych punktach czasowych są znakowane fluoroforami o różnych kolorach.Niniejszą procedurę można połączyć z mutantami genetycznymi lub technikami supresji genetycznej opartymi na morfinoach, aby przeanalizować specyficzne role poszczególnych enzymów syntetyzujących glikany podczas embriogenezy zebrafisha. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w biosyntezę glikanów, można ją również zastosować do innych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak acylacja lub glikozylacja.Można ją również zastosować do badania nowo zsyntetyzowanych białek.

imaging-glycans-zebrafish-embryos-metabolic-labeling-bioorthogonal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie glikanów w zarodkach danio rzecznego metodą metabilizowania znakującego i bioortogonalnej chemii klikowej

Opisujemy opracowanie systemu do zautomatyzowanego obrazowania i analizy transgenicznych embrionów zebrafish w płytkach wielodołkowych. System ten wykazuje możliwość pomiaru efektów zależnych od dawki małej cząsteczki, BCI, na ekspresję genu reporterowego Fibroblast Growth Factor i dostarcza technologii do tworzenia wysokoprzepustowych skriningów chemicznych na zebrafish.

Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy dla chemicznych badań przesiewowych na daniowiczkach Zebrafish.

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Ten film demonstruje test wychwytu przeciwciał w celu zobrazowania sygnalizacji Notch/DeltaD u progenitorów gleju radialnego danio pręgowanego. Polega ona na zamontowaniu osadzonych w agarozie zdekorionowanych zarodków danio pręgowanego, wstrzyknięciu roztworu barwnika ukierunkowanego na ligandy DeltaD na RGP oraz obrazowaniu pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu asymetrycznego podziału komórek, potwierdzając aktywację sygnalizacji Notch/DeltaD.

Test wychwytu przeciwciał do obrazowania sygnalizacji Notch/DeltaD w radialnych progenitorach gleju danio pręgowanego

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Opisano nowatorską technikę wykrywania endogennych receptorów o niskiej liczebności obecnych w zarodkach danio pręgowanego. Nazwaliśmy go AFLIP, ponieważ polega na znakowaniu powinowactwa receptora przez jego ligand związany z immunoprecypitacją.

Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

Ta praca opisuje metody tworzenia modeli ostrej i przewlekłej hiperglikemii u danio pręgowanego. Celem jest zbadanie wpływu hiperglikemii na procesy fizjologiczne, takie jak neurogeneza konstytutywna i wywołana urazem. Praca podkreśla również wykorzystanie danio pręgowanego do śledzenia cząsteczek znakowanych radioaktywnie (tutaj, [18F]-FDG) za pomocą PET/CT.

Ostre i przewlekłe modele hiperglikemii u danio pręgowanego: metoda oceny wpływu hiperglikemii na neurogenezę i biodystrybucję cząsteczek znakowanych radioaktywnie

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Poznaj metodę znakowania glikanów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą bioortogonalnej chemii kliknięć. Technika umożliwia dynamiczne obrazowanie fukozylowanych glikanów in vivo z wysoką rozdzielczością czasową.

Obrazowanie glikanów w embrionach danio pręgowanego za pomocą znakowania metabolicznego i bioortogonalnej chemii klik

Przeglądaj więcej filmów