Charakterystyka izolowanego, wentylowanego i oprzyrządowanego płuca myszy ukrwionego z przepływem pulsacyjnym

Badanie zależności pulsacyjnego przepływu ciśnienia w płucach. Protokół ten wyjaśnia, jak izolować, wentylować i ukrwić płuca myszy. Tchawica jest chirurgicznie odsłonięta w celu wentylacji.

Następnie izoluje się serce i płuca, aby można było kaniulować tętnicę płucną i lewe przedsionki. Układ oddechowy jest następnie perfundowany. Eksperymenty przeprowadza się poprzez zmianę przepływu w tętnicy płucnej, wielkości, kształtu fali i/lub częstotliwości.

Powstałe w ten sposób kształty fali ciśnienia w tętnicy płucnej i lewym przedsionku są rejestrowane i demonstrują zależności pulsacyjnego przepływu ciśnienia w płucach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak preparaty in vivo, są zmiany w zależności ciśnienia i przepływu. Zależności przepływu ciśnienia pulsacyjnego można uzyskać przy braku zmian w stanie objętości, tonie współczulnego układu nerwowego, aktywności i skutkach znieczulenia.

Ponadto większość izolowanych preparatów płucnych mierzy tylko stałe zależności przepływu ciśnienia, podczas gdy nasza technika pozwala na określenie zależności przepływu ciśnienia pulsacyjnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii płuc, takie jak: w jaki sposób choroba naczyń płucnych wpływa na pulsacyjną hemodynamikę płuc lub jak usztywnienie dużej tętnicy płucnej wpływa na obciążenie następcze prawej komory? Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ odsłanianie serca i płuc oraz mocowanie kaniuli w tętnicy płucnej jest trudne do nauczenia.

Nadmierne ciśnienie z oprzyrządowania może powodować obrzęk płuc, a niewłaściwe umieszczenie kaniuli może spowodować przebicie tętnicy płucnej. Przed rozpoczęciem eksperymentu konieczne jest przygotowanie systemu IL one służącego do wentylacji i perfuzji izolowanego płuca. Rurkę należy podłączyć do przetworników ciśnienia.

O całkowicie samotna pompa i przepływomierz Przepłucz system wodą destylowaną podgrzaną do 37 stopni Celsjusza i usuń wszelkie pęcherzyki z przewodów. Następnie zalać rurkę pompy Endur tech 1%PBS. Teraz zero.

Ciśnienie dla każdego przetwornika P 75 poprzez uprzednie zamknięcie jego zaworu do systemu IL one i otwarcie zaworu do atmosfery. Następnie użyj wtyczki SIS amplifier, aby automatycznie wyzerować ciśnienie przed przygotowaniem zwierzęcia, nawilżyć konfigurację IO one, mocząc ceramiczny porowaty element w wodzie destylowanej. Po znieczuleniu mysz ustabilizuj ją do operacji, przypinając jej przednie łapy do tablicy korkowej.

Teraz spryskaj klatkę piersiową 95% alkoholem. Użyj prostych kleszczy, aby chwycić skórę na szyi i wytnij jednocentymetrowy otwór prostymi nożyczkami. Po odsłonięciu wnętrza szyi odetnij białą tkankę gruczołową w mięśniach powierzchownych, szukając przełyku i tchawicy.

Odizoluj przełyk i tchawicę od tkanki po obu stronach i z tyłu i zawiąż luźny szew wokół tchawicy. Aby kaniulować tchawicę, ostrożnie wytnij małe V z jednej strony małymi nożyczkami. Teraz zabierz mysz do systemu IL one za pomocą kleszczy.

Chwyć kaniulę tchawicy i wsuń ją do tchawicy. Zabezpiecz kaniulę szwem. Rozpocznij wentylację od powietrza w pomieszczeniu, spryskaj klatkę piersiową alkoholem i usuń skórę za pomocą prostych kleszczy i prostych nożyczek.

Przeciąć skórę w górę wzdłuż mostka. Podnieś skórę z każdej strony i przetnij wzdłuż linii dolnych żeber. Teraz chwyć wyrostek mieczykowaty pęsetą i użyj nożyczek z końcówką kulkową, aby wyciąć otwór w przeponie, w miejscu, w którym styka się z dolną częścią mostka.

Chwyć membranę i odetnij ją od żeber. Używając nożyczek z końcówką kulkową, ponownie chwyć wyrostek mieczykowaty i użyj nożyczek z końcówką kulkową, aby ostrożnie przeciąć mostek przez żebra, nie uszkadzając płuc, serca ani naczyń krwionośnych. Aby odsłonić serce, chwyć lewe żebra i odetnij ich końce.

Teraz powoli wstrzyknij do prawej komory 0,1 mililitra heparyny Po wstrzyknięciu odetnij resztę żeber. Użyj tylnego lub zaokrąglonego końca kleszczy, aby delikatnie odepchnąć płuca od żebra, jednocześnie przecinając żebra pod mikroskopem. Usuń tkankę gruczołową z tłuszczu na górze serca.

Użyj pęsety, aby wyciągnąć chusteczki i odciąć je. Za pomocą nożyczek sprężynowych, aby założyć szew wokół aorty i tętnicy płucnej, delikatnie nałóż łyżką serce pęsetą. Opór powinien być niewielki.

Teraz zawiąż luźny szew z podwójnym rzutem. Następnie odetnij dolną część brzucha. Użyj skośnych nożyczek, aby przeciąć żebra i kręgosłup.

Spowoduje to przepływ znacznej ilości krwi. Użyj patyczka higienicznego, aby zatamować przepływ. Po zatrzymaniu przepływu krwi napełnij system IL czterema mililitrami RPMI ze strzykawki wypełnionej 10 mililitrami RPMI.

Dobrze jest dokładnie sprawdzić, czy rurka nie zawiera pęcherzyków powietrza. Teraz kaniuluj prawą komorę, wycinając małe wcięcie w pobliżu wierzchołka i wkładając kaniulę Celuj w dół w prawo, aby dotrzeć do tętnicy płucnej. Końcówka sondy powinna być widoczna przez prawie przezroczystą ścianę tętnicy płucnej.

Następnie zaciśnij szew wokół kaniuli, aorty i tętnicy płucnej, aby kanniulować lewą komorę. Wytnij wcięcie w wierzchołku i włóż kaniulę skierowaną do góry do lewego przedsionka. Do znalezienia zastawki może być potrzebne lekkie ciśnienie, ale po znalezieniu kaniula prześlizgnie się i będzie bezpieczna bez szwu.

Ręcznie wlewaj RPMI z 10-mililitrowej strzykawki z prędkością 0,3 mililitra na minutę, aż zobaczysz przepływ w rurce odpływowej. Jeśli w rurce odpływowej nie ma przepływu, zmień położenie kaniuli lewej komory. Jeśli jednak nie ma przepływu w płucach, przerwij eksperyment, ponieważ tętnica płucna prawdopodobnie ma nieszczelność.

Teraz, gdy serce jest w pełni kaniulowane, podłącz 60-mililitrową strzykawkę do systemu IL one. Za pomocą pompy o stałym przepływie i wlewaj RPMI Perfuse eight z szybkością jednego mililitra na minutę. Sprawdź, czy nie ma wycieków podczas początkowej perfuzji.

Stopniowo perfunduj płuca przez kolejne dwie minuty, w tym czasie płuca zmienią kolor na biały. Do badań przepływu pulsacyjnego. Najpierw ustaw pojedyncze przemieszczenie tłoka pompy na żądanych poziomach.

Następnie ustaw stałe natężenie przepływu. Teraz otwórz zawór pompy osli i rozpocznij rejestrację danych tuż przed uruchomieniem profilu przepływu osli. Po zakończeniu otwórz plik wyjściowy danych i wykreśl przepływ eksperymentalny na podstawie przepływów eksperymentalnych z początkowej próby.

Dostosuj przemieszczenie tłoka pompy oscylacyjnej przy każdej częstotliwości, tak aby Q max było zgodne z potrzebami. Utrzymuj wentylację pod stałym ciśnieniem Podczas zbierania danych do prób stałego przepływu zamknij zawór do pojedynczej pompy i ustaw stałe natężenie przepływu na żądany poziom. Rozpocznij rejestrowanie danych i przejdź przez protokół stałego przepływu.

Zbieranie danych przez co najmniej 10 sekund Przy każdym natężeniu przepływu między próbami. Zresetuj natężenie przepływu do 0,5 mililitra na minutę. Upewnij się, że podczas zbierania danych należy utrzymywać wentylację pod stałym ciśnieniem.

Jeśli pożądane jest uzyskanie zerowego ciśnienia w lewym przedsionku, należy usunąć rurkę odpływową podczas przeprowadzania prób. Czujnie obserwuj RPMI w przewodach oddechowych. Nie wolno dopuścić do tego, aby RPMI dotarł do przetworników ciśnienia w drogach oddechowych, ponieważ zostaną one uszkodzone.

Oto wyniki perfuzji o stałym przepływie z przepływem Q w górnym rzędzie i wynikającym z tego ciśnieniem w tętnicy płucnej i lewym przedsionku w drugim rzędzie w różnych warunkach. W pierwszych dwóch panelach ciśnienie w lewym przedsionku wzrastało i spadało wraz z Q, ponieważ rurka odpływowa była na swoim miejscu, pierwszy panel pokazuje ciśnienie powietrza na końcu, ciśnienie wdechowe, a drugi pokazuje ciśnienie powietrza na końcu ciśnienia wydechowego. Następnie rurka została usunięta tak, aby ciśnienie w lewym przedsionku było stałe i niezależne od Q. Następnie wysokość rurki wylotowej została wyregulowana ręcznie, tak aby ciśnienie w lewym przedsionku było wyższe.

Ale niezależnie od Q, pierwszy panel pokazuje ciśnienie powietrza na końcu, ciśnienie wdechowe, a drugi pokazuje ciśnienie powietrza na końcu. Ciśnienie wydechowe. Wynikowe stałe zależności przepływu ciśnienia w tętnicy płucnej dla każdego przypadku można uzyskać, wykreślając ciśnienie w funkcji przepływu.

Oto wyniki pulsacyjnej perfuzji przepływowej z przepływem Q w górnym panelu i wynikającymi z tego ciśnieniami w tętnicy płucnej, lewym przedsionku i powietrzu. W dolnym panelu. Na podstawie tych zależności pulsacyjnego przepływu ciśnienia w płucach można obliczyć impedancję naczyń płucnych, która odzwierciedla całkowite obciążenie następcze prawej komory.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 20 do 30 minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie spieszyć się i zrelaksować, aby ręce były stabilne. Gdy płuca są odpowiednio ukrwione, najtrudniejsza część się kończy.

Po tej procedurze można wykonać inne techniki, takie jak histologia lub testy biochemiczne na tkance płucnej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie mechanizmy molekularne są odpowiedzialne za obserwowane zmiany w zależności przepływu pulsacyjnego ciśnienia w płucach. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się fizjologią płuc do zbadania roli określonych genów i białek w rozwoju i progresji choroby naczyń płucnych przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych myszy.