Obrazowanie żywych komórek prekursorowych narządów zmysłów w nienaruszonych poczwarkach Drosophila
May 27th, 2011
W tym filmie opisujemy metodę obrazowania żywych komórek asymetrycznie dzielących się komórek progenitorowych narządów zmysłów i komórek naskórka w nienaruszonych poczwarkach Drosophila
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie Driss Pupi do obrazowania żywych komórek progenitorowych dzielących się komórek progenitorowych piersiowych narządów zmysłów lub komórek SOP podczas metamorfozy. Osiąga się to poprzez uprzednie ustawienie odpowiedniej krzyżówki genetycznej w celu uzyskania potomstwa puy do obrazowania żywych komórek. Drugim etapem zabiegu jest pobranie oph puy na odpowiednim etapie w celu uwidocznienia asymetrycznie dzielących się nerwowych komórek progenitorowych.
Trzecim etapem zabiegu jest usunięcie obudowy źrenicy w celu zamontowania poczwarki do obrazowania. Ostatnim etapem zabiegu jest zamontowanie poczwarki między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym i przystąpienie do obrazowania żywych komórek. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują dynamikę znakowanych fluorescencyjnie białek podczas asymetrycznego podziału komórek i różnicowania komórek narządów czuciowych typu dzikiego lub zmutowanego za pomocą epifluorescencji lub mikroskopii konfokalnej.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia, jest to, że dynamikę białka można śledzić w czasie rzeczywistym i w ciągu kilku godzin w nienaruszonej Z drugiej strony pożądanej linii gal cztery i białka fuzyjnego znakowanego GFP. Pod kontrolą bezzałogowego systemu powietrznego zidentyfikuj pola, które zostały poddane w ciągu godziny. Te puy będą miały charakterystyczną morfologię źrenic, ale nie będą miały pigmentacji.
Wybrane puy mogą być albo przeniesione do nowego pliku, albo mogą być oznaczone na pliku krzyżowym, aby zapamiętać, które z nich były białe. 18 godzin później, gdy puy osiągnie odpowiedni etap, umieść kawałek taśmy dwustronnej na szkiełku mikroskopowym i przyklej obudowę źrenicy do szkiełka brzuszną stroną do dołu pod mikroskopem preparacyjnym. Zidentyfikuj i chwyć krawędź URM za pomocą kleszczy i delikatnie unieś, odsłaniając głowę niedojrzałej muchy.
Uważając, aby nie przebić ciała muchy. Delikatnie rozerwij bok obudowy źrenicy i usuń ją całkowicie, aby odsłonić klatkę piersiową i przednią część brzucha. Kontynuuj ostrożne rozdzieranie tej samej strony w kierunku tyłu i pociągnij obudowę źrenicy na przeciwną stronę i przyklej ją do taśmy.
Teraz, gdy brzuch jest w pełni odsłonięty, delikatnie wepchnij miękką szczoteczkę z włosia pod głowę poczwarki i unieś ją z reszty obudowy źrenicy. Umieść poczwarkę na szkiełku mikroskopowym grzbietem do góry Ustaw poczwarkę pod kątem 45 stopni, tak aby szkiełko nakrywkowe dotykało obszaru komórek SOP klatki piersiowej. Najpierw zrób kwadratową ramkę o wymiarach 18 na 18 milimetrów z bibuły filtracyjnej watmana, wycinając okno o wymiarach 10 na 10 milimetrów pośrodku.
Zanurz ramkę w wodzie, aż ją nasyci, a następnie umieść wokół poczwarki. Użyj strzykawki o pojemności pięciu cm3, aby nałożyć jednolitą warstwę smaru silikonowego wokół ramy, tak aby grubość warstwy była tylko nieznacznie większa niż średnica źrenicy. Odpipetować około jednego mikrolitra wody na środku szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 na 22 milimetry i ustawić szkiełko nakrywkowe tak, aby kropla dotykała nodom źrenicy.
Delikatnie dociśnij, aby utworzyć pełne uszczelnienie i płaską powierzchnię na poczwarce. Teraz, gdy żywa poczwarka została zamontowana, można ją zobrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej, łącząc techniki sekcji i montażu. Dzięki obrazowaniu na żywo można zwizualizować akumulację białka fuzyjnego aktyny GFP w bruździe rozszczepienia mitotycznej komórki SOP.
W tym miejscu rozkład partnera Num RFP i RAB 5G FP można porównać w dwóch komórkach potomnych SOP. Należy zauważyć, że podczas gdy partner NUM RFP jest rozłożony asymetrycznie, RAB 5G FP jest równomiernie rozmieszczony w obu komórkach w późnych stadiach źrenicy. Zróżnicowane zewnętrzne narządy zmysłów mogą być uwidocznione: oczodoły czuciowe i włosy wykazują autofluorescencję i są pokazane tutaj nakładając się na L-G-L-G-F-P wyrażone w podzbiorze komórek SOP.
Korzystanie z systemu Markem Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja siarczanów komórek narządów czuciowych ze specyficznymi markerami przeciwciał lub badanie kolokalizacji białek fuzyjnych GFP z białkami endogennymi.
Przegląd
To wideo demonstruje metodę obrazowania żywych komórek dotyczącą asymetrycznie dzielących się komórek przodków narządów zmysłowych i komórek naskórka w nienaruszonych larwach Drosophila. Procedura ta pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki białek podczas podziału komórki i różnicowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Tło
- Obrazowano żywe komórki, co daje wgląd w procesy komórkowe w czasie rzeczywistym.
- Larwy Drosophila służą jako model do badania rozwoju narządów zmysłowych.
- Asymetryczny podział komórki jest kluczowy dla prawidłowego formowania narządów.
- Fluorescencyjne znakowanie pozwala na śledzenie określonych białek podczas rozwoju.
Cel badania
- Wizualizacja dynamiki dzielących się komórek przodków narządów zmysłowych.
- Porównanie dystrybucji białek w komórkach potomnych podczas asymetrycznego podziału.
- Zgłębienie rozumienia rozwoju narządów zmysłowych u Drosophila.
Stosowane metody
- Ustawienie krzyżówek genetycznych w celu uzyskania odpowiedniego potomstwa do obrazowania.
- Zbieranie larw w odpowiednim stadium rozwoju.
- Montowanie larw do obrazowania przy użyciu specjalistycznej techniki.
- Wykorzystanie mikroskopii konfokalnej do obserwacji fluorescencyjnie oznakowanych białek.
Główne wyniki
- Obrazowano w czasie rzeczywistym dynamikę aktyny i innych białek podczas podziału komórki.
- Obserwowano asymetryczną dystrybucję białek w komórkach potomnych SOP.
- Zewnętrzne narządy zmysłowe wykazywały autofluorescencję, co ułatwiło wizualizację.
- Technika ta może być wykonywana sprawnie, zwiększając wydajność eksperymentu.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia potężne narzędzie do badania dynamiki żywych komórek u Drosophila.
- Obrazowano w czasie rzeczywistym przewyższa tradycyjne metody takie jak immunohistochemia.
- Przyszłe badania mogą się opierać na tej technice, aby zgłębić dodatkowe pytania dotyczące komórek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae enables real-time visualization of asymmetric protein dynamics during cell division, providing mechanistic insights into Notch signaling regulation. This approach supports target validation by allowing direct observation of fate-determinant segregation and pathway activity in a genetically tractable, disease-relevant system. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking subcellular protein dynamics to cell fate outcomes, informing de-risking strategies for targets involved in asymmetric division and stem cell differentiation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing asymmetric distribution of cell fate determinants like Numb during mitosis.
- Scientific Value: Supports functional target validation through real-time correlation of protein dynamics with Notch pathway inhibition in daughter cells.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by allowing comparison of wild-type and mutant conditions using MARCM mosaic analysis in intact tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing reproducible live imaging of SOP cell division in intact pupae.
- Operational Value: Addresses assay standardization and quantitative outputs through measurable protein localization patterns (e.g., actin at cleavage furrow, symmetric RAB5 distribution).
- Operational Value: Highlights screening readiness and scalability via a mounting protocol completed in under 10 minutes, enabling repeated imaging sessions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through evolutionarily conserved mechanisms of asymmetric cell division and Notch signaling in sensory organ development.
- Scientific Value: Describes translational continuity from discovery (SOP specification) through terminal differentiation (external organ formation with autofluorescence).
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking protein dynamics to functional outcomes in progenitor cell lineages.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by enabling real-time assessment of target engagement and pathway modulation in asymmetric cell division.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking via direct visualization of Notch inhibitor segregation.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through standardized mounting and fluorescent protein tracking in mitotic SOPs.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, such as asymmetric vs. symmetric protein distribution in daughter cells.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through conservation of asymmetric division mechanisms in stem cell-driven tissue regeneration.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable to multiple GFP-tagged proteins and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in cell fate specification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of live imaging in intact developmental models.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early mechanistic insight.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct observation of target protein dynamics in disease-relevant contexts.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in Drosophila genetics, Gal4/UAS systems, and fluorescent protein tagging.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include confocal or epifluorescence microscopy and silicone-based mounting chambers.
- Cross-team standardization requirements for genetic crosses, pupal staging, and MARCM-based mutant analysis.
- Adaptation considerations across model systems, noting conservation of asymmetric division mechanisms but species-specific mounting adjustments.
- Practical limitations supported by source material: technique requires intact pupal thorax and is limited to stages where SOPs are mitotically active (first 12 hours post-pupariation).
