Name: Obrazowanie żywych komórek prekursorowych narządów zmysłów w nienaruszonych poczwarkach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 27 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek prekursorowych narządów zmysłowych w nienaruszonych poczwarkach Drosophila. Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki białek podczas asymetrycznego podziału komórkowego w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować J. Knoblichowi (IMP, Wiedeń) oraz M. Gonzalez-Gaitanowi (Uniwersytet Genewski) za szczepy Drosophila, a także Shinyi Inoué i Christianowi Sardetowi, których techniki montowania embrionów morskich stały się inspiracją do opracowania niniejszej metody. Protokół ten został pierwotnie opracowany w laboratorium Y.N. Jana. F.R. i D.Z. są wspierani przez grant NIH RO1 NS059971, fundusz Pennsylvania Tobacco Settlement oraz Fox Chase Cancer Center.

Wymagane materiały: stereomikroskop do sekcji, taśma dwustronna, standardowe szkiełko przedmiotowe i nakrywka, pęseta sekcyjna (rozmiar 5 lub 5,5), pędzel z miękkim włosiem, silikonowy smar próżniowy, strzykawka 5cc, papier Whatmana, mikroskop konfokalny lub epifluorescencyjny z kamerą cyfrową i oprogramowaniem do akwizycji obrazu.
1. Disekcja poczwarki
<ol>
	<li>Przeprowadź krzyżówkę (używając odpowiedniej kombinacji linii Gal4 oraz białka fuzyjnego z tagiem GFP pod kontrolą UAS) lub umieść muchy z linii, którą chcesz obrazować, w kilku świeżych fiolkach w temperaturze 25°C.</li>
	<li>Komórki SOP zazwyczaj zaczynają proliferować na klatce piersiowej poczwarki osiemnaście godzin po rozpoczęciu pupariacji, dlatego wybieramy poczwarki „białe” z odpowiedniej linii much lub krzyżówki. Białe poczwarki mają morfologię poczwarki, ale ich poczwarowa powłoka jest niepigmentowana, co wskazuje, że pupariacja nastąpiła w ciągu ostatniej godziny.</li>
	<li>Odczekaj około 18 godzin.</li>
	<li>Umieść kawałek dwustronnej taśmy klejącej na szkiełku. Zbierz poczwarki i przyklej ich powłokę do taśmy stroną brzuszną do dołu. Chwyć krawędź operculum (okrągłego włazu na przedniej górnej części powłoki poczwarki) za pomocą pęsety.</li>
	<li>Ostrożnie podnieś, usuń i odrzuć operculum, odsłaniając głowę niedojrzałej muchy.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby zacząć rozdzierać powłokę poczwarki wzdłuż jej boku. Podnieś środkową część powłoki od strony rozdarcia i przesuń ją na przeciwną stronę, usuwając ją całkowicie lub przyklejając do taśmy, odsłaniając klatkę piersiową i przednią część odwłoka. (Uwaga: Pomiędzy rozwijającą się muchą a powłoką poczwarki istnieje szczelina. Należy uważać, aby nie przebić muchy podczas rozdzierania ścianki powłoki).</li>
	<li>Zacznij przecinać powłokę poczwarki wzdłuż tej samej strony w kierunku końca tylnego. Ponownie uważaj, aby nie przebić muchy. Odsuń powłokę poczwarki na przeciwną stronę muchy i dociśnij ją do dwustronnej taśmy. Odwłok powinien być teraz w pełni odsłonięty. Umieść pędzelek z miękkim włosiem bezpośrednio pod głową muchy. Gdy mucha przyklei się do pędzelka i zostanie uwolniona z powłoki poczwarki, użyj pędzelka, aby delikatnie podnieść muchę ze szkiełka.</li>
</ol>
2. Montaż poczwarek
Po przeprowadzeniu sekcji poczwarki są następnie montowane pomiędzy szkiełkiem a nakrywką:
<ol start="8">
	<li>Wyizolowane poczwarki usunięte z kokonu można następnie umieścić na środku szkiełka przedmiotowego stroną grzbietową do góry.</li>
	<li>Przygotować kwadratową ramkę z papieru Whatman o wymiarach 18X18 mm z otworem 10X10 mm w środku. Zanurzyć papier w wodzie aż do nasycenia. Umieścić ramkę wokół poczwarki.</li>
	<li>Używając strzykawki 5 cc wypełnionej silikonowym smarem próżniowym, nanieść równą warstwę smaru wokół ramki z papieru Whatman. Warstwa smaru powinna mieścić się w obrębie szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1), a jej grubość powinna być tylko nieco większa niż średnica poczwarki.</li>
	<li>Nanieść małą kroplę wody (1 μl) na środek szkiełka nakrywkowego o wymiarach 2X2 mm i położyć szkiełko na powyższej preparacji tak, aby kropla wody stykała się z powierzchnią przeznaczoną do obrazowania (w tym przypadku z notum). Delikatnie docisnąć, aby utworzyć szczelną warstwę smaru próżniowego i płaską powierzchnię styku między szkiełkiem nakrywkowym a kutykulą poczwarki.</li>
	<li>Preparat można następnie obrazować na mikroskopach odwróconych lub prostych, wykorzystując epifluorescencję, mikroskopię konfokalną (typu laserowego lub z dyskiem wirującym) lub dwufotonową mikroskopię konfokalną. Przy zachowaniu ostrożności, po kilku dniach można odzyskać dorosłe muchy.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Wykorzystując linię Gal4 specyficzną dla SOP (neuralized-Gal4) skrzyżowaną z białkami znakowanymi GFP w celu obrazowania wrzeciona podziałowego (tubulina lub Tau-GFP) lub białek histonowych (H2B-GFP), można obserwować płaszczyznę podziału komórek SOP, długość cyklu komórkowego lub liczbę podziałów mitotycznych za pomocą obrazowania time-lapse 9. Inne białka fuzyjne celujące w organella komórkowe, takie jak Rab-GTPazy służące do znakowania różnych przedziałów endocytarnych (Rab5-GFP dla wczesnych endosomów lub Rab1 GFP dla endosomów recyklingujących) lub białka istotne w regulacji sygnalizacji Notch (Numb-, Partner of Numb -GFP lub Sanpodo-GFP), mogą dostarczyć ważnych informacji na temat mechanizmów asymetrycznego podziału komórkowego oraz transportu białek błonowych 2,3,7,10,1.
<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="Schemat przygotowania poczwarek Drosophila oraz sekwencja obrazów mikroskopowych do badań biologicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Disekcja i montaż poczwarki. A. Kolejne obrazy przedstawiają procedurę usuwania poczwarki oraz przygotowania nienaruszonych poczwarek do montażu i obrazowania żywych komórek. Poczwarki są wyjmowane z fiolki i umieszczone grzbietem do góry na dwustronnej taśmie klejącej przyklejonej do szkiełka przedmiotowego. Pierwsza kolumna: usunięcie operculum i rozdarcia wzdłuż bocznej strony poczwarki. Druga kolumna: usunięcie poczwarki z obszaru klatki piersiowej i odwłoka. Następnie wolna poczwarka jest podnoszona z otoczki poczwarkowej za pomocą pędzla z miękkim włosiem. B. Montaż poczwarki między szkiełkiem a nakrywekrem. Poczwarkę umieszcza się grzbietem do góry na szkiełku przedmiotowym, otaczając ją zwilżoną ramką z papieru Whatman. Ciągła warstwa silikonowego smaru próżniowego, naniesiona z 5-mililitrowej strzykawki, służy do uszczelnienia połączenia szkiełka z nakrywką, chroniąc poczwarkę przed wysychaniem i unosząc nakrywkę tak, aby delikatnie opierała się ona o tułów poczwarki. Mała kropla wody (1 μl) na styku szkiełka nakrywkowego i kutykuli klatki piersiowej znacznie poprawia jakość obrazu przy zastosowaniu obiektywów imersyjnych (wodnych lub olejowych). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="Proces podziału komórkowego; mikroskopia; lokalizacja białek; analiza struktury komórki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy żywych komórek SOP oraz zróżnicowanych zewnętrznych organów sensorycznych, wykonane przy użyciu naszej procedury sekcji i montowania poczwarek. AObrazy wyodrębnione z serii czasowej komórki SOP w fazie mitozy, wykazującej ekspresję białka fuzyjnego aktyna-GFP pod kontrolą zneuralizowaneGal4 (neur-Gal4/UAS-actin-GFP), zwróć uwagę na akumulację aktyny w korze w obrębi bruzdy podziałowej (1 obraz co 2 minuty). BSOP komórki potomne koekspresyjne dla białek Partner of Numb-RFP (czerwony) i Rab5-GFP sterowane przez zneuralizowaneGal4, zwróć uwagę na asymetryczny rozkład Pon-RFP w jednej z komórek potomnych (pIIb) oraz rozkład wczesnych endosomów w obu komórkach potomnych. CRendering wolumetryczny serii przekrojów z (z-series) zróżnicowanych zewnętrznych organów sensorycznych w późnym stadium poczwarki. Struktury kutykuli, takie jak szczecinki mechanosensoryczne i włosy epidermalne, są widoczne dzięki autofluorescencji kutykuli (kolor czerwony). Dodatkowo zastosowano system MARCM w celu ekspresji Lgl-GFP (pod kontrolą zneuralizowanyGal4) w podzbiorze komórek prekursorowych organów zmysłowych (zielony). (Wszystkie obrazy zostały zarejestrowane przy użyciu skanującego mikroskopu konfokalnego Nikon C1 z obiektywem 60X 1,45 N.A.)

<ol><li>Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+Drosophila+microchaete+lineage%3A+a+novel+intrinsically+asymmetric+cell+division+generates+a+glial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell.</a> Development. 126, 3573-3584 (1999).</li>
<li>Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+asymmetric+divisions+in+the+Drosophila+sensory+organ+precursor+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two types of asymmetric divisions in the Drosophila sensory organ precursor cell lineage.</a> Nat Cell Biol. 3, 58-67 (2001).</li>
<li>Bellaiche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+regulates+localization+of+cell-fate+determinants+and+mitotic+spindle+rotation+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division.</a> Nat Cell Biol. 3, 50-57 (2001).</li>
<li>Emery, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+dynamics+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosome dynamics during development.</a> Curr Opin Cell Biol. 18, 407-415 (2006).</li>
<li>Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bazooka+is+required+for+localization+of+determinants+and+controlling+proliferation+in+the+sensory+organ+precursor+cell+lineage+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bazooka is required for localization of determinants and controlling proliferation in the sensory organ precursor cell lineage in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 14469-14474 (2001).</li>
<li>Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+unanticipated+alleles+of+lethal+giant+larvae+in+Drosophila+second+chromosome+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Frequent unanticipated alleles of lethal giant larvae in Drosophila second chromosome stocks.</a> Genetics. 182, 407-410 (2009).</li>
<li>Tong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+independently+antagonizes+Sanpodo+membrane+targeting+and+Notch+signaling+in+Drosophila+sensory+organ+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Numb independently antagonizes Sanpodo membrane targeting and Notch signaling in Drosophila sensory organ precursor cells.</a> Mol Biol Cell. 21, 802-810 (2010).</li>
<li>Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+Component+of+the+Exocyst%2C+Promotes+Notch+Signaling+during+the+Asymmetric+Division+of+Drosophila+Sensory+Organ+Precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a Component of the Exocyst, Promotes Notch Signaling during the Asymmetric Division of Drosophila Sensory Organ Precursors.</a> Dev Cell. 9, 351-363 (2005).</li>
<li>Karbowniczek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionarily+conserved+TSC%2FRheb+pathway+activates+Notch+in+tuberous+sclerosis+complex+and+Drosophila+external+sensory+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The evolutionarily conserved TSC/Rheb pathway activates Notch in tuberous sclerosis complex and Drosophila external sensory organ development.</a> J Clin Invest. 120, 93-102 (2010).</li>
<li>Coumailleau, F., Furthauer, M., Knoblich, J. A., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Delta+and+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division.</a> Nature. 458, 1051-1055 (2009).</li>
<li>Emery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+rab11+endosomes+regulate+delta+recycling+and+specify+cell+fate+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric rab11 endosomes regulate delta recycling and specify cell fate in the Drosophila nervous system.</a> Cell. 122, 763-773 (2005).</li>
<li>Justice, N., Roegiers, F., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+giant+larvae+acts+together+with+numb+in+notch+inhibition+and+cell+fate+specification+in+the+Drosophila+adult+sensory+organ+precursor+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Lethal giant larvae acts together with numb in notch inhibition and cell fate specification in the Drosophila adult sensory organ precursor lineage.</a> Curr Biol. 13, 778-783 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W tym filmie przedstawiamy technikę izolowania i montowania poczwarek Drosophila do obrazowania żywych komórek SOP w notum poczwarki. Usunięcie poczwarek z poczwarkowej osłonki wymaga pewnej ręki, odpowiednich narzędzi i pewnej wprawy, lecz jest łatwe do opanowania. Ważne jest, aby precyzyjnie określić stadium rozwoju poczwarek, co zapewni względną łatwość preparacji i pozwoli uchwycić fazę proliferacji rozwoju SOP. Po zamontowaniu poczwarki będą nadal rozwijać się pomiędzy szkiełkiem a nakryweką i w większości przypadków osiągną stadium imago w poczwarce, a ostatecznie przejdą przeobrażenie. W naszym doświadczeniu komórki można obrazować przez kilka godzin. Ta technika montowania nie ogranicza się do obserwacji komórek prekursorowych PNS na klatce piersiowej poczwarki, ale może być wykorzystana do wizualizacji wszystkich komórek znajdujących się blisko powierzchni kutykuli i dostępnych dla obiektywu mikroskopu (należy zauważyć, że obserwacje prowadzone są w stadium, w którym osłonkę poczwarki można usunąć bez zabicia poczwarki, zazwyczaj około 10 do 14h po uformowaniu puparium). Z sukcesem wizualizowaliśmy białka połączeń, białka cytoszkieletowe oraz regulatory transportu pęcherzykowego w komórkach nabłonkowych poczwarki (dane niepublikowane).
Technika montażu poczekonek pozwoliła nam również opracować metodę obrazowania struktur kutykularnych w późnych stadiach poczekonek przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego, w celu wizualizacji morfologii szczecinek mechanosensorycznych i włosków epidermalnych z wykorzystaniem wewnętrznej autofluorescencji kutykuli. Obrazy te przypominają mikrografie z transmisyjnego mikroskopu elektronowego kutykuli muchy, ale mogą być pozyskiwane z żywych zwierząt i pozwalają na jednoczesną wizualizację morfologii kutykularnej oraz ekspresji fluorescencji GFP 6,7,12.

<table><tbody><tr><td>dwustronna taśma klejąca Scotch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko podstawowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełko nakrywkowe 18 mm x 18 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>papier Whatman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy smar próżniowy</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny lub epifluorescencyjny</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek prekursorowych organów zmysłowych w nienaruszonych poczwarkach drosophila

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Od czasu odkrycia zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) nastąpiła rewolucyjna zmiana w wykorzystaniu obrazowania żywych komórek jako narzędzia do zrozumienia fundamentalnych mechanizmów biologicznych. Wyjątkowy postęp jest szczególnie widoczny w przypadku Drosophila, którego rozbudowany zestaw mutantów i linii transgenicznych stanowi dogodny model do badania konserwatywnych ewolucyjnie mechanizmów rozwojowych i biologii komórki. Naszym celem jest zrozumienie mechanizmów kontrolujących specyfikację losu komórek w dorosłym obwodowym układzie nerwowym (PNS) u Drosophila. Szczecinki pokrywające głowę, klatkę piersiową, odwłok, odnóża i skrzydła dorosłej muchy są poszczególnymi organami mechanoreceptywnymi i były badane jako system modelowy służący do zrozumienia mechanizmów decyzji o losie komórek zależnych od białka Notch. Komórki prekursorowe organów sensorycznych (SOP) mikrochaet (czyli małych szczecinek) są rozmieszczone w całym nabłonku klatki piersiowej poczwarki i ulegają specyfikacji w ciągu pierwszych 12 godzin po rozpoczęciu pupariacji. Po specyfikacji komórki SOP zaczynają się dzielić, segregując determinant losu komórkowego Numb do jednej komórki potomnej podczas mitozy. Numb działa jako autonomicznie komórkowy inhibitor szlaku sygnalizacyjnego Notch.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę śledzenia dynamiki białek w komórkach SOP oraz ich potomstwie w obrębie nienaruszonego klatki piersiowej poczwarki, wykorzystując kombinację tkankowo-specyficznych driverów Gal4 oraz białek fuzyjnych znakowanych GFP 1,2. Technika ta posiada przewagę nad utrwalonymi tkankami lub hodowanymi eksplantami, ponieważ pozwala na śledzenie pełnego rozwoju organu — od specyfikacji prekursora neuronalnego po wzrost i terminalne różnicowanie narządu. Dzięki temu możemy bezpośrednio powiązać zmiany w zachowaniu komórek ze zmianami w terminalnym różnicowaniu. Ponadto możemy połączyć technikę obrazowania na żywo z systemem mozaikowej analizy z represyjnym markerem komórkowym (MARCM), aby ocenić dynamikę znakowanych białek w mitotycznych komórkach SOP w warunkach mutantowych lub typu dzikiego. Wykorzystując tę technikę, my oraz inni badacze zdobyliśmy nową wiedzę na temat regulacji asymetrycznego podziału komórek oraz kontroli aktywacji sygnalizacji Notch w komórkach SOP (przykłady znajdują się w referencjach 1-6,7 ,8).

W tym filmie opisujemy metodę obrazowania żywych komórek w celu obserwacji asymetrycznego podziału komórek progenitorowych organów sensorycznych oraz komórek epidermy w nienaruszonych poczwarkach Drosophila

Obrazowanie żywych komórek prekursorowych organów zmysłowych w nienaruszonych poczwarkach Drosophila

Od czasu odkrycia zielonej białka fluorescencyjnego (GFP) nastąpiła rewolucyjna zmiana w wykorzystaniu obrazowania żywych komórek jako narzędzia do zrozumienia ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie much *Drosophila* do obrazowania żywych komórek dzielących się progenitorów torakalnych organów sensorycznych lub komórek SOP podczas przeobrażenia. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie odpowiedniego krzyżowania genetycznego w celu uzyskania potomstwa do obrazowania żywych komórek. Drugim krokiem procedury jest zebranie larw w odpowiednim stadium, aby móc wizualizować asymetrycznie dzielące się neurony progenitorowe.Trzecim krokiem procedury jest usunięcie poczwarki, aby umożliwić zamocowanie poczwarki do obrazowania. Ostatnim krokiem procedury jest umieszczenie poczwarki pomiędzy szkiełkiem a nakryciem i przystąpienie do obrazowania żywych komórek. W rezultacie można uzyskać wyniki pokazujące dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie podczas asymetrycznego podziału komórek i różnicowania komórek organów sensorycznych typu dzikiego lub mutantów, wykorzystując mikroskopię epifluorescencyjną lub konfokalną.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia, jest możliwość śledzenia dynamiki białek w czasie rzeczywistym i w ciągu kilku godzin w nienaruszonej tkance. Z pożądanej linii gal4 i białka fuzyjnego z tagiem GFP, pod kontrolą UAS, zidentyfikuj pupy, które przeszły transformację w ciągu godziny. Pupy te będą posiadać charakterystyczną morfologię oczu, ale nie będą posiadały pigmentacji.Wybrane poczwarki można przenieść do nowego naczynia lub oznaczyć w naczyniu zbiorczym, aby zapamiętać, które z nich były białe. Po 18 godzinach, gdy poczwarki osiągną odpowiedni stopień rozwoju, naklej kawałek dwustronnej taśmy na szkiełko przedmiotowe i przymocuj poczwarkę do szkiełka stroną brzuszną do dołu pod mikroskopem stereoskopowym. Zidentyfikuj i chwyć krawędź URM za pomocą pęsety, a następnie delikatnie ją unieś, odsłaniając głowę niedojrzałej muchy.Należy uważać, aby nie przebić ciała muchy. Ostrożnie rozerwać bok poczwarki i całkowicie ją usunąć, aby odsłonić tułowiu oraz przednią część odwłoka. Kontynuować ostrożne rozdzieranie tej samej strony w kierunku tylnym, a następnie odsunąć powłokę poczwarki na przeciwną stronę i przykleić ją do taśmy.Po całkowitym odsłonięciu odwłoka, delikatnie wsuń pędzelek z miękkim włosiem pod głowę poczwarki i oddziel ją od reszty kokonu. Umieść poczwarkę na szkiełku mikroskopowym stroną grzbietową do góry. Ustaw poczwarkę pod kątem 45 stopni w taki sposób, aby szkiełko nakrywki dotykało obszaru komórek SOP klatki piersiowej. Najpierw przygotuj z papieru filtracyjnego Watman ramkę o wymiarach 18 na 18 milimetrów, wycinając w jej centrum okno o wymiarach 10 na 10 milimetrów.Zanurz ramkę w wodzie aż do nasycenia, a następnie umieść ją wokół poczwarki. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 cc nanieś równomierną warstwę smaru silikonowego wokół ramki w taki sposób, aby grubość warstwy była tylko nieznacznie większa od średnicy źrenicy. Nanieś pipetą około 1 µL wody na środek szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 by 22 mm i ustaw szkiełko tak, aby kropla dotykała nodomu źrenicy.Naciśnij delikatnie, aby stworzyć szczelną i płaską powierzchnię przylegającą do poczwarki. Po zamontowaniu żywej poczwarki można przeprowadzić obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej, łącząc techniki preparowania i montażu. Dzięki obrazowaniu na żywo można zwizualizować akumulację białka fuzyjnego GFP z aktyną w bruzdzie podziałowej mitotycznej komórki SOP.W miarę upływu czasu można porównać rozmieszczenie partnera Num RFP oraz RAB 5G FP w dwóch komórkach potomnych SOP. Należy zauważyć, że podczas gdy partner Num RFP jest rozłożony asymetrycznie, RAB 5G FP jest rozłożony równomiernie w obu komórkach w późnych stadiach rozwoju źrenicy. Różnicowane zewnętrzne organy sensoryczne można zwizualizować; gniazda sensoryczne i włoski wykazują autofluorescencję i są tutaj pokazane jako nakładające się na L-G-L-G-F-P wyrażane w podzbiorze komórek SOP.Korzystając z systemu Markem. Po opanowaniu tej techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura może zająć mniej niż 10 minut. Po zastosowaniu tej metody można przeprowadzić inne analizy, takie jak immunohistochemia, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. identyfikacji siarczanów komórek organów zmysłów za pomocą specyficznych markerów przeciwciał lub badanie kolokalizacji białek fuzyjnych GFP z białkami endogennymi.

live-cell-imaging-sensory-organ-precursor-cells-intact-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie żywych komórek prekursorów narządów zmysłowych w nietkniętych poczwarkach Drosophila

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Tutaj omawiamy proces przygotowania, sekcji, montażu i obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster, aby obserwować dynamikę komórkową i subkomórkową w warunkach fizjologicznych.

Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster

Tutaj przedstawiono protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w fazie poczwarki, obejmujący całkowite usunięcie poczwarki. Protokół ten można również zastosować do innych tkanek.

Długoterminowe obrazowanie na żywo rozwoju nogi poczwarki Drosophila po usunięciu pupary

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek prekursorowych narządów zmysłowych w nienaruszonych poczwarkach Drosophila. Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki białek podczas asymetrycznego podziału komórkowego w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie żywych komórek prekursorowych organów zmysłowych w nienaruszonych poczwarkach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów