In vivo laserowa aksonotomia u C. elegans
19 maja 2011
Przedstawiono protokół przecinania neuronów u C. elegans przy użyciu impulsowego lasera MicroPoint. Opisujemy konfigurację systemu, unieruchamianie nicieni oraz przecinanie znakowanych neuronów. Zalety obejmują relatywnie niski koszt systemu oraz możliwość przecinania wypustek neuronalnych lub ablacji komórek in vivo.
Ogólnym celem tej procedury jest precyzyjne przecięcie neuronów CL u nicieni za pomocą lasera in vivo. Osiąga się to poprzez montaż systemu do takotomii oraz precyzyjne ogniskowanie, wyrównanie i regulację mocy lasera. Gdy nicienie zostaną unieruchomione na szkiełku przedmiotowym, ich neurony można przeciąć z precyzyjną kontrolą przestrzenną i czasową.
Stopień regeneracji przeciętych neuronów jest następnie mierzony poprzez ocenę liczby stożków wzrostu lub poprzez pomiar długości neurytów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak laser femtosekundowy, jest fakt, że laser impulsowy z mikroogniwkiem stanowi kosztowo efektywny system, który jest łatwy w konfiguracji i konserwacji oraz łatwo adaptowalny do szerokiego zakresu zastosowań. Choć zazwyczaj stosujemy tę metodę do badania regeneracji neuronów ruchowych GABA, system ten może być również wykorzystany do ablacji innych typów komórek, takich jak mięśnie skóry lub specyficzne synapsy neuronalne.
Ta metoda wymaga zastosowania systemu lasera mikro punktowego. Laser montuje się w porcie epi-fluorescencyjnym mikroskopu złożonego; system obejmuje pojedynczy filtr dichroiczny dopasowany do fluoroforu w komórkach przeznaczonych do cięcia, generator impulsów oraz pedał nożny do obsługi lasera. Mikroskop powinien być wyposażony co najmniej w obiektyw olejowy 100x 1,4 NA oraz obiektyw 4x.
Należy zastosować zmotoryzowany stolik z obsługą za pomocą dżojstika, zamontowany na stole pneumatycznym w celu zapewnienia odpowiedniego oświetlenia. Do mikro-lasera punktowego przymocowane jest źródło światła z prowadnikiem i mechanizmem przysłony. Mechanizm przysłony jest przydatny do niezależnego od lasera ograniczania intensywności oświetlenia.
Kamera podłączona do komputera musi posiadać częstotliwość odświeżania co najmniej 16 hertz i sprawnie działać w warunkach ograniczonego oświetlenia. Komputer wymaga oprogramowania do obrazowania, takiego jak Nikon elements, w celu wizualizacji neuronów, sterowania kamerą oraz obsługi zmotoryzowanego stolika. Po pełnym złożeniu zestawu użytkownik może jedną ręką ustawiać ostrość mikroskopu, drugą przesuwać stolik, a za pomocą pedału aktywować laser, mając jednocześnie wyraźny podgląd obrazu na ekranie.
Przecinanie neuronów w organizmie o rozmiarach ziarnka piasku może być wyzwaniem. Aby to osiągnąć, wiązka lasera musi być ściśle skupiona w trzech wymiarach. Rozpocznij od ustawienia ostrości w płaszczyźnie Z.
Wsuń filtr gęstości neutralnej ND 16, aby osłabić wiązkę lasera podczas precyzyjnego ustawiania ostrości, wsuwając jednocześnie filtr ND 16 oraz cztery filtry fluorescencyjne ND. Następnie ustaw laser mikro punktowy na jeden impuls za pomocą przełącznika wyboru, a następnie obróć koło filtrowe do odpowiedniego filtru barierowego długoprzepustowego. Teraz umieść lustrzany szkiełko na stoliku i ustaw ostrość na znajdujące się w nim otwory pinhole, korzystając z obiektywu 4x i światła przechodzącego.
Po ustawieniu ostrości nanieść kroplę olejku imersyjnego na preparat i ponownie ustawić ostrość na otworki (pinholes) za pomocą obiektywu 100x. Następnie użyć dźwigni przełączającej ścieżkę optyczną, aby otworzyć migawkę kamery i migawkę lasera. Jeśli uzyskanie dokładnej ostrości jest utrudnione, należy zmniejszyć natężenie światła przechodzącego, aby krawędzie otworka były wyraźne.
Aby przetestować ogniskowanie, użyj pedału, aby uruchomić laser. Jeśli płaszczyzna Z jest prawidłowo ustawiona, w lustrze powinien pojawić się mały otwór. Teraz ustaw ostrość mikroskopu nieco powyżej płaszczyzny lustrzanego preparatu i ponownie uruchom laser.
Powinno to spowodować powstanie otworu jeszcze mniejszego niż przy pierwszym strzale lub nie pozostawić żadnego śladu. Te same wyniki powinny być widoczne podczas ogniskowania poniżej lustrzanego preparatu. Jeśli jednak powstanie większy otwór, należy ponownie ustawić ostrość lasera za pomocą pierścienia regulacji ogniska w głowicy ablacyjnej.
Na koniec sprawdź, czy otwór jest nadal prawidłowo wyrównany z nitkami w okularze. Przy regularnym użytkowaniu rzadko zachodzi potrzeba regulacji ostrości w płaszczyźnie Z. Aby ustawić ostrość lasera w płaszczyźnie XY, wykonaj kolejny otwór w lustrze, a następnie uruchom oprogramowanie Nikon elements.
Uruchom tryb podglądu na żywo w menu akwizycji. Na pasku narzędzi pomiarowych wybierz edytor ROI, zaznacz narzędzie podwójnego krzyża i przesuń go tak, aby wycentrować celownik względem nowego otworu. Kliknij zapisz ROI, a następnie wyjdź z edytora, aby powrócić do podglądu na żywo.
Aby sterować stolikiem za pomocą myszy, aktywuj ustawienie myszy XY. Laser jest teraz w ogniskowej. Przywróć filtry gęstości neutralnej do ich pierwotnego położenia i ustaw liczbę impulsów lasera z jednego na 10 do późniejszego użycia.
W pierwszej kolejności należy przygotować 3% roztwór stopionego aros w roztworze M nine i odmierzyć około 5 ml do probówki o pojemności 50 ml. Probówkę należy umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze od 55 do 65 °C, a pozostałą część roztworu przechowywać do późniejszego użycia. Następnie należy przygotować dwa szkiełka przedmiotowe z etykietami.
Przyklej taśmą parę czystych szkiełek i nanieś kroplę agarozy, aby stworzyć podkładkę, na której zostaną umieszczone nicienie. Po 30 sekundach agaroza stężeje; za pomocą pipety nanieś od 3 do 5 µL kulek polistyrenowych o średnicy od 0,05 do 0,1 µm na podkładkę. W ciągu 10 minut szybko przenieś za pomocą platynowej igły od 5 do 10 nicieni transgenicznych na kulki, tak aby ich znakowane neurony były łatwo widoczne. Aby uniknąć uszkodzenia nicieni, ostrożnie nałóż na nie standardowe szkiełko nakrywki.
Przesuń go w odpowiednie miejsce. Preparat z nicieniami jest teraz gotowy do przeprowadzenia analizy taksonomicznej. Używając okularu, zlokalizuj nicienie przy powiększeniu czterokrotnym, a następnie ustaw ostrość przy użyciu obiektywu 100x, wyłącz światło przechodzące, włącz fluorescencję i przełącz ścieżkę optyczną na kamerę.
Używając myszy, wycentruj neuron na krzyżu celownika. Następnie uruchom laser za pomocą pedału. Odpowiednia moc lasera pozwoli przeciąć neuron w jeden lub dwa impulsy.
Zbyt duża moc lasera spowoduje uszkodzenia obwodowe lub wypalenie otworu w robaku; aby dostosować moc lasera, należy przesuwać płytkę tłumika. Jeśli wiązka lasera osłabnie, można skorygować położenie płytki tłumika, aby kontynuować cięcie. Może to jednak wskazywać na konieczność wymiany ogniwa D w laserze, gdy procedura jest przeprowadzana prawidłowo.
Taksotomia laserowa powoduje niewielkie przerwanie neuronu. W niektórych przypadkach wokół miejsca urazu może utworzyć się mała blizna. W praktyce u każdego zwierzęcia przecina się od jednego do trzech neuronów, jednak teoretycznie nie ma żadnego ograniczenia.
Po zakończeniu odzyskaj nicienie, zdejmując szkiełko nakrywkowe zdecydowanym ruchem w górę, dbając o to, aby nicienie pozostały na podkładce z agrozylu. Nie zsuwaj szkiełka nakrywkowego. Użyj pęsety anatomicznej, aby wyciąć fragment podkładki wokół nicieni.
Umieść podkładkę na świeżo zaszczepionej płytce NGM zawierającej OP 50 i uwolnij nicienie za pomocą 10 µL sterylnego roztworu M9. Regenerację można ocenić od ośmiu do 48 godzin po exotomii; aby to zrobić, ponownie zamocuj zdrowe nicienie w 3–5 µL kulek polistyrenowych i zwizualizuj ich neurony w miejscu przecięcia neuronów. Pozostanie pień neuronalny dystalny względem miejsca cięcia. Zarówno pień dystalny, jak i proksymalny początkowo cofają się po przecięciu, jednak regeneracji oczekuje się z pnia proksymalnego.
Regenerację można ocenić na podstawie formowania się stożka wzrostu. Alternatywnie można śledzić i porównywać długość neurytów; zazwyczaj od 60 do 70% neuronów GABA tworzy stożki wzrostu w ciągu 24 godzin od przecięcia. Jeśli laser nie tnie prawidłowo, prawdopodobnie wynika to z braku ostrości wiązki lub konieczności wymiany barwnika w komórce z barwnikiem.
Jeśli zauważą Państwo, że nicienie się poruszają, prawdopodobnie wynika to z nadmiernej wilgotności podkładki agarowej. Stwierdziliśmy, że aby uniknąć tego problemu, należy odczekać około 30 s przed umieszczeniem nicieni na podkładkach. Dodatkowo, w celu unieruchomienia nicieni można spróbować zastosować mikrokulki o mniejszej średnicy.
Na koniec, jeśli zauważą Państwo, że aksony mają wygląd paciorkowaty, prawdopodobnie wynika to ze zbyt dużego wysuszenia podkładki agarowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat konfiguracji systemu laserowego mikro punktowego, montowania nicieni do taksotomii, przecinania pojedynczych neuronów oraz oceny ich późniejszej regeneracji.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół przecinania neuronów u C. elegans przy użyciu impulsowego lasera MicroPoint. Metoda ta umożliwia precyzyjne przecinanie oznakowanych neuronów in vivo, oferując tanią i elastyczną metodę dla różnorodnych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biologia komórki
Wstęp
- Technika ta koncentruje się na regeneracji neuronów ruchowych GABA.
- Zapewnia ona metodę przecinania neuronów in vivo z wysoką precyzją.
- Istniejące metody, takie jak lasery femtosekundowe, są droższe i bardziej złożone.
- System laserowy MicroPoint jest łatwiejszy w konfiguracji i konserwacji.
Cel badania
- Opracowanie protokołu precyzyjnego przecinania neuronów u C. elegans.
- Pomiar regeneracji przeciętych neuronów.
- Zaprezentowanie wszechstronności systemu laserowego MicroPoint.
Zastosowane metody
- Montaż systemu takotomii z laserem MicroPoint.
- Immobilizacja C. elegans na szkiełku mikroskopowym.
- Precyzyjne ogniskowanie i wyrównanie wiązki lasera.
- Pomiar regeneracji neuronów poprzez ocenę stożków wzrostu.
Główne wyniki
- Skuteczne przerwanie neuronów przy minimalnych uszkodzeniach obwodowych.
- Zdolność do przecięcia wielu neuronów u jednego zwierzęcia.
- Wykazana regeneracja neuronów po ablacji.
- Adaptowalność metody do innych typów komórek.
Wnioski
- System laserowy MicroPoint jest cennym narzędziem w badaniach z zakresu neuronauki.
- Metoda ta pozwala na precyzyjną kontrolę podczas przecinania neuronów.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różnorodne badania komórkowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjne modele urazów neuronalnych in vivo są niezbędne do minimalizowania ryzyka podczas walidacji celów w programach badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Ta metoda laserowej aksonotomii umożliwia powtarzalną, ilościową ocenę regeneracji aksonów w systemie podatnym na modyfikacje genetyczne, co wspiera poznanie mechanizmów ścieżek naprawczych. Dzięki zapewnieniu kosztowo efektywnej i skalowalnej platformy do badań nad urazami i regeneracją neuronów, metoda ta ułatwia podejmowanie wczesnych decyzji w procesie odkrywania celów wpływających na odporność i naprawę neuronów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływu czynników genetycznych i farmakologicznych na regenerację aksonów w zdefiniowanym obwodzie neuronalnym.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje powszechnie dostępny system laserowy impulsowy MicroPoint do spójnego i wysokoprecyzyjnego przecinania neuronów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera testowanie hipotez dotyczących konkretnych celów poprzez powiązanie modulacji genów lub szlaków sygnałowych z mierzalnymi efektami regeneracyjnymi.
Przesiew i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Umożliwia generowanie standaryzowanych modeli uszkodzeń neuronów, odpowiednich do przesiewowego badania genetycznych modyfikatorów lub małych cząsteczek wpływających na regenerację.
- Ilościowe wyniki: Pozwala na pomiar regeneracji poprzez ocenę formowania się stożków wzrostu lub śledzenie długości neurytów, co umożliwia porównania oparte na danych.
- Skalowalność: Ułatwia przeprowadzanie aksotomii wielu neuronów w licznych osobnikach podczas jednego eksperymentu, zwiększając wydajność analizy fenotypowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Zapewnia platformę mechanistyczną do badania konserwowanych szlaków regeneracyjnych, które można zastosować w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrywanie celów genetycznych w *C. elegans* z ich walidacją w preklinicznych systemach wyższego rzędu.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala ustalić, czy dany cel działa w sposób autonomiczny w neuronach, wpływając na zdolność regeneracyjną.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając walidację celu poprzez fenotypowy screening wyników regeneracji przed przystąpieniem do identyfikacji związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia funkcjonalne testowanie szlaków naprawy neuronów poprzez indukowanie kontrolowanego uszkodzenia aksonów i monitorowanie regeneracji.
- Przesiewanie: Pozwala na tworzenie mierzalnych i powtarzalnych modeli uszkodzeń do oceny wpływu związków chemicznych lub modyfikacji genetycznych na odpowiedzi regeneracyjne.
- Analityka: Generuje mierzalne punkty końcowe, takie jak częstość występowania stożków wzrostu i wydłużanie neurytów, w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera ekstrapolację międzygatunkową mechanizmów regeneracji zidentyfikowanych u nicieni na modele ssaków.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi modularną i adaptacyjną platformę do badań nad uszkodzeniami neuronów, którą można zastosować w wielu projektach z zakresu neuronauki.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia przejrzystość mechanizmów naprawy neuronów oraz walidację celów w procesach neurodegeneracji.
- Wartość operacyjna: Stanowi kosztowo efektywną i powtarzalną alternatywę dla systemów laserowych femtosekundowych w aksonotomii in vivo.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność w podejmowaniu decyzji go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności w fenotypach regeneracji modulowanych przez cele.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o walidację funkcjonalną w modelu uszkodzenia neuronów.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Do niezawodnego przeprowadzenia procedury wymagana jest wiedza z zakresu bezpieczeństwa laserowego,yustowania optycznego oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymagany jest impulsowy system laserowy MicroPoint, mikroskop fluorescencyjny z obiektywem olejowym 100x oraz zmotoryzowany stół do manipulacji nicieniami.
- Standaryzacja unieruchomienia nicieni oraz ustawień mocy lasera jest niezbędna dla zapewnienia powtarzalności aksonotomii pomiędzy różnymi użytkownikami i doświadczeniami.
- Adaptacja do różnych typów neuronów zależy od znakowania fluorescencyjnego oraz dostępności docelowych neuronów in vivo.
- Ograniczenia praktyczne obejmują możliwość uszkodzeń obwodowych wynikających z niewłaściwej mocy lasera oraz zmienność w ocenie regeneracji w przypadku braku oceny w ślepym badaniu.
