Name: In vivo (in vivo) Aksotomia laserowa u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę precyzyjnego przecinania neuronów in vivo u C. elegans za pomocą lasera MicroPoint. Technika ta umożliwia badanie regeneracji neuronów GABA z kontrolą przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium Hammarlunda jest finansowana przez: granty NIH R01 NS066082-01 i T32GM007223, fundację Beckman Foundation oraz fundację Ellison Medical Foundation.

1. Montaż systemu
Szczegółowe komponenty naszego systemu zostały przedstawione poniżej. Po prawidłowym montażu użytkownik powinien móc ustawiać ostrość mikroskopu jedną ręką, przesuwać stolik drugą (za pomocą myszy lub joysticka), aktywować laser za pomocą pedału oraz mieć wyraźny podgląd obrazu na ekranie.
<ol>
	<li>Laser MicroPoint zamontowany do portu epi-fluorescencyjnego mikroskopu złożonego. Używamy modelu Nikon 80i, jednak jakikolwiek mikroskop badawczy, prosty lub odwrócony, powinien być odpowiedni. System MicroPoint zawiera specjalistyczny filtr dichroiczny, który musi być dopasowany do fluoroforu znakującego komórki przeznaczone do przecięcia. Przecinanie komórek znakowanych innymi fluoroforami wymaga dodatkowych filtrów dichroicznych. W skład systemu MicroPoint wchodzi również generator impulsów oraz pedał sterujący.</li>
	<li>Obiektyw olejowy 10x, 1,4 NA do przeprowadzania operacji i oceny regeneracji, oraz dodatkowe obiektywy niezbędne do lokalizacji próbki na szkiełku. Do operacji używamy obiektywu Nikon Plan Apo VC, a obiektyw 4x okazuje się przydatny do wstępnego ustawienia ostrości i odnalezienia próbki.</li>
	<li>Zmotoryzowany stolik z joystickiem. Stolik o niezwykle wysokiej precyzji i powtarzalności nie jest konieczny, ponieważ służy on jedynie do celowania. Używamy modelu Prior OptiScan II (patrz w dyskusji).</li>
	<li>Kamera. Kamera musi zapewniać częstotliwość odświeżania klatek wystarczającą do ustawienia ostrości i wycelowania w znakowany neuryt przy użyciu obiektywu 10x podczas wizualizacji obrazu na monitorze komputera. Podczas procedury aksonotomii preferujemy osłabianie światła iluminacyjnego, aby uniknąć potencjalnych efektów zakłócających wynikających z fotowyblaknięcia lub uszkodzeń (patrz pkt 1.7 poniżej). W związku z tym kamera musi być wystarczająco czuła, aby obsłużyć ten zredukowany poziom światła. Używamy kamery Hamamatsu Orca 05G i stwierdziliśmy, że obrazowanie przy 16,3 Hz jest wystarczające. Można zastosować równoważne kamery.</li>
	<li>Komputer, monitor i oprogramowanie do obrazowania sterujące kamerą. Dodatkowo wykorzystujemy oprogramowanie do obrazowania do sterowania zmotoryzowanym stolikiem za pomocą myszy (patrz w dyskusji).</li>
	<li>Stół pneumatyczny. Wymóg ten może być zależny od lokalizacji, ale ponieważ operacja jest przeprowadzana z obiektywem 10x, uważamy izolację od wibracji za niezbędną.</li>
	<li>Źródło światła z prowadnicą światłowodową i mechanizmem przysłony do wzbudzania fluoroforu. Prowadnica światłowodowa jest podłączona do systemu MicroPoint. Mechanizm przysłony jest przydatny do redukcji intensywności oświetlenia niezależnie od lasera. Używamy modelu Prior Lumen 20 lub Leica EL60 i osłabiamy do 80% całkowitej intensywności światła podczas aksonotomii.</li>
</ol>
2. Konfiguracja lasera
Wraz z systemem laserowym MicroPoint dostarczono szczegółowy protokół wstępnego wyrównania i ustawienia ostrości lasera. Zakładamy, że procedura ta została pomyślnie przeprowadzona podczas początkowej konfiguracji. Obejmuje ona wyrównanie lasera z nitką krzyża w okularze. Poniżej przedstawiamy protokół regularnej konserwacji ostrości i intensywności lasera.
Jak zaznaczono w instrukcji MicroPoint, impulsowy laser azotowy może spowodować poważne uszkodzenia ludzkiego oka. Należy zachować szczególną ostrożność i nigdy nie patrzeć bezpośrednio w wiązkę lasera. Po zainstalowaniu filtr barierowy powinien bezpiecznie blokować promieniowanie przechodzące przez okulary.
Przecinanie neuronów w organizmie o rozmiarach ziarnka piasku może być dużym wyzwaniem. Ponieważ obszar uszkodzenia wywołanego przez laser jest bardzo mały, niezbędna jest znajomość trójwymiarowej lokalizacji ogniska lasera, aby precyzyjnie skierować go na próbkę. Ognisko lasera odnajduje się za pomocą lustrzanego szkiełka. Najpierw sprawdzamy, czy położenie ogniska lasera w osi z pokrywa się z ogniskową toru obrazowania. Następnie lokalizacja ogniska uszkodzenia w płaszczyźnie x-y jest zaznaczona za pomocą celownika w oprogramowaniu do obrazowania.
Ustawianie ostrości w płaszczyźnie z
<ol>
	<li>Wsuń filtr gęstości neutralnej ND16 (Rysunek 1a). Filtry gęstości neutralnej stosuje się w drodze oświetlenia epifluorescencyjnego w celu osłabienia wiązki lasera podczas ustawiania ostrości. Aby uzyskać jeszcze precyzyjniejsze ogniskowanie, wsuń oba filtry fluorescencyjne: ND16 oraz ND4.</li>
	<li>Ustaw laser MicroPoint na 1 impuls, przełączając przełącznik w pozycję „Select” (Rysunek 1b), a następnie przesuń koło filtrowe na odpowiedni filtr barierowy długoprzepustowy (Rysunek 1c).</li>
	<li>Umieść lustrzany preparat na stole mikroskopu i przy użyciu obiektywu 4X oraz światła przechodzącego ustaw ostrość na znajdujące się w nim otwory (pinholes).</li>
	<li>Nanieś kroplę olejku immersyjnego na lustrzany preparat i ponownie ustaw ostrość na otwory, korzystając z obiektywu 100X. Otwórz migawkę kamery za pomocą dźwigni przełączającej drogę optyczną (Rysunek 1d) oraz migawkę lasera (Rysunek 1e). W razie potrzeby zmniejsz intensywność światła przechodzącego, aby krawędzie otworów były wyraźne, co ułatwi precyzyjne ustawienie ostrości.</li>
	<li>Naciśnij pedał. Jeśli laser jest prawidłowo ogniskowany, powinno to spowodować powstanie niewielkiego otworu w lustrze.</li>
	<li>Ustaw ostrość mikroskopu nieco powyżej płaszczyzny lustrzanego preparatu i ponownie wystrzel laserem. Powinno to utworzyć otwór jeszcze mniejszy niż przy pierwszym strzale lub nie zostawić żadnego śladu. Powtórz czynność, ustawiając ostrość poniżej lustrzanego preparatu.</li>
	<li>Jeśli w punkcie 2.5 nie powstanie otwór lub jeśli przy ogniskowaniu powyżej lub poniżej powierzchni lustra powstanie większy otwór, ponownie ustaw ostrość lasera za pomocą pierścienia ostrości na głowicy ablacyjnej. Sprawdź, czy otwór jest nadal prawidłowo wyrównany z nitką w okularze. Przy regularnym użytkowaniu ostrość w płaszczyźnie z rzadko wymaga regulacji.</li>
</ol>
Ustawianie ostrości w płaszczyźnie x-y 
<ol start="8">
	<li>Wykonaj powyższe kroki od 2.1 do 2.3 i naciśnij pedał, aby wykonać niewielki otwór w lustrzanej szkiełku.</li>
	<li>Uruchom tryb przechwytywania „Live” z menu „Acquire” w programie Elements. W pasku narzędzi „Measure” wybierz „ROI editor”, następnie wybierz narzędzie „double cross” i przesuń celownik tak, aby wyrównać go z centrum nowego otworu. Kliknij „Save ROI”, a następnie „Exit editor” i powróć do trybu przechwytywania Live.</li>
	<li>Aktywuj ustawienie „mouse XY” w programie Elements, aby móc sterować stolikiem za pomocą myszy.</li>
	<li>Przesuń filtr(y) neutralnej gęstości z powrotem do pozycji wyjściowej, ustaw liczbę impulsów lasera na 10 i wyjmij lustrzane szkiełko.</li>
</ol>
Regulacja mocy lasera
<ol start="12">
	<li>Moc lasera należy dostosować do minimalnej wartości niezbędnej do przecięcia wybranego neuronu. Moc reguluje się poprzez przesuwanie płytki tłumika (Rycina 1f) podczas przecinania żywych nicieni (opisano poniżej). Zbyt wysoka moc lasera spowoduje uszkodzenia obwodowe lub przepalenie otworu w organizmie nicienia. Zbyt niska moc lasera nie pozwoli na przecięcie neuronu. Po skonfigurowaniu systemu pozycja tłumika rzadko wymaga zmiany. Jeśli moc lasera spadnie i konieczne będzie przesunięcie płytki tłumika, aby kontynuować przecinanie, może to być sygnałem, że barwnik w komórce barwiącej wymaga wymiany (patrz sekcja dyskusja).</li>
</ol>
3. Unieruchomienie nicieni
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 3% stopionej agarozy w M9 (2mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 85mM NaCl, 1mM MgSO4). Odmierzyć 5 mL stopionej agarozy do probówki typu falcon o pojemności 15 mL. Inną probówkę napełnić wodą. Umieścić probówki w modułowym elemencie grzewczym ustawionym na 5°C. Napełnić element grzewczy wodą, aby stworzyć mini kąpiele wodne dla każdej probówki. Uwaga: agarozę można przygotować w dużych ilościach z wyprzedzeniem i ponownie stopić do kolejnych eksperymentów.</li>
	<li>Nakleić dwie warstwy taśmy znakującej na każdy z dwóch szkiełek oraz położyć czyste szkiełko pomiędzy nimi. Za pomocą plastikowej pipety z gruszką nanieść kroplę agarozy na środek czystego szkiełka, a następnie położyć kolejne szkiełko prostopadle do pierwszego, tak aby powstała podkładka agarozowa o grubości dwóch kawałków taśmy (Rycina 2). Po 30 sekundach usunąć jedno z dwóch szkiełeczek z podkładki. Przepłukać i przechowywać plastikową pipetę w napełnionej wodą probówce falcon do użytku z kolejnymi szkiełkami.</li>
	<li>Następnie w centrum podkładki nanieść 3-5 μL kulek polistyrenowych o rozmiarze 0.10 μm lub 0.05 μm. Dodać 5-10 nicieni wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego w neuronach będących przedmiotem badania. Jeśli badane neurony są rozmieszczone asymetrycznie po prawej lub lewej stronie nicienia, użyć igły platynowej, aby obrócić nicienie tak, aby właściwa strona była skierowana do góry. Nicienie muszą zostać umieszczone na szkiełkach w ciągu 10 minut od przygotowania podkładek agarozowych.</li>
	<li>Ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkę na nicienie. Po nałożeniu szkiełka nakrywki nie przesuwać go względem podkładki agarozowej, ponieważ spowoduje to uszkodzenie kutykuli i zniszczenie nicieni. Umieścić przygotowane szkiełko na stoliku mikroskopu.</li>
</ol>
4. Przecięcie neuronów
<ol>
	<li>Kieruj światło do okularów za pomocą dźwigni przełączającej ścieżkę optyczną. Ustaw ostrość na niciela przeznaczonego do cięcia, korzystając z obiektywu 4X, nanieś kroplę oleju na szkiełko nakrywkowe i przełącz na obiektyw 10X. Przełącz ścieżkę optyczną z powrotem na kamerę.</li>
	<li>Używając myszy, przesuń wybrany neuron pod środek krzyża celowniczego. Naciśnij pedał, aby uruchomić laser i przeciąć wypustek neuronalny. W razie potrzeby można zastosować dwie serie impulsów, aby przeciąć neuron. Na początku pomocne jest precyzyjne śledzenie, które neurony zostały przecięte w poszczególnych osobnikach, aby móc ocenić późniejszą regenerację. Prawidłowo wykonana aksonotomia laserowa powoduje niewielkie przerwanie neuronu, nie wyrządzając znaczących szkód w otaczającej tkance skóry ani w innych neuronach (patrz Rycina 3). W niektórych przypadkach w miejscu urazu może powstać niewielka blizna.</li>
	<li>Odzyskaj niciele, usuwając szkiełko nakrywkowe ruchem bezpośrednio w górę, uważając, aby zwierzęta pozostały na podkładce agarowej. NIE zsuwaj szkiełka nakrywkowego. Następnie wytnij fragment podkładki wokół nicieli za pomocą pęsety z wąskimi końcówkami i umieść ten fragment agaru na świeżo zaszczepionej płytce NGM zawierającej OP508. Nanieś 10 μL sterylnego roztworu M9 na podkładkę, aby uwolnić niciele z kulek i usunąć agar.</li>
</ol>
5. Ocena regeneracji neuronów
<ol>
	<li>Przygotować podkładkę agarozową zgodnie z opisem w kroku 2.2.</li>
	<li>Umieścić nicienie w 3-5 μL kulek polistyrenowych. Nałożyć szkiełko nakrywki. Preparaty można przygotowywać sekwencyjnie lub alternatywnie przygotować wszystkie nicienie wcześniej i przechowywać szkiełka w 10 cm szalkach hodowlanych, z których każda zawiera wilgotną chusteczkę Kimwipe w celu utrzymania wilgotności agarozy.</li>
	<li>Użyć obiektywu 100X, aby zwizualizować przerwane neurony. W wielu neuronach pozostanie pień neuronalny dystalnie w stosunku do miejsca przecięcia. Obecność tego pozostałego fragmentu traktujemy jako dowód na to, że neuron został rzeczywiście przerwany (Rycina 4). Obecność tego pnia pozwala odróżnić neuron, który został przecięty i zregenerowany, od neuronu, który nie został przecięty. Uwaga: zarówno pień dystalny, jak i proksymalny początkowo cofają się po przecięciu.</li>
	<li>Ocenić regenerację. Można określić szereg parametrów. Jednym z prostych testów jest sprawdzenie, czy uszkodzony neuron wytworzył stożek wzrostu (Rycina 4a) i zregenerował się, czy też nie (Rycina 4b). Alternatywnie można zmierzyć i porównać długość neurytu.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Jako przykład opisujemy charakterystykę regeneracji neuronów ruchowych kwasu γ-aminomasłowego (GABA). Neurony te, znajdujące się w brzuszny sznurze nerwowym i rozciągające swoje wypustki obwodowo w kierunku grzbietowego sznura nerwowego, są niezbędne dla prawidłowej lokomocji9. Neurony GABA można wizualizować poprzez ekspresję genetycznie kodowanego fluoroforu, takiego jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), pod kontrolą promotorów unc-47 lub unc-25 (odpowiednio szczepy EG1285 i CZ120, dostępne w C. elegans Genetic Center).
Zamocuj nicienie w stadium L4 zgodnie z opisem, odwróć je tak, aby neurony GABA po ich prawej stronie były skierowane ku górze, a następnie nałóż szkiełko nakrywką. Przetnij 1-3 komisury tylne w każdym nicieniu, w połowie odległości między sznurami grzbietowym a brzusznym. Unikaj przecinania komisur, które krzyżują się lub tworzą pęczki z innymi komisurami, ponieważ ich późniejsza ocena jest utrudniona. Odzyskaj nicienie zgodnie z opisem.
Od 18 do 24 godzin po udanej aksotomii nicienie powinny dojść do siebie po zabiegu i wykazywać prawidłowe zachowania lokomotoryczne oraz składanie jaj. Należy odrzucić osobniki martwe lub chore. Pozostałe nicienie należy ponownie zamontować zgodnie z opisem i ocenić regenerację. Zazwyczaj dążymy do oceny co najmniej 30 przeciętych neuronów na warunek eksperymentalny. U zwierząt oxIs12 typowo 60-70% przeciętych neuronów GABA L4 zainicjuje tworzenie struktury stożka wzrostu, co objawia się poszerzeniem błony na końcu oraz wydłużeniem kilku gałęzi neurytów, i przemieści się z miejsca cięcia (Rycina 4a). W wielu przypadkach stożki wzrostu przemieszczą się, aby ponownie połączyć się z grzbietowym sznurem nerwowym, sąsiednią komisurą neuronalną lub dystalnym kikutem. Pozostałe 30% neuronów albo nie zainicjuje wzrostu, tworząc kikut proksymalnie względem miejsca aksotomii, albo wydłuży jedynie niewielkie filopodia (Rycina 4b).
<img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="Układ mikroskopowy do analizy wzbudzenia i emisji optycznej; obejmuje mikroskop oraz komponenty laserowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. System aksonotomii z użyciem impulsowego lasera UVPoszczególne elementy to: (a) filtry ND, (b) selektor impulsów, (c) dźwignia koła filtrowego, (d) dźwignia przełączająca drogę optyczną, (e) migawka laserowa oraz (f) płyta tłumiąca.
<img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej z symbolami sił i momentów, ilustrujący koncepcje stanu równowagi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przygotowanie podkładki agarozowejAby przygotować podkładkę agarozową o pożądanej grubości, na dwóch szkiełkach przedmiotowych umieszcza się dwie warstwy taśmy (zielonej). Między pierwsze dwa szkiełka wkłada się kolejne szkiełko, a następnie na czyste szkiełko nakłada się kroplę agarozy. Na koniec, prostopadle do pierwszych trzech, kładzie się czwarte szkiełko, w wyniku czego powstaje podkładka o grubości dwóch kawałków taśmy.
<img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="Analiza wzrostu neuronów; obraz mikroskopowy; badanie rozwoju neuronów; obserwacja eksperymentalna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne aksonotomie neuronów GABA-ergicznychW typowym eksperymencie przecinane są komisury neuronów GABA w połowie bocznej strony ciała nicienia. Przecięta komisura jest przedstawiona bezpośrednio przed (panel lewy) i po (panel prawy) aksotomii. Wszystkie obrazy wykonano przy użyciu obiektywu olejowego 10X.
<img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna szlaków neuronalnych; strzałki wskazują struktury synaptyczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki aksonotomii neuronów GABAergicznych24 godziny po aksonotomii oceniono regenerację przerwanych aksonów. Na obrazie (a) przedstawiono regenerujący się akson z stożkiem wzrostu (strzałka), natomiast na obrazie (b) widoczny jest akson nieregenerujący się w postaci kikutu proksymalnego (strzałka). Na każdym panelu widoczny jest kikut dystalny każdego przeciętego aksonu (grot strzałki), co potwierdza przerwanie aksonu.

<ol><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li>
<li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage%2C+ephrin+signaling%2C+and+synaptic+branchi+ng%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branchi ng.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 15132-15137 (2007).</li>
<li>Yan, D., Wu, Z., Chisholm, A. D., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DLK-1+Kinase+Promotes+mRNA+Stability+and+Local+Translation+in+C.+elegans+Synapses+and+Axon+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The DLK-1 Kinase Promotes mRNA Stability and Local Translation in C. elegans Synapses and Axon Regeneration.</a> Cell. 138, 1005-1018 (2009).</li>
<li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+Functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: Functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li>
<li>Gabel, C. V., Antoine, F., Chuang, C., Samuel, A. D. T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li>
<li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li>
<li>Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1988).</li>
<li>McLntire, S. L., Jorgensen, E., Kaplan, J., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GABAergic+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The GABAergic nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364, 337-341 (1993).</li>
<li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in.</a> C. elegans. Optics Express. 15, 8521-8531 (2007).</li>
<li>Chung, S., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+A%3A+Materials+Science+%26+Processing%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Applied Physics A: Materials Science & Processing. 96, 335-341 (2009).</li>
<li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature Protocols. 5, 395-407 (2010).</li>
<li>Wang, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+axon+regeneration.+Current+Opinion+in+Neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of axon regeneration. Current Opinion in Neurobiology.</a> , Forthcoming (2010).</li>
<li>Huang, X., Cheng, H. -J., Tessier-Lavigne, M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAX-1%2C+a+Novel+PH%2FMyTH4%2FFERM+Domain+Cytoplasmic+Protein+Implicated+in+Netrin-Mediated+Axon+Repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">MAX-1, a Novel PH/MyTH4/FERM Domain Cytoplasmic Protein Implicated in Netrin-Mediated Axon Repulsion.</a> Neuron. 34, 563-576 (2002).</li>
<li>McIntire, S. L., Reimer, R. J., Schuske, K., Edwards, R. H., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+vesicular+GABA+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the vesicular GABA transporter.</a> Nature. 389, 870-876 (1997).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFang-Yen%2C+C+%22Laser+microsurgery+in+C.+elegans+in+Methods+in+Cell+Biology%3A+Caenorhabditis+elegans%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Laser microsurgery in C. elegans in Methods in Cell Biology: Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. , Elsevier Academic Press. Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Guo, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5, 531-533 (2008).</li>
<li>Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+precision+on-chip+small-animal+immobilization%2C+multi-photon+imaging+and+femtosecond-laser+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation.</a> Lab on a Chip. 8, 653-656 (2008).</li>
<li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 13891-13895 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li>
<li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior%2C+nerve+regeneration%2C+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 561-567 (2009).</li>
<li>Samara, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+in+vivo+femtosecond+laser+neurosurgery+screen+reveals+small-molecule+enhancer+of+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).</li>
<li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).</li>
<li>Sulston, J. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+cell+autonomy+during+postembryonic+development+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 78, 577-597 (1980).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Do przecinania neurytów u C. elegans wykorzystywano różne systemy laserowe, a ich wydajność została szczegółowo omówiona w kilku badaniach3,7,10,11. Laser MicroPoint użyty w naszym protokole jest systemem typu turnkey, który jest łatwy w konfiguracji i konserwacji oraz dostępny dla badaczy w niższej cenie niż system laserowy Ti-Szafir. W porównaniu z systemem Ti-Szafir oczekuje się jednak, że laser MicroPoint spowoduje uszkodzenie większego obszaru, co może być niekorzystne w niektórych zastosowaniach. W przypadku zapotrzebowania na system Ti-Szafir dostępny jest doskonały protokół dotyczący budowy takiego układu12.
Niniejszy protokół można przeprowadzić na różnych neuronach C. elegans; zauważamy jednak, że spodziewane są różnice w zdolnościach regeneracyjnych pomiędzy poszczególnymi typami neuronów13. Ponadto różne tła transgeniczne mogą wpływać na sukces regeneracji. Chociaż procent regenerujących się neuronów GABA jest dość spójny pomiędzy różnymi szczepami markerów transgenicznych, odnotowaliśmy ogólny, niewielki wzrost regeneracji u nicieni juIs7614 w porównaniu do oxIs12 15. Opisano również różnice pomiędzy markerami neuronów dotykowych2.
Wolimy unieruchamiać nicienie za pomocą mikrokulek zamiast środków znieczulających, ponieważ kulki pozwalają na szybsze i bardziej spójne unieruchomienie16. Jest to również korzystne, gdyż pozwala nam obserwować regenerację bez żadnych możliwych efektów zakłócających wynikających z znieczulenia17. Alternatywną metodą unieruchamiania bez użycia środków znieczulających jest zastosowanie urządzeń mikrofluidycznych. Wykorzystanie mikrofluidyki do aksotomii zostało szeroko opisane17-22.
Stwierdziliśmy, że przy regularnym użytkowaniu laser działa najlepiej, gdy Coumarin 440 w kuwecie z barwnikiem jest wymieniany raz w tygodniu zgodnie z procedurą opisaną w instrukcji MicroPoint. W razie potrzeby można użyć suwaka tłumienia w celu zwiększenia mocy, jednak może to być sygnałem zużycia barwnika lub rozregulowania lasera. Ponadto kuweta z barwnikiem ma ograniczoną żywotność i z czasem będzie wymagała regeneracji lub wymiany (patrz Rozwiązywanie problemów).
Manewrowanie docelowym neurytem pod celownikiem wyznaczającym ognisko lasera może być trudne, szczególnie jeśli zwierzę nie jest całkowicie sparaliżowane. Uważamy, że stolik manualny nie jest optymalny do tego celu, choć z pewnością jest użyteczny. Stolik zmotoryzowany sterowany joystickiem jest bardziej precyzyjny, a zdaniem autorów najlepszym rozwiązaniem jest korzystanie z oprogramowania umożliwiającego przesuwanie stolika zmotoryzowanego poprzez przeciąganie obrazu myszą. Program Nikon Elements oferuje tę funkcję i jest on opisany w niniejszym protokole, jednak darmowy pakiet Micromanager, podobnie jak inne oprogramowanie do obrazowania, może posiadać podobną funkcjonalność. Inną metodą precyzyjnego celowania jest przesuwanie ogniska lasera zamiast zwierzęcia. Jeśli preferowane jest takie podejście, dostępny jest mechanizm sterowania wiązką za pomocą galwanometru jako dodatek do lasera MicroPoint.
Poza zastosowaniem w badaniach nad regeneracją neuronów, laser może być wykorzystany do ablacji innych typów komórek, takich jak komórki skóry, mięśni lub komórki wyspecjalizowane, a także do niszczenia konkretnych synaps neuronalnych23-27. Ponadto za pomocą tego systemu można badać szlaki regulujące degenerację neuronów towarzyszącą urazom lub chorobom. W związku z tym stosowanie laserów impulsowych będzie nadal przyczyniać się do wyjaśniania zarówno czynników genetycznych, jak i zmian biologiczno-komórkowych, które ułatwiają regenerację neuronów i inne istotne procesy.
Rozwiązywanie problemów:
W niniejszej sekcji opisano niektóre typowe problemy oraz odpowiadające im rozwiązania.
<ol type="a">
	<li>Laser nie tnie prawidłowo. Prawdopodobnie wynika to z rozregulowania ostrości lasera (patrz sekcja 2) lub konieczności wymiany barwnika w komórce barwnika (patrz instrukcja MicroPoint). Alternatywnie konieczna może być wymiana lub przebudowa komórki barwnika.</li>
 <li>Nicienie poruszają się na podkładce agarozowej. Jest to zazwyczaj oznaka, że podkładka agarozowa jest zbyt wilgotna. Stwierdziliśmy, że aby uniknąć tego problemu, podkładki powinny wysychać przez około 30 sekund przed umieszczeniem na nich nicieni. Można również spróbować zastosować mikrokulki o mniejszej średnicy (0,05 μm).</li>
 <li>Odzyskiwanie nicieni jest trudne i nieefektywne. Może to być spowodowane nieprawidłowym usunięciem szkiełka nakrywkowego lub wyschnięciem podkładki agarozowej. Jeśli podkładka jest zbyt sucha, można zauważyć, że aksony przyjmują wygląd paciorkowaty. W niektórych przypadkach wynika to z faktu, że nicienie nie zostały umieszczone na podkładce wystarczająco szybko po jej przygotowaniu. Alternatywnie, stary zapas roztworu agarozy może mieć stężenie wyższe niż 3% po wielokrotnym przetapianiu.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Kuleczki polistyrenowe 0,05 &amp;mu;m</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08691</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki polistyrenowe 0,10 &amp;mu;m</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza GPG/LE</td><td>American Bioanalytical</td><td>00972</td><td>Ultrapure</td></tr><tr><td>Polistyrenowa probówka Falcon 14 ml z okrągłym dnem</td><td>BD Biosciences</td><td>352057</td><td>Wymiary 17 x 100 mm, niepirogenna</td></tr><tr><td>Zwykłe, wstępnie oczyszczone szkiełka przedmiotowe Thermo Scientific</td><td>Erie Scientific</td><td>420-004T</td><td>3&quot; x 1&quot; x 1 mm</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR international</td><td>48366 205</td><td>18 mm x 18 mm nr 1 1/2</td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes KIMTECH Science</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Petriego BD Falcon 100 x 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Taśma blank 3/4w x 500L</td><td>TimeMed</td><td>T-512</td><td></td></tr><tr><td>Olej imersyjny</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Typ A, nd=1,515</td></tr><tr><td>EG1285 lub CZ1200</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/</td><td></td></tr><tr><td>OptiScan II</td><td>Prior Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Ar lub Br</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserowy system ablacyjny MicroPoint</td><td>Photonic Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop złożony</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Hamamatsu</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>Model C8484-05G01</td><td></td></tr><tr><td>Komputer Dell Precision T3400 z procesorem Intel Core 2 Duo</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows XP Professional</td><td></td><td>Microsoft</td><td>Wersja 2002, Service Pack 3</td></tr><tr><td>Podwójny suchy inkubator kąpielowy</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Sterowanie analogowe</td></tr><tr><td>Obiektyw 4X Plan Fluor</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw imersyjny 100X Plan Apo VC</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5/45</td><td>Dumont</td><td>11251-35</td><td>Standardowe końcówki Dumoxel, można również użyć #7</td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td>Z oświetlaczem o wysokiej intensywności NI-150</td></tr></tbody></table>

in vivo laserowa aksonotomia u c. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurony komunikują się z innymi komórkami za pomocą aksonów i dendrytów, czyli cienkich wypustek błonowych zawierających specjalizacje presynaptyczne lub postsynaptyczne. W przypadku uszkodzenia neuronu wskutek urazu lub choroby, może on ulec regeneracji. Na zdolność neuronu do regeneracji i przywrócenia funkcji wpływają czynniki wewnątrzkomórkowe oraz zewnętrzne. Niedawno niciel C. elegans stała się doskonałym organizmem modelowym do identyfikacji genów i szlaków sygnałowych wpływających na regenerację neuronów1-6. Główną metodą inicjowania regeneracji neuronalnej u C. elegans jest cięcie za pomocą lasera, czyli aksotomia. Podczas aksotomii fluorescencyjnie znakowany wypustek neuronalny jest przecinany przy użyciu impulsów o wysokiej energii. Początkowo regenerację neuronalną u C. elegans badano przy użyciu wzmocnionego lasera femtosekundowego5. Jednak późniejsze badania nad regeneracją wykazały, że konwencjonalny laser impulsowy może być wykorzystany do precyzyjnego przecinania neuronów in vivo i wywoływania podobnej odpowiedzi regeneracyjnej1,3,7.
Przedstawiamy protokół przeprowadzania aksonotomii laserowej in vivo u nicieni z wykorzystaniem impulsowego lasera MicroPoint – gotowego systemu, który jest powszechnie dostępny i szeroko stosowany do celowanej ablacji komórek. Opisujemy proces ustawiania lasera, mocowania nicieni, przecinania konkretnych neuronów oraz oceny późniejszej regeneracji. System ten umożliwia przecięcie dużej liczby neuronów u wielu osobników w ramach jednego eksperymentu. W związku z tym aksonotomia laserowa w opisanym tutaj ujęciu stanowi wydajny system do inicjowania i analizowania procesu regeneracji.

Przedstawiono protokół przecinania neuronów u C. elegans przy użyciu impulsowego lasera MicroPoint. Opisujemy konfigurację systemu, unieruchamianie nicieni oraz przecinanie znakowanych neuronów. Zalety obejmują relatywnie niski koszt systemu oraz możliwość przecinania wypustek neuronalnych lub ablacji komórek in vivo.

In vivo laserowa aksonotomia u C. elegans

Neurony komunikują się z innymi komórkami za pomocą aksonów i dendrytów, czyli cienkich wypustek błonowych zawierających specjalizacje presynaptyczne lub postsynaptyczne. Jeśli neuron ...

Ogólnym celem tej procedury jest precyzyjne przecięcie neuronów CL u nicieni za pomocą lasera in vivo. Osiąga się to poprzez montaż systemu do takotomii oraz precyzyjne ogniskowanie, wyrównanie i regulację mocy lasera. Gdy nicienie zostaną unieruchomione na szkiełku przedmiotowym, ich neurony można przeciąć z precyzyjną kontrolą przestrzenną i czasową.Stopień regeneracji przeciętych neuronów jest następnie mierzony poprzez ocenę liczby stożków wzrostu lub poprzez pomiar długości neurytów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak laser femtosekundowy, jest fakt, że laser impulsowy z mikroogniwkiem stanowi kosztowo efektywny system, który jest łatwy w konfiguracji i konserwacji oraz łatwo adaptowalny do szerokiego zakresu zastosowań. Choć zazwyczaj stosujemy tę metodę do badania regeneracji neuronów ruchowych GABA, system ten może być również wykorzystany do ablacji innych typów komórek, takich jak mięśnie skóry lub specyficzne synapsy neuronalne.Ta metoda wymaga zastosowania systemu lasera mikro punktowego. Laser montuje się w porcie epi-fluorescencyjnym mikroskopu złożonego; system obejmuje pojedynczy filtr dichroiczny dopasowany do fluoroforu w komórkach przeznaczonych do cięcia, generator impulsów oraz pedał nożny do obsługi lasera. Mikroskop powinien być wyposażony co najmniej w obiektyw olejowy 100x 1,4 NA oraz obiektyw 4x.Należy zastosować zmotoryzowany stolik z obsługą za pomocą dżojstika, zamontowany na stole pneumatycznym w celu zapewnienia odpowiedniego oświetlenia. Do mikro-lasera punktowego przymocowane jest źródło światła z prowadnikiem i mechanizmem przysłony. Mechanizm przysłony jest przydatny do niezależnego od lasera ograniczania intensywności oświetlenia.Kamera podłączona do komputera musi posiadać częstotliwość odświeżania co najmniej 16 hertz i sprawnie działać w warunkach ograniczonego oświetlenia. Komputer wymaga oprogramowania do obrazowania, takiego jak Nikon elements, w celu wizualizacji neuronów, sterowania kamerą oraz obsługi zmotoryzowanego stolika. Po pełnym złożeniu zestawu użytkownik może jedną ręką ustawiać ostrość mikroskopu, drugą przesuwać stolik, a za pomocą pedału aktywować laser, mając jednocześnie wyraźny podgląd obrazu na ekranie.Przecinanie neuronów w organizmie o rozmiarach ziarnka piasku może być wyzwaniem. Aby to osiągnąć, wiązka lasera musi być ściśle skupiona w trzech wymiarach. Rozpocznij od ustawienia ostrości w płaszczyźnie Z.Wsuń filtr gęstości neutralnej ND 16, aby osłabić wiązkę lasera podczas precyzyjnego ustawiania ostrości, wsuwając jednocześnie filtr ND 16 oraz cztery filtry fluorescencyjne ND. Następnie ustaw laser mikro punktowy na jeden impuls za pomocą przełącznika wyboru, a następnie obróć koło filtrowe do odpowiedniego filtru barierowego długoprzepustowego. Teraz umieść lustrzany szkiełko na stoliku i ustaw ostrość na znajdujące się w nim otwory pinhole, korzystając z obiektywu 4x i światła przechodzącego.Po ustawieniu ostrości nanieść kroplę olejku imersyjnego na preparat i ponownie ustawić ostrość na otworki (pinholes) za pomocą obiektywu 100x. Następnie użyć dźwigni przełączającej ścieżkę optyczną, aby otworzyć migawkę kamery i migawkę lasera. Jeśli uzyskanie dokładnej ostrości jest utrudnione, należy zmniejszyć natężenie światła przechodzącego, aby krawędzie otworka były wyraźne.Aby przetestować ogniskowanie, użyj pedału, aby uruchomić laser. Jeśli płaszczyzna Z jest prawidłowo ustawiona, w lustrze powinien pojawić się mały otwór. Teraz ustaw ostrość mikroskopu nieco powyżej płaszczyzny lustrzanego preparatu i ponownie uruchom laser.Powinno to spowodować powstanie otworu jeszcze mniejszego niż przy pierwszym strzale lub nie pozostawić żadnego śladu. Te same wyniki powinny być widoczne podczas ogniskowania poniżej lustrzanego preparatu. Jeśli jednak powstanie większy otwór, należy ponownie ustawić ostrość lasera za pomocą pierścienia regulacji ogniska w głowicy ablacyjnej.Na koniec sprawdź, czy otwór jest nadal prawidłowo wyrównany z nitkami w okularze. Przy regularnym użytkowaniu rzadko zachodzi potrzeba regulacji ostrości w płaszczyźnie Z. Aby ustawić ostrość lasera w płaszczyźnie XY, wykonaj kolejny otwór w lustrze, a następnie uruchom oprogramowanie Nikon elements.Uruchom tryb podglądu na żywo w menu akwizycji. Na pasku narzędzi pomiarowych wybierz edytor ROI, zaznacz narzędzie podwójnego krzyża i przesuń go tak, aby wycentrować celownik względem nowego otworu. Kliknij zapisz ROI, a następnie wyjdź z edytora, aby powrócić do podglądu na żywo.Aby sterować stolikiem za pomocą myszy, aktywuj ustawienie myszy XY. Laser jest teraz w ogniskowej. Przywróć filtry gęstości neutralnej do ich pierwotnego położenia i ustaw liczbę impulsów lasera z jednego na 10 do późniejszego użycia.W pierwszej kolejności należy przygotować 3% roztwór stopionego aros w roztworze M nine i odmierzyć około 5 ml do probówki o pojemności 50 ml. Probówkę należy umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze od 55 do 65 °C, a pozostałą część roztworu przechowywać do późniejszego użycia. Następnie należy przygotować dwa szkiełka przedmiotowe z etykietami.Przyklej taśmą parę czystych szkiełek i nanieś kroplę agarozy, aby stworzyć podkładkę, na której zostaną umieszczone nicienie. Po 30 sekundach agaroza stężeje; za pomocą pipety nanieś od 3 do 5 µL kulek polistyrenowych o średnicy od 0,05 do 0,1 µm na podkładkę. W ciągu 10 minut szybko przenieś za pomocą platynowej igły od 5 do 10 nicieni transgenicznych na kulki, tak aby ich znakowane neurony były łatwo widoczne. Aby uniknąć uszkodzenia nicieni, ostrożnie nałóż na nie standardowe szkiełko nakrywki.Przesuń go w odpowiednie miejsce. Preparat z nicieniami jest teraz gotowy do przeprowadzenia analizy taksonomicznej. Używając okularu, zlokalizuj nicienie przy powiększeniu czterokrotnym, a następnie ustaw ostrość przy użyciu obiektywu 100x, wyłącz światło przechodzące, włącz fluorescencję i przełącz ścieżkę optyczną na kamerę.Używając myszy, wycentruj neuron na krzyżu celownika. Następnie uruchom laser za pomocą pedału. Odpowiednia moc lasera pozwoli przeciąć neuron w jeden lub dwa impulsy.Zbyt duża moc lasera spowoduje uszkodzenia obwodowe lub wypalenie otworu w robaku; aby dostosować moc lasera, należy przesuwać płytkę tłumika. Jeśli wiązka lasera osłabnie, można skorygować położenie płytki tłumika, aby kontynuować cięcie. Może to jednak wskazywać na konieczność wymiany ogniwa D w laserze, gdy procedura jest przeprowadzana prawidłowo.Taksotomia laserowa powoduje niewielkie przerwanie neuronu. W niektórych przypadkach wokół miejsca urazu może utworzyć się mała blizna. W praktyce u każdego zwierzęcia przecina się od jednego do trzech neuronów, jednak teoretycznie nie ma żadnego ograniczenia.Po zakończeniu odzyskaj nicienie, zdejmując szkiełko nakrywkowe zdecydowanym ruchem w górę, dbając o to, aby nicienie pozostały na podkładce z agrozylu. Nie zsuwaj szkiełka nakrywkowego. Użyj pęsety anatomicznej, aby wyciąć fragment podkładki wokół nicieni.Umieść podkładkę na świeżo zaszczepionej płytce NGM zawierającej OP 50 i uwolnij nicienie za pomocą 10 µL sterylnego roztworu M9. Regenerację można ocenić od ośmiu do 48 godzin po exotomii; aby to zrobić, ponownie zamocuj zdrowe nicienie w 3–5 µL kulek polistyrenowych i zwizualizuj ich neurony w miejscu przecięcia neuronów. Pozostanie pień neuronalny dystalny względem miejsca cięcia. Zarówno pień dystalny, jak i proksymalny początkowo cofają się po przecięciu, jednak regeneracji oczekuje się z pnia proksymalnego.Regenerację można ocenić na podstawie formowania się stożka wzrostu. Alternatywnie można śledzić i porównywać długość neurytów; zazwyczaj od 60 do 70% neuronów GABA tworzy stożki wzrostu w ciągu 24 godzin od przecięcia. Jeśli laser nie tnie prawidłowo, prawdopodobnie wynika to z braku ostrości wiązki lub konieczności wymiany barwnika w komórce z barwnikiem.Jeśli zauważą Państwo, że nicienie się poruszają, prawdopodobnie wynika to z nadmiernej wilgotności podkładki agarowej. Stwierdziliśmy, że aby uniknąć tego problemu, należy odczekać około 30 s przed umieszczeniem nicieni na podkładkach. Dodatkowo, w celu unieruchomienia nicieni można spróbować zastosować mikrokulki o mniejszej średnicy.Na koniec, jeśli zauważą Państwo, że aksony mają wygląd paciorkowaty, prawdopodobnie wynika to ze zbyt dużego wysuszenia podkładki agarowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat konfiguracji systemu laserowego mikro punktowego, montowania nicieni do taksotomii, przecinania pojedynczych neuronów oraz oceny ich późniejszej regeneracji.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In vivo Axotomia laserowa w C. elegans

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Aksonotomia laserowa z następującym po niej obrazowaniem time-lapse jest czułą metodą badania wpływu mutacji u C. elegans na regenerację aksonów. Wysokiej jakości, a jednocześnie niedrogi system ablacji laserowej można z łatwością dołączyć do większości mikroskopów. Obrazowanie time-lapse trwające 15 godzin wymaga starannego unieruchomienia nicienia.

Budowa niskobudżetowego systemu laserowej aksonotomii do badania regeneracji aksonów u C. elegans

Ten film przedstawia metodę laserowego ranienia, która jest używana do powodowania bardzo precyzyjnych uszkodzeń naskórka robaka. Przykładowy protokół pochodzi z badania reakcji i naprawy ran.

Laserowe ranienie naskórka: wywoływanie miejscowych uszkodzeń w celu zbadania procesów naprawczych u C. elegans

Ten film opisuje metodę uszkadzania aksonów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą aksotomii lasera dwufotonowego i obserwacji regeneracji aksonów po urazie.

Aksotomia lasera dwufotonowego: metoda uszkadzania aksonów w zarodkach danio pręgowanego i obserwowania regeneracji aksonów

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Obrazowanie dwufotonowe, sprzężone z nanodysekcją laserową, są użytecznymi narzędziami do badania procesów zwyrodnieniowych i regeneracyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym z rozdzielczością subkomórkową. Protokół ten pokazuje, jak oznaczać, obrazować i preparować pojedyncze włókna pnące w korze móżdżku in vivo.

Laserowa nanochirurgia aksonów móżdżku in vivo

Skóra dorosłego C. elegans jest łatwym modelem do badań nad reakcjami na rany nabłonkowe, w tym zamykaniem ran, tworzeniem blizn i odpornością wrodzoną.

Metody leczenia ran skóry i oznaczania reakcji na rany u C. elegans

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Ten protokół demonstruje laserową ablację komórek pojedynczych neuronów u nienaruszonych larw Drosophila. Metoda umożliwia badanie efektu zmniejszenia konkurencji między neuronami w rozwijającym się układzie nerwowym.

Laserowa ablacja komórek w nienaruszonych larwach Drosophila ujawnia konkurencję synaptyczną

Poznaj metodę precyzyjnego przecinania neuronów in vivo u C. elegans za pomocą lasera MicroPoint. Technika ta umożliwia badanie regeneracji neuronów GABA z kontrolą przestrzenną i czasową.

In vivo laserowa aksonotomia u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów