Wstrzykiwanie insuliny i pobieranie hemolimfy w celu pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster
30 czerwca 2011
Zasobniki konserwowanych szlaków sygnalizacji insulinowej występujące u muszki owocówki Drosophila melanogaster sprawiają, że organizm ten jest potencjalnym narzędziem do modelowania zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycy typu II. W związku z tym kluczowe jest opracowanie testów fizjologicznych pozwalających na skuteczne pomiary ogólnoustrojowego działania insuliny w zakresie obwodowej utylizacji glukozy u dorosłych much.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar wpływu wstrzykniętej insuliny na poziom glukozy w hemolimfie u dorosłych osobników Drosophila melanogaster. Realizuje się to najpierw poprzez umożliwienie zagłodzonym muchom spożycie stężonego roztworu glukozy. Drugim krokiem procedury jest wstrzyknięcie insuliny muchom, którym podano glukozę.
Trzecim krokiem procedury jest pobranie niezanieczyszczonej próbki hemolimfy. Ostatnim krokiem procedury jest oznaczenie stężenia glukozy w hemolimfie. W efekcie, za pomocą spektrometrii, można uzyskać wyniki wykazujące, że egzogenna insulina wspomaga klirens glukozy u *Drosophila melanogaster*.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pobieranie krwi poprzez dekapitację dorosłych osobników, jest fakt, że procedura ta minimalizuje zanieczyszczenie próbki hemolimfy treścią jelitową. Zbierz muchy w ciągu 24 godzin od zamknięcia, znieczulając je za pomocą uwilgotnionego dwutlenku węgla. Wyselekcjonuj samice i umieść je w fiolkach zawierających standardową pożywkę.
Pozostaw muchy do starzenia przez 10 dni. Po 10 dniach przenieś muchy do fiolek zawierających 5 mL zatyczkę z 2% agaru i poddaj je głodzeniu przez 12 do 16 godzin. Przed wstrzyknięciem insuliny przenieś głodzone muchy na jedną godzinę do fiolek zawierających papier filtracyjny nasączony 10% glukozą. Aby przygotować roztwór insuliny do iniekcji, rozpuść insulinę wołową w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do stężenia końcowego 0,01 mg/mL.
Przygotować również roztwór kontrolny zawierający wyłącznie PBS. Do roztworu insuliny oraz roztworu kontrolnego dodać niebieski barwnik spożywczy do stężenia końcowego 0,5% i przechowywać oba roztwory w lodzie przez cały czas trwania procedury. Zaokrąglić końcówki świeżo wyciągniętych igieł szklanych, przeciskając je przez chusteczkę Kim wipe.
Aby stworzyć grubszą końcówkę o większej średnicy otworu, umieść stępioną igłę końcówką do góry w probówce do mikrocentryfugi zawierającej insulinę lub roztwór kontrolny i pozwól, aby działanie kapilarne wypełniło igłę od tyłu. Sprawdź każdą igłę pod mikroskopem stereoskopowym pod kątem obecności pęcherzyków powietrza i odrzuć wszystkie, które nie zostały wypełnione całkowicie. Włóż wypełnione igły do uchwytu igieł ręcznego mikroinjektora i ustaw uchwyt za pomocą mikromanipulatora tak, aby końcówka igły była widoczna pod mikroskopem stereoskopowym.
Wywrzyj nadciśnienie na kolumnę cieczy w igle, obracając pokrętłem mikrometru przymocowanym do tłoka strzykawki mikroinjektora. Dotknij końcówki igły chusteczką bezpyłową, aby zweryfikować, czy ciśnienie jest wystarczające do przepływu cieczy. Po przygotowaniu igły do iniekcji przymocuj skalę kalibracyjną do trzpienia igły za pomocą przezroczystej taśmy i ustaw ostrość na końcówkę igły, korzystając ze stereomikroskopu przy 20-krotnym powiększeniu.
Krótko znieczulcie muszki karmione glukozą za pomocą nawilżonego dwutlenku węgla i umieśćcie je na podkładce z lodem, aby utrzymać znieczulenie podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym. Chwyćcie muszkę za pomocą precyzyjnej pincety i przytrzymajcie ją blisko igły w taki sposób, aby jej końcówka znajdowała się obok przedniego regionu lewej strony muszki. Ustawcie ostrość obrazu zarówno dla końcówki igły, jak i klatki piersiowej muszki.
Delikatnie przesuń muchę w stronę końcówki igły tak, aby końcówka dotknęła środka wypukłości lewego regionu presum muchy. Przesuń muchę dalej na igłę tak, aby igła przebiła środek presum. Wywrzyj dodatnie ciśnienie, przesuwając tłok strzykawki za pomocą pokrętła mikromanipulatora mikroinjektora do wartości 0.1.
Do muchy wstrzyknięto mikrolitr roztworu insuliny lub roztworu kontrolnego. Iniekcja nada niebieski kolor lewej stronie przedniej części klatki piersiowej. Wstrzyknięte muchy pozostawiono do regeneracji w 2% Aros w grupach powtórzeniach przez 0, 15 i 30 minut przed ekstrakcją hemolimfy; w tym czasie do podkładki z dwutlenkiem węgla przytwierdzono kawałek dwustronnej taśmy.
Znieczulić muchy z grupy zero i ułożyć je na taśmie grzbietem do dołu w równych rzędach, tak aby ich torebki głowowe były wyrównane. Po przymocowaniu much do taśmy, chwycić trąbkę muchy za pomocą precyzyjnej pęsety i delikatnie pociągnąć ją w stronę strony brzusznej, a następnie tylnej, aby odsłonić przednią część torebki głowowej. Trzymając trąbkę w tej pozycji, nakłuć torebkę głowową powyżej szwu czołowego za pomocą ostrej igły wolframowej, uważając, aby nie przebić głowy na wylot.
Po nakłuciu wszystkich much, należy użyć przyciętego drewnianego aplikatora, aby delikatnie nacisnąć odwłok muchy. Spowoduje to wydzielenie małej kropli hemolimfy w miejscu nakłucia torebki głowowej. Końcówkę mikrokapilary o pojemności 1 µL należy dotknąć do kropli hemolimfy.
Należy określić i zapisać objętość pobranej hemolimfy, sprawdzając słup cieczy w rurce mikrokapilarnej za pomocą skali objętości, a następnie przy użyciu spektrofotometru zmierzyć absorbancję przy 340 nanometrach i określić stężenie glukozy. Muchy wstrzyknięte roztworem insuliny wołowej wykazywały obniżony poziom glukozy w hemolimfie w 15. i 30. minucie po iniekcji w porównaniu z muchami, którym wstrzyknięto roztwór kontrolny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wstrzykiwać niewielkie objętości roztworu dorosłym osobnikom Drosophila, jak pobierać hemolimfę z dorosłych Drosophila oraz jak określić stężenie glukozy w hemolimfie dorosłych Drosophila zgodnie z opisaną procedurą.
Można przeprowadzić inne eksperymenty, takie jak oznaczanie stężenia białka oraz oznaczanie stężenia triglicerydów w hemolimfie, aby odpowiedzieć na pytania, np. jak insulina wpływa na powiązane aspekty metabolizmu składników odżywczych u dorosłych muszek drosophila?
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje wpływ insuliny na poziom glukozy w hemolimfie dorosłych Drosophila melanogaster, wskazując na potencjał tego organizmu modelowego w badaniach nad zaburzeniami metabolicznymi. Poprzez opracowanie testów fizjologicznych, badanie ma na celu pomiar systemicznego działania insuliny oraz utylizacji glukozy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Metabolizm
- Fizjologia
Wprowadzenie
- Drosophila melanogaster posiada konserwatywne szlaki sygnałowe insuliny.
- Organizm ten służy jako model do badania zaburzeń metabolicznych.
- Zrozumienie działania insuliny jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat cukrzycy typu II.
- Niezbędne są analizy fizjologiczne w celu pomiaru wpływu insuliny na metabolizm glukozy.
Cel badania
- Pomiar wpływu wstrzykniętej insuliny na poziom glukozy u *Drosophila*.
- Opracowanie metody oceny działania insuliny w organizmie modelowym.
- Wkład w zrozumienie regulacji metabolicznej.
Zastosowane metody
- Głodzone muchy otrzymują skoncentrowany roztwór glukozy do spożycia.
- Muchom po podaniu glukozy wstrzyknięto insulinę.
- Zebrano niezanieczyszczone próbki hemolimfy.
- Oznaczono stężenie glukozy w hemolimfie przy użyciu spektrometrii.
Główne wyniki
- Wyniki wskazują, że egzogenna insulina ułatwia klirens glukozy.
- Wykazano skuteczność testu fizjologicznego.
- Uzyskano wgląd w rolę insuliny w metabolizmie glukozy u much.
- Potwierdzono zasadność wykorzystania Drosophila jako modelu w badaniach nad metabolizmem.
Wnioski
- Badanie potwierdza użyteczność muszek Drosophila w modelowaniu działania insuliny.
- Opracowanie tych testów może pomóc w zrozumieniu zaburzeń metabolicznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach, aby zgłębić mechanizmy cukrzycy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster umożliwia mechanistyczną weryfikację ryzyka celów metabolicznych w systemie podatnym genetycznie. Niniejszy protokół zapewnia bezpośredni odczyt fizjologiczny z utylizacji glukozy po podaniu insuliny, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów w badaniach nad chorobami metabolicznymi. Podejście to stanowi pomost pomiędzy wczesną fazą odkryć a rozwojem modeli przedklinicznych do analizy szlaków metabolicznych i przesiewania interwencji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną komponentów szlaku sygnalizacyjnego insuliny in vivo.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określenie klirensu glukozy po perturbacjach genetycznych lub farmakologicznych.
- Ułatwia priorytetyzację celów metabolicznych na podstawie fizjologicznej odpowiedzi na insulinę.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia powtarzalny test do pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych much.
- Zapewnia ilościowe odczyty poziomu glukozy, odpowiednie do analizy porównawczej między genotypami lub interwencjami.
- Umożliwia standaryzację procedur oceny związków kandydackich wpływających na metabolizm glukozy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie homeostazy glukozy i działania insuliny.
- Wspiera ciągłość od odkryć genetycznych do przedklinicznej walidacji interwencji metabolicznych.
- Oferuje skalowalną platformę do przesiewowego badania modyfikatorów wrażliwości na insulinę w kontekście całego organizmu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w continuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących regulatorów metabolicznych i interwencji w genetycznie zdefiniowanym modelu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej w odniesieniu do funkcji szlaku insulinowego i zaangażowania celu.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne pomiary glukozy w celu standaryzacji analizy.
- Analityka: Dostarcza spektrometryczne odczyty poziomu glukozy do solidnego porównania statystycznego grup doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Modeluje systemową regulację glukozy istotną dla mechanizmów chorób metabolicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnego badania celów i szlaków w badaniach nad metabolizmem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów metabolicznych i analizie szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację testów wrażliwości na insulinę.
- Wartość strategiczna: Stanowi podstawę do podejmowania decyzji go/no-go w zakresie rozwoju celów metabolicznych i triage’u interwencji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów leczenia chorób metabolicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli Drosophila, mikroiniekcji oraz ekstrakcji hemolimfy.
- Niezbędny jest dostęp do aparatury do mikroiniekcji, spektrofotometrii oraz infrastruktury analitycznej.
- W celu zapewnienia powtarzalności wymagana jest standaryzacja protokołów iniekcji i pobierania próbek pomiędzy zespołami.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych szczepów much lub fenotypów metabolicznych.
- W celu uzyskania wiarygodnych wyników należy zminimalizować kontaminację próbek oraz zmienność techniczną.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dot. Biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Title
0:41
Introduction
0:54
Starvation Treatment for Adult Flies
1:26
Insulin Injection Preparation
2:48
Insulin Injection Procedure
3:52
Hemolymph Collection and Glucose Determination
5:13
Conclusion
4:55
Representative Insulin Tolerance Response Determined by Spectrophotometry
