Name: Wstrzyknięcie insuliny i ekstrakcja hemolimfy w celu pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Naucz się mierzyć wrażliwość na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster poprzez wstrzyknięcie insuliny i ekstrakcję hemolimfy. Ta metoda pozwala badać metabolizm glukozy w modelu organizmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez granty NIA przyznane Y-W.C.F (AG21068, AG31086).

1. Przygotowanie roztworu insuliny
<ol>
<li>Przygotować świeży roztwór insuliny wołowej, rozpuszczając insulinę w PBS do uzyskania stężenia 0,01 mg/ml. Zarówno roztwór insuliny w PBS, jak i kontrolny roztwór PBS muszą być przechowywane w lodzie przez cały czas trwania procedury wstrzykiwania. Roztwory te należy przygotować z dodatkiem 0,5% (v/v) barwnika spożywczego FD&amp;C Blue no. 1.</li>
</ol>
2. Przygotowanie igły i konfiguracja zestawu do iniekcji
<ol>
<li>Przygotować szklane igły kapilarne za pomocą wyciągacza mikropipet. Następujące ustawienia wyciągacza pozwalają na uzyskanie igieł o jakości wystarczającej do iniekcji: Heat, 345; Pull, 210; Velocity, 10; Time, 20 (10ms). Nowo wyciągnięte igły należy stępić, dociskając ich końcówkę do chusteczki Kimwipe. Proces ten usuwa wydłużoną końcówkę o wysokiej oporności i tworzy sztywniejszą końcówkę o większej średnicy otworu.</li> 
<li>Umieścić stępione igły końcówkami do góry w probówce do mikrowirowania zawierającej roztwór insuliny/PBS lub sam PBS. W wyniku działania kapilarnego każda igła zostanie wypełniona od tyłu. Obserwować końcówkę igły pod stereomikroskopem, aby upewnić się, że nie ma na niej zanieczyszczeń ani pęcherzyków powietrza. Odrzucić wszystkie igły, które nie zostały wypełnione całkowicie.</li>
<li>Włożyć wypełnione igły do uchwytu igieł manualnego mikroinjektora i ustawić uchwyt za pomocą mikromanipulatora tak, aby końcówka igły była widoczna pod stereomikroskopem. Nadać nadciśnienie kolumnie cieczy w igle, obracając pokrętło mikrometryczne manualnego mikroinjektora przymocowane do tłoka strzykawki mikroinjektora.</li> 
<li>Zweryfikować, czy zastosowano ciśnienie wystarczające do przemieszczenia cieczy, dotykając końcówki igły chusteczką Kimwipe i potwierdzając przepływ cieczy.</li> 
<li>Po przygotowaniu igły do iniekcji przytwierdzić tabelę kalibracyjną do trzonu igły za pomocą przezroczystej taśmy i ustawić ostrość obrazu końcówki igły pod stereomikroskopem przy powiększeniu 20X.</li>
</ol>
3. Przygotowanie much
<ol>
<li>Do eksperymentów z iniekcją wykorzystuje się dziesięciodniowe samice much. Zbieraj muchy w ciągu 24 h od wyjścia z poczwarki. Znieczul muchy wilgotnym CO2 na podkładce gazowej, oddziel samce, a samice umieść w probówkach zawierających dietę standardową lub testową. Utrzymuj samice na dietach eksperymentalnych przez 10 dni.</li>
<li>Dziesiątego dnia po wyjściu z poczwarki i rozdzieleniu na diety eksperymentalne, przenieś muchy z probówek z pożywką do probówek zawierających czop z 2% agaru o objętości 5 ml i poddaj je głodzeniu przez 12-16 h.</li>
<li>Przed iniekcją insuliny przenieś głodzone muchy do probówek zawierających filtry nasączone 10% glukozą na 1 godzinę.</li>
<li>Po podaniu glukozy krótko znieczul muchy wilgotnym CO2, a następnie unieruchom je w niskiej temperaturze na lodzie.</li>
</ol>
4. Procedura wstrzykiwania
<ol>
<li>Delikatnie chwyć unieruchomioną zimnem muchę za pomocą precyzyjnej pęsety i przytrzymaj ją blisko końcówki igły, tak aby końcówka znajdowała się w sąsiedztwie przedniego regionu lewej strony klatki piersiowej muchy. Ustaw ostrość stereomikroskopu na końcówkę igły oraz klatkę piersiową muchy.</li>
<li>Delikatnie przesuń muchę w stronę końcówki igły, tak aby końcówka dotknęła centrum wypukłości lewego regionu prescutum klatki piersiowej muchy (Rys. 1). Po odpowiednim zorientowaniu i wyrównaniu muchy względem końcówki igły, kontynuuj napieranie muchy na igłę, aż zostanie ona wbita w środek prescutum.</li>
<li>W razie potrzeby przyłóż dodatnie ciśnienie, przesuwając tłok strzykawki za pomocą pokrętła mikromanipulatora mikroinjektora, aż do momentu wstrzyknięcia 0,1 μl płynu do muchy. Przepływ płynu do hemocelu muchy nada niebieski kolor lewej stronie przedniej części klatki piersiowej. Okazyjnie należy kilkakrotnie wycofać i ponownie przesunąć igłę, aby usunąć ewentualne zatory w końcówce i umożliwić przepływ płynu.</li> 
<li>Pozostaw wstrzyknięte muchy do regeneracji w fiolkach z 2% agarem przez wyznaczone okresy czasu przed ekstrakcją hemolimfy.</li>
</ol>
5. Pobieranie hemolimfy
<ol>
<li>Krótko znieczulić muchy wilgotnym CO2 w wybranych punktach czasowych po wstrzyknięciu i ułożyć każdą muchę grzbietem do dołu na dwustronnej taśmie przyklejonej do powierzchni podkładki do CO2. Rozmieścić muchy w równych rzędach z wyrównanymi torebkami głowowymi. Można użyć przyciętego drewnianego patyczka aplikacyjnego, aby docisnąć skrzydła do kleju taśmy i zapewnić unieruchomienie.</li> 
<li>Po przytwierdzeniu much do taśmy, chwycić aparat gębowy (proboscis) każdej muchy precyzyjną pęsetą i delikatnie odciągnąć go w kierunku brzusznej, a następnie tylnej części ciała, tak aby przednia część torebki głowowej była widoczna pod stereomikroskopem.</li>
<li>Drugą ręką, trzymając aparat gębowy w pozycji, przebić środek torebki głowowej tuż nad szwem ptilinalnym za pomocą ostrej igły wolframowej (Rys. 2). Należy uważać, aby nie wprowadzić igły zbyt głęboko, ponieważ łatwo jest przebić końcówką igły drugą stronę torebki głowowej, co może doprowadzić do utraty kontroli nad przepływem hemolimfy. Należy przebić torebki głowowe wszystkich much w grupie wstrzyknięciowej przed rozpoczęciem pobierania hemolimfy.</li>
<li>Po przebiciu torebki głowowej, użyć przyciętego drewnianego patyczka aplikacyjnego, aby delikatnie wywrzeć nacisk na odwłok muchy. Pomocne może być obrócenie muchy na stronę brzuszną podczas wywierania nacisku. Ta procedura spowoduje wydzielenie kropli hemolimfy w miejscu nakłucia torebki głowowej.</li>
<li>Dotknąć jednym końcem mikrokapilary o objętości 1μl kropli hemolimfy wydobywającej się z miejsca nakłucia torebki głowowej. Hemolimfa zostanie wciągnięta do rurki dzięki działaniu kapilarnemu. Ustalić i zapisać ilość pobranej hemolimfy, sprawdzając wysokość słupa cieczy w mikrokapilarze przy pomocy skali objętości.</li>
</ol>
6. Oznaczanie poziomu glukozy w hemolimfie
<ol>
<li>Wprowadź próbki hemolimfy do studzienek mikropłytki zawierających 10 μl odczynnika Infinity Glucose Reagent. Podczas nakładania próbek hemolimfy należy przechowywać płytkę w lodzie.</li>
<li>Utwórz krzywą wzorcową, nakładając oddzielnie po 1 μl roztworów stokowych glukozy o stężeniach 50mM, 25mM, 12.5mM, 6.25mM oraz 3.125mM.</li>
<li>Inkubuj próbki w temperaturze 37°C przez 10 minut.</li>
<li>Zmierzy absorbancję przy 340 nm.</li>
<li>Uwzględnij objętość pobranej hemolimfy i wyznacz stężenie glukozy w próbkach na podstawie krzywej wzorcowej z known stężeniami glukozy.</li> 
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Typowa odpowiedź na test tolerancji insuliny jest wykrywana u much po wstrzyknięciu insuliny, gdzie spadek poziomu glukozy w krążeniu obserwuje się 15 minut po iniekcji. W przeciwieństwie do tego, taka odpowiedź nie występuje u much po wstrzyknięciu PBS (Rys. 3). Odpowiedź ta w zakresie obwodnego usuwania glukozy utrzymuje się u much po wstrzyknięciu insuliny do 30 minut po iniekcji. Rutynowo pobieramy 0,2-0,5 μl hemolimfy z 4-5 much w każdej grupie iniekcyjnej. W każdym eksperymencie uwzględniane są trzy grupy iniekcyjne.
<img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig1.jpg" alt="Schemat anatomii owada: igła wprowadzona w okolicy szyi, etykiety obejmują prescutum i odwłok." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Lewa strona klatki piersiowej Drosophila z zaznaczonym miejscem wkłucia igły (Modyfikowano na podstawie Demerec, 1950) 7Wprowadź igłę przez środek prescutum w przedniej, grzbietowej części klatki piersiowej po lewej stronie.
<img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig2.jpg" alt="Schemat rozwoju Drosophila; sonda wolframowa w pobliżu szwu ptilinalnego do badań anatomicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Widok z przodu głowy Drosophila wskazujący miejsce nakłucia w celu pobrania hemolimfy (Zmodyfikowano na podstawie: Demerec, 1950) 7Przebij kapsułę głowy za pomocą precyzyjnie zaostrzonej sondy wolframowej w centrum kapsuły głowy, tuż powyżej szwu ptilinalnego. 
<img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig3.jpg" alt="wykres testu tolerancji na insulinę, poziomy glukozy po wstrzyknięciu, porównanie w118+ins vs. w18+PBS" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Typowa odpowiedź na test tolerancji insuliny wykryta u dorosłych much kontrolnych. Kontrola w1118 Muchy wstrzyknięto insuliną bydlęcą (1 ng w PBS) lub samym PBS. Następnie grupom powtórzonym pozwolono na regenerację przez 0, 15 lub 30 minut, po czym zmierzono poziomy krążącej glukozy.

<ol><li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1118 (2002).</li>
<li>Kim, S. K., Rulifson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mechanisms+of+glucose+sensing+and+regulation+by+Drosophila+corpora+cardiaca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells.</a> Nature. 431, 316-316 (2004).</li>
<li>Broughton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longer+lifespan%2C+altered+metabolism%2C+and+stress+resistance+in+Drosophila+from+ablation+of+cells+making+insulin-like+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).</li>
<li>Haselton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+ablation+of+adult+Drosophila+insulin-producing+neurons+modulates+glucose+homeostasis+and+extends+life+span+without+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance.</a> Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).</li>
<li>Haselton, A. T., Fridell, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+the+study+of+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis.</a> Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).</li>
<li>Belgacem, Y. H., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+insulin+pathways+alters+trehalose+level+and+abolishes+sexual+dimorphism+in+locomotor+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila.</a> J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).</li>
<li>Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Technika opisana w niniejszym raporcie jest potencjalnie użyteczna w każdym badaniu analizującym procesy fizjologiczne prowadzące do wykrywalnych zmian w składzie hemolimfy Drosophila. Dzięki połączeniu iniekcji i pobierania hemolimfy w ten sposób, możliwe jest ustalenie bezpośrednich, istotnych fizjologicznie efektów konkretnej procedury eksperymentalnej lub manipulacji. Główną zaletą tej techniki „upuszczania krwi” w pobieraniu hemolimfy w porównaniu z wcześniejszymi metodami obejmującymi dekapitację 2</s...

<table><tbody><tr><td>Insulina wołowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania glukozy Infinity Glucose Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TR1541</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny mikroinjektor</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytciągacz do mikropipet P-87 Flamming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednokanalowe kapilary borokrzemianowe</td><td>A-M Systems</td><td>626000</td><td></td></tr><tr><td>FD&amp;amp;C Blue No. 1</td><td>McCormick &amp;amp; Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapiary 1 &amp;mu;l</td><td>Drummond Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trzyosiowy ręczny mikromanipulator z podstawą</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wstrzykiwanie insuliny i pobieranie hemolimfy w celu pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Między ssakami a muszką owocową istnieją konserwatywne mechanizmy wykrywania składników odżywczych, w których peptydy przypominające odpowiednio insulinę i glukagon u ssaków pełnią funkcję utrzymywania homeostazy glukozy podczas larwalnych stadiów rozwojowych 1,2. Badania nad dorosłymi muchami, które są w przeważającej mierze postmitotyczne, wykazały zaburzenia homeostazy glukozy w wyniku genetycznej ablacji komórek produkujących peptydy insulinopodobne (IPCs) 3. Zatem dorosłe muszki owocowe stanowią obiecujący i odpowiedni model genetyczny dla zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycy typu II. Aby dalej rozwijać system wykorzystujący muszkę owocową, należy opracować porównywalne testy fizjologiczne służące do pomiaru tolerancji glukozy i wrażliwości na insulinę, jakie stosuje się u ssaków. W tym celu opisaliśmy niedawno nową procedurę pomiaru odpowiedzi na doustną próbę obciążenia glukozą u dorosłej muchy i wykazaliśmy znaczenie dorosłych IPCs w utrzymaniu homeostazy glukozy 4,5. W niniejszej pracy zmodyfikowaliśmy wcześniej opisaną procedurę wstrzykiwania insuliny 6 i połączyliśmy ją z nową metodą ekstrakcji hemolimfy w celu pomiaru obwodowej wrażliwości na insulinę u dorosłej muchy. Unikalną cechą naszego protokołu jest umożliwienie bezpośrednich pomiarów fizjologicznych zdolności dorosłej muchy do usuwania obwodowego obciążenia glukozą po wstrzyknięciu insuliny; metodologia ta pozwala na charakterystykę mutantów sygnalizacji insulinowej oraz potencjalnych interwencji wpływających na tolerancję glukozy i wrażliwość na insulinę u dorosłej muchy.

Zasobniki konserwowanych szlaków sygnalizacji insulinowej występujące u muszki owocówki Drosophila melanogaster sprawiają, że organizm ten jest potencjalnym narzędziem do modelowania zaburzeń metabolicznych, w tym cukrzycy typu II. W związku z tym kluczowe jest opracowanie testów fizjologicznych pozwalających na skuteczne pomiary ogólnoustrojowego działania insuliny w zakresie obwodowej utylizacji glukozy u dorosłych much.

Wstrzykiwanie insuliny i pobieranie hemolimfy w celu pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster

Pomiędzy ssakami a muszką owocówką istnieją konserwatywne mechanizmy wykrywania składników odżywczych, w których peptydy przypominające odpowiednio insulinę i glukagon ssaków pełnią funkcję ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar wpływu wstrzykniętej insuliny na poziom glukozy w hemolimfie u dorosłych osobników Drosophila melanogaster. Realizuje się to najpierw poprzez umożliwienie zagłodzonym muchom spożycie stężonego roztworu glukozy. Drugim krokiem procedury jest wstrzyknięcie insuliny muchom, którym podano glukozę.Trzecim krokiem procedury jest pobranie niezanieczyszczonej próbki hemolimfy. Ostatnim krokiem procedury jest oznaczenie stężenia glukozy w hemolimfie. W efekcie, za pomocą spektrometrii, można uzyskać wyniki wykazujące, że egzogenna insulina wspomaga klirens glukozy u *Drosophila melanogaster*.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pobieranie krwi poprzez dekapitację dorosłych osobników, jest fakt, że procedura ta minimalizuje zanieczyszczenie próbki hemolimfy treścią jelitową. Zbierz muchy w ciągu 24 godzin od zamknięcia, znieczulając je za pomocą uwilgotnionego dwutlenku węgla. Wyselekcjonuj samice i umieść je w fiolkach zawierających standardową pożywkę.Pozostaw muchy do starzenia przez 10 dni. Po 10 dniach przenieś muchy do fiolek zawierających 5 mL zatyczkę z 2% agaru i poddaj je głodzeniu przez 12 do 16 godzin. Przed wstrzyknięciem insuliny przenieś głodzone muchy na jedną godzinę do fiolek zawierających papier filtracyjny nasączony 10% glukozą. Aby przygotować roztwór insuliny do iniekcji, rozpuść insulinę wołową w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do stężenia końcowego 0,01 mg/mL.Przygotować również roztwór kontrolny zawierający wyłącznie PBS. Do roztworu insuliny oraz roztworu kontrolnego dodać niebieski barwnik spożywczy do stężenia końcowego 0,5% i przechowywać oba roztwory w lodzie przez cały czas trwania procedury. Zaokrąglić końcówki świeżo wyciągniętych igieł szklanych, przeciskając je przez chusteczkę Kim wipe.Aby stworzyć grubszą końcówkę o większej średnicy otworu, umieść stępioną igłę końcówką do góry w probówce do mikrocentryfugi zawierającej insulinę lub roztwór kontrolny i pozwól, aby działanie kapilarne wypełniło igłę od tyłu. Sprawdź każdą igłę pod mikroskopem stereoskopowym pod kątem obecności pęcherzyków powietrza i odrzuć wszystkie, które nie zostały wypełnione całkowicie. Włóż wypełnione igły do uchwytu igieł ręcznego mikroinjektora i ustaw uchwyt za pomocą mikromanipulatora tak, aby końcówka igły była widoczna pod mikroskopem stereoskopowym.Wywrzyj nadciśnienie na kolumnę cieczy w igle, obracając pokrętłem mikrometru przymocowanym do tłoka strzykawki mikroinjektora. Dotknij końcówki igły chusteczką bezpyłową, aby zweryfikować, czy ciśnienie jest wystarczające do przepływu cieczy. Po przygotowaniu igły do iniekcji przymocuj skalę kalibracyjną do trzpienia igły za pomocą przezroczystej taśmy i ustaw ostrość na końcówkę igły, korzystając ze stereomikroskopu przy 20-krotnym powiększeniu.Krótko znieczulcie muszki karmione glukozą za pomocą nawilżonego dwutlenku węgla i umieśćcie je na podkładce z lodem, aby utrzymać znieczulenie podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym. Chwyćcie muszkę za pomocą precyzyjnej pincety i przytrzymajcie ją blisko igły w taki sposób, aby jej końcówka znajdowała się obok przedniego regionu lewej strony muszki. Ustawcie ostrość obrazu zarówno dla końcówki igły, jak i klatki piersiowej muszki.Delikatnie przesuń muchę w stronę końcówki igły tak, aby końcówka dotknęła środka wypukłości lewego regionu presum muchy. Przesuń muchę dalej na igłę tak, aby igła przebiła środek presum. Wywrzyj dodatnie ciśnienie, przesuwając tłok strzykawki za pomocą pokrętła mikromanipulatora mikroinjektora do wartości 0.1.Do muchy wstrzyknięto mikrolitr roztworu insuliny lub roztworu kontrolnego. Iniekcja nada niebieski kolor lewej stronie przedniej części klatki piersiowej. Wstrzyknięte muchy pozostawiono do regeneracji w 2% Aros w grupach powtórzeniach przez 0, 15 i 30 minut przed ekstrakcją hemolimfy; w tym czasie do podkładki z dwutlenkiem węgla przytwierdzono kawałek dwustronnej taśmy.Znieczulić muchy z grupy zero i ułożyć je na taśmie grzbietem do dołu w równych rzędach, tak aby ich torebki głowowe były wyrównane. Po przymocowaniu much do taśmy, chwycić trąbkę muchy za pomocą precyzyjnej pęsety i delikatnie pociągnąć ją w stronę strony brzusznej, a następnie tylnej, aby odsłonić przednią część torebki głowowej. Trzymając trąbkę w tej pozycji, nakłuć torebkę głowową powyżej szwu czołowego za pomocą ostrej igły wolframowej, uważając, aby nie przebić głowy na wylot.Po nakłuciu wszystkich much, należy użyć przyciętego drewnianego aplikatora, aby delikatnie nacisnąć odwłok muchy. Spowoduje to wydzielenie małej kropli hemolimfy w miejscu nakłucia torebki głowowej. Końcówkę mikrokapilary o pojemności 1 µL należy dotknąć do kropli hemolimfy.Należy określić i zapisać objętość pobranej hemolimfy, sprawdzając słup cieczy w rurce mikrokapilarnej za pomocą skali objętości, a następnie przy użyciu spektrofotometru zmierzyć absorbancję przy 340 nanometrach i określić stężenie glukozy. Muchy wstrzyknięte roztworem insuliny wołowej wykazywały obniżony poziom glukozy w hemolimfie w 15. i 30. minucie po iniekcji w porównaniu z muchami, którym wstrzyknięto roztwór kontrolny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wstrzykiwać niewielkie objętości roztworu dorosłym osobnikom Drosophila, jak pobierać hemolimfę z dorosłych Drosophila oraz jak określić stężenie glukozy w hemolimfie dorosłych Drosophila zgodnie z opisaną procedurą.Można przeprowadzić inne eksperymenty, takie jak oznaczanie stężenia białka oraz oznaczanie stężenia triglicerydów w hemolimfie, aby odpowiedzieć na pytania, np. jak insulina wpływa na powiązane aspekty metabolizmu składników odżywczych u dorosłych muszek drosophila?

insulin-injection-hemolymph-extraction-to-measure-insulin-sensitivity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wstrzyknięcie insuliny i pobieranie hemolimfy w celu zmierzenia wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Ten film opisuje, jak wykonać zastrzyk żywym dorosłym muchom i zawiera przykładowy protokół, w którym oznaczone cząstki i błękit trypanowy są wstrzykiwane do brzuchów muchy w celu zbadania fagocytozy.

Wstrzyknięcie dorosłych much Drosophila: metoda dostarczania związku lub etykiety

Molimimfa Drosophila służy zarówno jako krew, jak i płyn śródmiąższowy, krążąc po całym ciele podczas stadium larwy i dorosłego osobnika. Ten film opisuje protokół pobierania larw hemolimfy w celu ilościowego określenia krążących komórek.

Przerwanie naskórka: metoda zbierania hemolimfy z larw Drosophila

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru utleniania paliwa u Drosophila melanogaster, w której muchom podawane są śladowe ilości specyficznych, znakowanych radioaktywnie substratów metabolicznych. Wydychany znakowany radioizotopowo CO2 powstający w wyniku utleniania paliwa jest zbierany i mierzony.

Pomiar produkcji dwutlenku węgla z substratów znakowanych radioaktywnie u Drosophila melanogaster

Test CApillary FEeder (CAFE) jest prostą, niedrogą i wysoce niezawodną metodą badania mechanizmów leżących u podstaw przyjmowania pokarmu. Stosowany w połączeniu z wysoce wszechstronnym modelem genetycznym Drosophila melanogaster, stanowi potężny środek do uzyskania nowego wglądu w mechanizmy regulacyjne przyjmowania pokarmu.

Test CApillary FEeder mierzy spożycie pokarmu u Drosophila melanogaster

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje test in vivo fagocytozy używany do oceny i ilościowego określenia zdolności młodych i starszych hemocytów Drosophila melanogaster do fagocytozy bakterii.

Ocena specyficznej dla wieku zdolności fagocytarnej dorosłych hemocytów Drosophila melanogaster za pomocą testu fagocytozy in vivo

Dorosłe muchy Drosophila melanogaster były szeroko wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza i strategii infekcji mikrobiologicznej. Aby promować stadium larwy D. melanogaster jako dodatkowy lub alternatywny system modelowy, opisano technikę iniekcji larw.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw

Naucz się mierzyć wrażliwość na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster poprzez wstrzyknięcie insuliny i ekstrakcję hemolimfy. Ta metoda pozwala badać metabolizm glukozy w modelu organizmu.

Wstrzykiwanie insuliny i pobieranie hemolimfy w celu pomiaru wrażliwości na insulinę u dorosłych Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów