Obrazowanie wapnia w żywych komórkach w połączeniu z wyciszaniem genów za pośrednictwem siRNA identyfikuje kanały przeciekowe Ca²⁺ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

W komórkach ssaków retikulum endoplazmatyczne lub ER odgrywa ważną rolę w biogenezie białek i sygnalizacji wapniowej. Heterotrimeryczny kompleks płci 61 w błonie ER zapewnia wodną ścieżkę dla nowo zsyntetyzowanych polipeptydów do światła ER. Ostatnie dane sugerują, że seks 61 może również tworzyć przejściowe kanały wycieku wapnia, aby bezpośrednio odnieść się do roli kompleksu Sex 61 jako potencjalnego kanału wycieku wapnia.

Aby scharakteryzować jego domniemane mechanizmy regulacyjne, komórki są najpierw traktowane siRNA skierowanymi przeciwko genowi płci 61 A. W analizie komplementacji komórki są transfekowane wektorem GFP tęczówki, który pozwala na odporną na irna ekspresję genu płci dzikiej 61 A one. Następnie komórki są ładowane wskaźnikiem metrycznym RO dwa i monitorowane są zmiany stężenia wapnia w cytozolu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Podczas pomiaru poziomu wapnia przeprowadza się zmiany roztworu w celu oceny wpływu różnych czynników, takich jak antagoniści kalmoduliny i argon FABS na wyciek wapnia. Analiza ilościowa uzyskanych obrazów ujawnia zmiany w strumieniu wapnia F wywołane wyciszeniem płci 61 A. W tym filmie zostanie zaprezentowany model roli płci 61 A w strumieniu wapnia F po zademonstrowaniu procedury i przedstawieniu wyników.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak eksperymenty biologiczne z lipidami planetarnymi lub pomiary jednokanałowe, jest to, że potencjalne białka błonowe mogą być analizowane w środowisku natywnym, bez żmudnego oczyszczania i zazwyczaj nieefektywnej rekonstytucji funkcjonalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji wapniowej, takie jak na przykład, jaki jest udział określonych białek błonowych ER w FFL wapnia z ER w różnych typach komórek i jak są one kontrolowane? Demonstracja procedury będzie długo i NICO dwóch utalentowanych absolwentów z naszych laboratoriów Rozpocznij tę procedurę od przygotowania roztworów i odczynników, które mają być użyte Najpierw przygotuj bufor wolny od wapnia zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym pisemnym protokole.

Zadzwoń dalej, rozcieńczyć roztwór podstawowy wskaźnika wapnia. Umrzeć fira 2:00 AM w jednym mililitrze DMEM zawierającym 10% FBS i 1% streptomycyny penicyliny do końcowego stężenia czterech mikromolów, rozcieńczyć jednomilimolowy roztwór podstawowy Apso Garin w buforze wolnym od wapnia do końcowego stężenia trzech mikromolowych, mieć również pod ręką 200 mikromolowych oleiny A i 20 mikromolowych, aby zmniejszyć ryzyko badania niedocelowych skutków określonego irna. Dwa różne irny są używane do wyciszenia każdego genu w celu oceny możliwych skutków ubocznych procedury transfekcji.

SiRNA kontroli ujemnej, które składają się z losowej sekwencji nukleotydów, są transfekowane równolegle z eksperymentalnymi siRNA. Ważne jest, że efekt wyciszania za pośrednictwem irna może być uratowany przez ekspresję dzikiego typu CD NA. Dlatego siRNA użyte w eksperymencie są specjalnie dobrane tak, aby siRNA nie miały wpływu na plazmid ratunkowy. W tym eksperymencie siRNA są skierowane zarówno przeciwko regionowi powlekającemu, jak i niepowlekającemu lub regionowi nieulegającemu translacji, w skrócie UTR interesującego genu.

Gdy siRNA są skierowane przeciwko ratunkowi UTR, plazmidy bez endogennego UTR mogą być użyte do przeprowadzenia transfekcji w komórkach hela. Przygotuj komórki do transfekcji, umieszczając 25-milimetrowe szkiełko nakrywkowe pokryte poliolem i lizyną w jednym sześciocentymetrowym naczyniu do hodowli komórek dla każdej transfekcji po jednej godzinie, dodaj 5,2 razy 10 do piątej komórki hela i uzupełnij DMEM do każdej szalki. Aby transfekować komórki, należy oznaczyć jedną mikroprobówkę wirówkową.

Do każdej reakcji transfekcji do każdej probówki dodaje się cztery mikrolitry 20 mikromolowych S irna rozpuszczonych w 80 mikrolitrach optimum tutaj, SEC 61 A jeden, płeć 61 A jeden UTR i kontrolny irna kontroli ujemnej są przygotowywane do każdej probówki. Dodaj 20 mikrolitrów odczynnika do transfekcji Hyper Perfect, delikatnie wiruj, a następnie inkubuj reakcje w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Aby transfekować komórki, dodaj irna mix w sumie 104 mikrolitry kroplami do osadzonych komórek heli i delikatnie zakręć naczyniem, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie kompleksów transfekcji.

Inkubowany w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku z 5% dwutlenkiem węgla. Po 24 godzinach zastąp pożywkę 3,9 mililitra świeżej pożywki. Następnie, aby zwiększyć wydajność transfekcji, wykonaj transfekcję po raz drugi, używając tej samej mieszanki irna do oceny wyciszenia, wykonaj analizę western blot.

Wyciszenie powinno wynosić powyżej 80%, jak pokazano tutaj dla seksu 61 Jeden. Maksymalny efekt wyciszenia obserwuje się zwykle 96 godzin po pierwszej transfekcji, 48 godzin po pierwszej transfekcji przygotowanej w celu uratowania fenotypu wynikającego z płci. 61 Wyciszanie należy rozpocząć od oznaczenia nowej mikroprobówki wirówkowej.

Dla każdej reakcji komórki będą teraz transfekowane albo pustym wektorem, albo płcią typu dzikiego. 61 Plazmid o jednej ekspresji. Zastosowany tutaj plazmid ekspresyjny typu dzikiego został wygenerowany przez wstawienie płciowego 61 A jednego cDNA do miejsca wielokrotnego klonowania pcd.

Trójwewnętrzny rybosomalny wektor GFP zawierający promotor wirusa cytomegalii, tęczówkę oraz sekwencję zielonej fluorescencyjnej powłoki białkowej. Przygotować odczynnik do transfekcji, dodając do każdej probówki cztery mikrogramy każdego plazmidu rozpuszczonego w 80 mikrolitrach optymalnego. Następnie dodaj do tego 16 mikrolitrów odczynnika do transfekcji genu FU HD, delikatnie zwiruj ten roztwór i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie, po wymianie pożywki, dodaj mieszaninę plazmidów kroplami do osadzonych 5,2 razy 10 do piątych komórek heli i delikatnie zakręć szalką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie kompleksów transfekcyjnych. Umieść komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i inkubuj przez kolejne 48 godzin. Aby określić wydajność transfekcji, oceń ekspresję GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Po 48 godzinach co najmniej 80% komórek powinno zostać przetransfekowanych. Przed obrazowaniem. Za pomocą kleszczy przenieś szkiełka nakrywkowe z transfekowanymi komórkami hela do nowego 3,5-centymetrowego naczynia do hodowli komórek i dodaj jeden mililitr DMEM z czterema mikromolami.

Jeśli jesteś o 2:00 w nocy, wysiakuj przez 45 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Aby wykonać obrazowanie, przenieś szkiełko nakrywkowe z mniejszą liczbą dwóch załadowanych komórek do metalowej komory zapisu i zamocuj ją na miejscu, skręcając ze sobą dwie części komory. Za pomocą pipety dodaj i usuń 300 mikrolitrów buforu wolnego od wapnia do komórek, aby je umyć.

Powtórz tę czynność, a następnie zamontuj komorę zapisu na mikroskopie I MIC z krematorem polichromowanym pięciocylindrycznym. Korzystając z zestawu filtrów dla URA dwa, znajdź pole zawierające co najmniej 20 komórek, aby oszacować niezależną od wapnia fluorescencję FU A dwa. Długość fali wzbudzenia użyta na tym etapie wynosi 360 nanometrów.

Po wybraniu odpowiedniego pola skonfiguruj oprogramowanie do obrazowania tak, aby wzbudzało przy 340 nanometrach i 380 nanometrach i mierzyło emitowaną fluorescencję przy 510 nanometrach co trzy sekundy, ustaw czas ekspozycji, aby uzyskać intensywność fluorescencji około 1000 dowolnych jednostek dla pokazanej tutaj konfiguracji. Ustawiony jest czas ekspozycji wynoszący pięć milisekund. Dodatkowo oznacz obszary zainteresowania lub ROI, aby uzyskać obszar tła wolny od komórek i do 20 konturów komórek.

Zainicjuj obrazowanie komórek życiowych podczas trwania eksperymentu, system przedstawi obrazy metryczne proporcji dla mniej dwóch sygnałów, a także współczynniki F trzy 40 F trzy 80 dla każdego oznaczonego ROI w postaci wykresu liniowego, gdzie F trzy 40 i F trzy 80 odpowiadają intensywności fluorescencji w ROI odpowiednio przy 340 i 380 nanometrach. Po jednej minucie dodaj roztwory testowe do komory obrazowania, aby przetestować różne parametry eksperymentalne. W tych eksperymentach antagonista Cal Modlin, trifluor i bollin A są testowane po przeprowadzeniu pomiarów metrycznych proporcji przez dodatkowe 10 minut.

W przypadku antagonistów modułowych CAL dodaj gargan DSA i kontynuuj pomiary. Nagraj 400 sparowanych obrazów w eksperymencie. Po zebraniu obrazów przejrzyj obrazy i zaznacz ROI dla co najmniej 20 komórek dla każdego pola view.

Następnie użyj opcji analizy kinetycznej w oprogramowaniu, aby utworzyć sekwencję obrazów o odjętym współczynniku tła i wykres przedstawiający kinetykę stosunku wapnia odjętego tła. Dla każdego zwrotu z inwestycji na koniec wyeksportuj dane do Excela i punktu początkowego przy użyciu ustalonej metody kalibracji. Stężenie wapnia w cytozolu można obliczyć na podstawie pomiarów stosunkowych, aby zbadać, czy płeć 61 Jeden gen wpływa na wyciek wapnia z er.

Gen płci 61 A został wyciszony przez dwa różne RNA i komórki helo na 96 godzin. Wyciszenie oceniono za pomocą zachodniej analizy krwi podobnej liczby komórek w trzech egzemplarzach, jak pokazano tutaj, istnieje silny sygnał alfa 6 61 w pasach od pierwszego do trzeciego i znacznie słabszy sygnał w pasmach od czwartego do szóstego i od siódmego do dziewiątego, które odpowiadają 6 61 A jeden komórek ciszy. Aby określić ilościowo wyniki, sygnały płci 61 alfa znormalizowano do sygnałów beta aktyny większych niż 80%, co osiągnięto w celu przetestowania roli kalmoduliny w strumieniu wapnia F ER.

URA dwa obrazowanie płci 61 A jeden sir A leczone komórki helo przeprowadzono w obecności lub bez antagonisty Cal Modin. Bollin A. Ten film pokazuje komórki kontrolne leczone bollin 10 minut po bollin. Leczenie uwalnianiem wapnia rozpoczęto poprzez zastosowanie FSO Gargan, inhibitora circa, który demaskował uwalnianie wapnia z ER przy braku zewnętrznego wapnia, jak widać tutaj.

Dodanie argonu FSA doprowadziło do przejściowego, ale znaczącego wzrostu fluorescencji wskazującego na strumień wapnia F z er. W przeciwieństwie do tego, strumień wapnia F po dodaniu garyny FSO do kości PHE, płeć traktowana A 61 A jedna cicha komórka jest znacznie mniej wyraźny, jak widać tutaj. Różnicę tę można wyraźnie zobaczyć na tym wykresie, który pokazuje szacowany wapń cytozolu w czasie w serii filmów, pokazane tutaj wyniki ilościowe potwierdzają zwiększony flx wapnia w komórkach kontrolnych w odpowiedzi na argon towy w obecności offi boliny A, jak widać na tym schemacie słupkowym.

To samo zjawisko zaobserwowano w przypadku drugiego antagonisty krzywki, triazyny. Jednak efekty antagonistów krzywki nie były obserwowane, gdy kompleks płci 61 został zubożony z komórek przez jedną z dwóch płci. 61 Częściowe uratowanie tego fenotypu przez jedno specyficzne siRNA można zaobserwować, gdy płeć 61 A jedna cicha komórka została transfekowana płcią.

61 plazmid o jednej ekspresji, jak można zobaczyć tutaj. Calcium ffl w odpowiedzi na agonistów Cal Modin jest częściowo przywracany przez transfekcję niewrażliwego na irna plazmidu typu dzikiego. Wyniki te sugerują, że Cal Modlin bierze udział w ograniczaniu ER wapnia flx na poziomie kompleksu płci 61 w komórkach.

Jeśli tak, transfekcja płci, 61 Gen jeden z podwójną mutacją w miejscu wiązania Cal Modin nie powinna uratować fenotypu indukowanego przez irna. Rzeczywiście, gdy komórki zostały przetransfekowane przy użyciu plazmidu płci 61 A o jednej ekspresji z podwójną mutacją w motywie IQ, nie było ratunku dla fenotypu wziętego razem. Dane te wskazują, że uwolnienie powstających łańcuchów z kompleksu płci 61 rzeczywiście prowadzi do uwolnienia wapnia z ER i powstania nanodomeny wapnia wokół ust cytoselekcjonera kompleksu płci 61.

Ten wapń jest wiązany przez Cal Moulin, a wapń Cal Moulin zamyka kompleks płci 61. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak połączyć wyciszanie genów za pośrednictwem IRNA w komórkach ludzkich z obrazowaniem wapnia w stylu życia Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak ekspresja CDNA z mutacjami związanymi z chorobą, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak potencjalny wpływ mutacji związanych z chorobą na nieistotne komponenty.

I nie zapominaj, że praca z lekami, takimi jak kran, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachowywać ostrożność, taką jak używanie rękawiczek.