Name: Obrazowanie wapnia w żywych komórkach w połączeniu z wyciszaniem genów za pośrednictwem siRNA identyfikuje kanały przeciekowe Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia w żywych komórkach z wyciszaniem genów siRNA, która identyfikuje kanały przeciekowe Ca²⁺ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.L. otrzymał wsparcie w ramach stypendium z DFG (Graduate Research School 845). Praca ta była finansowana z grantów DFG (SFB 530/C1 oraz FOR 967) oraz przez HOMFOR.

1. Przygotowanie roztworów stokowych
<ol>
<li>Przygotować bufor wolny od wapnia (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM glukozy w 10 mM HEPES-KOH, (pH 7,35)).</li>
<li>Rozpuścić FURA-2 AM w DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór stokowy. Mieszać za pomocą wortexa, aż roztwór stanie się jednorodnie jasnożółty. Chronić probówkę przed światłem. Rozcieńczyć roztwór stokowy FURA-2 AM w 1 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle'a Dulbecco (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny do stężenia końcowego 4 μM w celu obciążenia komórek HeLa.</li>
<li>Przygotować 12,5 mM roztwór stokowy puromycyny w wodzie destylowanej (pH 7,0). Alikwoty przechowywać w temperaturze -20°C. Rozcieńczyć 12,5 mM roztwór stokowy puromycyny w buforze wolnym od wapnia do stężenia końcowego 500 μM puromycyny.</li>
<li>Rozpuścić tapsygarginę w DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór stokowy.</li>
<li>Rozpuścić 1 mg ophioboliny A w 20 μl chloroformu, a następnie zmieszać z 25 μl DMSO. Probówkę do mikrocentryfugi pozostawić otwartą do czasu odparowania chloroformu. W ten sposób końcowe stężenie ophioboliny A wynosi 100 mM. Alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwory stokowe w buforze wolnym od wapnia do stężenia końcowego 100 μM. Dzięki temu końcowe stężenie DMSO podczas obrazowania żywych komórek nie przekracza 0,1%.</li>
<li>Rozpuścić trifluoperazynę w DMSO do stężenia 10 mM i przechowywać alikwoty w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwory stokowe w buforze wolnym od wapnia do stężenia końcowego 10 μM. Dzięki temu końcowe stężenie DMSO podczas obrazowania żywych komórek, podobnie jak w przypadku ophioboliny A, nie przekracza 0,1%.</li>
<li>Rozpuścić siRNA (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA oraz kontrolne siRNA) w wodzie wolnej od RNazy, aby przygotować 20 μM roztwór stokowy. Mieszać za pomocą wortexa i kontrolować rozpuszczanie wizualnie. Alikwoty o objętości 50 μl przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Wyciszanie genów w komórkach HeLa
W celu zbadania udziału konkretnego białka w odpływie Ca2+ z ER, odpowiedni gen musi zostać efektywnie wyciszony za pomocą dwóch różnych siRNA (Rys. 1). Dodatkowo efekt wyciszenia musi zostać zniesiony poprzez ekspresję odpowiedniego genu typu dzikiego. Zazwyczaj stosujemy siRNA skierowane odpowiednio przeciwko regionowi kodującemu i niekodującemu (UTR) badanego genu. Zastosowanie siRNA skierowanego przeciwko UTR stanowi dogodną metodę komplementacji.
<ol>
	<li> Wysiać 5,2 x 105 komórek HeLa (ATCC nr CCL-2) w 6-centymetrowej szalce hodowlanej z 25-milimetrowym szkiełkiem nakrywkowym (wstępnie potraktowanym 200 μl poli-L-lizyny (1 mg/ml) przez 1 h) w pożywce DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny, a następnie inkubować w 37°C w warunkach zwiększonej wilgotności z 5% CO2 (objętość końcowa 3,9 ml). </li>
<li> Przeprowadzić transfekcję komórek siRNA przeciwko SEC61A1, siRNA przeciwko SEC61A1-UTR lub kontrolnym siRNA negatywnym, używając odczynnika HiPerFect zgodnie z instrukcją producenta (stężenie końcowe siRNA: 20 nM). W skrócie: przygotować świeże roztwory siRNA w oddzielnej probówce do mikrocentryfugi przed właściwą procedurą transfekcji: dodać 20 μl odczynnika do transfekcji HiPerFect do 4 μl każdego siRNA (20 μM) rozpuszczonego w 80 μl OptiMEM. Mieszaninę delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. Mieszaninę siRNA (104 μl) dodać kroplami do wysianych 5,2 x 105 komórek HeLa (3,9 ml).</li>
<li> Po 24 h wymienić pożywkę (3,9 ml) i przeprowadzić drugą transfekcję komórek tą samą mieszaniną siRNA (104 μl).</li> 
<li> Ocenić wyciszenie za pomocą analizy Western blot. Powinno ono przekraczać 80%. Przemyć komórki z szalki hodowlanej w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i zebrać je w pożywce DMEM. Policzyć komórki przy użyciu automatycznego licznika komórek Countess. Zlizować komórki w buforze do lizy komórek (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 3 mM MgCl2, 0,5% NP40) uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteaz (3 μg/ml Pepstatyny A, 3 μg/ml Leupeptyny, 3 μg/ml Antipainu, 3 μg/ml Chymastatyny) i zmieszać z buforem do próbek SDS (60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerolu, 5% β-merkaptoetanolu, 0,01% błękitu bromofenolowego), aby uzyskać stężenie końcowe 10 000 komórek/μl. Próbki podgrzewać w 56 °C przez 15 min, a następnie dodać szklane kuleczki i mieszać na wirówce typu vortex przez 20 min w celu fragmentacji DNA. 20 μl każdej próbki rozdzielić za pomocą SDS-PAGE typu Laemmli (zazwyczaj 15% poliakryloamidu dla żelu rozdzielającego). Przenieść rozdzielone białka na membranę PVDF metodą elektrotransferu („wet-blot”) przy stałym natężeniu 400 mA przez 3 h lub przez noc w buforze do transferu (100 mM glicyny, 12,5 mM Tris-HCl). Następnie blokować 5% (w/v) odtłuszczonym mlekiem w proszku w PBS przez 30 min w temperaturze pokojowej, a potem inkubować membranę z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko końcowi C-terminalnemu Sec61α z królika oraz przeciwciałem przeciwko β-aktynie z myszy. Przemyć membranę w roztworze PBS-TritonX-100 (0,05%) i dwukrotnie w PBS przez odpowiednio 5 min. Wizualizować przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą koniugatu ECL Plex goat-anti-rabbit IgG-Cy5 lub ECL Plex goat-anti-mouse IgG-Cy3 oraz systemu obrazowania Typhoon-Trio w połączeniu z oprogramowaniem Image Quant TL 7.0. W przypadku genu SEC61A1 maksymalny efekt wyciszenia obserwuje się zazwyczaj 96 h po pierwszej transfekcji. Reprezentatywny eksperyment przedstawiono na Rys. 2.</li>
</ol>
3. Komplementacja komórek HeLa
Aby przywrócić fenotyp po wyciszeniu SEC61A1, cDNA SEC61A1 wprowadzono do miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) wektora pCDNA3-internal ribosomal entry site (IRES)-GFP, który zawierał promotor cytomegalowirusa (CMV), MCS, IRES oraz sekwencję kodującą zielone białko fluorescencyjne (GFP).
<ol>
<li>48 h po pierwszej transfekcji siRNA, wymień medium (3.9 ml) po raz drugi i przekształć komórki za pomocą pustego wektora lub plazmidu ekspresyjnego SEC61A1 przy użyciu Fugene HD zgodnie z protokołem producenta (ostateczny stosunek wektora do Fugene HD wynosi 4 μg wektora na 16 μl Fugene HD). W skrócie, przed procedurą transformacji przygotuj świeżo plazmidy w oddzielnej probówce do mikrowirówki: dodaj 16 μl odczynnika do transformacji Fugene HD do 4 μg każdego plazmidu rozpuszczonego w 80 μl OptiMEM. Delikatnie wymieszaj tę mieszaninę w wirówce vortex i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min. Dodaj kroplami mieszaninę plazmidową (0.1 ml) do wysianych 5.2 x 105 komórek HeLa (3.9 ml).</li>
<li>Po 48 h ekspresji plazmidu poddaj szalki hodowlane mikroskopii fluorescencyjnej przed obrazowaniem wapnia i zbiorami. W razie potrzeby zastąp DMEM roztworem PBS, aby uzyskać lepsze sygnały fluorescencyjne. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD. Wydajność transformacji można określić, dzieląc liczbę komórek wykazujących fluorescencję GFP przez liczbę komórek policzonych w trybie jasnego pola; powinna ona wynosić powyżej 80%. Typowy wynik przedstawiono na Rys. 3.</li>
</ol>
4. Obrazowanie wapnia w żywych komórkach
<ol>
<li>Przed pomiarem przenieś szkiełko podstawowe z transfektowanymi komórkami HeLa do oddzielnej szalki hodowlanej o średnicy 3,5 cm. Obciąż komórki 4 μM FURA-2 AM w 1 ml DMEM przez 45 min w temperaturze 25°C w ciemności11,12.</li> 
<li>Zamocuj szkiełko podstawowe o średnicy 25 mm w metalowej komorze iMIC, przemyj komórki dwukrotnie i inkubuj w buforze wolnym od wapnia (za każdym razem 300 μl).</li>
<li>Rozpocznij zbieranie danych za pomocą mikroskopu iMIC z modułem polychrome V, stosując naprzemienne wzbudzanie przy 340 nm i 380 nm oraz mierząc emitowaną fluorescencję przy 510 nm (zestaw filtrów: dzielnik wiązki, 565 nm; emitter, 605/70 nm). Pobieraj obrazy próbek zawierające 20-50 komórek na klatkę co 3 s. Rejestruj sygnały FURA-2 jako stosunki F340/F380, gdzie F340 i F380 odpowiadają odpowiednio natężeniu fluorescencji po odjęciu tła przy 340 i 380 nm.</li> 
<li>Po 1 min potraktuj komórki puromycyną (500 μM) w buforze wolnym od wapnia lub samym buforem. Alternatywnie, potraktuj komórki inhibitorem małocząsteczkowym (takim jak 10 μM trifluoperazyny lub 100 μM ophiboliny A) lub buforem wolnym od wapnia.</li> 
<li>Po przeprowadzeniu pomiarów ratiometrycznych przez 2 lub 10 min dodaj tapsygarginę (1 μM) i kontynuuj pomiary.</li> 
<li>Ostatecznie, stężenie cytozolowe [Ca2+] szacuje się z pomiarów stosunków (ratio) za pomocą uznanej metody kalibracyjnej.2 Przeanalizuj dane za pomocą programów Excel 2007 i Origin 6.1.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Do tej pory analizowaliśmy kwestię tego, czy wyciszenie genu SEC61A1 wpływa na wyciek wapnia (Ca2+) z ER (Rys. 1). Gen SEC61A1 został wyciszony za pomocą dwóch różnych siRNA w komórkach HeLa przez 96 godzin. Podczas gdy wyciszenie niemal nie wpłynęło na wzrost i żywotność komórek, transport białek do ER w komórkach półprzepuszczalnych został niemal całkowicie zahamowany. Co więcej, komórki z wyciszonym genem SEC61A1 wykazały znaczne zaburzenia w zakresie wycieku Ca2+ z ER. Efekt wyciszenia genu został odwrócony poprzez ekspresję genu SEC61A1. Zatem kompleksy Sec61 obecne w błonie ER wszystkich komórek jądrzastych tworzą kanały wycieku Ca2+, które prawdopodobnie odgrywają kluczową rolę w homeostazie Ca2+. Jednakże obecność dużych, wypełnionych wodą porów o niekontrolowanej przepuszczalności jonowej, takich jak te tworzone przez kompleksy Sec61 w błonie ER, poważnie zakłócałaby regulowane uwalnianie Ca2+ z lumeny ER do cytosolu, co jest niezbędnym mechanizmem sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Zidentyfikowaliśmy motyw wiążący kalmodulinę (CaM) w cytozolowym N-końcu ssaczej Sec61α, który wiązał CaM, ale nie wolną od Ca2+ apokalmodulinę, z powinowactwem nanomolarnym i specyficznością sekwencyjną. Na poziomie komórkowym dwa różne antagoniści CaM stymulowały uwalnianie Ca2+ z ER w obecności, ale nie w przypadku braku kanałów Sec61 (Rys. 4 i 5). Zjawisko to nie zostało zaobserwowane w przypadku obecności kanałów Sec61 zawierających mutacje w motywie IQ białka Sec61α. Zatem kompleks Ca2+-CaM uczestniczy w ograniczaniu wycieku Ca2+ z ER (Rys. 6).
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Transfekcja plazmidu siRNA w komórkach HeLa, obrazowanie Ca²⁺ z użyciem Fura-2; schemat procesu eksperymentalnego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Schemat blokowy. Szczegóły znajdują się w tekście.
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Schemat Western blot, efekt siRNA SEC61 na Sec61α, kontrola β-actin; analiza ekspresji białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Analiza danych dotyczących wydajności wyciszania. Wyciszanie oceniono za pomocą analizy Western-blot przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko Sec61α oraz β-actin (kontrola załadunku). Przeciwciała pierwotne wizualizowano przy użyciu przeciwciał wtórnych ECL Plex oraz obrazowania fluorescencyjnego.
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Porównanie kanału jasnego pola i GFP dla próbek nieleczonych, z pustym wektorem oraz po transfekcji wektorem SEC61A1." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Analiza danych dotyczących wydajności transfekcji. Obrazy zarejestrowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD. Wydajność transformacji można określić, dzieląc liczbę komórek wykazujących fluorescencję GFP przez liczbę komórek policzonych w trybie jasnego pola.
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Eksperyment z siRNA na komórkach HeLa, Cyto A; minuty tg; obraz mikroskopii fluorescencyjnej; analiza SEC61." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Zrzuty ekranu z obrazowania wapnia w żywych komórkach HeLa w obecności kontrolnego siRNA lub siRNA przeciwko SEC61A1 oraz w obecności lub przy braku antagonisty CaM, ophioboliny A. Komórki HeLa były traktowane siRNA skierowanym przeciwko SEC61A1 (B) lub negatywnym kontrolnym siRNA (A) przez 96 h, zgodnie z oznaczeniem. Komórki te załadowano wskaźnikiem wapnia FURA-2 AM i inkubowano w buforze wolnym od Ca2+ zawierającym 0,5 mM EGTA, a następnie dodano bufor lub ophiobolinę A (Ophio A) w buforze i wznowiono inkubację. Po 10 min zainicjowano uwalnianie Ca2+ poprzez zastosowanie tapsygarginy (TG) w obecności braku zewnętrznego Ca2+ i kontynuowano inkubację. Zrzuty ekranu z ciągłego obrazowania wapnia wykonano we wskazanych odstępach czasu.
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Wykres dynamiki sygnalizacji wapniowej; wpływ siRNA; wykresy słupkowe; testy z tapsygarginą i ofioboliną A." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. Analiza danych dla eksperymentów obrazowania wapnia w żywych komórkach. (A) Analiza kinetyczna i ilościowa serii eksperymentów przedstawionych na Ryc. 4A. Cytosoliczne [Ca2+] oszacowano na podstawie pomiarów stosunku (ratio) przy użyciu uznanej metody kalibracji2. Efekt działania tapsygarginy przedstawiono na wykresie słupkowym. (B-D) Komórki traktowano kontrolnym siRNA lub wskazanym siRNA przeciwko SEC61A1 przez 48 h, a następnie transformowano wektorem kontrolnym (C), plazmidem ekspresyjnym SEC61A1 (C) lub zmutowanym plazmidem ekspresyjnym SEC61A1 (D), zgodnie z oznaczeniem. Po 48 h przeprowadzono eksperymenty obrazowania wapnia, analogicznie jak na Ryc. 4 i 5A. Przedstawiono analizę statystyczną zmian stężenia Ca2+ w cytozolu po dodaniu tapsygarginy w eksperymentach takich jak zaprezentowane w A. Wartości P &lt; 0,001 uznano za istotne statystycznie w nieparzystym teście t i oznaczono trzema gwiazdkami (***); n.s. – brak istotności statystycznej. Podano liczbę analizowanych komórek. Przedstawiono wartości średnie, a słupki błędów reprezentują standardowe błędy średniej (s.e.m.). Zaznaczamy, że przykłady te zostały zaadaptowane z ref. 13.
<img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Schemat translokacji białek, rybosom, kompleks Sec61, transport wapnia, proces w błonie ER." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Dane te wskazują, że uwalnianie nowo powstających łańcuchów z kompleksu Sec61 rzeczywiście prowadzi do uwalniania wapnia z ER i powstania nanodomeny wapniowej wokół cytozolowego wylotu kompleksu Sec61. Wapń ten jest wiązany przez kalmodulinę, a kompleks wapń-kalmodulina zamyka kompleks Sec61.

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+physiological+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li>
<li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li>
<li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li>
<li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum%3A+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li>
<li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li>
<li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocon+closure+to+Ca2%2B+leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li>
<li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilins+form+ER+Ca2%2B+leak+channels%2C+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer%27s+disease-linked+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li>
<li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li>
<li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li>
<li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Ca2%2B+signalling+by+Na%2B%2FCa2%2B+exchangers+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li>
<li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC5+is+a+Ca2%2B-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2%2B-selective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li>
<li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W komórkach ssaków siateczka śródplazmatyczna (ER) odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek, jak również w sygnalizacji wapniowej. W niniejszej pracy opisaliśmy układ eksperymentalny, który pozwala nam bezpośrednio zbadać rolę jednego z potencjalnych kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować jego domniemane mechanizmy regulacyjne13. Ten układ eksperymentalny daje nam wyjątkowe możliwości, aby: i) ocenić wkład różnych białek błony ER w pasywny odpływ Ca2+ z ER w różnych typach komórek, ii) scharakteryzować białka i mechanizmy ograniczające ten pasywny odpływ Ca2+ oraz iii) zbadać wpływ mutacji związanych z chorobami w odpowiednich komponentach.
Zauważamy, że do analizy należy wykorzystać wyłącznie żywe komórki, a ogólna żywotność powinna przekraczać 80%. W związku z tym żywotność komórek jest rutynowo oceniana przy użyciu odczynnika do badania żywotności komórek Nuclear-ID blue/green zgodnie z protokołem producenta. Ponadto obowiązkowa jest analiza statystyczna zmian stężenia Ca2+ w cytozolu. Eksperymenty muszą być zatem przeprowadzone na czterech różnych seriach komórek, a w ramach jednego eksperymentu dla każdego stanu należy przeanalizować dwa szkiełka podstawowe zawierające co najmniej 20 komórek. Zaznaczamy, że poszczególne eksperymenty muszą zostać przeprowadzone w tym samym czasie po wysianiu komórek na szkiełka podstawowe.

<table><tbody><tr><td>DMEM+GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM+GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrom AG</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>PAA Laboratories</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect</td><td>Qiagen</td><td>301707</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Roche Group</td><td>04709713</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oceny żywotności komórek Nuclear-ID Blue/Green</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ENZ-53004</td><td></td></tr><tr><td>FURA-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1221</td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>Tapsygargina</td><td>Invitrogen</td><td>T-7459</td><td></td></tr><tr><td>Ofiobolina A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-109</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoperazyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T 6062</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess&amp;#174;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania Typhoon-Trio</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop TE2000-S z kamerą DS-5Mc</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop iMIC z polychrome V</td><td>Till Photonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą sirna identyfikuje kanały przecieku ca2+ w błonie er i ich mechanizmy regulacyjne

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

W komórkach ssaków siateczka śródplazmatyczna (ER) odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek, a także w sygnalizacji wapniowej1. Heterotrymeryczny kompleks Sec61 w błonie ER zapewnia wodną drogę dla nowo syntetyzowanych polipeptydów do światła ER. Niedawne prace różnych laboratoriów zasugerowały, że ten heterotrymeryczny kompleks może również tworzyć przejściowe kanały przecieku Ca2+2-8. Kluczową obserwacją dla tej koncepcji był fakt, że uwolnienie powstających polipeptydów z rybosomu i kompleksu Sec61 za pomocą puromycyny prowadzi do przejściowego uwalniania Ca2+ z ER. Ponadto zaobserwowano in vitro, że białko lumenalne ER, BiP, bierze udział w zapobieganiu przepuszczalności jonowej na poziomie kompleksu Sec619,10. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam bezpośrednio zbadać rolę kompleksu Sec61 jako potencjalnego kanału przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować jego domniemane mechanizmy regulacyjne11-13. System ten łączy wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach13. Komórki są traktowane siRNAs skierowanymi odpowiednio przeciwko regionowi kodującemu i niekodującemu (UTR) genu SEC61A1 lub negatywną kontrolą siRNA. W analizie komplementacji komórki są kotransfekowane wektorem IRES-GFP, który umożliwia ekspresję genu SEC61A1 typu dzikiego odporną na siRNA. Następnie komórki są obciążane ratiometrycznym wskaźnikiem Ca2+ FURA-2, aby za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego jednocześnie monitorować zmiany stężenia Ca2+ w cytozolu w wielu komórkach. Ciągły pomiar Ca2+ w cytozolu pozwala również na ocenę wpływu różnych czynników, takich jak puromycyna, małocząsteczkowe inhibitory i tapsygargin, na przeciek Ca2+. Ten system eksperymentalny daje nam wyjątkowe możliwości, aby: i) ocenić wkład różnych białek błony ER w pasywny odpływ Ca2+ z ER w różnych typach komórek, ii) scharakteryzować białka i mechanizmy ograniczające ten pasywny odpływ Ca2+ oraz iii) zbadać efekty mutacji związanych z chorobami w odpowiednich komponentach.

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

W komórkach ssaków siateczka śródplazmatyczna (ER) odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek, jak i w sygnalizacji wapniowej1. Heterotrymeryczny kompleks Sec61 ...

W komórkach ssaków siateczka śródplazmatyczna (ER) odgrywa istotną rolę w biogenezie białek oraz w sygnalizacji wapniowej. Heterotrymeryczny kompleks Sec61 w błonie ER tworzy wodny kanał, przez który nowo zsyntetyzowane polipeptydy przedostają się do światła siateczki. Niedawne dane sugerują, że Sec61 może również tworzyć przejściowe kanały przecieku wapnia, co pozwala bezpośrednio zbadać rolę kompleksu Sec61 jako potencjalnego kanału przecieku wapnia.Aby scharakteryzować domniemane mechanizmy regulacyjne, komórki są najpierw traktowane siRNA skierowanymi przeciwko genowi sex 61 A one. W analizie komplementacji komórki są współtransfekowane wektorem iris GFP, który umożliwia ekspresję genu sex 61 A one typu dzikiego w sposób odporny na irna. Następnie komórki są obciążone ratiometrycznym wskaźnikiem wapnia RO two, a zmiany w stężeniu wapnia w cytozolu są monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Podczas pomiaru poziomu wapnia wprowadzane są zmiany w roztworze, aby ocenić wpływ różnych czynników, takich jak antagoniści kalmoduliny i fab argon, na wyciek wapnia. Analiza ilościowa uzyskanych obrazów wykazuje zmiany w strumieniu wapnia indukowane wyciszeniem genu sex 61 A one. W tym filmie, po zaprezentowaniu procedury i omówieniu wyników, przedstawiony zostanie model roli sex 61 A one w strumieniu wapnia.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak eksperymenty na błonach lipidowych czy pomiary jednokanałowe, jest możliwość analizy kandydackich białek błonowych w ich naturalnym środowisku, bez uciążliwego oczyszczania i zazwyczaj nieefektywnej rekonstytucji funkcjonalnej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji wapniowej, na przykład: jaki jest udział konkretnych białek błony ER w odpływie wapnia z ER w różnych typach komórek i w jaki sposób są one kontrolowane? Procedurę zaprezentują dwaj utalentowani studenci studiów doktoranckich z naszych laboratoriów. Rozpocznij procedurę od przygotowania niezbędnych roztworów i odczynników. W pierwszej kolejności przygotuj bufor wolny od wapnia zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym protokole pisemnym.W kolejnym kroku rozcieńcz roztwór zapasowy wskaźnika wapnia. Dodaj 2 µL do jednego mililitra DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny, aby uzyskać końcowe stężenie 4 µM. Rozcieńcz 1 mM roztwór zapasowy Apso-Garin w buforze wolnym od wapnia do końcowego stężenia 3 µM. Przygotuj również 200 µM oleiny A oraz 20 µM, aby zmniejszyć ryzyko wystąpienia efektów poza-celowych konkretnego irna. W celu wyciszenia każdego genu wykorzystuje się dwa różne irna, co pozwala ocenić możliwe skutki uboczne procedury transfekcji.Negatywne siRNAs kontrolne, składające się z losowej sekwencji nukleotydów, są transfektowane równolegle z eksperymentalnymi siRNAs. Istotne jest, aby efekt wyciszania zapośredniczonego przez siRNA mógł zostać zniesiony poprzez ekspresję CD NA typu dzikiego. Dlatego siRNAs użyte w eksperymencie są specyficznie dobierane tak, aby plazmid ratujący nie był podatny na działanie tych siRNAs. W niniejszym doświadczeniu siRNAs są skierowane zarówno przeciwko regionowi kodującemu, jak i niekodującemu, czyli regionowi nietranslacyjnemu, w skrócie UTR, genu będącego przedmiotem zainteresowania.Gdy siRNA są skierowane przeciwko ratowaniu UTR, do transfekcji komórek HeLa można użyć plazmidów bez endogennego UTR. Przygotuj komórki do transfekcji, umieszczając w każdej sześciocentymetrowej szalce hodowlanej do każdej transfekcji szkiełko podstawowe o średnicy 25 milimetrów powlekone poli-L-lizyną; po godzinie dodaj do każdej szalki 5,2 × 10⁵ komórek HeLa oraz uzupełnione DMEM. Aby przeprowadzić transfekcję komórek, opisz jedną probówkę do mikrocentryfugi.Do każdej probówki dla każdej reakcji transfekcji należy dodać 4 µL 20 µM siRNA rozpuszczonego w 80 µL Opti-MEM. Do poszczególnych probówek przygotowuje się siRNA dla SEC61A1, SEC61A1 UTR oraz siRNA kontrolne ujemne. Następnie należy dodać 20 µL odczynnika do transfekcji Hyperfect, delikatnie wymieszać w wirówce Vortex, a następnie inkubować mieszaniny w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Aby przeprowadzić transfekcję komórek, należy kroplowo dodać mieszaninę siRNA (łącznie 104 µL) do osiadłych komórek HeLa, a następnie delikatnie zakręcić naczyniem, aby zapewnić równomierny rozkład kompleksów transfekcyjnych.Inkubowano w temperaturze 37°C w środowisku nawilżonym z dodatkiem 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach wymieniono pożywkę na 3,9 ml świeżej pożywki. Następnie, aby zwiększyć wydajność transfekcji, przeprowadzono transfekcję po raz drugi, używając tej samej mieszaniny irna; w celu oceny wyciszenia przeprowadzono analizę western blot.Wyciszenie powinno wynosić powyżej 80%, jak pokazano tutaj dla sex 61 A one. Maksymalny efekt wyciszenia jest zazwyczaj obserwowany 96 godzin po pierwszej transfekcji, 48 godzin po pierwszej transfekcji przygotowano w celu odzyskania fenotypu wynikającego z wyciszenia sex. 61; rozpocznij od oznakowania nowej probówki do mikrowirówki.W każdej reakcji komórki zostaną teraz transfektowane pustym wektorem lub plazmidem ekspresyjnym dla typu dzikiego białka sex 61 A one. Plazmid ekspresyjny typu dzikiego wykorzystany w tym badaniu został stworzony poprzez wstawienie cDNA sex 61 A one do miejsca wielokrotnego klonowania wektora pcd.Wektor GFP z trzema wewnętrznymi sekwencjami wejścia rybosomalnego, zawierający promotor cytomegalowirusa, IRES oraz sekwencję kodującą zielone białko fluorescencyjne. Przygotować odczynnik do transfekcji, dodając cztery mikrogramy każdego plazmidu rozpuszczonego w 80 µl Opti-MEM do każdej probówki. Następnie dodać 16 µl odczynnika do transfekcji FUgene HD, delikatnie wymieszać ten roztwór na wirówcetce i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie po wymianie pożywki dodać kroplami mieszaninę plazmidów do wysianych komórek HELI w zagęszczeniu 5,2 × 10⁵ i delikatnie zakręcić naczyniem, aby zapewnić równomierny rozkład kompleksów transfekcyjnych. Umieścić komórki w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂ i inkubować przez kolejne 48 godzin. W celu określenia wydajności transfekcji ocenić ekspresję GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Po 48 godzinach co najmniej 80% komórek powinno zostać przetransfekowanych. Przed obrazowaniem, za pomocą pęsety przenieś szkiełka nakrywowe z przetransfekowanymi komórkami HeLa do nowej szalki hodowlanej o średnicy 3,5 centymetra i dodaj jeden mililitr DMEM z czterema mikromolami.Jeśli jest godzina 2:00, inkubuj przez 45 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Aby przeprowadzić obrazowanie, przenieś szkiełko nakrywki z co najmniej dwiema załadowanymi komórkami do metalowej komory rejestracyjnej i zamocuj ją, skręcając dwie części komory. Używając pipety, dodaj i usuń 300 mikrolitrów buforu pozbawionego wapnia, aby przemyć komórki.Powtórz tę procedurę, a następnie zamontuj komorę rejestracyjną na mikroskopie I MIC z krematorem polichromatycznym pięć. Używając zestawu filtrów dla URA dwa, znajdź pole zawierające co najmniej 20 komórek, aby oszacować fluorescencję FU A dwa niezależną od wapnia. Długość fali wzbudzenia stosowana w tym kroku wynosi 360 nanometrów.Po wybraniu odpowiedniego pola, skonfiguruj oprogramowanie obrazujące tak, aby wzbudzanie następowało przy 340 nanometrach i 380 nanometrach, a pomiar emitowanej fluorescencji odbywał się przy 510 nanometrach co trzy sekundy; ustaw czas ekspozycji tak, aby uzyskać intensywność fluorescencji wynoszącą około 1000 jednostek dowolnych dla przedstawionej tutaj konfiguracji. Ustawiono czas ekspozycji wynoszący pięć milisekund. Dodatkowo wyznacz obszary zainteresowania (ROI) dla regionu tła wolnego od komórek oraz dla maksymalnie 20 konturów komórek.Rozpocznij obrazowanie żywych komórek podczas trwania eksperymentu; system wyświetli obrazy ratiometryczne dla co najmniej dwóch sygnałów, a także wykres liniowy przedstawiający w czasie rzeczywistym stosunki F340/F380 dla każdego zaznaczonego obszaru ROI, gdzie F340 i F380 odpowiadają intensywności fluorescencji w obszarach ROI odpowiednio przy 340 i 380 nanometrach. Po jednej minucie dodaj roztwory testowe do komory obrazowania, aby sprawdzić różne parametry eksperymentalne. W tych doświadczeniach testuje się antagonistę kalmoduliny, trifluorynę i bolin A po przeprowadzeniu pomiarów ratiometrycznych przez dodatkowe 10 minut.W przypadku modularnych antagonistów CAL należy dodać DSA gargan i kontynuować pomiary. Należy zarejestrować 400 par obrazów na eksperyment. Po zebraniu obrazów należy je przejrzeć i wyznaczyć obszary ROI dla co najmniej 20 komórek w każdym polu widzenia.Następnie należy użyć opcji analizy kinetycznej w oprogramowaniu, aby utworzyć sekwencję obrazów stosunków z odjętym tłem oraz wykres przedstawiający kinetykę stosunku wapnia z odjętym tłem. Dla każdego ROI należy na koniec wyeksportować dane do programów Excel i Origin, stosując uznaną metodę kalibracji. Stężenie wapnia w cytozolu można obliczyć na podstawie pomiarów stosunku, aby zbadać, czy gen sex 61 A one wpływa na wyciek wapnia z ER.Gen SOCS1 został wyciszony za pomocą dwóch różnych RNA i komórki HeLa inkubowano przez 96 godzin. Wyciszenie oceniono za pomocą analizy Western blot dla podobnych liczb komórek w trzech powtórzeniach; jak pokazano tutaj, w ścieżkach od pierwszej do trzeciej widoczny jest silny sygnał SOCS1α, natomiast w ścieżkach od czwartej do szóstej oraz od siódmej do dziewiątej, które odpowiadają komórkom z wyciszonym genem SOCS1, sygnał jest znacznie słabszy. Aby ilościowo ocenić wyniki, sygnały SOCS1α znormalizowano względem sygnałów beta-aktyny; osiągnięto wyciszenie powyżej 80%, aby zbadać rolę kalmoduliny w przepływie wapnia w siateczce endoplasmicznej (ER).Obrazowanie URA two komórek helo płci 61 A one sir A traktowanych w obecności lub przy braku antagonisty Cal Modin. Bollin A. Ten film przedstawia komórki kontrolne traktowane bollinem a; 10 minut po traktowaniu bollinem A. Uwolnienie wapnia zostało zainicjowane poprzez zastosowanie FSO Gargan, inhibitora circa, który odsłonił uwalnianie wapnia z ER w przypadku braku zewnętrznego wapnia, co można zobaczyć tutaj.Dodanie FSA argon doprowadziło do przejściowego, lecz znaczącego wzrostu fluorescencji, co wskazuje na strumień wapnia z ER. W przeciwieństwie do tego, strumień wapnia po dodaniu FSO garin w PHE bone, A treated sex 61 A one silent cells jest znacznie mniej wyraźny, co widać tutaj. Różnica ta jest wyraźnie widoczna na tym schemacie, który przedstawia szacowane stężenie wapnia w cytosolu w czasie w serii filmów; ilościowe wyniki pokazane tutaj potwierdzają zwiększony strumień wapnia w komórkach kontrolnych w odpowiedzi na thic argon w obecności offi bolin A, co obrazuje ten wykres słupkowy.Podobne zjawisko zaobserwowano w przypadku drugiego antagonisty cam, triazyny. Jednakże efekty antagonistów cam nie wystąpiły, gdy kompleks sex 61 został usunięty z komórek za pomocą jednego z dwóch specyficznych dla sex 61 A one siRNA. Częściowe odwrócenie tego fenotypu można zaobserwować, gdy komórki z wyciszonym genem sex 61 A one zostały przetransfekowane sex.Plazmid z jedną ekspresją, jak widać tutaj. Przepływ wapnia w odpowiedzi na agoniści Cal Modliny jest częściowo przywrócony po transfekcji plazmidu typu dzikiego, niewrażliwego na irna. Wyniki te sugerują, że Cal Modlina bierze udział w ograniczaniu przepływu wapnia z ER na poziomie kompleksu sex 61 w komórkach.Jeśli tak, transfekcja genu Sec61α1 z podwójną mutacją w miejscu wiązania kalmoduliny nie powinna doprowadzić do odwrócenia fenotypu wywołanego przez irna. Rzeczywiście, gdy komórki poddano transfekcji przy użyciu plazmidu ekspresyjnego Sec61α1 z podwójną mutacją w motywie IQ, nie zaobserwowano odwrócenia fenotypu w całości. Dane te wskazują, że uwalnianie nowo powstających łańcuchów z kompleksu Sec61 rzeczywiście prowadzi do uwalniania wapnia z ER i tworzenia nanodomeny wapniowej wokół cytoplazmatycznego wylotu kompleksu Sec61.Wapń ten jest wiązany przez kalmodulinę, a wapń i kalmodulina zamykają kompleks CaMKII. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak połączyć wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA w komórkach ludzkich z obrazowaniem wapnia na żywo, stosując opisaną procedurę. W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak potencjalny wpływ mutacji związanych z chorobą na poszczególne komponenty, można zastosować inne metody, np. ekspresję cDNA z mutacjami związanymi z chorobą.Należy również pamiętać, że praca z takimi lekami jak tap może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie rękawiczek.

live-cell-calcium-imaging-combined-with-sirna-mediated-gene-silencing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszeniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały wycieku Ca2+ w błonie RE i ich mechanizmy regulacyjne

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Ładowanie barwnikiem indukowane przez esterazy celowane (TED) wspiera analizę dynamiki wewnątrzkomórkowego magazynowania wapnia za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda opiera się na ukierunkowaniu rekombinowanej karboksylesterazy na retikulum endoplazmatyczne (ER), gdzie poprawia miejscowe demaskowanie syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca2+ o niskim powinowactwie w świetle ER.

Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach.  Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER.   Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Prezentujemy protokoły zastosowania naszego ukierunkowanego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) CatchER+ do monitorowania szybkich stanów przejściowych wapnia w retikulum endoplazmatycznym/sarkoplazmatycznym (ER/SR) HEK293 i komórkach C2C12 mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Omówiono również protokół pomiaru i kalibracji in situ Kd.

Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Ten protokół opisuje podejście do wykonywania obrazowania wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych i oferuje podejście do analizy.

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj metodę obrazowania wapnia w żywych komórkach z wyciszaniem genów siRNA, która identyfikuje kanały przeciekowe Ca²⁺ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne.

Obrazowanie wapnia w żywych komórkach w połączeniu z wyciszaniem genów za pośrednictwem siRNA identyfikuje kanały przeciekowe Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca²⁺ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Przeglądaj więcej filmów