Pomiar kohezji agregatów metodą tensjometrii powierzchni tkanek

Niniejsza procedura demonstruje sposób pomiaru wytrzymałości kohezji wewnątrzkomórkowej w trójwymiarowych strukturach tkankowych, takich jak agregaty. Pierwszym krokiem jest wytworzenie sferycznych agregatów tkankowych i przeniesienie ich do szalki Petriego wypełnionej pożywką do hodowli tkanek. Następnie poszczególne agregaty są aspirowane do pipety Pasteura i umieszczane na dolnej płycie kompresyjnej komory tensiometru.

Następnie górna płyta ściekająca zostaje podłączona do drutu niklowo-chromowego, który łączy ją z wagą elektroniczną i ustanawia zerową linię bazową ciężaru, określaną jako F zero. Eksperyment rozpoczyna się poprzez podnoszenie dolnej płyty ściekającej, aż do momentu, gdy agregat zostanie ściśnięty między dolną a górną płytą, a kończy się, gdy agregaty osiągną równowagę kształtu i siły, czyli FEQ. Ostatnimi krokami procedury są wykonanie zdjęć, pomiar geometrii agregatu oraz siły oporu, a następnie wprowadzenie tych pomiarów do równania Younga-Laplace'a.

W ostateczności można uzyskać wyniki wykazujące zmiany w kohezji tkanki oraz to, w jaki sposób mogą one wpływać na rozprzestrzenianie się guza lub rozmieszczenie przestrzenne między różnymi populacjami komórek, odpowiednio poprzez testy rozprzestrzeniania agregatów lub testy sortowania komórek. Zatem metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biologii nowotworów, rozwoju embrionalnego i inżynierii tkankowej. Pytania takie jak: w jaki sposób kohezja guza wpływa na inwazję złośliwą oraz na stratyfikację warstw zarodkowych podczas gastrulacji?

Lub w jaki sposób możemy faktycznie zaprojektować kohezję, aby wytworzyć w warunkach in vitro struktury przypominające funkcjonalne organy? Manipulacje eksperymentalne obejmujące hodowlę żywych komórek należy przeprowadzać w warunkach aseptycznych w wyznaczonym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Przez cały czas należy używać sterylnych roztworów i sterylnych naczyń laboratoryjnych. Aby rozpocząć ten eksperyment, należy zebrać komórki adherentne przy 90% konfluencji.

Najpierw odessać pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przepłukać arkusz komórek roztworem PBS. Następnie odessać PBS i nanieść pipetą dwa mililitry 0,05% roztworu trypsyny w EDTA na monowarstwę. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C i inkubować do czasu odklejenia się komórek.

Następnie wyjmij płytkę z inkubatora i przerwij proces inkubacji, dodając 2 ml pożywki kompletnej. Użyj pipety 5 ml, aby wymieszać zawiesinę do momentu całkowitego zawieszenia komórek. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.

Do zawiesiny komórkowej nanieś pipetą 40 µL roztworu DNA o stężeniu 10 mg/mL i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji krótko wymieszaj zawiesinę komórkową na wortexie, a następnie odwiruj z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Po zakończeniu wirowania odessij i usuń nadosad. Następnie resuspenduj osad w 1 mL pożywki kompletnej i powtórz wirowanie w celu przemycia resuspensji.

Resuspender osad w jednym mililitrze pełnej pożywki, następnie przeprowadzić zliczenie komórek i w razie potrzeby dostosować stężenie zawiesiny komórkowej do wartości 6 × 10⁶ komórek na mililitr za pomocą pipety z pełną pożywką. Przenieść trzy mililitry zawiesiny komórkowej do kolby o okrągłym dnie o pojemności 10 ml i inkubować w wytrząsanej kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez cztery godziny przy 120 obr./min, aż komórki dojdzą do siebie po jonizacji, co objawia się ich przywieraniem do siebie i tworzeniem niewielkich skupisk.

Następnie przenieś komórki do szklanej probówki wirówkowej z okrągłym dnem i wiruj z prędkością 200 ×g przez cztery minuty, aby po wirowaniu utworzyła się cienka warstwa. Poluź korek probówki, aby umożliwić wymianę gazową, a następnie umieść probówkę w inkubatorze do hodowli tkanek. Inkubuj przez 24 godziny, po czym warstwa powinna stać się spójna.

Po 24 godzinach delikatnie potrząśnij probówką wirnikową, aby oddzielić arkusz. Następnie przelej zawartość probówki hodowlanej do małej, sterylnej szklanej płytki do hodowli tkanek. Za pomocą mikroskalpeli potnij arkusz komórkowy na fragmenty o różnych rozmiarach, a następnie przenieś fragmenty do 10 mililitrowej kolby o okrągłym dnie zawierającej trzy mililitry pożywki do hodowli tkanek.

Fragmenty inkubuj w temperaturze 37°C w wytrząsanej kąpieli wodnej przy 120 obr./min w atmosferze 5% CO2 przez dwa do trzech dni lub do momentu, aż staną się kuliste. Formowanie agregatów można również przeprowadzić metodą wiszącej kropli. Zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem, zestaw tensiometru powierzchni tkanki (TST) składa się z głównej komory tensiometru zawierającej ogniwo kompresyjne, kąpieli wodnej służącej do utrzymania temperatury komory, mikroskopu sekcyjnego z dołączoną kamerą CCD, wagi elektronicznej z zasilaczem oraz rejestratora wykresów.

Komora kompresyjna TST składa się z dwóch części: komory zewnętrznej i wewnętrznej. W komorze wewnętrznej znajdują się górna i dolna płyta kompresyjna pokryte poli(metakrylanem 2-hydroksyetylu). Najpierw ustaw pompę wody cyrkulacyjnej na 37 °C i upewnij się, że rurki są podłączone do portów w komorze zewnętrznej.

Następnie wkręć dolny zespół, służący do podnoszenia agregatu w celu zainicjowania kompresji, do podstawy wewnętrznej komory. Następnie przygotuj odcinek prostowanego w płomieniu drutu niklowo-chromowego, zawieszając najpierw 15-calowy odcinek drutu na statywie i mocując na jego końcu mały zacisk biurowy. Następnie przesuwaj palnik Bunsena w górę i w dół wzdłuż drutu, aż ten rozżarzy się na czerwono.

Używając obcinaczy do drutów, utnij wyprostowany drut na odpowiednią długość. Następnie za pomocą dwóch żylet wygnij drut w odległości około jednej czwartej cala od końca, aby utworzyć mały haczyk. Na koniec napełnij wewnętrzną komorę TST pożywką do hodowli tkanek niezależną od dwutlenku węgla, która została odgazowana poprzez inkubację w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

Użyj pipety, aby usunąć pęcherzyki powietrza, które mogły powstać na dolnej płycie ściskającej. Aparatura TST jest teraz gotowa do przeprowadzenia eksperymentu kompresji agregatu. Użyj pipety APA, aby pobrać z płytki hodowlanej agregat komórek o wielkości od 200 do 300 mikronów.

Następnie delikatnie przenieś agregat na dolną płytkę kompresyjną w komorze wewnętrznej aparatu TST. Ustaw agregat jak najbliżej środka dolnej płytki kompresyjnej, delikatnie przesuwając go kapilarą z niewielką pętlą z włosia. Podłącz drut niklowo-chromowy z zespołu płytek do ramienia wagi rejestrującej elektrobalance Can Venton Model 2000.

Dostosuj położenie wagi tak, aby górna i dolna płyta kompresyjna były równoległe i znajdowały się bezpośrednio jedna nad drugą. Odczekaj, aż górna płyta osiądzie. Następnie wyzeruj rejestrator wykresów do ustalonej wagi bazowej.

Użyj stereomikroskopu wyposażonego w kamerę CCD, aby utrwalić obraz niesciśniętego agregatu. Następnie dostosuj wysokość urządzenia rdzenia wewnętrznego, aby kontrolować pożądany stopień kompresji, a następnie podnieś dolną płytę kompresyjną, aż agregat zostanie dociśnięty do górnej płyty kompresyjnej. Użyj stereomikroskopu z kamerą CCD do monitorowania kompresji i rejestrowania obrazów agregatu, takich jak ten pokazany tutaj.

Ciągle rejestruj zmianę pozornej wagi górnej płyty kompresyjnej za pomocą rejestratora paskowego przez cały czas trwania kompresji, aż do uzyskania pożądanego kształtu. Równowaga jest sygnalizowana ustabilizowaniem się wyjścia napięcia z wagi puszek. Ponownie użyj mikroskopu sekcyjnego wyposażonego w kamerę CCD, aby uchwycić obraz skompresowanego agregatu.

Ten obraz zostanie wykorzystany do pomiaru geometrii agregatu. Po wykonaniu zdjęcia opuść płytę kompresyjną, aby rozprężyć agregat i zmierzyć siłę nacisku w stanie równowagi. Odczytaj zapis z rejestratora wykresowego jako różnicę między siłą zmierzoną bezpośrednio przed rozprężeniem agregatu a ustalonym poziomem zero. Powtórz proces, stosując inny stopień kompresji, aby tym razem wyznaczyć równowagę sił.

Zmierz siłę ściskania oraz geometrię w stanie równowagi sił, a następnie zastosuj te pomiary wraz z pomiarami stanu równowagi kształtu w równaniu Younga-Laplace'a, aby wyznaczyć wartości liczbowe pozornego napięcia powierzchniowego tkanki. Zgodnie z instrukcjami w protokole pisemnym, tabela ta przedstawia pomiary napięcia powierzchniowego tkanki oraz potwierdzenie płynności agregatów dla agregatów prostaty szczura, fibroblastów i komórek mięśni gładkich. Agregaty fibroblastów prostaty szczura mają napięcie powierzchniowe wynoszące 22,8 ± 1,1 dyn/cm.

Ponadto, średnie wartości napięcia powierzchniowego zmierzone po pierwszej oraz drugiej kompresji były statystycznie identyczne w analizie za pomocą testu T dla par. Porównaliśmy również stosunki sigma dwa do Sigma jeden oraz F dwa do F1, aby upewnić się, że agregaty te nie spełniają prawa Hooke'a, co miałoby miejsce, gdyby zachowywały się jak ciała sprężyste, co wykazano w tabeli jeden. Stosunek sigma dwa do Sigma jeden rzeczywiście dąży do jedności.

Co więcej, stosunek F dwa do F1 był znacznie większy niż sigma dwa do sigma jeden. Potwierdza to, że agregaty te nie podlegają prawu Hooke'a i w rzeczywistości zachowują się jak ciecze. W przeciwieństwie do tego, jak wynika z tabeli jeden, stosunek sigma dwa do sigma jeden w przypadku komórek mięśni gładkich prostaty szczura jest znacznie większy niż jeden i nie różnił się statystycznie od stosunku F dwa do F1. Aby dalej wykazać zachowanie przypominające ciecz, zbadaliśmy zależność między napięciem powierzchniowym a objętością agregatu, co przedstawiono tutaj. Objętość jest niezależna od sigma dla komórek RPF, co obrazuje czerwona linia regresji, podczas gdy w przypadku komórek mięśni gładkich prostaty szczura wydaje się istnieć pewna zależność sigma od objętości, co obrazuje niebieska linia regresji.

Dane te dodatkowo potwierdzają, że agregaty fibroblastów prostaty szczura zachowują się w sposób przypominający ciecze, podczas gdy agregaty komórek mięśni gładkich prostaty szczura wykazują właściwości bardziej zbliżone do ciał sprężystych. Zatem po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny rozwoju embrionalnego, inwazji złośliwej i inżynierii tkankowej do zbadania roli kohezji tkankowej w tworzeniu przedziałów i granic między różnymi typami komórek podczas rozwoju warstw zarodkowych embrionu, podczas oddziaływań komórek zrazikowych guza oraz przearanżowania komórek wysepek trzustki w wielu różnych modelach zwierzęcych, w tym u płazów, ryb, ptaków oraz w modelach ludzkich.