Name: Pomiar spójności agregatu za pomocą tensjometrii powierzchni tkanki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Poznaj metodę pomiaru spójności komórkowej w 3D agregatach tkankopodobnych za pomocą tensjometrii powierzchniowej. Technika ta pozwala ilościowo określić napięcie powierzchniowe tkanki i skorelować je z inwazyjnością nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie agregatów do pomiaru napięcia powierzchniowego tkanki.
W przypadku komórek adherentnych sferoidy można formować, stosując metodę wiszących kropel lub poprzez wytworzenie spójnej warstwy komórek, którą następnie można pociąć na fragmenty o wielkości 1 mm.
Tworzenie agregatów metodą wiszącej kropli:
<ol>
<li>Bliskie konfluencji hodowle komórek adherentnych należy hodować do osiągnięcia 90% konfluencji, po czym monowarstwy należy dwukrotnie przepłukać PBS. Po dokładnym odlaniu płynu dodać 2 ml (dla płytek 100 mm) 0,05% trypsyny-1 mM EDTA i inkubować w 37°C do czasu odklejenia się komórek. Proces trypsynizacji należy przerwać, dodając 2 ml pełnej pożywki, a następnie delikatnie pipetować mieszaninę pipetą 5 ml w celu resuspensji komórek. Przenieść komórki do probówki stożkowej 15 ml.</li>
<li>Dodać 40 μl roztworu zapasowego DNAse o stężeniu 10 mg/ml i inkubować przez 5 minut w RT. Krótko wymieszać na wirówce typu vortex i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.</li>
<li>Odlać supernatant i przemyć osad 1 ml pełnej pożywki do hodowli tkanek. Powtórzyć czynność, a następnie resuspendować komórki w 2 ml pełnej pożywki do hodowli tkanek.</li>
<li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek i dostosować stężenie do 2,5 x 106 komórek/ml.</li>
<li>Zdjąć pokrywkę z naczynia hodowlowego 60 mm i wlać 5 ml PBS na dno naczynia. Będzie ono pełnić funkcję komory nawilżającej.</li>
<li>Odwrócić pokrywkę i za pomocą pipety 20 μl nanieść krople o objętości 10 μl na jej wewnętrzną stronę. Należy upewnić się, że krople są rozmieszczone w odpowiedniej odległości, aby się nie stykały. Możliwe jest naniesienie co najmniej 20 kropli na jedną płytkę.</li>
<li>Nałożyć odwróconą pokrywkę na dno naczynia wypełnione PBS i inkubować w 37°C/5% CO2/95% wilgotności; monitorować krople codziennie i inkubować do czasu utworzenia się arkuszy komórkowych lub agregatów.</li>
<li>Po utworzeniu się arkuszy można je przenieść do okrągłodennych szklanych kolb do wytrząsania zawierających 3 ml pełnej pożywki i inkubować w wytrząsanej kąpieli wodnej w 37°C i 5% CO2 aż do powstania sferoidów.</li>
</ol>
Tworzenie agregatów metodą arkusza komórkowego:
<ol start="9">
<li>Zawiesiny pojedynczych komórek przygotowuje się zgodnie z powyższym opisem, jednak stężenie dostosowuje się do poziomu 1x106 komórek/ml.</li>
<li>Przenieść 3 ml zawiesiny komórkowej do kolbek o okrągłym dnie o pojemności 10 ml (Belco, Vineland, NJ).</li>
<li>Inkubować kolby w wirującej łaźni wodnej/inkubatorze wytrząsowym (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) w temperaturze 37°C, 5% CO22 przez 4 h przy 120 obr./min, aż do momentu, gdy komórki odzyskają zdolność do przylegania po trypsynizacji.</li>
<li>Przenieść komórki do szklanej probówki do wirowania z okrągłym dnem i odwirować z siłą 200 X g do uzyskania cienkiego osadu. Inkubować przez kolejne 24 h do czasu utworzenia się spójnej warstwy.</li>
<li>Delikatnie zakręć probówką z hodowlą, aby oderwać płat, a następnie przelej zawartość probówki do małego, sterylnego szklanego naczynia do hodowli tkanek.</li>
<li>Użyj mikroskalpeli, aby pociąć arkusze na fragmenty o różnych rozmiarach.</li>
<li>Inkubować fragmenty w temperaturze 37°C na wytrząsarce z łaźnią wodną przy 120 obr./min w atmosferze 5% CO22 przez 2 do 3 dni lub do momentu, aż staną się sferyczne.</li>
</ol>
2. Pomiar napięcia powierzchniowego agregatów
<ol>
<li>Tensiometr powierzchni tkanek. Aparatura przedstawiona jest na rys. 1 i 2. Komora kompresyjna (rys. 3) składa się z dwóch części. Komora zewnętrzna (OC) jest połączona z pompą cyrkulacyjną wody o temperaturze 37°C i służy do regulacji temperatury komory wewnętrznej (IC). Komory są wykonane z frezowanego Delrinu i zawierają okna kwarcowe do wizualizacji agregatu. Zespół dolny (LA) jest przykręcony do podstawy komory wewnętrznej i służy do: 1) pozycjonowania agregatu w komorze wewnętrznej; 2) uszczelniania dna komory wewnętrznej; 3) unoszenia agregatu w celu zainicjowania kompresji; oraz (4) kontrolowania odległości między równoległymi płytkami, a tym samym stopnia kompresji agregatu. Rdzeń centralny (CC) zespołu jest regulowany. Końcówka rdzenia centralnego (postument) wykonana jest z gładkiego Teflonu i pełni rolę dolnej płytki kompresyjnej (LCP). Górna płytka kompresyjna (UCP) to cylinder teflonowy o długości 15mm, zawieszony na ramieniu wagi (B) za pomocą prostowanego płomieniem drutu niklowo-chromowego (NCW)*. W trakcie eksperymentu agregat komórkowy (A) jest umieszczany na dolnej płytce i unoszony, aż zetknie się z górną płytką. Górna płytka jest połączona z ramieniem wagi (B). Kompresja agregatu powoduje przemieszczenie ramienia wagi. Waga to rejestrująca elektrowaga model 2000 firmy Cahn/Ventron, która działa na zasadzie wagi zerowej. Punkt podparcia ramienia wagi posiada armaturę w stałym polu magnetycznym. Podczas pracy waga stale moduluje prąd przepływający przez zespół elektromagnetyczny, co z kolei utrzymuje ramię wagi w pozycji poziomej. Gdy obiekt jest zawieszony na ramieniu wagi, napięcie, które waga przykłada w celu utrzymania ramienia w pozycji poziomej, jest proporcjonalne do masy obiektu. Napięcie to mierzy zewnętrzną siłę kompresji przyłożoną do agregatu. Kształt agregatu jest monitorowany poprzez obserwację wizualną za pomocą stereoskopu Nikon SMZ10A 25x połączonego z komputerem wyposażonym w moduł przechwytywania obrazu (frame grabber). Aby zminimalizować adhezję agregatów komórkowych do płytek kompresyjnych, zarówno dolna, jak i górna płytka kompresyjna zostały pokryte poli(2-hydroksyetylometakrylanem) {poly(HEMA)}, materiałem polimerowym, do którego komórki nie przylegają 16. 
* Drut jest prostowany płomieniem poprzez zawieszenie 15-calowego odcinka drutu na statywie i przymocowanie małego klipsa do końca. Następnie palnikiem Bunsena prowadzi się ogień wzdłuż drutu, aż ten rozżarzy się na czerwono. Wyprostowany drut można następnie pociąć na odpowiednie długości. Mały haczyk tworzy się, zginając drut w odległości około ¼ cala od końca za pomocą dwóch żyletek. Drugi koniec zostaje następnie włożony do gniazda dolnej płytki kompresyjnej.</li>
<li>Kompresja agregatu.
<ol>
<li>Komorę wewnętrzną wypełnia się uprzednio ogrzaną, niezależną od CO2 pożywką do hodowli tkanek (Gibco/BRL, NY).</li>
<li>Agregaty o rozmiarach od około 200-300 μ są umieszczane na dolnej płytce kompresyjnej (rys. 4A). Agregaty są pobierane poprzez zasysanie agregatu w pożywce do hodowli tkanek do połowy końcówki pipety Pasteura wyposażonej w silikonową gruszkę, przeniesienie pipety do komory wewnętrznej i umieszczenie końcówki pipety nad LCP. Następnie agregat jest delikatnie wypuszczany na LCP poprzez lekkie ściśnięcie gruszki. Alternatywnie agregat może opaść na LCP pod wpływem grawitacji.</li>
<li>Górną płytkę kompresyjną (UCP) ustawia się nad agregatem i pozwala jej osiąść, ustanawiając linię bazową pozornej masy UCP przed kompresją.</li> 
<li>Następnie LCP jest unoszona, aż agregat zostanie ściśnięty przeciwko UCP (rys. 4B). Regulacja wysokości rdzenia wewnętrznego dolnego urządzenia pozwoli na kontrolę różnych stopni kompresji. Kompresja jest monitorowana poprzez obserwację pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w kamerę wideo CCD.</li>
<li>Obrazy agregatów są przechwytywane, digitalizowane i analizowane za pomocą programu ImageJ. Zmiana pozornej masy UCP jest stale rejestrowana na rejestratorze paskowym, a osiągnięcie równowagi kształtu jest sygnalizowane przez ustabilizowanie się wyjścia napięciowego wagi Cahn. Każdy agregat jest poddawany dwóm różnym stopniom kompresji.</li>
</ol>
</li>
<li>Obliczanie napięcia powierzchniowego agregatu. 
W stanie równowagi kształtu kohezyjność agregatu komórek ściśniętych między równoległymi płytkami, do których nie przylegają, może zostać wyznaczona z równania Younga-Laplace'a (rys. 5), gdzie σ to kohezyjność, F to siła działająca w celu ściśnięcia agregatu, πr32 to powierzchnia agregatu, na którą działa siła F, a R2 i R3 to odpowiednio promień równika ściśniętego agregatu oraz promień łuku definiującego jego profil powierzchni prostopadły do płytek kompresyjnych i rozciągający się między nimi (rys. 6). Pomiar siły kompresji i geometrii w stanie równowagi siły i kształtu oraz zastosowanie tych pomiarów w równaniu Younga-Laplace'a pozwala uzyskać wartości liczbowe pozornego napięcia powierzchniowego tkanki. Po osiągnięciu równowagi i obliczeniu σ1, agregaty są dekompresowane i pozostawione do osiągnięcia drugiej równowagi, po czym oblicza się σ2 w opisany wyżej sposób.</li>
<li>Potwierdzenie płynności agregatu. 
Obliczone napięcie powierzchniowe agregatu płynnego, poddanego dwóm różnym kompresjom, pozostanie stałe. W takich agregatach stosunek σ2/σ1 będzie równy 1 i będzie mniejszy niż stosunek siły przyłożonej przy każdej kolejnej kompresji (F2/F1). W przeciwieństwie do tego, obliczone napięcie powierzchniowe agregatu sprężystego będzie zgodne z prawem Hooke'a i wzrośnie proporcjonalnie do przyłożonej siły. Dla agregatów sprężystych stosunek σ2/σ1 nie będzie równy 1, lecz będzie zbliżać się do stosunku F2/F1. Napięcie powierzchniowe agregatów płynnych będzie również niezależne od wielkości agregatu 2,17. Do obliczenia średniego σ dla każdej linii komórkowej wykorzystuje się wyłącznie pomiary, w których napięcie powierzchniowe jest niezależne od przyłożonej siły i rozmiaru. 
</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Poniżej znajduje się tabela typowych wyników TST dla agregatów fibroblastów prostaty szczura (RPF) oraz komórek mięśni gładkich prostaty szczura (RPSMC). Jak widać na Rys. 7, agregaty komórek RPF mają napięcie powierzchniowe wynoszące 22,8 ± 1,1 dynes/cm. Ponadto średnie wartości napięcia powierzchniowego zmierzone po pierwszej kompresji (compression 1) i drugiej kompresji (compression 2) były statystycznie identyczne w analizie za pomocą testu t dla prób zależnych. Porównaliśmy również stosunki σ2/σ1 oraz F2/F1, aby upewnić się, że agregaty te nie spełniają prawa Hooke'a, co miałoby miejsce, gdyby zachowywały się jak ciała stałe sprężyste. Jak wykazano w Tabeli 1, stosunek σ2/σ1 rzeczywiście zbliża się do 1,0. Co więcej, stosunek F2/F1 był istotnie większy niż σ2/σ1 (test t dla prób zależnych, P &lt; 0,05), co dodatkowo potwierdza, że agregaty te nie spełniają prawa Hooke'a i w rzeczywistości zachowują się jak ciecze. W przeciwieństwie do nich, komórki RPSMC spełniały prawo Hooke'a. Jak wynika z Tabeli 1, stosunek σ2/σ1 jest istotnie większy od 1 i nie różnił się statystycznie od stosunku F2/F1. Aby dalej wykazać zachowanie przypominające ciecz, zbadaliśmy zależność między napięciem powierzchniowym (σ) a objętością agregatu. Jak widać na Rys. 8, objętość jest niezależna od sigma dla komórek RPF (czerwona linia regresji, r2 = 0,002), podczas gdy dla komórek RPSMC wydaje się istnieć pewna zależność sigma od objętości (niebieska linia regresji, r2 = 0,146). Dane te dodatkowo potwierdzają, że agregaty RPF zachowują się w sposób przypominający ciecz, podczas gdy agregaty RPSMC wydają się zachowywać bardziej jak ciała stałe sprężyste. Do obliczenia napięcia powierzchniowego wykorzystywano wyłącznie pomiary uzyskane z agregatów zachowujących się jak ciecze.
<img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="Układ eksperymentalny z elektrowagą Cahna, kamerą CCD i rejestratorem wykresowym do pomiaru masy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd tensjometru powierzchni tkanek.
<img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="Układ tensiometru z mikroskopem stereoskopowym do analizy napięcia powierzchniowego w eksperymencie laboratoryjnym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Bardziej szczegółowy widok komory tensiometru (panel prawy).
<img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, schemat układu dynamiki płynów z zaworami, kanałami, kontrolą ciśnienia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Schematyczny widok komory tensjometru.
<img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="Równowaga statyczna, rozkład sił; schemat przedstawia deformację pod obciążeniem, oznaczoną jako A i B." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Obrazy agregatów niesciśniętych (A) i ściśniętych (B).
<img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="Wzór na równowagę statyczną, σ=F/(πR₃²(1/R₁+1/R₂)⁻¹), równanie matematyczne do analizy siły." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Równanie Laplace'a.
<img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="Schemat przepływu hydrodynamicznego pokazujący wymiary R1, R2, R3, H, X; koncepcja mechaniki płynów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Schemat kropli cieczy ściśniętej między dwiema równoległymi płytami, do których słabo przylega, w stanie równowagi kształtu. R1 i R2 to dwa główne promienie krzywizny, odpowiednio na równiku kropli oraz w płaszczyźnie przechodzącej przez jej oś symetrii. R3 to promień kołowej powierzchni styku kropli z każdą z płyt kompresyjnych. H to odległość między górną a dolną płytą kompresyjną. X to jeden z boków trójkąta prostokątnego o przeciwprostokątnej R2, prowadzącej do punktu styku między powierzchnią kropli a każdą z płyt kompresyjnych.

<table border="1">
 <tbody> 
 <tr>
 <td> </td>
 <td>σ1(dyn/cm ± SEM)</td>
 <td>σ2(dyn/cm ± SEM)</td>
 <td>Pσ1 vs σ2</td>
 <td>σ1,2(dyn/cm ± SEM)</td>
 <td>σ2/σ1</td>
 <td>F2/F1</td>
 <td>Pσ2/σ1 oraz F2F1</td> 
 </tr> 
 <tr>
 <td>RPF</td>
 <td>22.6 ± 1.7</td>
 <td>22.9 ± 1.4</td>
 <td>&gt; 0.05*</td>
 <td>22.8 ± 1.1</td>
 <td>1.04 ± 0.04</td>
 <td>1.47 ± 0.06</td>
 <td>&lt; 0.05</td>
 
 </tr>
 <tr>
 <td>RPSMC</td>
 <td>15.0 ± 2.8</td>
 <td>23.0 ± 3.2</td>
 <td>0.039</td>
 <td>N/D</td>
 <td>1.9 ± 0.3</td>
 <td>1.6 ± 0.1</td>
 <td>0.16*</td>
 
 </tr> 
 </tbody>
</table>
Rysunek 7. Pomiary TST i potwierdzenie płynności agregatów dla agregatów fibroblastów prostaty szczura oraz komórek mięśni gładkich.
<img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="Wykres objętości w funkcji sigma; analiza korelacji liniowej; naukowa wizualizacja danych; jednostki dyne/cm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 8">
 Rysunek 8. Zależność między sigma a objętością dla agregatów RPF (linia czerwona) i RPSMCs (linia niebieska).

<ol><li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+properties+of+embryonic+tissues%3A+Measurement+of+interfacial+tensions%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).</li>
<li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Schotz, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP Journal. 2, 42-56 (2008).</li>
<li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li>
<li>Schwarz, M. A., Zheng, H., Legan, S., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Self-Assembly+is+Modulated+by+Tissue+Surface+Tensions%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Lung Self-Assembly is Modulated by Tissue Surface Tensions.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2010).</li>
<li>Ryan, P. L., Foty, R. A., Kohn, J., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+spreading+on+implantable+substrates+is+a+competitive+outcome+of+cell-cell+vs.+cell-substratum+adhesivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue spreading on implantable substrates is a competitive outcome of cell-cell vs. cell-substratum adhesivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4323-4327 (2001).</li>
<li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+adhesion+hypothesis%3A+a+direct+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li>
<li>Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+matrix+assembly+regulates+alpha5beta1-mediated+cell+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibronectin matrix assembly regulates alpha5beta1-mediated cell cohesion.</a> Mol Biol Cell. 15, 973-981 (2004).</li>
<li>Robinson, E. E., Zazzali, K. M., Corbett, S. A., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha5beta1+integrin+mediates+strong+tissue+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">alpha5beta1 integrin mediates strong tissue cohesion.</a> J Cell Sci. 116, 377-386 (2003).</li>
<li>Winters, B. S., Raj, B. K., Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+regulates+Raf-1+expression+to+modulate+fibronectin+matrix+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture regulates Raf-1 expression to modulate fibronectin matrix assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3386-3396 (2006).</li>
<li>Caicedo-Carvajal, C. E., Shinbrot, T., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha5beta1+integrin-fibronectin+interactions+specify+liquid+to+solid+phase+transition+of+3D+cellular+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alpha5beta1 integrin-fibronectin interactions specify liquid to solid phase transition of 3D cellular aggregates.</a> PLoS One. 5, e11830-e11830 (2010).</li>
<li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+tumor+cell+cohesion+and+suppression+of+invasion+by+E-+or+P-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of tumor cell cohesion and suppression of invasion by E- or P-cadherin.</a> Cancer Res. 57, 5033-5036 (1997).</li>
<li>Foty, R. A., Corbett, S. A., Schwarzbauer, J. E., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+up-regulates+cadherin+expression+and+cohesion+of+HT-1080+human+fibrosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells.</a> Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).</li>
<li>Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+measurement+of+brain+tumor+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biophysical measurement of brain tumor cohesion.</a> Int J Cancer. 114, 371-379 (2005).</li>
<li>Foty, R. A., Cummings, K. B., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+surface+tensiometry%3A+a+novel+technique+for+predicting+invasive+potential+of+prostate+tumors+based+on+tumor+cell+aggregate+cohesivity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Forum+L%22%5BJournal%5D)">Tissue surface tensiometry: a novel technique for predicting invasive potential of prostate tumors based on tumor cell aggregate cohesivity in vitro.</a> Surgical Forum L. , 707-708 (1999).</li>
<li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+shape+in+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li>
<li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+properties+of+embryonic+tissues%3A+Measurement+of+interfacial+tensions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).</li>
<li>Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+biological+viscoelastic+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Aspiration of biological viscoelastic drops.</a> Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Pomiar kohezji agregatów za pomocą TST jest stosunkowo prosty. Istnieją jednak kluczowe kroki, które muszą zostać opanowane, aby uzyskać użyteczne dane TST; 1) agregaty muszą być „zdrowe”. Można to kontrolować, upewniając się, że formowanie agregatów rozpoczyna się od komórek o optymalnej konfluencji przed ich odłączeniem. Należy również kontrolować wielkość agregatów oraz czas ich hodowli, aby zminimalizować powstawanie rdzenia nekrotycznego wewnątrz agregatu; 2) innym parametrem, który może wpływać na pomiary TST, jest...

<table><tbody><tr><td>łaźnia wodna z wytrząsarką</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolby okrągłodenne 10 ml</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar kohezji agregatów metodą tensjometrii powierzchni tkanek

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rygorystyczny pomiar energii wiązania międzykomórkowego można przeprowadzić wyłącznie przy użyciu metod opartych na zasadach termodynamiki w systemach znajdujących się w stanie równowagi. Opracowaliśmy tensjometrię powierzchni tkanek (TST) specjalnie w celu pomiaru powierzchniowej energii swobodnej oddziaływania między komórkami. Biofizyczne koncepcje leżące u podstaw TST zostały wcześniej szczegółowo opisane1,2. Metoda ta opiera się na obserwacji, że komórki wykazujące wzajemną kohezję, jeśli są utrzymywane w kulturze z wytrząsaniem, spontanicznie łączą się w klastry. Z czasem klastry te zaokrąglają się, tworząc sfery. To zachowanie naśladuje procesy charakterystyczne dla układów ciekłych. Energię wiązania międzykomórkowego mierzy się poprzez ściskanie sferycznych agregatów pomiędzy równoległymi płytkami w specjalnie zaprojektowanym tensjometrze powierzchni tkanek. Do pomiaru napięcia powierzchniowego trójwymiarowych, przypominających tkankę agregatów sferycznych wykorzystuje się to samo równanie matematyczne, które służy do pomiaru napięcia powierzchniowego kropli cieczy. Komórkowym odpowiednikiem napięcia powierzchniowego cieczy jest energia wiązania międzykomórkowego, a szerzej – kohezja tkankowa. Poprzednie badania przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że napięcie powierzchniowe tkanki (1) pozwala przewidzieć, w jaki sposób dwie grupy komórek embrionalnych będą oddziaływać na siebie nawzajem1-5, (2) może silnie wpływać na zdolność tkanek do oddziaływania z biomateriałami6, (3) może być modyfikowane nie tylko poprzez bezpośrednią manipulację kohezją międzykomórkową opartą na kadherynach7, ale także poprzez manipulację kluczowymi cząsteczkami ECM, takimi jak FN8-11, oraz (4) koreluje z potencjałem inwazyjnym linii komórkowych raka płuca12, włókniaka złośliwego13, guza mózgu14 oraz guza prostaty15. W niniejszym artykule opiszemy aparaturę, szczegółowo przedstawimy kroki niezbędne do generowania sferoidów, umieszczania sferoidów w komorze tensjometru, inicjowania kompresji agregatów oraz analizy i walidacji uzyskanych pomiarów napięcia powierzchniowego tkanki.

Opisujemy metodę pomiaru energii wiązania, wyrażonej jako napięcie powierzchniowe tkanki, pomiędzy komórkami wewnątrz trójwymiarowych agregatów przypominających tkankę. Wykazano, że różnice w napięciu powierzchniowym tkanki korelują z inwazyjnością nowotworów płuc, mięśni i mózgu oraz są fundamentalnymi czynnikami determinującymi ustanawianie relacji przestrzennych między różnymi typami komórek.

Pomiar kohezji agregatów metodą tensjometrii powierzchni tkanek

Precyzyjny pomiar energii wiązania międzykomórkowego jest możliwy wyłącznie przy zastosowaniu metod opartych na zasadach termodynamicznych w układach znajdujących się w stanie równowagi. My...

Niniejsza procedura demonstruje sposób pomiaru wytrzymałości kohezji wewnątrzkomórkowej w trójwymiarowych strukturach tkankowych, takich jak agregaty. Pierwszym krokiem jest wytworzenie sferycznych agregatów tkankowych i przeniesienie ich do szalki Petriego wypełnionej pożywką do hodowli tkanek. Następnie poszczególne agregaty są aspirowane do pipety Pasteura i umieszczane na dolnej płycie kompresyjnej komory tensiometru.Następnie górna płyta ściekająca zostaje podłączona do drutu niklowo-chromowego, który łączy ją z wagą elektroniczną i ustanawia zerową linię bazową ciężaru, określaną jako F zero. Eksperyment rozpoczyna się poprzez podnoszenie dolnej płyty ściekającej, aż do momentu, gdy agregat zostanie ściśnięty między dolną a górną płytą, a kończy się, gdy agregaty osiągną równowagę kształtu i siły, czyli FEQ. Ostatnimi krokami procedury są wykonanie zdjęć, pomiar geometrii agregatu oraz siły oporu, a następnie wprowadzenie tych pomiarów do równania Younga-Laplace'a.W ostateczności można uzyskać wyniki wykazujące zmiany w kohezji tkanki oraz to, w jaki sposób mogą one wpływać na rozprzestrzenianie się guza lub rozmieszczenie przestrzenne między różnymi populacjami komórek, odpo

measurement-of-aggregate-cohesion-by-tissue-surface-tensiometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pomiar spójności kruszywa przez tensjometrię powierzchni tkanki

Omówiono metodę, za pomocą której mechaniczne zachowanie in vivo materiałów reagujących na bodźce jest monitorowane w funkcji czasu. Próbki są badane ex vivo przy użyciu testera mikrorozciągania z kontrolą środowiska w celu symulacji środowiska fizjologicznego. Praca ta dodatkowo przyczynia się do zrozumienia zachowania naszego materiału in vivo.

Kontrolowane środowiskowo badania mikrorozciągalności mechanicznie adaptacyjnych nanokompozytów polimerowych do charakterystyki ex vivo

Przedstawiono ulepszoną metodę mechanicznego testowania zakotwiczenia kości na powierzchniach potencjalnych implantów. Metoda ta pozwala na wyrównanie siły rozrywającej dokładnie prostopadle lub równolegle do płaszczyzny powierzchni implantu i zapewnia dokładny sposób kierowania sił zakłócających na dokładny obszar wokół implantu.

Ulepszona metoda badań mechanicznych do oceny zakotwiczenia implantu kostnego

Dwu- i trójwymiarowe superhydrofobowe materiały polimerowe są przygotowywane przez elektroprzędzenie lub elektronatryskiwanie biodegradowalnych polimerów zmieszanych z polimerem o niższej energii powierzchniowej o podobnym składzie.

Wytwarzanie superhydrofobowych materiałów polimerowych do zastosowań biomedycznych

Biomechanika tkanek jest ważna dla utrzymania kształtu i funkcji komórki oraz dla określenia fenotypu. W niniejszym raporcie przedstawiono nieniszczące protokoły mechaniczne do charakteryzowania elastycznych i lepkosprężystych właściwości ludzkich tkanek miękkich, które można bezpośrednio zastosować do podłoży inżynierii tkankowej, aby umożliwić ścisłe dopasowanie materiałów inżynieryjnych do tkanek natywnych.

Charakterystyka biomechaniczna tkanek miękkich człowieka za pomocą prób wgnieceń i rozciągania

Ten artykuł opisuje metodę ilościowego określania dynamicznego schnięcia i właściwości mechanicznych warstwy rogowej naskórka poprzez pomiar przestrzennie rozdzielczych przemieszczeń suszenia w płaszczyźnie kolistych próbek tkanek przylegających do podłoża elastomerowego. Technika ta może być wykorzystana do pomiaru, w jaki sposób różne zabiegi chemiczne zmieniają właściwości suszenia i mechaniczne tkanek.

Pomiar i modelowanie wysuszania kurczliwego w ludzkiej warstwie rogowej naskórka

Substraty o sztywności w zakresie kilopaskali są przydatne do badania reakcji komórek na fizjologicznie istotną sztywność mikrośrodowiska. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia można określić moduł Younga miękkich żeli silikonowych za pomocą wgłębienia z odpowiednią kulą.

Pomiar sztywności miękkich podłoży silikonowych do badań mechanobiologicznych przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego

Prezentujemy test siły pociągowej o wysokiej przepustowości wykonany z gumy silikonowej (PDMS). Ten nowatorski test nadaje się do badania fizycznych zmian kurczliwości komórek podczas różnych procesów i chorób biologicznych i biomedycznych. Wykazujemy użyteczność tej metody, mierząc zależny od TGF-β wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego.

Wysokoprzepustowa mikroskopia sił trakcyjnych z wykorzystaniem PDMS ujawnia zależne od dawki efekty transformacji czynnika wzrostu β na przejście z nabłonka do mezenchymów

Sondowanie podczas operacji artroskopii jest zwykle wykonywane w celu oceny stanu tkanek miękkich, ale to podejście zawsze było subiektywne i jakościowe. W niniejszym raporcie opisano urządzenie pomiarowe, które może mierzyć ilościowo opór tkanek miękkich za pomocą trójosiowego czujnika siły podczas artroskopii.

Urządzenie pomiarowe do ilościowego pomiaru właściwości mechanicznych tkanek miękkich podczas artroskopii

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.

Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

Opracowaliśmy proces mechano-obrazowania do badania heterogenicznych strukturalnych i mechanicznych właściwości blaszek miażdżycowych. Rurociąg ten umożliwia korelację lokalnego dominującego kąta i dyspersji orientacji włókien kolagenowych, zachowania podczas pękania i odcisków palców naprężeń włóknistej tkanki płytki nazębnej.

Metoda badania korelacji między lokalną strukturą kolagenu a właściwościami mechanicznymi tkanki włóknistej blaszki miażdżycowej

Poznaj metodę pomiaru spójności komórkowej w 3D agregatach tkankopodobnych za pomocą tensjometrii powierzchniowej. Technika ta pozwala ilościowo określić napięcie powierzchniowe tkanki i skorelować je z inwazyjnością nowotworów.

Pomiar kohezji agregatów metodą tensjometrii powierzchni tkanek

Przeglądaj więcej filmów