Wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biodetekcja z fluorescencyjnymi szczepami C. elegans

Ten film przedstawia metodę hodowli i dozowania fluorescencyjnych szczepów CL gans w celu wysokoprzepustowego badania przesiewowego bibliotek chemicznych lub wykrywania zanieczyszczeń środowiskowych w celu oceny wpływu czynników chemicznych lub środowiskowych na określoną aktywność białek. W CL elgan najpierw przygotowuje się kultury bakteryjne jako pokarm dla robaków i transgenicznych GFP. Zsynchronizowane robaki są hodowane.

Następnie zbiera się od 0,5 do 2 milionów robaków, myje je i dozuje do 3 84. Do robaków dodaje się płytki do mikromiareczkowania, a następnie małe cząsteczki z biblioteki chemicznej lub próbki testowe, takie jak woda, żywność lub gleba. Na koniec mierzy się fluorescencję robaków za pomocą czytnika mikropłytek.

Analiza danych dotyczących intensywności fluorescencji ujawnia małe cząsteczki, które modulują indukowane szlaki transkrypcyjne lub pozwalają na wykrycie zanieczyszczeń środowiska. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak testy in vitro i oparte na hodowlach komórkowych, jest to, że nie będzie marnować czasu na związki, które są toksyczne lub nieaktywne in vivo. Ta wysokoprzepustowa metoda może pomóc w identyfikacji małych cząsteczek, które modulują różne indukowalne szlaki.

Chociaż opracowaliśmy tę metodę do wysokoprzepustowych badań przesiewowych bibliotek małych cząsteczek, można ją również zastosować do biodetekcji zanieczyszczeń w próbkach żywności i środowiska. Procedurę zademonstruje Andrew Dine, technik w moim laboratorium i Q Long, doktor habilitowany w moim laboratorium. Przygotuj pokarm dla robaków bakteryjnych z wyprzedzeniem.

Zacznij od zaszczepienia 500 mililitrów wspaniałego bulionu, uzupełnionego 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny pięcioma mililitrami nasyconej E coli. OP 50. Umieść kulturę na shakerze i hoduj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia podziel kulturę na 10 50-mililitrowych probówek. Następnie umieść probówki w wirówce z chłodzeniem i wiruj z prędkością 2 500 RCF przez 20 minut. Po wirowaniu Resus zawieś każdą pastylkę bakteryjną w 10 mililitrach płynnej pożywki wzrostowej nicieni lub NGM.

Potrząśnij zawiesinami poziomo. Wytrząsarka podłogowa na 15 minut w celu ponownego zawieszenia bakterii. Następnie odwiruj kulturę bakteryjną w temperaturze 2 500 RCF w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.

Zdekantować NGM i zważyć osad bakteryjny. Następnie dodaj równą objętość bufora NGM i ponownie zawieś granulki przez wirowanie. Na koniec podnieś trzy mililitry zawieszonej kultury bakteryjnej do 15-mililitrowych probówek i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne.

W tej demonstracji jako przykład zostanie zmierzony wpływ indukującej stres pożyczki Xeno Duke na czynnik transkrypcyjny Sskn one. Sskn one jest znany z aktywacji genów cytoprotekcyjnych podczas stresu oksydacyjnego i ksenobiego. Przygotowywana jest wielkoskalowa hodowla roślin okopowych z linii VP 5 96, w której znajdują się dwa konstrukty fluorescencyjne.

Robaki VP 5 96 wykazują ekspresję zarówno czteroosobowego promotora GST napędzającego GFP, który jest używany do monitorowania aktywności czynnika transkrypcyjnego. Sskn jeden i DOP trzy promotor jazdy. RFP jest używany jako standard normalizacji liczby robaków.

DOP trzy jest promotorem receptora dopaminy i ulega konstytutywnej ekspresji w neuronach w całym ciele. W tym przykładzie, biorąc pod uwagę, że xenobi lon silnie aktywuje sskn one i zwiększa ilość GFP wyrażonego z promotora GS T four, aby przygotować kultury, zacznij od połączenia 150 mililitrów buforu N NGM, 1,5 mililitra LB 150, mikrolitrów jednego molowego cholesterolu i 75 mikrolitrów 100 miligramów na mililitr. Streptomycyny. Dodanie LB pomaga zapobiegać przywieraniu robaków do naczyń szklanych i plastikowych, ale ta ilość nie wystarcza, aby wspierać rozwój bakterii.

Przefiltrować, aby wysterylizować mieszaninę, a następnie przenieść ją do sterylnej kolby o pojemności jednego litra i odłożyć kolbę na bok, aby uwolnić jaja z dorosłych robaków GR. Zmyć bakterie z robaków, odwirowując je i wymieniając pożywkę NGM, aż supinat będzie czysty. Umyj robaki po raz drugi za pomocą Resusa, zawieszając je ponownie w sterylnej wirówce wodnej po wirowaniu.

Usuń supinat i napełnij probówkę 3,75 mililitra sterylnej wody. Dodaj jeden mililitr domowego wybielacza i 250 mikrolitrów 10 normalnych wodorotlenków sodu, wymieszaj natychmiast przez inwersję pięć do sześciu razy. Umieść probówkę w rotatorze po wystawieniu robaków na działanie wybielacza przez cztery minuty.

Umieść rurkę pod mikroskopem stereoskopowym. Większość dorosłych powinna być kłamliwa. Energicznie potrząśnij probówką 15 do 20 razy, aby pomóc pozostałym dorosłym robakom po lizie przez łącznie pięć minut, dodaj sterylną wodę, aż probówka będzie pełna.

Wymieszaj przez odwrócenie pięć do sześciu razy, aby zebrać jajka. Wirować probówkę przez jedną minutę przy 500 RCF. Umyj jajka trzy razy za pomocą Resusa, zginając je w 10 mililitrach sterylnej wody, wirując i usuwając supinat.

Następnie rozcieńczyć 100-mikrolitrową próbkę jaj 100-krotnie, dodając 10 mililitrów buforu NGM. Następnie odpipetować trzy porcje o pojemności pięciu mikrolitrów na pokrywkę szalki Petriego pod mikroskopem. Policz liczbę jaj w trzech oddzielnych podwielokrotnościach po pięć mikrolitrów.

Aby oszacować całkowitą liczbę jaj. Dodać 200 000 do 2 milionów jaj do kolby z buforem NGM i wstrząsnąć kulturą z prędkością 100 obr./min w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Co najmniej 16 godzin po dodaniu jaj do kolby, za pomocą sterylnej pipety serologicznej usunąć około 0,5 mililitra zawieszonej kultury robaków.

Odpipetuj trzy krople o pojemności pięciu mikrolitrów na sterylną pokrywkę szalki Petriego. Umieść pokrywkę w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni na jedną do dwóch minut, aby sparaliżować robaki, gdy robaki zostaną sparaliżowane. Policz średnią liczbę żywych wyklutych robaków na pięć mikrolitrów za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby oszacować całkowitą liczbę.

Przygotowaną wcześniej zamrożoną kulturę bakterii OP 50 rozmrozić umieszczając ją na ławce na kilka minut. Następnie dodaj trzy mililitry 50% OP 50 na 500 000 wyklutych robaków. Potrząśnij kolbą z prędkością 100 obr./min w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Robaki rozwiną się w larwy L cztery i młode dorosłe stadia w ciągu około 51 godzin. Monitoruj ilość bakterii przez cały okres inkubacji poprzez oględziny. Dodaj więcej bakterii, jeśli podłoże stanie się przezroczyste.

Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieść około 0,5 mililitra zawieszonej kultury robaków na standardową płytkę agarową NGM. Zobacz robaki za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby upewnić się, że większość z nich to larwy L cztery i młode dorosłe osobniki pod mikroskopem jasnego pola, larwy L cztery będą miały brzuszną wyraźną plamę pośrodku ciała. Młodzi dorośli będą nieco więksi i nie będą mieli wyraźnego miejsca.

Następnie wciągnij kulturę robaków do sterylnych 50-mililitrowych probówek. Umieść probówki w stojaku na probówki w kapturze i pozwól im osiąść na niewyklutych jajach lub robakach, które się nie rozwijają. Osiedlają się wolniej niż rozwinięte robaki.

Po 10 minutach usuń supinat, który zawiera niewyklute i nierozwinięte robaki, zasysając około 10 mililitrów buforu NGM do każdej granulki i zawiesić robaki, delikatnie obracając rurki. Zbierz wszystkie robaki do jednej 50-mililitrowej tuby. Wirować wirówkę z wahadłowym wiadrem przy 500 RCF przez 30 sekund.

Następnie ponownie zawieś robaki w 50 mililitrach NGM z 1% funtem, aby je umyć. Powtórz to, umyj trzy do czterech razy, aby usunąć bakterie po umyciu. Napełnij probówkę buforem NGM plus LB do 50 mililitrów.

Wlej to do niestandardowej kolby dozującej robaki na mieszadle i umieść na talerzu do mieszania. Potrzeba co najmniej około 20 mililitrów lub 60 000 robaków, aby wypełnić martwą przestrzeń przy kolbie dozującej i kasecie dozującej. Policz liczbę robaków w trzech kroplach po pięć mikrolitrów, jak pokazano wcześniej.

Po zliczeniu w NGM plus LB do stężenia od 12 do 15 robaków na pięć mikrolitrów, każda płytka 3 84-dołkowa wymaga około 35 000 robaków lub 11,5 mililitrów zawieszonych robaków. Załaduj kasetę dozującą o pojemności 10 mikrolitrów do dozownika i wysterylizuj ją, zalewając 70% etanolem. Wypłucz etanol, zalewając go sterylną wodą.

Włóż koniec kasety dozującej do kolby tak, aby znajdował się tuż nad mieszadłem, nie zakłócając jego ruchu. Upewnij się, że robaki pozostają zawieszone w całej kolbie. Zaprogramuj dozownik tak, aby dozował robaki z niską prędkością za pomocą dwóch impulsów wstępnych, zalania i uruchomienia Co najmniej 10 mililitrów zawieszonych ślimaków.

Szybko napełnij płytki do mikromiareczkowania, które powinny już zawierać badane związki, aby zapobiec osadzaniu się robaków w rurce. W tym przypadku należy pobrać badany związek uprzednio załadowany na płytkę do mikromiareczkowania. Żar. Uszczelnij płyty oddychającą taśmą, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu w studzienkach.

Umieścić płytki na platformie wibracyjnej w inkubatorze w temperaturze odpowiedniej do przeprowadzenia testu. Nie układaj talerzy jeden na drugim, ponieważ może to ograniczyć przepływ powietrza. Umieść płytkę docelową w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć intensywność fluorescencji każdej studzienki przy odpowiednich długościach fal emisji i wzbudzenia.

Filtry stosowane w GFP to wzbudzenie przy 4 85 i emisja przy 5 28. Filtry dla zapytania ofertowego to wzbudzenie o piątej 40 i emisja o piątej 90. Po odczytaniu tabliczki należy obliczyć stosunek GFP do RFP i znormalizować z odczytami studzienek kontrolnych, które nie zawierają związku aktywującego, aby określić dokładną różnicę krotności intensywności fluorescencji uzyskaną z poszczególnych zabiegów.

Pokazany tutaj test SSKN One wykorzystuje chromosomalnie zintegrowany podwójny raport, szczep, w którym robaki były ręcznie liczone za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Liczba robaków korelowała z objętością, z której zrezygnowano, przy wartości R do kwadratu wynoszącej 0,94 i wartości p mniejszej niż 0,0001. Oznacza to, że liczbę robaków dozowanych do każdej studzienki można kontrolować, dostosowując dozowaną objętość.

Całkowita fluorescencja GFP na studzienkę pokazana po lewej stronie i fluorescencja RFP na studzienkę pokazana po prawej stronie jest wysoce odtwarzalna od studni do studni na płytce 3 84 dołków na tych rysunkach. XS wskazują względną fluorescencję zmierzoną w każdym dołku. Linie ciągłe wskazują średnie, a linie przerywane wskazują trzy odchylenia standardowe powyżej lub poniżej średniej fluorescencji wszystkich studzienek o współczynniku zmienności poniżej 9%Jak pokazano na tym rysunku, fluorescencja GFP z promotora GST cztery jest liniowo skorelowana z fluorescencją RFP z promotora DOP trzy w 3 84 dołkach o wartości R kwadrat 0,62 i wartości p mniejszej niż 0,0001.

W związku z tym nieindukowalny reporter RFP może być używany do normalizacji indukowalności. Reporter GFP. Gdy wyraża stosunek GFP do RFP, fluorescencja staje się wysoce odtwarzalna od studni do studni na płytce 3 84-dołkowej.

Obliczenie stosunku GFP do RFP zmniejszyło współczynnik zmienności do poziomu poniżej 6%, co świadczy o zdolności reportera zapytania ofertowego DOP three promotora do zmniejszenia zmienności, jak pokazano poniżej. Indukcja GFP w stosunku do RFP za pomocą aktywującego ksenobiotyku SK N jest solidna i wysoce odtwarzalna na płytce 3 84-dołkowej, średnie względne współczynniki fluorescencji wszystkich studzienek kontrolnych i należnych GLO są oznaczone liniami ciągłymi. Trzy odchylenia standardowe powyżej średniej kontrolnej i poniżej średniej dlo są oznaczone liniami przerywanymi.

Po opanowaniu, rozpoczęcie hodowli robaków może trwać około godziny pierwszego dnia, a następnie zbieranie i dozowanie. Robaki można zrobić około dwóch godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby zacząć od co najmniej 60 000 robaków i utrzymywać je w zawieszeniu podczas dozowania, postępując zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić badania przesiewowe z innymi, na przykład ciągami raportów dla innych indukowalnych ścieżek w celu opracowania modulatorów dla innych ścieżek Po jego rozwoju.

Technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi i biodetekcją w celu szybkiej identyfikacji modulatorów szlaku małych cząsteczek lub wykrywania zanieczyszczeń środowiskowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować, dozować i mierzyć fluorescencyjne szczepy elegan w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych, jeśli indukowane szlaki transkrypcyjne lub testowania wielu próbek pod kątem zanieczyszczeń środowiskowych.