Name: Wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biodetekcja z fluorescencyjnymi szczepami C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego z fluorescencyjnymi szczepami C. elegans do detekcji zanieczyszczeń środowiskowych i analizy ekspresji genów. Technika umożliwia szybkie, reprodukowalne testowanie związków chemicznych w modelu wielokomórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

C. elegans transgeny zostały udostępnione przez Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Niniejsza praca była wspierana przez grant NIH R21 NS0667678-01 przyznany KS. Wszyscy autorzy uczestniczyli w gromadzeniu, analizie i interpretacji danych. CKL, KS i KPC uczestniczyli w pisaniu i redagowaniu manuskryptu.

1. Przygotowanie bakteryjnej pożywki dla nicieni
Dzień 1
<ol>
<li>Do 500 ml pożywki Terrific broth uzupełnionej o 50 μg/ml streptomycyny dodać 5 ml nasyconej kultury bakteryjnej E. coli OP50 i inkubować przez noc w inkubatorze wytrząsającym (225 rpm) w temperaturze 37°C.</li> 
</ol>
Dzień 2
<ol start="2">
<li>Podziel nocną hodowlę bakteryjną do dziesięciu probótek o pojemności 50 ml i odwiruj bakterie w wirówce chłodzącej przy 2,500 rcf przez 20 minut.</li>
<li>Odlej pożywkę LB i resuspender każdy osad bakteryjny w 10 ml ciekłego podłoża do wzrostu nicieni (NGM). Wstrząsaj poziomo w inkubatorze z wytrząsaniem przez 15 minut, aby resuspender bakterie. Aby przygotować bufor NGM, dodaj 3 g NaCl do 1 L wody dejonizowanej i wysterylizuj w autoklawie. Ochłodź do 55°C i dodaj kolejno następujące sterylne roztwory: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 oraz 25 ml 1 M fosforanu potasu, pH 6,0.</li>
<li>Odwiruj hodowlę bakteryjną w wirówce chłodzącej przy 2,500 rcf przez 20 minut.</li>
<li>Odlej bufor NGM i zważ osad bakteryjny.</li>
<li>Dodaj taką samą objętość buforu NGM, aby resuspender osady, odmierz 3 ml koncentratu bakteryjnego do probótek 15 ml i przechowuj w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
2. Wielkoskalowa hodowla płynna C. elegans
Używamy linii transgenicznej VP596 (dvIs19[pAF15(gst-4::GFP::NLS);vsIs33[dop-3::RFP]) zawierającej dwa konstrukty fluorescencyjne: Pgst-4::GFP14 do monitorowania aktywności SKN-1 oraz Pdop-3::RFP17 służący jako standard do normalizacji liczby nicieni.
Dzień 1
<ol>
<li>Wymieszać 150 ml buforu NGM, 1,5 ml pożywki LB, 150 μl cholesterolu o stężeniu 5 mg/ml (w etanolu) oraz 75 μl streptomycyny o stężeniu 100 mg/ml. Mieszaninę wysterylizować przez filtrację i przelać do sterylnej kolby o pojemności 1 litra. 
UWAGA: Dodanie 1% pożywki LB do buforu NGM zapobiega przywieraniu nicieni do szkła i tworzyw sztucznych, a ilość ta jest niewystarczająca do wspierania wzrostu bakterii.</li>
<li>Zsynchronizować nicienie, stosując standardową procedurę z użyciem podchlorynu18. Do 0,5 ml nicieni z jajami można przetworzyć w jednej probówce 15 ml z 5 ml roztworu podchlorynu (3,75 ml sterylnej wody, 1 ml domowego wybielacza oraz 250 μl 10 N NaOH). Uwolnione jaja przemyć sterylną wodą i ponownie zawiesić w 10 ml buforu NGM.</li> 
<li>Próbkę jaj rozcieńczyć 100-krotnie w buforze NGM (np. 100 μl w 10 ml) i policzyć liczbę jaj w trzech oddzielnych alikwotach o objętości 5 μl. Średnią liczbę pomnożyć przez 200 000 (czynnik rozcieńczenia 100 x 2 000), aby oszacować całkowitą liczbę jaj.</li>
<li>Do kolby z buforem NGM dodać od 200 000 do 2 milionów jaj i inkubować kulturę przy wytrząsaniu z prędkością 100 rpm w temperaturze 20°C.</li>
</ol>
Dzień 2
<ol start="5">
<li>Przynajmniej 16 h po dodaniu jaj do kolby, za pomocą sterylnej pipety serologicznej pobrać około 0,5 ml zawiesiny kultury nicieni. Nanieść trzy krople po 5 μl na sterylną pokrywkę szalki Petriego. Umieścić pokrywkę w zamrażarce w temperaturze -20°C na 1-2 minuty, aby sparaliżować nicienie. Obliczyć średnią liczbę żywych, wyklutych nicieni w 5 μl, a następnie pomnożyć tę wartość przez 30 000 (150 ml/5 μl), aby oszacować całkowitą liczbę wyklutych nicieni.</li>
<li>Rozmrozić probówkę z mrożoną kulturą bakterii OP50 (Protokół 1.6) i dodać 3 ml 50% OP50 do kultury nicieni na każde 500 000 wyklutych nicieni. Inkubować kolbę przy wytrząsaniu z prędkością 100 rpm w temperaturze 20°C. Nicienie rozwiną się do stadium larw L4 i młodych osobników dorosłych w ciągu około 51 godzin. Wartość OD600 bakterii na początku powinna wynosić około 2,200. Monitorować ilość bakterii za pomocą absorbancji i dodawać kolejne porcje, jeśli wartość OD600 spadnie poniżej 0,900.</li>
</ol>
3. Zbieranie i dozowanie nicieni
Dzień 4
<ol>
<li>Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieś około 0.5 ml zawiesiny hodowli nicieni na standardową płytkę z agarem NGM. Obejrzyj nicienie pod stereomikroskopem, aby upewnić się, że większość z nich to larwy L4 lub młode dorosłe osobniki. Larwy L4 będą miały jasną plamkę na stronie brzusznej w środkowej części ciała. Młode dorosłe osobniki będą nieco większe i nie będą miały tej plamki.</li>
<li>Przelej hodowlę nicieni do sterylnych probówek 50 ml i umieść probówki w statywie na blacie laboratoryjnym. Pozostaw nicienie do osadzenia na około 10 minut. Usuń nadsącz poprzez aspirację lub pipetowanie. 
UWAGA: Ten krok może być istotny w celu usunięcia niewyklutych jaj lub nicieni, które nie rozwinęły się prawidłowo, ponieważ osiadają one wolniej niż larwy L4 i młode dorosłe osobniki.</li>
<li>Zbierz wszystkie nicienie do jednej probówki 50 ml i przemyj 3-4 razy buforem NGM z 1% bulionem LB (NGM+LB), aby usunąć bakterie. 
UWAGA: Najlepiej wykonać to w wirówce z koszykami wahadłowymi, wirowując nicienie przy 500 rcf przez 30 sec i zastępując nadsącz świeżym buforem NGM+LB.</li>
<li>Po przemyciu dopełnij probówkę buforem NGM+LB do 50 ml i przelej do specjalnej kolby do dozowania nicieni. Dodaj mały magnes mieszający i mieszaj, aby utrzymać nicienie w zawiesinie. Policz liczbę nicieni w trzech kroplach o objętości 5 μl, zgodnie z powyższymi instrukcjami. Rozcieńczaj buforem NGM+LB, aż uzyskasz 12-15 nicieni na kroplę 5 μl (˜2.5-3.0 nicieni/μl). 
UWAGA: Do wypełnienia przestrzeni martwej kolby dozującej i kasety dozownika potrzeba minimum około 20 ml (60 000 nicieni). Każda płytka 384-dołkowa wymaga około 35 000 nicieni lub 11.5 ml zawiesiny nicieni.</li>
<li>Załaduj kasetę dozującą 10 μl i wysterylizuj ją poprzez przepłukanie 70% etanolem. Wypłucz etanol, przepłukując kasetę sterylną wodą.</li>
<li>Włóż koniec kasety dozującej do kolby tak, aby znajdował się tuż nad magnesem mieszającym, nie zakłócając jego ruchu. Upewnij się, że nicienie pozostają w zawiesinie w całej objętości kolby. Zaprogramuj dozownik na niską prędkość z 2 wstępnymi impulsami. Przepłucz układ i przepuść co najmniej 10 ml zawiesiny nicieni. Napełniaj płytki szybko w miarę potrzeb, aby zapobiec osiadaniu nicieni w rurkach.</li>
<li>Zapieczętuj płytki przepuszczalną taśmą.</li>
<li>Umieść płytki na platformie wytrząsowej w inkubatorze w temperaturze odpowiedniej dla danego testu. Nie układaj płytek w stosy.</li>
</ol>
4. Analiza fluorescencyjna
<ol>
<li>Umieść docelową płytkę w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć intensywność fluorescencji każdej studni z zastosowaniem odpowiedniej długości fali emisji i wzbudzenia (Filtry dla naszego testu: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em).</li>
<li>Oblicz stosunek GFP/RFP i znormalizuj go względem odczytów ze studni kontrolnych (bez związku aktywującego), aby określić dokładną krotność różnicy w intensywności fluorescencji wynikającą z poszczególnych zabiegów.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Nasza metoda analizy SKN-1 wykorzystuje szczep z chromosomowo zintegrowanym podwójnym reporterem (VP596). Jak pokazano na Rysunku 1, liczba nicieni jest silnie skorelowana z dozowaną objętością. Jak pokazano na Rysunkach 2A i 2B, całkowita fluorescencja GFP i RFP na studzienkę jest wysoce powtarzalna pomiędzy studzienkami na płytce 384-dołkowej. Jak pokazano na Rysunku 2C, fluorescencja nieindukowanego Pgst-4::GFP jest liniowo skorelowana z Pdop-3::RFP w obrębie 384 studzienek. Po wyrażeniu w postaci stosunku GFP/RFP, fluorescencja staje się wysoce powtarzalna pomiędzy studzienkami na płytce 384-dołkowej (porównaj współczynnik zmienności z Rysunku 2D z Rysunkiem 2A), co wykazuje zdolność reportera Pdop-3::RFP do redukcji zmienności. Jak pokazano na Rysunku 3, indukcja GFP względem RFP za pomocą ksenobiotyku aktywującego SKN-1 (38 μM juglonu) jest silna i wysoce powtarzalna na całej płytce 384-dołkowej.
<img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Wykres liczby nicieni w funkcji objętości dozowanej (μl), r²=0,9352, p&lt;0,0001, analiza korelacji liniowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Liczba nicieni w funkcji objętości dozowanej. Nicienie rozcieńczono do stężenia około 2/μl i naniesiono na płytkę 24-dołkową w celu ręcznego przeliczenia przy użyciu stereomikroskopu. N = 8 dołków na objętość.
<img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Wyniki analizy fluorescencji; wykresy A-D; CV, dane z dołków; korelacja GFP vs. RFP; analiza statystyczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Całkowita fluorescencja nicieni naniesionych na płytkę 384-dołkową jest powtarzalna. Nicienie rozcieńczono do stężenia około 2,5/μl, a następnie 30 μl naniesiono do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Fluorescencja GFP (A) i RFP (B) we wszystkich dołkach wykazała współczynnik zmienności poniżej 9%. (C) Fluorescencja GFP jest silnie skorelowana z fluorescencją RFP. (D) Obliczenie stosunku GFP do RFP zredukowało współczynnik zmienności do poziomu poniżej 6%. (A, B i D) Linie ciągłe oznaczają średnie, a linie przerywane oznaczają trzy odchylenia standardowe powyżej lub poniżej średniej.
<img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Wykres względnej fluorescencji w funkcji numeru studzienki, przedstawiający rozkład danych i czynnik Z, analiza GFP/RFP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Aktywacja Pgst-4::GFP jest silna i powtarzalna. Do wszystkich studzienek płytki 384-dołkowej naniesiono około 75 nicieni w stadium L4, a do co drugiej kolumny dodano 38 μM juglonu. Fluorescencję GFP i RFP zmierzono po 21 h inkubacji. Średnie względne stosunki fluorescencji dla wszystkich studzienek kontrolnych (1,0) i z juglonem (8,9) zaznaczono liniami ciągłymi. Trzy odchylenia standardowe powyżej średniej kontrolnej i poniżej średniej dla juglonu zaznaczono liniami przerywanymi.

<ol><li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li>
<li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+a+versatile+platform+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li>
<li>WormBase [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbase.org">http://www.wormbase.org</a> (2012).</li>
<li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).</li>
<li>Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WD40+repeat+protein+WDR-23+functions+with+the+CUL4%2FDDB1+ubiquitin+ligase+to+regulate+nuclear+abundance+and+activity+of+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).</li>
<li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide-responsive+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).</li>
<li>Tullet, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+inhibition+of+the+longevity-promoting+factor+SKN-1+by+insulin-like+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans.</a> Cell. 132, 1025-1038 (2008).</li>
<li>Oliveira, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-adapted+stress+and+longevity+gene+regulation+by+Caenorhabditis+elegans+SKN-1%2FNrf%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf.</a> Aging Cell. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8, 258-269 (2009).</li>
<li>Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+chemoprevention+mechanisms+mediated+through+the+Keap1-Nrf2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway.</a> Antioxid Redox Signal. , (2010).</li>
<li>Kwak, M. K., Kensler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+NRF2+signaling+for+cancer+chemoprevention%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).</li>
<li>Leiser, S. F., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+signaling%2C+a+mechanism+for+cellular+stress+resistance+in+long-lived+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice.</a> Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).</li>
<li>Link, C. D., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+transgenes+for+study+of+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).</li>
<li>Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1%2FNrf2+inhibits+dopamine+neuron+degeneration+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+methylmercury+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity.</a> Toxicol Sci. , (2010).</li>
<li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+inexpensive+method+to+screen+for+common+foods+that+reduce+the+action+of+acrylamide%2C+a+harmful+substance+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food.</a> Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).</li>
<li>Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+extrasynaptic+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).</li>
<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%2C+a+Practical+Guide%22">C. elegans, a Practical Guide</a>. , Oxford University Press. (2005).</li>
<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy metodę hodowli i dozowania dużych liczb transgenicznych nicieni. Sprzęt używany do hodowli nicieni jest standardowy dla laboratoriów zajmujących się klonowaniem molekularnym, a urządzenia do obsługi cieczy i pomiarów fluorescencji są standardowe dla laboratoriów przetwarzających duże liczby mikropłytek. Inne metody dozowania dużych liczb żywych C. elegans wymagają drogiego sprzętu do sortowania cząstek19. Test Pgst-4::GFP może być wykorzystany do przesiewania małocząsteczkowych ...

<table><tbody><tr><td>pożywka LB</td><td>Research Products International Corp.</td><td>L24066</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Terrific Broth</td><td>Research Products International Corp.</td><td>T15100</td><td></td></tr><tr><td>Wielofunkcyjny czytnik mikropłytek Synergy HT</td><td>BioTek</td><td></td><td>Filtry: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em</td></tr><tr><td>Dozownik MicroFlo Select</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba do dozowania nicieni</td><td>Southern Scientific Inc., Micanopy, FL</td><td></td><td>Złożone na zamówienie(352) 284-2531</td></tr><tr><td>mikropłytki 384-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5678-1209</td><td></td></tr><tr><td>Oddychająca taśma uszczelniająca</td><td>Nalge Nunc international</td><td>241205</td><td></td></tr><tr><td>Juglon (5-hydroksy-p-naftochinon)</td><td>Acros Organics</td><td>121640010</td><td>Juglon rozpuszcza się w DMSO </td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5879</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; szczep transgeniczny</td><td>Autor&amp;rsquo;laboratorium</td><td>VP596</td><td>&lt;em&gt;Pgst-4::GFP i Pdop-3::RFP&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów c. elegans

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Przesiewanie wysokoprzepustowe (HTS) jest potężnym podejściem do identyfikacji chemicznych modulatorów procesów biologicznych. Jednakże wiele związków zidentyfikowanych w badaniach przesiewowych z wykorzystaniem modeli kultur komórkowych okazuje się często toksycznych lub farmakologicznie nieaktywnych in vivo1-2. Przesiewanie w modelach całego organizmu może pomóc uniknąć tych pułapek i usprawnić drogę do opracowania leków.
C. elegans jest wielokomórkowym organizmem modelowym, który doskonale nadaje się do HTS. Jest on mały (&lt;1 mm) i może być w sposób ekonomiczny hodowany oraz dozowany w cieczach. C. elegans jest również jednym z najbardziej podatnych na badania eksperymentalne modeli zwierzęcych, umożliwiającym szybką i szczegółową identyfikację mechanizmu działania leku3.
Opisujemy protokół hodowli i dozowania fluorescencyjnych szczepów C. elegans do wysokoprzepustowego przesiewania bibliotek chemicznych lub wykrywania zanieczyszczeń środowiskowych, które zmieniają ekspresję konkretnego genu. Duża liczba zsynchronizowanych rozwojowo nicieni jest hodowana w kulturze płynnej, zbierana, płukana i zawieszana w określonym zagęszczeniu. Następnie nicienie są przenoszone do czarnych płytek 384-dołkowych o płaskim dnie za pomocą perystaltycznego dozownika cieczy. Do dołków z nicieniami można dodać małe cząsteczki z biblioteki chemicznej lub próbki testowe (np. wodę, żywność lub glebę). Intensywność fluorescencji in vivo w czasie rzeczywistym jest mierzona za pomocą mikroplatego czytnika fluorescencji. Metoda ta może zostać dostosowana do każdego indukowalnego genu u C. elegans, dla którego dostępny jest odpowiedni reporter. Wiele indukowalnych szlaków transkrypcyjnych związanych ze stresem i rozwojem jest dobrze zdefiniowanych u C. elegans, a dla wielu z nich istnieją już transgeniczne szczepy reporterowe GFP4. W połączeniu z odpowiednimi reporterami transgenicznymi nasza metoda może być wykorzystana do przesiewania modulatorów szlaków lub do opracowywania solidnych testów biosensorowych dla zanieczyszczeń środowiskowych.
Prezentujemy nasz protokół hodowli i dozowania C. elegans na przykładzie opracowanego przez nas testu HTS do monitorowania czynnika transkrypcyjnego SKN-1 u C. elegans. SKN-1 oraz jego ssaczy homolog Nrf2 aktywują geny cytoprotekcyjne podczas stresu oksydacyjnego i ksenobiotycznego5-10. Nrf2 chroni ssaki przed licznymi schorzeniami związanymi z wiekiem, takimi jak nowotwory, neurodegeneracja i przewlekłe stany zapalne, i stał się głównym celem chemioterapii11-13. Nasz test opiera się na transgenicznym reporterze GFP dla genu docelowego SKN-1 gst-414, który koduje S-transferazę glutationową6. Reporter gst-4 jest również biosensorem dla substancji ksenobiotycznych i utleniających aktywujących SKN-1 i może być wykorzystywany do wykrywania niskich stężeń zanieczyszczeń, takich jak akryloamid i metylortęć15-16.

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Przesiewy wysokoprzepustowe (HTS) stanowią potężne podejście do identyfikacji chemicznych modulatorów procesów biologicznych. Jednakże wiele związków zidentyfikowanych w...

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę hodowli i dyspensowania fluorescencyjnych szczepów CL gans w celu wysokoprzepustowego przesiewu bibliotek chemicznych lub wykrywania zanieczyszczeń środowiskowych, aby ocenić wpływ czynników chemicznych lub środowiskowych na aktywność konkretnych białek. W przypadku CL elgan, w pierwszej kolejności przygotowywane są kultury bakteryjne służące jako pożywka dla nicieni, a następnie hodowane są zsynchronizowane nicienie transgeniczne GFP.Następnie zbiera się od 0,5 do 2 milionów nicieni, które są przemywane i rozdzielane do trzech 84-dołkowych płytek mikrotitracyjnych, a następnie do nicieni dodaje się małe cząsteczki z biblioteki chemicznej lub próbki testowe, takie jak woda, żywność lub gleba. Na koniec fluorescencję nicieni pomiar za pomocą czytnika mikropłytek.Analiza danych dotyczących intensywności fluorescencji pozwala na wykrycie małych cząsteczek modulujących indukowalne ścieżki transkrypcyjne lub umożliwia detekcję zanieczyszczeń środowiskowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy in vitro oraz testy oparte na hodowlach komórkowych, jest uniknięcie marnowania czasu na związki, które są to

high-throughput-screening-biosensing-with-fluorescent-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie przesiewowe o wysokiej wydajności i biosensoryzacji z użyciem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Źródło: Anderson, Q. L. i wsp. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych z wykorzystaniem Caenorhabditis elegans do badania knockdownów genów podczas interakcji gospodarz-patogen. Przedstawiono w nim procedurę przygotowania powalanych robaków i przenoszenia ich na płytki testowe w celu oceny skutków zabijania robaków przez patogeny.

Wielodołkowy test na bazie płynu do badań przesiewowych nokautów C. elegans

Źródło: Ali, I., i in. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów mikroorganizmów o wpływie na zdrowie Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2022)Ten film prezentuje wysokowydajny test fluorescencyjny, mający na celu ocenę, jak bakterie jelitowe wpływają na odporność na stres u Caenorhabditis elegans. Śledząc niebieską fluorescencję z pękniętych granulek jelit, test ujawnia wcześniejsze sygnały śmierci u robaków narażonych na testowe bakterie.

Wysokowydajny test fluorescencjonujący do badania interakcji mikroorganizmów z robakami

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy protokół, który jest elastycznym, wszechstronnym narzędziem przesiewowym o wysokiej zawartości, które może być wykorzystane do badania interakcji gospodarz-patogen i może być wykorzystane do odkrywania leków.

Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj metodę wysokoprzepustowego badania przesiewowego z fluorescencyjnymi szczepami C. elegans do detekcji zanieczyszczeń środowiskowych i analizy ekspresji genów. Technika umożliwia szybkie, reprodukowalne testowanie związków chemicznych w modelu wielokomórkowym.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Przeglądaj więcej filmów