Name: Wzrost rozciągliwości aksonów: mechanotransdukcja wzrostu neuronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Poznaj metodę inżynierii tkankowej wzrostu aksonów przez rozciąganie, która osiąga tempo do 10 mm dziennie. Technika ta pozwala badać mechanizmy wzrostu nerwów i rozwijać nowe strategie leczenia uszkodzeń nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była finansowana przez NSF CAREER CBET-0747615. Autorzy pragną podziękować dr. Douglasowi H. Smithowi oraz dr. Davidowi F. Meaneyowi za opiekę naukową i wsparcie.

1. Przegląd systemu bioreaktora do wzrostu aksonów pod wpływem rozciągania
<ol>
	<li>W celu przyłożenia sił eksperymentalnych do neuronów wykorzystywano dwa główne podejścia. W pierwszym podejściu siły są przykładane do całego neuronu (Lu, Franze et al. 2006; Chetta, Kye et al. 2010; Lindqvist, Liu et al. 2010). W drugim podejściu siły są przykładane bezpośrednio do aksonu poprzez pociąganie stożka wzrostu. To drugie podejście, z wykorzystaniem szklanych igieł, było stosowane do modelowania formowania się nowych aksonów (Bernal, Pullarkat et al. 2007; O'Toole, Lamoureux et al. 2008; Lamoureux, Heidemann et al. 2010), określania progów siły dla elongacji i retrakcji (Dennerll, Lamoureux et al. 1989; Zheng, Lamoureux et al. 1991; Lamoureux, Zheng et al. 1992) oraz analizy klastrowania neuroprzekaźników w terminalach aksonalnych (Siechen, Yang et al. 2009). Opracowano unikalne rozszerzenie tej metody w zakresie inżynierii tkankowej, aby wytwarzać duże konstrukty nerwowe przy użyciu zautomatyzowanego systemu bioreaktora do wzrostu indukowanego rozciąganiem aksonów (Axon Stretch Growth, ASG) (Iwata, Browne et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006). Niedawno opracowaliśmy zminiaturyzowaną wersję systemu bioreaktora, aby badać ASG mikroskopowo w czasie rzeczywistym (Loverde, Ozoka et al. 2011). Poniżej szczegółowo opisujemy 9-dniowy protokół (tabela 1), którego obecnie używamy do przygotowywania bioreaktorów i rutynowego przeprowadzania ASG.</li>
	<li>Ogólna zasada działania: System bioreaktora ASG składa się z trzech głównych elementów: 1) komory bioreaktora z niezależnymi torami (wydłużonymi dołkami), w których hodowane i rozciągane są neurony, 2) zautomatyzowanego stołu ruchu liniowego do przykładania sił rozciągających oraz 3) sterownika silnika krokowego z oprogramowaniem do kontroli wzrostu indukowanego rozciąganiem (rycina 1).</li>
	<li>W skrócie, prototypy bioreaktora zostały wykonane w warsztacie mechanicznym przy użyciu pionowej frezarki (Bridgeport, Elmira, NY). Ze względu na biokompatybilność, łatwość sterylizacji i trwałość, wewnętrzne komponenty bioreaktora wykonano z polieteroeteroketonu (PEEK) o grubości 3/8". Przezroczysty poliwęglan został użyty do wykonania pokryw, aby umożliwić mikroskopię świetlną i obserwację kultur. Montaż uzupełniają odporne na korozję śruby i elementy zintegrowane ze stali nierdzewnej 316 (McMaster-Carr, Elmhurst, IL).</li>
	<li>Komora bioreaktora składa się z ramy rozciągającej tworzącej 3 tory, regulowanego bloku holowniczego, który przesuwa komórki w poprzek torów, oraz wystających prętów holowniczych do manipulacji zewnętrznej (rycina 2). Kultury neuronalne są wysiewane na jednorazowe podłoża hodowlane holownicze z Aclar, wsparte przez blok holowniczy (ryciny 2 i 3). Jednorazowe stacjonarne podłoże w postaci szkiełka nakrywkowego jest przymocowane do spodu ramy rozciągającej i obejmuje wszystkie 3 tory. Przed rozciąganiem wysiane neurony muszą rozwinąć wypustki aksonalne z podłoża holowniczego na podłoże stacjonarne poprzez wysuwanie stożka wzrostu. Populacja aksonów tworzących mostek między podłożami zostanie następnie poddana rozciąganiu poprzez kontrolę przemieszczenia bloku holowniczego.</li>
	<li>Zautomatyzowany stół ruchu liniowego składa się z silnika krokowego (HT23-397, Applied Motion Products, Watsonville, CA) i stołu ruchu liniowego (MIPS-2-10-1.0mm, Servo Systems, Monteville, NJ) zamontowanych na stole wyrównawczym z delrinu. Komora bioreaktora jest osadzona w stole równolegle do stołu ruchu liniowego. Pręty holownicze wystające z komory bioreaktora są przymocowane do stołu ruchu liniowego za pomocą adaptera.</li>
	<li>Sterownik silnika krokowego (Si 2035, Applied Motion Products) jest programowany za pomocą dołączonego oprogramowania Si programmer w celu sterowania manipulacją podłożami holowniczymi. Rozciąganie aksonalne jest stosowane stopniowo, poprzez wykonywanie serii małych kroków przemieszczenia oddzielonych czasami oczekiwania (Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Iwata et al. 2006). Ten system sterowany komputerowo zapewnia możliwość programowania spersonalizowanych profili ASG i jest niezbędny do prowadzenia ciągłych eksperymentów przez okres od kilku dni do kilku tygodni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory bioreaktora
<ol>
	<li>Przygotuj jednorazowe podłoża hodowlane ruchome i stacjonarne do hodowli neuronalnej:
	<ol>
		<li>Podłoża hodowlane ruchome wycina się z arkuszy folii Aclar o wymiarach 8,5" x 11" (33C 2,0 mil, Structure Probe, West Chester, PA). Za pomocą ostrego ostrza wytnij podłoża o wymiarach około 0,5 x 2,5cm, lub nieco krótsze niż szerokość kanałów, aby zachować co najmniej 1-2mm luzu po obu stronach.</li>
		<li>Lekko zeszlifuj dolną 1/3ią podłoży hodowlanych ruchomych z obu stron, używając drobnoziarnistego papieru ściernego o gradacji 1200 (McMaster Carr). Szlifowanie podłoży ruchomych ułatwia wzrost aksonów z podłoży ruchomych na stacjonarne podłoże w postaci szkiełka podstawowego.</li>
		<li>Wytnij kawałek folii Aclar o wymiarach 5 x 7cm lub użyj szkiełka podstawowego nr 1, aby służyło jako podłoże stacjonarne (#4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA).</li>
		<li>Oczyść podłoża hodowlane rozcieńczonym roztworem Alconox i dokładnie wypłucz oczyszczoną wodą dH2O.</li>
		<li>Sterylizuj podłoża hodowlane poprzez zanurzenie w 70% etanolu na 30 minut. Pozostaw podłoża do wyschnięcia na powietrzu w sterylnej komorze do hodowli tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść komorę bioreaktora rozcieńczonym roztworem Alconox i wysterylizuj w autoklawie w pojemniku do autoklawowania. Natychmiast po autoklawowaniu przenieś do sterylnej komory i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Kontynuując pracę w sterylnej komorze, przyklej podłoża hodowlane do bioreaktora, używając silikonu RTV (Dow Corning #732, McMaster Carr) oraz sterylnych patyczków z bawełnianą końcówką (McMaster Carr):
	<ol>
		<li>Przy całkowicie pionowym ustawieniu nóżek bloku ruchomego, przyklej podłoża hodowlane ruchome do nóżek bloku w części nieszlifowanej. Unikaj kontaktu ze szlifowaną powierzchnią hodowlaną.</li>
		<li>Przyklej stacjonarne podłoże hodowlane do dna komory bioreaktora.</li>
		<li>Usuń nadmiar kleju i pęcherzyki powietrza, delikatnie dociskając suchym patyczkiem do przyklejonych podłoży.</li>
		<li>Ponieważ silikon RTV uwalnia kwas octowy, który jest toksyczny dla neuronów, bioreaktor pozostawia się do wyschnięcia pod światłem UV w komorze przez pełne 2 dni przed wprowadzeniem hodowli neuronalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obniż nóżki bloku ruchomego, aby uzyskać 2-3mm zakładki między końcami szlifowanych podłoży ruchomych a podłożem stacjonarnym. Należy zwrócić szczególną uwagę na wielkość zakładki; jeśli będzie zbyt duża, końce podłoży ruchomych mogą odchylić się od podłoża stacjonarnego, co zmniejszy liczbę aksonów przecinających obszar zakładki (rycina 3).</li>
	<li>Ustaw blok ruchomy w pozycji startowej, z prętami ruchomymi wciągniętymi do wnętrza bioreaktora. Dokręć śruby immobilizacyjne, aby zapobiec przesunięciu prętów ruchomych przed rozpoczęciem wzrostu rozciągniętego.</li>
</ol>
3. Kultury neuronalne
<ol>
	<li>Nanieś 1mL poli-d-lizyny o wysokiej masie cząsteczkowej w stężeniu 10 μg/mL (kat# 354210, BD, Bedford, MA) w pożywce bezsurowiczej na obszar interfejsu podłoża w każdym kanale. Pozostaw roztwór niezakłócony na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przepłucz delikatnie 3x wodą dH2O, a następnie wykonaj końcowe płukanie pożywką hodowlaną. Pipetowanie należy przeprowadzać z tyłu kanałów, w miejscu najdalej oddalonym od interfejsu podłoża.</li>
	<li>Wyizoluj eksplantaty zwojów korzeni grzbietowych (DRGs) z embrionu szczura w 16. dniu rozwoju (E16). Używając stereomikroskopu, rozdziel eksplantaty na pojedyncze krople w szalkach Petriego. Zbierz 3-4 eksplantaty za pomocą pipety 100 μL i nanieś je na krawędź szlifowanego podłoża hodowlanego do przeciągania. Należy zachować ostrożność, aby nanieść eksplantaty na krawędź podłoża do przeciągania, używając niewielkiej ilości pożywki. Do 1mL pożywki hodowlanej na kanał jest wystarczające, aby zapobiec parowaniu przez kilka godzin, ograniczając jednocześnie ruch eksplantatów. Skład pożywki: Neurobasal z B-27 + 0,5mM L-Glutaminy (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5g/L D-Glukozy (G-7528, Sigma, St. Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) oraz inhibitory mitotyczne 20 μM FdU + 20 μM Urydyny (F-0503, U-3003, Sigma).</li>
	<li>Zamknij pokrywę i przenieś bioreaktor do inkubatora na 1 godzinę lub do momentu adhezji komórek.</li>
	<li>Wypełnij bioreaktor pożywką hodowlaną w punkcie najdalej oddalonym od eksplantatów, aby uniknąć ich wypłukania. Inkubuj bioreaktor przez minimum 5 dni, podczas gdy neurony będą wydłużać wypustki aksonalne na stacjonarnym podłożu.</li>
</ol>
4. Wzrost aksonów indukowany rozciąganiem
<ol>
	<li>Bioreaktor poddawany jest końcowym procedurom przygotowawczym wewnątrz sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza:
	<ol>
		<li>Należy napełnić zbiorniki wewnątrz bioreaktora roztworem soli fosforanowej (PBS) w celu nawilżenia komory i ograniczenia odparowywania pożywek hodowlanych. W naszym systemie rolę zbiorników pełnią wydrążone ścianki obudowy. Alternatywnie, po obu stronach bloku holującego nad kanałami hodowlanymi można umieścić małe przykrywki do szalek Petriego.</li>
		<li>Należy wymienić pożywkę hodowlaną i napełnić kanały do pełna. Pipetowanie powinno być wykonywane z tyłu kanałów, w miejscu najdalej oddalonym od interfejsu z substratem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy umieścić bioreaktor w automatycznym stole do liniowego przesuwania. Jeśli eksperyment ma być przeprowadzany w inkubatorze, nie może być on nawilżany ze względu na ryzyko korozji automatycznego stołu do liniowego przesuwania.</li>
	<li>Należy przymocować adapter pręta holującego do prętów holujących.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania Si Programmer należy przesunąć stół liniowy tak, aby wyrównać go z adapterem pręta holującego, a następnie przymocować go do stołu. Dla ułatwienia zaleca się wcześniejsze przygotowanie sekwencji w programie Si Programmer, aby sterować stołem w określonych przyrostach.</li>
	<li>Należy poluzować śruby immobilizacyjne na komorze bioreaktora, aby umożliwić swobodny ruch bloku holującego.</li>
	<li>Rozciąganie jest stosowane stopniowo poprzez inicjowanie serii małych kroków przemieszczenia oddzielonych czasami oczekiwania (Pfister, Iwata et al. 2006). Nasz model rozpoczyna się od wykonywania kroków o wielkości 2 μm co 172 sekundy, co daje wypadkowe rozciągnięcie o 1 mm w ciągu 24 godzin. Po jednym dniu tempo rozciągania można zwiększyć poprzez zwiększenie przemieszczenia lub skrócenie czasu oczekiwania (tabela 2).</li>
	<li>Po zainicjowaniu ASG zazwyczaj nie jest wymagana wymiana pożywek. Z czasem pożywka hodowlana zazwyczaj zakwasza się, co objawia się zmianą koloru na żółtawy. Jeśli wymagane są dalsze eksperymenty, starej pożywki nigdy nie odlewa się całkowicie, lecz wymienia ją tylko częściowo, aby zminimalizować urazy pływających aksonów.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Wypustki aksonalne mogą ulegać niezwykle szybkiemu i intensywnemu wzrostowi indukowanemu rozciąganiem. Początkowo proces ten zaczyna się od okresu powolnego rozciągania (≤ 1mm/day), który składa się z niewielkich i rzadkich przemieszczeń. W ciągu pierwszych 24 godzin rozciągania dochodzi do mechanotransdukcji szlaków wzrostu neuronalnego, w wyniku której neurony rozpoczynają dodawanie materiału do cylindra aksonalnego. Po 24 godzinach ciągłego ASG aksony wykazują zwiększoną tolerancję na większe i częstsze przemieszczenia. Generalnie aksony mogą wytrzymać zwiększenie tempa rozciągania o 1mm/day co 12-24 godzin (Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006). Jednak zbyt wczesne zwiększenie tempa rozciągania może prowadzić do szybszego wzrostu wybranych aksonów, ale spowoduje również patologiczną okluzję prowadzącą do przerwania połączeń.
Aksony rosnące pod wpływem rozciągania mają tendencję do tworzenia pęczków, co przypomina architekturę pęczków nerwowych. Przy zastosowaniu obecnych protokołów centralna, rozciągnięta część pęczków aksonów nie wykazuje adhezji do podłoża hodowlanego. Tylko początkowo przylegające segmenty proksymalne i dystalne aksonów rosnących pod wpływem rozciągania pozostają przytwierdzone do podłoży hodowlanych. W związku z tym centralna część rozciągniętych aksonów unosi się swobodnie i jest podatna na uszkodzenia podczas manipulacji.
Z różnych powodów niektóre aksony nie mogą rosnąć w zastosowanym tempie rozciągania. Na przykład neuron zzęślennego zwoju korzeniowego (DRG) z dwoma wypustkami aksonalnymi, z których obie podlegają rozciąganiu, może nie być w stanie syntetyzować wystarczającej ilości białek i rosnąć w zastosowanym tempie rozciągania. Aksony, które nie są w stanie dostosować się do zastosowanego rozciągania, ulegną zwężeniu zgodnie z efektem Poissona. Dalsze rozciąganie doprowadzi do zamknięcia aksonów, co zahamuje ich organizację i doprowadzi do patologicznego przerwania połączeń. Większość aksonów jest jednak w stanie pomyślnie przejść proces ASG, a jedynie niewielki odsetek aksonów ulega temu procesowi przypominającemu pruning.
<img alt="Układ bioreaktora na zautomatyzowanym stole ruchomym do sterowania komorą hodowlaną; pokazany interfejs oprogramowania." src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. System bioreaktora do wzrostu aksonów z rozciąganiem. (A) Komora hodowlana bioreaktora i zautomatyzowany stół ruchu liniowego, (B) Sterownik napędu silnika krokowego oraz oprogramowanie programistyczne Si.
<img alt="Schemat urządzenia mikrofluidycznego przedstawiający kanały hodowlane i pręty holownicze do analizy komórek." src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Komora hodowlana bioreaktora. Ten schemat przedstawia komorę bioreaktora widzianą z góry z usuniętą pokrywą. Położenie bloku holowniczego odzwierciedla końcowy etap wzrostu aksonów indukowanego rozciąganiem. Rozciągnięte aksony są widoczne w postaci pęczków wewnątrz kanałów hodowlanych.
<img alt="Równowaga statyczna podczas trakcji wypustek; schemat przedstawiający prawidłowe i nadmierne nakładanie się podczas przeciągania." src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Interfejs płytkowania podłoża hodowlanego. Ten schemat przedstawia komponenty mechanizmu przeciągania w każdym kanale bioreaktora w widoku z boku. (Góra) Prawidłowe nakładanie się przeciąganego i stacjonarnego podłoża hodowlanego. (Dół) Nadmierne nakładanie się podłoża przeciąganego i stacjonarnego powoduje zwijanie się końcówki podłoża przeciąganego.
Film 1. Mocowanie podłoży hodowlanych do komory bioreaktora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>
Film 2. Wysiew eksplantów DRG na podłoża do holowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>
Film 3. Obsługa SiProgrammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>
Film 4. Wydłużanie stożka wzrostu na nieruchomym podłożu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>
Film 5. Wzrost aksonów indukowany rozciąganiem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dzień</td>
			<td>Krok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Sterylizacja &amp; Suszenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Klejenie &amp; Montaż</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Powłoki &amp; Wysiew kultur neuronalnych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Rozpoczęcie wzrostu rozciągniętego</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Harmonogram eksperymentu.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>Czas [godz]</td>
			<td>Szybkość rozciągania [mm/dobę]</td>
			<td>Czas przebywania [s]</td>
			<td>Długość całkowita [mm]</td>
			<td>Całkowity czas rozciągania [dni]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naprężenie wstępne</td>
			<td>24</td>
			<td>1</td>
			<td>172.8</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozciąganie</td>
			<td>24</td>
			<td>1</td>
			<td>172.8</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozciąganie</td>
			<td>24</td>
			<td>2</td>
			<td>86.4</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozciąganie</td>
			<td>24</td>
			<td>3</td>
			<td>57.6</td>
			<td>6</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozciąganie</td>
			<td>24</td>
			<td>4</td>
			<td>43.2</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozciąganie</td>
			<td>24</td>
			<td>5</td>
			<td>34.6</td>
			<td>15</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Harmonogram szybkości rozciągania. Wszystkie stopnie rozciągania wynoszą 2 μm przemieszczenia (10 kroków silnika krokowego = 2 μm rozciągnięcia).

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

Mechaniczne wydłużanie komórek neuronalnych ex-vivo jest opatentowane na mocy patentów USA nr 6264944 oraz 7429267.

Podczas przygotowywania bioreaktorów należy przestrzegać dwóch krytycznych kroków. Po pierwsze, konieczne jest zapewnienie optymalnego nakładania się powierzchni na styku podłoży, aby aksony mogły przejść na podłoże stacjonarne. Nie należy używać folii Aclar, która jest nadmiernie zwinięta lub w inny sposób wadliwa (rycina 3). Aby zoptymalizować zakres nakładania, należy upewnić się, że podłoże przesuwne jest równomiernie oszlifowane i styka się z podłożem stacjonarnym jednorodnie na obszarze kontaktu o długości 2-3mm. Nakładanie powinno zostać zoptymalizowane przed każdym eksperymentem poprzez ostrożną regulację wysokości nóg przesuwnych.
Po drugie, choć powłoki podłoża zapewniają przytwierdzanie neuronów, są one narażone na znaczne siły ścinające wywołane przemieszczaniem bioreaktora oraz napięciem skurczowym aksonów (Heidemann i Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al. 2004; Loverde, Ozoka et al. 2011). Podłoża należy dokładnie przepłukać sterylną wodą zarówno przed, jak i po naniesieniu powłoki z lizyny. Powłoki należy aplikować z nowo rozmrożonych alikwotów i rozprowadzać tak równomiernie, jak to możliwe. Co ważne, podłoży nie powinno się przesuwać ani w inny sposób zakłócać w okresie adhezji. W kolejnych krokach należy unikać kontaktu z podłożami podczas wysiewania, a wszystkie roztwory pipetować z przeciwległego końca kanałów, z dala od interfejsu podłoża.
Tolerancje w połączeniach poszczególnych elementów bioreaktora mogą objawiać się w postaci luzu. W początkowym okresie ASG luz w systemie jest widoczny jako ruch zautomatyzowanego stołu liniowego bez jednoczesnego ruchu bloku holującego. Luz może się różnić w zależności od eksperymentu, ale w naszym doświadczeniu zazwyczaj wynosi &lt;1mm. Z tego powodu przed harmonogramem ASG następuje jednodniowa faza „wstępnego naprężania” w celu eliminacji luzu w tempie 1mm/dzień, podczas której części bioreaktora zazębiają się i rozpoczynają przesuwanie podłoży holujących.
Rozwiązywanie problemów może być konieczne, jeśli krok przemieszczenia zautomatyzowanego stołu liniowego nie odpowiada przemieszczeniu bloku holowniczego po zakończeniu fazy wstępnego naprężenia. Asynchroniczne, niedokładne przemieszczenia bloku holowniczego wiążą się ze „stykcją” (tarciem statycznym) w obrębie sprzętu holowniczego oraz uginaniem się adaptera. Aby zapobiec tym problemom, po montażu należy ręcznie sprawdzić, czy blok holowniczy porusza się płynnie i niemal bez wysiłku. W przypadku wystąpienia blokowania, zespół holowniczy należy zwolnić przed rozpoczęciem eksperymentu. Wymagana jest również odpowiednia sztywność adaptera, aby mieć pewność, że dokładne i synchroniczne przemieszczenia nie zostaną zniwelowane przez tarcie statyczne sprzętu holowniczego.

<table><tbody><tr><td>Polyeteroeteroketon (PEEK)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8504K69</td><td>Klawia bioreaktora wykonana na zamówienie</td></tr><tr><td>Poliwęglan</td><td>McMaster-Carr</td><td>8574K28</td><td>Pokrywa komory bioreaktora wykonana na zamówienie</td></tr><tr><td>Silnik krokowy</td><td>Applied Motion Products, Watsonville, CA</td><td>HT23-397</td><td></td></tr><tr><td>Stół liniowy</td><td>Servo Systems, Montville, NJ</td><td>MIPS-2-10-1.0mm</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik silnika krokowego</td><td>Applied Motion Products, Watsonville, CA</td><td>Si2035</td><td></td></tr><tr><td>Aclar</td><td>Structure Probe Inc., West Chester, PA</td><td>1859</td><td>Podłoża do hodowli z przeciąganiem</td></tr><tr><td>Kryszalka nr 1</td><td>Brain Research Labs, Newton, MA</td><td>4865-1</td><td>Stacjonarne podłoże do hodowli</td></tr><tr><td>Silikon RTV</td><td>McMaster-Carr</td><td>7587A37</td><td></td></tr><tr><td>Wymiaczki z bawełnianą końcówką</td><td>McMaster-Carr</td><td>7074T62</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lizyna</td><td>BD Biosciences</td><td>354210</td><td></td></tr></tbody></table>

wzrost aksonów indukowany rozciąganiem: mechanotransdukcja wzrostu neuronalnego

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Podczas presynaptycznego rozwoju embrionalnego wypustki neuronalne pokonują krótkie dystanse, aby dotrzeć do swoich celów za pomocą stożka wzrostu. Z czasem ciała neuronów oddalają się od zakończeń aksonalnych na skutek wzrostu szkieletowego powiększającego się organizmu (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). Mechanotransdukcja ta indukuje wtórny tryb wzrostu neuronów, który umożliwia ciągłe wydłużanie się aksonu (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Wzrost aksonów indukowany rozciąganiem (Axon Stretch Growth, ASG) jest prawdopodobnie kluczowym czynnikiem w dojrzewaniu krótkich wypustek embrionalnych w długie nerwy i pasma istoty białej charakterystyczne dla układu nerwowego dorosłych. Aby badać ASG in vitro, zaprojektowaliśmy bioreaktory służące do przykładania naprężeń do krótkich wypustek aksonalnych w kulturach neuronów (Loverde, Ozoka et al. 2011). W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy metody przygotowania bioreaktorów oraz przeprowadzania ASG. Najpierw, w każdym kanale rozciągającym bioreaktora, neurony są wysiewane na mikromanipulowany podłoże holownicze. Następnie neurony regenerują swoje wypustki aksonalne poprzez wysuwanie stożków wzrostu na podłoże stacjonarne. Na koniec wzrost przez rozciąganie jest realizowany poprzez odciąganie wysianych ciał komórkowych od zakończeń aksonów przylegających do podłoża stacjonarnego, co odtwarza wzrost szkieletowy następujący po wysunięciu stożka wzrostu.
Wcześniejsze prace wykazały, że ASG neuronów z embrionalnych zwojów korzeni grzbietowych szczura są zdolne do osiągania bezprecedensowego tempa wzrostu do 10mm/dzień, osiągając długość do 10cm, przy jednoczesnym zwiększeniu średnicy aksonów (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). Stoi to w drastycznej sprzeczności z regeneracyjnym wysuwaniem się stożka wzrostu (wobec braku bodźców mechanicznych), gdzie średnie tempo wzrostu wynosi 1mm/dzień, a skuteczna regeneracja jest ograniczona do długości poniżej 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). W związku z tym dalsze badanie ASG może pomóc w ujawnieniu rozregulowanych mechanizmów wzrostu, które ograniczają regenerację w przypadku braku bodźców mechanicznych.

Opracowano unikalną metodę inżynierii tkankowej w celu wydłużenia licznych włókien nerwowych w hodowli poprzez odtworzenie wzrostu aksonów indukowanego rozciąganiem; jest to forma wzrostu układu nerwowego, w której nerwy wydłużają się równocześnie ze wzrostem powiększającego się organizmu.

Wzrost aksonów indukowany rozciąganiem: mechanotransdukcja wzrostu neuronalnego

Podczas presynaptycznego rozwoju zarodkowego wypustki neuronowe pokonują krótkie dystanse, aby dotrzeć do swoich celów za pomocą stożka wzrostu. Z czasem ciała neuronów ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przyłożenie siły rozciągającej do wypustki aksonalnej neuronu w celu stymulacji i podtrzymania jego wzrostu. Osiąga się to poprzez wysiewanie neuronów na mikromanipulowany podkład holujący, sterowany komputerowo za pomocą reaktora. Po wysiewaniu neurony są hodowane przez maksymalnie tydzień, podczas którego aksony rozprzestrzeniają się na stacjonarny podkład poprzez wydłużanie stożków wzrostu.Kolejno przeprowadzany jest wzrost aksonów przez rozciąganie, polegający na odciąganiu osadzonych ciał komórkowych od zakończeń aksonalnych przylegających do nieruchomego podłoża. Ta technika inżynierii tkankowej, jaką jest wzrost aksonów przez rozciąganie, pozwala na utrzymanie tempa wzrostu do 10 milimetrów na dobę, co w analizie mikroskopowej objawia się tworzeniem długich pęczków pęcherzykowych powiększonych traktów aksonalnych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak wydłużanie prądem wzrostu, jest to, że wzrost aksonów przez rozciąganie umożliwia hodowlę traktów aksonalnych o dowolnej pożądanej długości w krótszych odstępach czasu.Implikacje wzrostu aksonów indukowanego rozciąganiem pozwalają nam odtworzyć sygnały biomechaniczne stymulujące wzrost nerwów. Sygnały te można badać w celu ich wykorzystania i opracowania nowych strategii leczenia uszkodzonych lub chorych nerwów. Zatem metoda wzrostu aksonów indukowanego rozciąganiem może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania fundamentalne dotyczące rozwoju i utrzymania układu nerwowego.Co istotne, możemy zbadać mechanizmy pozwalające aksonom na wzrost z prędkością większą, niż dotychczas uważano za możliwą. System bioreaktora do wzrostu aksonów pod wpływem rozciągania składa się z trzech głównych komponentów. Pierwszym z nich jest komora bioreaktora, w której neurony są hodowane i rozciągane.Po drugie, zautomatyzowany stół liniowy, który przykłada siły rozciągające. I na koniec, sterownik napędu silnika krokowego z oprogramowaniem do kontroli wzrostu rozciągania. W tym przypadku protokół jest zaprezentowany z wykorzystaniem zminiaturyzowanego systemu, który umożliwia pracę pod mikroskopem.Prototypy bioreaktora wykonano przy użyciu pionowej frezarki, aby zapewnić biozgodność oraz łatwość sterylizacji hodowli. Elementy komory zostały wyfrezowane z polieteroeteroketonu, a do ukończenia montażu użyto trzech odpornych na korozję elementów mocujących ze stali nierdzewnej 16. Komora hodowlana bioreaktora zawiera ramę rozciągającą, regulowany blok holowniczy, pręty holownicze do manipulacji zewnętrznej oraz jednorazowe podłoża holownicze i stacjonarne do hodowli.Zautomatyzowany stół przesuwu liniowego składa się ze stołu przesuwu liniowego z silnikiem krokowym zamontowanym do stołu z delrinu. Do programowania i monitorowania sterownika napędu połączonego z silnikiem krokowym służy program komputerowy o nazwie P si programmer. Podłoża do hodowli przygotowuje się poprzez pocięcie folii LAR na wąskie paski o wymiarach około 0.5 na 2.5 centymetrów.Lekko przeszlifuj dolną jedną trzecią podłoży kultury holowniczej z obu stron, używając drobnoziarnistego papieru ściernego o ziarnistości 1 200, aby ułatwić wzrost aksonów z podłoży holowniczych na podłoże stacjonarne. Użycie zakładki dzielącej pomaga w bardziej równomiernym szlifowaniu. Wytnij kawałek LAR o wymiarach pięć na siedem centymetrów lub użyj szkiełka podstawowego nr 1, aby służyło jako podłoże stacjonarne.Oczyść podłoża hodowlane oraz komorę bioreaktora rozcieńczonym roztworem Alcan, a następnie dokładnie opłucz wodą dejonizowaną. Sterylizuj podłoża hodowlane poprzez zanurzenie w 70% etanolu na 30 minut. Komorę bioreaktora wysterylizuj w autoklawie, umieszczając ją w pojemniku przeznaczonym do autoklawowania.Po sterylizacji przenieść podłoża hodowlane oraz komorę bioreaktora do dygestorium do hodowli tkankowych i pozostawić do wyschnięcia. Do osuszania podłoży hodowlanych można wykorzystać pudełko z końcówkami do pipet. Włożyć podłoża hodowlane za pomocą sterylnych wymazówek z bawełnianym końcem.Przykleić podłoża hodowlane do elementów holujących bloku holującego. Za pomocą cienkiej warstwy silikonu RTV należy przykleić podłoże w miejscu nieszlifowanym, unikając kontaktu ze szlifowaną powierzchnią hodowlaną. Następnie przykleić stacjonarne podłoże hodowlane do dna komory bioreaktora.Usuń nadmiar kleju i pęcherzyki powietrza, delikatnie dociskając suchy patyczek do spodu nieruchomego podłoża. Pozostaw komorę do wyschnięcia na pełne dwa dni wewnątrz dygestorii do hodowli tkanek. Po dwóch dniach wyreguluj nóżki bloku holującego, aby uzyskać nakładkę od dwóch do trzech milimetrów między końcami standardowych podłoży holujących a podłożem nieruchomym.Należy zwrócić szczególną uwagę na wielkość obszaru nakładania. Jeśli będzie on zbyt duży, końce podłoży przesuwnych mogą odchylić się od podłoża stacjonarnego, co zmniejszy liczbę aksonów przecinających obszar nakładania. Umieść blok przesuwny w pozycji startowej z prętami przesuwnymi wciągniętymi do wnętrza bioreaktora.Dokręć śruby unieruchomiające, aby zapobiec przemieszczaniu się prętów rozciągających. Przed rozpoczęciem hodowli rozciągającej, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nanieś jeden mililitr polilizyny o wysokiej masie cząsteczkowej w pożywce bezsurowiczej na interfejs podłoża w każdej z sekcji. Pozostaw roztwór na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a po upływie godziny wypłucz trzy razy wodą dejonizowaną, a następnie wykonaj końcowe płukanie pożywką hodowlaną. Wyłóż eksplanty z zwojów korzeni grzbietowych szczurząt w wieku E 16 na oszlifowane podłoża do hodowli rozciągającej.Używając stereomikroskopu, najpierw rozdziel preparat w kroplach na szalkach Petriego, a następnie pobierz od trzech do czterech roślin za pomocą pipety 100 µL. Umieść rośliny na krawędzi podłoża transportowego w małej kałuży pożywki o objętości do 1 mL kultury. Taka ilość pożywki jest wystarczająca, aby zapobiec parowaniu przez kilka godzin, ograniczając jednocześnie ruch roślin.Zamknij pokrywę bioreaktora i przenieś go do inkubatora na jedną godzinę, aby umożliwić przyleganie bakłażanów. Po godzinie napełnij bioreaktor pożywką hodowlaną w punkcie najdalej oddalonym od bakłażanów, aby uniknąć ich oderwania. Inkubuj bioreaktor przez pięć dni, aby umożliwić neuronom DRG wyciągnięcie wypustek aksonalnych na stacjonarne podłoże.Wewnątrz dygestorium do hodowli tkankowych napełnić zbiorniki bioreaktora solą fizjologiczną z buforem fosforanowym, aby nawilżyć komorę i ograniczyć odparowywanie pożywki. Przeprowadzić końcową wymianę pożywki, napełniając kanały bioreaktora do pełnej pojemności. Umieścić bioreaktor na zautomatyzowanym stole z ruchem liniowym w inkubatorze bez nawilżania.Przymocuj adapter pręta holowniczego do prętów holowniczych. Używając oprogramowania Cy programmer, przesuń w trybie ręcznym (jog) stół o liniowym ruchu, aby wyrównać go z adapterem pręta holowniczego, a następnie przymocuj go do stołu dla ułatwienia pracy.Przygotuj wcześniej sekwencje programatora, aby manipulować stolikiem w określonych przyrostach. Przed rozpoczęciem programu wzrostu Axon Stretch poluzuj śruby unieruchamiające w komorze bioreaktora. Rozciąganie jest stosowane w sposób stopniowy poprzez wykonanie serii małych kroków przemieszczenia oddzielonych okresami spoczynku.Paradygmat ten rozpoczyna się od wykonywania dwóch kroków o wielkości jednego mikrona co 172 sekundy, co skutkuje całkowitym rozciągnięciem o jeden milimetr w ciągu pierwszych 24 godzin po wstępnym naprężeniu. Po jednym dniu tempo rozciągania można przyspieszyć poprzez zwiększenie wielkości kroku przemieszczenia lub skrócenie czasu spoczynku. Reprezentatywne wyniki procesu wzrostu aksonów podczas rozciągania przedstawiono tutaj.Pierwsze komórki w obrębie wysianych implantów migrują na podłoże holujące. Przez kolejne pięć dni stożki wzrostu wydłużają wypustki aksonalne na stacjonarnym podłożu. Gdy stożki wzrostu wydłużą się o co najmniej 1 mm na stacjonarnym podłożu, rozpoczyna się wzrost aksonów indukowany rozciąganiem.Podłoże holownicze jest przesuwane w stronę oddalenia od stożków wzrostu AED. W serii takich kroków elastyczność rozpiętych aksonów staje się natychmiast widoczna podczas ich rozciągania. Zazwyczaj aksony początkowo ulegają zwężeniu, lecz w ciągu kilku godzin wchodzą w fazę wzrostu, w której odzyskują i utrzymują swoje średnice. W ciągu 24 godzin ciągłego wzrostu z rozciąganiem aksony wykazują zwiększoną tolerancję na rozciąganie i są w stanie znosić przyrosty szybkości rozciągania.W miarę dalszego wzrostu aksonów i krążenia FAS, wykazują one zwiększoną tolerancję na rozciąganie. W tym przypadku unoszenie się aksonów hodowanych w warunkach rozciągania jest widoczne, gdy bioreaktor zostaje celowo potrącony ręką. Sporadycznie aksony mogą odłączyć się od stacjonarnego podłoża z powodu niewystarczającej adhezji.Jest to najczęstszy rodzaj niepowodzenia, który najprawdopodobniej występuje, gdy początkowy rozmiar kroku jest zbyt duży lub gdy podłoże stacjonarne zostało niewłaściwie pokryte. W tym przypadku, w wyniku zbyt dużego rozmiaru kroku, część aksonów odrywa się od podłoża stacjonarnego w momencie zainicjowania wzrostu rozciągniętego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby poświęcić odpowiednią ilość czasu na przygotowanie interfejsu podłoża.Palec i podłoże powinny nachodzić na podłoże stacjonarne o dwa do trzech milimetrów, a DRG należy wysiać jak najbliżej interfejsu w trakcie zachodzenia wzrostu rozciągającego. Otrzymają Państwo wyjątkową możliwość badania wzrostu aksonów przy użyciu żywych sond fluorescencyjnych lub poprzez lizę komórek w trakcie ich rozciągania w celu zbadania ekspresji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania przyłożonego naprężenia do stymulowania wzrostu aksonów.Stosując tę technikę, odkrywamy, że aksony mają niezwykłą zdolność do wzrostu w tempie szybszym, niż dotychczas sądzono, oraz do tworzenia połączeń, których nie da się uzyskać żadną inną metodą.

axon-stretch-growth-the-mechanotransduction-of-neuronal-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Rozciąganie wzrostu aksonu: Mechanotransdukcja wzrostu neuronów

Precyzyjne pomiary i aplikacja sił działających na neurony w zakresie od 2 do 1000 mikrodyn są realizowane przy użyciu kalibrowanych szklanych igieł. Metodologia ta może być wykorzystana do kontrolowania i pomiaru wielu aspektów rozwoju aksonów, w tym inicjacji aksonalnej, napięcia aksonalnego, prędkości wydłużania się aksonów oraz wektorów siły.

Mechaniczna manipulacja neuronami w celu kontrolowania rozwoju aksonów

Żywe bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie mogą zostać unieruchomione na miki powlekanej żelatyną i obrazowane w cieczy przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM).

Immobilizacja bakterii do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii sił atomowych

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.

Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Ta procedura opisuje, jak szybko inicjować, rozszerzać i łączyć neuryty zorganizowane w komorach mikroprzepływowych za pomocą pokrytych poli-D-lizyną koralików przymocowanych do mikropipet, które kierują wydłużaniem neurytu.

Przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Tutaj prezentujemy wszechstronne urządzenie do rozciągania równoosiowego, które jest uruchamiane pneumatycznie i kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości.

Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Przedstawiamy tutaj nowatorskie urządzenie, które stosuje fale izotropowe i jednoosiowe odkształcenia na komórkach, wspierając hodowlę na substratach o regulowanej sztywności i konfigurowalnych macierzach białkowych. Ta prosta, ekonomiczna platforma umożliwia badaczom badanie, jak mechaniczne sygnały regulują funkcjonowanie komórek zarówno w badaniach podstawowych, jak i w kontekstach związanych z chorobą.

Nowatorska platforma do rozciągania i obrazowania komórkowego in vitro

Poznaj metodę inżynierii tkankowej wzrostu aksonów przez rozciąganie, która osiąga tempo do 10 mm dziennie. Technika ta pozwala badać mechanizmy wzrostu nerwów i rozwijać nowe strategie leczenia uszkodzeń nerwowych.

Wzrost aksonów indukowany rozciąganiem: mechanotransdukcja wzrostu neuronalnego

Przeglądaj więcej filmów