Name: Izolowanie węchowych komórek macierzystych nosa od gryzoni lub ludzi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj metodę izolacji węchowych komórek macierzystych z błony śluzowej nosa gryzoni i ludzi. Technika ta umożliwia identyfikację markerów molekularnych chorób mózgu oraz potencjalne zastosowanie w terapii uszkodzeń układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana przez ANR (Agence nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Myopathies), FEDER w regionie PACA oraz IRME (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encéphale). Wyrażamy wdzięczność Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Institute) za jej nieocenioną pomoc podczas rejestracji time-lapse.

1. Pobieranie błony śluzowej węchowej u szczurów
<ol>
 <li>Rozpocznij od przygotowania w czystym dygestorium trzech szalek Petriego o średnicy 35 mm wypełnionych pożywką DMEM/HAM F12.</li>
 <li>Każda metoda eutanazji musi zostać wcześniej zatwierdzona przez instytucjonalną komisję ds. opieki i użytkowania zwierząt oraz przeprowadzona przez wykwalifikowany personel. Po wprowadzeniu szczura w głęboką narkozę za pomocą pentobarbalsodu lub innych wstrzykiwalnych środków znieczulających, takich jak ketamina/ksylazyna, wykonaj dekapitację i usuń skórę. Należy unikać środków znieczulających wziewnych. Odpowiedniość znieczulenia zostanie oceniona poprzez ucisk palców stopy przed dekapitacją. Usuń żuchwę za pomocą nożyczek, a następnie kleszczykami kostnymi usuń mięśnie twarzy po obu stronach.</li>
 <li>Zaczynając od tylnej części siekaczy, usuń kleszczykami kostnymi kość pokrywającą jamę nosową, wykonując to po jednej stronie. Przewijściski węchowe stają się widoczne jako pomarańczowe/brązowe organy znajdujące się w tylnej części nosa.</li>
 <li>Ostrożnie usuń przewijściski za pomocą pęsety. Używając igły 26 G, wyizoluj błonę śluzową węchową znajdującą się na przegrodzie, przecinając tkankę wzdłuż trzech linii: łuku płytki prostopadłej, płytki sitowej oraz stropu jamy nosowej.</li>
 <li>Pobierz biopsje z obu stron i przenieś je do szalki Petriego wypełnionej pożywką DMEM/HAM F12. Procedura ta nie powinna trwać dłużej niż 10 minut od rozpoczęcia eutanazji.</li>
 <li>Następnie, w celu usunięcia śluzu, przenieś biopsje dwukrotnie do szalek Petriego wypełnionych pożywką.</li>
</ol>
2. Pobieranie błony śluzowej węchowej u ludzi
<ol>
 <li>Procedurę tę powinien przeprowadzić chirurg laryngolog (ENT), zgodnie z wytycznymi właściwych lokalnych komisji etycznych; każdy pacjent ambulatoryjny powinien podpisać formularz świadomej zgody.</li>
 <li>Używając sztywnego endoskopu 0° lub 30° (średnica 4 mm), należy zbadać obie jamy nosowe i ocenić domniemaną obecność polipów lub jakichkolwiek zmian zapalnych. Wybierz optymalną jamę nosową, biorąc pod uwagę ewentualne skrzywienie przegrody.</li>
 <li>Za pomocą aplikatora bawełnianego należy zastosować znieczulenie miejscowe, np. lidokainę z epinefryną, na 10 minut.</li>
 <li>Używając kleszczy etmoidalnych o przekroju poprzecznym, pobierz biopsjat o wielkości dwóch milimetrów kwadratowych z nasady przyśrodkowej części małżowiny nosowej środkowej lub z obszaru grzbietowo-przyśrodkowego przegrody.</li>
 <li>Następnie, za pomocą sterylnej igły, przenieś biopsjat węchowy do sterylnej probówki o pojemności 2 ml wypełnionej 1 ml DMEM/HAM F12. Odwróć probówkę dnem do góry, aby upewnić się, że biopsjat jest zanurzony w pożywce hodowlanej.</li>
 <li>Umieść probówkę w pojemniku chłodzącym i przetransportuj ją do laboratorium badawczego. Na tym etapie biopsjat może być wykorzystany bezpośrednio do komparatywnych badań molekularnych skoncentrowanych na konkretnych chorobach mózgu lub poddany obróbce w celu generowania komórek macierzystych.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek macierzystych węchu z błony śluzowej człowieka i szczura
<ol>
 <li>Przemyj biopsaty w DMEM/HAM F12. Inkubuj biopsaty w szalce Petri wypełnionej 1 ml roztworu dispazy II (2,4 IU/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym z dyfrakcyjnym światłem odwróconym, oddziel nabłonek węchowy od leżącej poniżej blaszki właściwej (lamina propria) za pomocą mikrospatułki.</li>
 <li>Nabłonek węchowy jest cieńszy i wydaje się półprzezroczysty na czarnym tle w porównaniu do blaszki właściwej, która ma pomarańczowo-brązowe prążki. Na białym tle nabłonek wygląda na szary, a blaszka właściwa na brązową.</li>
 <li>Po oczyszczeniu przenieś blaszkę właściwą do szalki Petri wypełnionej DMEM/HAM F12.</li>
 <li>Jeśli tkanka pochodzi od gryzonia, potnij blaszkę właściwą na małe kawałki za pomocą dwóch igieł o rozmiarze 25 G. Następnie przenieś kawałki do probówki 15 ml wypełnionej 1 ml kolagenazy IA.</li>
 <li>W probówce, używając sterylnej plastikowej pipety, zdysocjuj tkankę. Następnie inkubuj probówkę przez 10 minut w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Aby przerwać dysocjację, delikatnie potrząśnij probówką, dodaj 9 ml PBS wolnego od Ca i Mg i odwiruj przy 200 g przez 5 minut.</li>
 <li>Resuspenduj osad komórkowy w pożywce DMEM/HAM F12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej oraz antybiotyki i wysiej na plastikowe naczynia hodowlane.</li>
 <li>W przypadku tkanki ludzkiej, potnij blaszkę właściwą na 3 do 4 kawałków o grubości od 200 do 500 μm.</li>
 <li>Umieść każdy pasek w osobnej naczyniach hodowlanych o średnicy 2 cm i przykryj tkankę sterylnymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 1,3 cm.</li>
 <li>Następnie dodaj 500 μl pożywki hodowlanej (DMEM/HAM F12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej oraz antybiotyki) do każdego naczynia hodowlanego.</li>
 <li>Dla obu typów tkanek wymieniaj pożywkę hodowlaną co 2 do 3 dni.</li>
 <li>Po pięciu do siedmiu dniach komórki macierzyste zaczną naciekać naczynie hodowlane, a po dwóch tygodniach powinny osiągnąć konfluencję. Po osiągnięciu konfluencji pasażuj i przenieś komórki do kolb hodowlanych.</li>
</ol>
4. Tworzenie sfer i różnicowanie neuronalne komórek macierzystych węchowych
<ol>
 <li>Aby wygenerować sfery komórek macierzystych, inkubować kolby przez dwie godziny w temperaturze 37°C z poli-L-lizyną (TEXT: 5 g/cm2).</li>
 <li>Wysiać komórki w opracowanych kolbach z gęstością 16 000 komórek na centymetr kwadratowy.</li>
 <li>Co dwa dni dokarmiać komórki 0,2 ml na centymetr kwadratowy suplementowanego pożywki (DMEM/HAM F12 suplementowane insuliną, transferryną, selenem (ITS-X, 1%), EGF (50 ng/ml) oraz FGF2 (50 ng/ml)).</li>
 <li>Po dwóch do pięciu dniach zebrać pływające sfery komórkowe, a następnie ponownie je wysiać lub zdysocjować przed przeszczepieniem w zwierzęcych modelach terapii komórkowej.</li>
 <li>Aby zróżnicować obwąchowe komórki macierzyste w komórki neuronopodobne, hodować je przez 21 dni w pożywce Neurobasal zawierającej B-27, penicylinę, streptomycynę, glutaminę i glutaminian.</li>
 <li>Następnie wymieniać pożywkę co 3 dni. Komórki neuronopodobne powinny pojawić się po dwóch do trzech tygodniach.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Komórki macierzyste wyrosłe z ludzkich eksplantów nosowych (Rycina 2A) dzielą się szybko, a konfluencję można osiągnąć w ciągu jednego do dwóch tygodni. Oceńiono jedną z kluczowych cech macierzystości – ekspresję nestyny (Rycina 2B). Podczas hodowli na poli-L-lizynie w bezserwatkowym medium hodowlanym uzupełnionym o EGF (50 ng/ml) i FGF2 (50 ng/ml), olfaktoryczne komórki macierzyste tworzą sfery (rycina 2C). W przypadku hodowli w medium zawierającym surowicę, nowo wysiane sfery dają początek komórkom wykazującym ekspresję GFAP (˜50%), tubuliny (˜10-15%) oraz O4 (˜2-5%)9 (Ryciny 2D-F). Los komórek pochodzących ze sfer może jednak zostać zmodyfikowany. Na przykład, podczas hodowli w medium Neurobasal uzupełnionym o B27 i glutaminian, większość nosowych olfaktorycznych komórek macierzystych przekształca się w komórki neuronopodobne wykazujące ekspresję β-III tubuliny (Rycina 2G) i MAP2 (Rycina 2H). 
<img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="Schemat izolacji komórek macierzystych węchu z tkanki szczura i człowieka w celu identyfikacji biomarkerów chorób mózgu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogólny schemat eksperymentu. Biopsje błony śluzowej węchowej są pobierane z jamy nosowej szczura lub człowieka. Eksplantaty mogą być wykorzystywane bezpośrednio do porównawczych badań molekularnych mających na celu identyfikację biomarkerów w chorobach mózgu. W celu izolacji komórek macierzystych węchu, interakcje między blaszka właściwa a neuroepithelium są rozrywane przy użyciu enzymu dispase II, a po 45 minutach nabłonek jest usuwany za pomocą mikrospatułki. Komórki macierzyste węchu gryzoni są następnie selekcjonowane poprzez dysocjację blaszki właściwej za pomocą kollagenazy IA. W przypadku tkanki ludzkiej, fragmenty blaszki właściwej błony węchowej są hodowane pod szkiełkiem podstawowym do czasu, aż wyrastające komórki macierzyste zajmą całą studzienkę. Po proliferacji, z zastosowaniem odpowiedniego pożywki hodowlanej, komórki macierzyste węchu mogą generować sfery lub różnicować się w komórki neuronopodobne. Komórki macierzyste węchu mogą być wykorzystywane do i) leczenia chorób mózgu lub urazów lub ii) identyfikacji markerów molekularnych chorób ośrodkowego układu nerwowego. Ilustracje zostały wykonane przy pomocy Servier Medical Art.
<img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="Różnicowanie neuronalne, immunobarwienie, hodowle komórkowe; markery: NESTIN, GFAP, BETA-TUBULIN III." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Hodowla i różnicowanie ludzkich komórek macierzystych węcha z nosa. Ludzkie komórki macierzyste wyrastające z eksplantu błony właściwej (A) dzielą się szybko podczas hodowli w medium zawierającym surowicę. Komórki macierzyste wykazują ekspresję markera macierzystości nestin (B). Po wysianiu na plastik pokryty poli-L-lizyną i hodowli w bezsurowiczym medium hodowlanym uzupełnionym o EGF i FGF2, komórki macierzyste węcha tworzą sfery (C). Komórki pochodzące ze sfer, po wysianiu w medium hodowlanym z surowicą, dają początek komórkom wykazującym ekspresję GFAP (˜50%), tubuliny (˜10-15%) oraz O4 (˜2-5%)9 (D-F). W przypadku hodowli w medium Neurobasal uzupełnionym o B27 i glutaminian, różnicują się one w komórki neuronopodobne wykazujące ekspresję β-III tubuliny (G) oraz MAP2 (H).

<ol><li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li>
<li>Ronnett, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+biopsies+demonstrate+a+defect+in+neuronal+development+in+Rett%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome.</a> Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).</li>
<li>Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+adhesion%2C+proliferation+and+death+in+neural+cultures+from+adults+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia.</a> Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).</li>
<li>Matigian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific%2C+neurosphere-derived+cells+as+models+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders.</a> Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).</li>
<li>Arnold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+epithelium+amyloid-beta+and+paired+helical+filament-tau+pathology+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease.</a> Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).</li>
<li>Boone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+stem+cells%2C+a+new+cellular+model+for+studying+molecular+mechanisms+underlying+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia.</a> PLoS One. , (2010).</li>
<li>McCurdy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+alterations+in+biopsied+olfactory+neuroepithelium+in+schizophrenia+and+bipolar+I+disorder+using+cell+culture+and+gene+expression+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses.</a> Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).</li>
<li>Roisen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+olfactory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Adult human olfactory stem cells.</a> Brain Res. 890, 11-22 (2001).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem+cells+from+adult+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa.</a> Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).</li>
<li>Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+nonepithelial+multipotent+cells+in+the+embryonic+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa.</a> Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).</li>
<li>Delorme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+nose+harbors+a+niche+of+olfactory+ectomesenchymal+stem+cells+displaying+neurogenic+and+osteogenic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties.</a> Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+rescue+axotomized+rodent+rubrospinal+neurons+and+promote+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery.</a> Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+promote+axotomized+rubrospinal+tract+axonal+reinnervation+and+locomotor+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery.</a> Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).</li>
<li>Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li>
<li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia%3A+a+3-year+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawione tutaj techniki sprawiają, że błona śluzowa węchowa gryzoni i ludzi stanowi użyteczny model w badaniach klinicznych nad przyczynami chorób neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych, a także narzędzie do regeneracji patologicznie zmienionego lub urazowego mózgu. Protokół jest stosunkowo prosty i może zostać z łatwością przeprowadzony przez doświadczonego biologa komórkowego. Skuteczność technik biopsji i hodowli jest wysoka.
Kluczowe etapy
<ul>
	<li>W przypadku pobierania błony śluzowej węchowej gryzoni zaleca się, aby czas między eutanazją a końcowym wycięciem tkanki węchowej nie przekraczał 10 minut.</li>
	<li>Dysocjację blaszki właściwej błony śluzowej węchowej gryzoni zazwyczaj uzyskuje się po 10 min. inkubacji w kolagenazie IA. Jeśli tak się nie stanie, zalecamy, aby następnego dnia zebrać nadpływ, w którym unoszą się niedysocjowane fragmenty blaszki właściwej, odwirować go przy 200 g i mechanicznie dysocjować pływającą tkankę za pomocą pipety Pasteura przed ponownym wysianiem komórek do nowej studzienki. Pierwszą studzienkę zawierającą już przytwierdzone komórki należy wypełnić świeżą pożywką hodowlaną.</li>
	<li>W przypadku ludzkiej blaszki właściwej, która jest bardziej zwarta niż tkanka gryzoni, nie zalecamy dysocjacji enzymatycznej. Tkankę należy pokroić, a każdy eksplant umieścić pomiędzy dnem plastikowej szalki a szkiełkiem nakrywkowym. Udane hodowle obejmują eksplanty o grubości od 200 do 500 μm.</li>
</ul>
Możliwe modyfikacje
<ul>
	<li>Obecny protokół można nieco zmodyfikować w celu generowania neuronów węchowych in vitro. W tym celu nie usuwa się neuroepitelium, a całą błonę śluzową nosa tnie się za pomocą siekacza McIlwaina (grubość 200 μm). Każdy eksplant wysiewa się do szalki, częściowo wysusza przez jedną godzinę, a następnie nawilża pożywką hodowlaną zawierającą FCS. W ciągu pierwszych dni po wysianiu z eksplantu wyrastają komórki nabłonkowe i mezenchymalne. Następnie progenitory neuronów migrują na powierzchnię tej warstwy komórkowej i różnicują się w neurony.</li>
	<li>Oczyszczanie komórek macierzystych węchu można przeprowadzić za pomocą cytometrii przepływowej. Specyficzne markery powierzchniowe można znaleźć na liście opublikowanej w pracy dotyczącej charakterystyki11.</li>
	<li>Do eksperymentów z transplantacją można wykorzystać szczep szczurów, którego komórki macierzyste węchu są GFP-dodatnie. Ten szczep szczurów (Sprague Dawley, eGFP sterowane przez promotor PGK) jest dostępny w ITERT (Nantes, Francja). Do wprowadzenia genu GFP do ludzkich komórek macierzystych węchu stosujemy metodę opartą na infekcji lentiwirusowej.</li>
	<li>Niniejsza praca koncentruje się na ektomezenchymalnych komórkach macierzystych węchu. Jednakże inny interesujący typ komórek, komórki otaczające włókna węchowe, może zostać oczyszczony z tej samej tkanki. Opisaliśmy metodę ich pozyskiwania i oczyszczania1,17, a ludzkie komórki otaczające włókna węchowe wykorzystaliśmy w badaniu klinicznym fazy I/IIa u pacjentów z paraplegią18.</li>
	<li>Jako członek superrodziny mezenchymalnych komórek macierzystych, OE-MSCs są w stanie, w odpowiednich warunkach hodowli, różnicować się w adipocyty, osteocyty i miocyty11.</li>
</ul>
Przyszłe zastosowania
<ul>
	<li>Wykorzystaliśmy już biopsje błony śluzowej nosa ludzi do badania anomalii komórkowych i molekularnych u pacjentów z autyzmem, zaburzeniami afektywnymi dwubiegunowymi, rodzinną dysautonomią, chorobą Parkinsona, chorobą Alzheimera oraz schizofrenią2-7. Teoretycznie wszystkie choroby mózgu mogą być badane z wykorzystaniem biopsji nosa lub obwodowych komórek macierzystych węcha.</li>
	<li>Gryzoniowe i ludzkie komórki macierzyste węcha nosa były już przeszczepiane w zwierzęcych modelach amnezji, choroby Parkinsona, uszkodzeń ślimaka oraz urazów rdzenia kręgowego12-16. Możliwe jest transplantowanie tych komórek do zwierzęcych modeli choroby Alzheimera, niedokrwienia mózgu oraz stwardnienia rozsianego.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td>Pobieranie błony śluzowej węchowej u szczurów</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/HAM F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki kostne</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła G 26</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Pobieranie błony śluzowej węchowej u ludzi</td><td></td></tr><tr><td>Sztywny endoskop</td><td>Karl Storz lub Richard Wolf Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epinefryna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do kości sitowej</td><td>Karl Storz lub Richard Wolf Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Izolacja komórek macierzystych węchu</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Group</td><td>10 295 825 001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereotypowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez Ca/Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>Invitrogen</td><td>10270098</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>Knittel Glaser</td><td>001/35</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Tworzenie sfer i różnicowanie neuronalne</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, transferyna, selen (ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 bezsurowiczy</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Błona śluzowa węchowa, znajdująca się w jamie nosowej, odpowiada za wykrywanie zapachów. Jest to również jedyna tkanka nerwowa wystawiona na działanie środowiska zewnętrznego i łatwo dostępna u każdej żywej jednostki. W związku z tym tkanka ta jest wyjątkowa dla każdego, kto dąży do zidentyfikowania anomalii molekularnych w patologicznym mózgu lub wyizolowania dorosłych komórek macierzystych do terapii komórkowej.
Nieprawidłowości molekularne w chorobach mózgu są często badane przy użyciu próbek tkanki nerwowej pobranych po śmierci. Materiał ten ma jednak liczne ograniczenia. W przeciwieństwie do niego, błona śluzowa powonienia jest łatwo dostępna i można ją bezpiecznie pobrać drogą biopsji bez utraty zmysłu węchu1. W związku z tym błona śluzowa powonienia stanowi u dorosłego człowieka „otwarte okno”, przez które można badać choroby rozwojowe (np. autyzm, schizofrenię)2-4 lub neurodegeneracyjne (np. chorobę Parkinsona, chorobę Alzheimera)4,5. Błonę śluzową powonienia można wykorzystać zarówno do porównawczych badań molekularnych4,6, jak i eksperymentów in vitro dotyczących neurogenezy3,7.
Nabłonek węchowy jest również tkanką nerwową, która codziennie wytwarza nowe neurony w celu zastąpienia tych uszkodzonych przez zanieczyszczenia, infekcje bakteryjne lub wirusowe. Ta permanentna neurogeneza jest podtrzymywana przez komórki progenitorowe, a także komórki macierzyste znajdujące się w obu przedziałach błony śluzowej, mianowicie w neuroepithelium oraz w położonej pod nim warstwie właściwej (lamina propria)8-10. Opracowaliśmy niedawno metodę oczyszczania dorosłych komórek macierzystych zlokalizowanych w warstwie właściwej i po wykazaniu, że są one ściśle powiązane z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi szpiku kostnego (BM-MSC), nazwaliśmy je olfaktorycznymi ektomezenchymalnymi komórkami macierzystymi (OE-MSC)11.
Co ciekawe, w porównaniu z BM-MSCs, OE-MSCs wykazują wysoką szybkość proliferacji, zwiększoną klonogenność oraz tendencję do różnicowania się w komórki neuronalne. Wykorzystaliśmy te właściwości do przeprowadzenia badań mających na celu ujawnienie nowych genów kandydackich w schizofrenii i chorobie Parkinsona4. My oraz inni badacze wykazaliśmy również, że OE-MSCs są obiecującymi kandydatami do terapii komórkowej po urazie rdzenia kręgowego12,13, uszkodzeniu ślimaka14 lub w modelach zwierzęcych choroby Parkinsona15 bądź amnezji16.
W niniejszym badaniu przedstawiamy metody pobierania biopsji błony śluzowej węchowej u szczurów i ludzi. Po pobraniu, blaszka właściwa jest oddzielana od nabłonka enzymatycznie, a komórki macierzyste są oczyszczane za pomocą metody enzymatycznej lub nieenzymatycznej. Oczyszczone komórki macierzyste węchu mogą być następnie namnażane w dużych ilościach i przechowywane w ciekłym azocie, indukowane do tworzenia sfer lub różnicowane w komórki neuronalne. Komórki macierzyste te mogą być również wykorzystane w porównawczych badaniach omicznych (genomicznych, transkryptomicznych, epigenomicznych, proteomicznych).

Opisujemy tutaj metodę pobierania biopsji błony śluzowej węchowej z jam nosowych szczura i człowieka. Biopsje te mogą być wykorzystane do identyfikacji anomalii molekularnych w chorobach mózgu lub do izolacji wielopotencjalnych dorosłych komórek macierzystych, które mogą zostać użyte do transplantacji komórkowej w zwierzęcych modelach urazów i chorób mózgu.

Izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

Błona śluzowa węchowa, zlokalizowana w jamie nosowej, odpowiada za wykrywanie zapachów. Jest ona również jedyną tkanką nerwową wyeksponowaną na działanie zewnętrznego...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja nosowych komórek macierzystych węchowych od szczurów lub ludzi w celu zidentyfikowania anomalii molekularnych lub naprawy patologicznego lub uszkodzonego mózgu. Osiąga się to poprzez wstępne chirurgiczne pobranie biopsji błony śluzowej węchowej z jamy nosowej. Następnie usuwa się nabłonek węchowy i jego nabłonkowe komórze macierzyste, aby skupić się na ektomezynchymalnych komórkach macierzystych w znajdującej się poniżej błonie własnej (lamina propria), a następnie izoluje się te komórki poprzez dysocjację tkanki gryzoni lub zbieranie komórek przerastających z ludzkich implantów hodowanych pod szkiełkami nakrywkowymi.Ostatnim krokiem procedury jest hodowla sfer komórek macierzystych z indukcją różnicowania w komórki neuronopodobne. Ostatecznie następuje eksplantacja całej błony śluzowej węchowej oraz izolacja indywidualnych komórek macierzystych. Pływające sfery lub komórki neuronopodobne mogą być wykorzystane do identyfikacji markerów molekularnych w chorobach mózgu lub do naprawy uszkodzeń układu nerwowego.Opisujemy metodę izolacji ludzkich i gryzoni komórek macierzystych nosa z błony śluzowej węchowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest fakt, że komórki macierzyste należą do tkanki nerwowej, są łatwo dostępne u każdej żyjącej osoby i mogą być wykorzystywane do diagnostyki lub naprawy patologicznie zmienionego mózgu. Jako chirurg laryngolog przeprowadziłem setki biopsji nosa na potrzeby badań klinicznych.Procedura jest bezpieczna i może zostać przeprowadzona w znieczuleniu miejscowym lub ogólnym. Jestem młodym naukowcem specjalizującym się w hodowli ludzkich komórek macierzystych z nosa lub innych czynników komórek macierzystych.Wykazują one wysoką szybkość proliferacji oraz skłonność do różnicowania się w kierunku typów komórek neuronalnych. Udowodniono ich skuteczność w zwierzęcych modelach amnezji i chorób neurodegeneracyjnych. Przed pobraniem śluzówki, przygotowano biopsje w 35 milimetrowych szalkach Petriego z pożywką DMEM/F12 w sterylnej komorze laminarnej.Po zweryfikowaniu za pomocą ucisku palca stopy, że szczur wszedł w stan głębokiej anestezji po podaniu pentobarbitalu sodowego, przeprowadź eutanazję poprzez ścięcie głowy. Odizoluj głowę i usuń skórę. Usuń dolną szczękę za pomocą nożyczek, a następnie za pomocą własnego skalpela usuń mięśnie twarzy po obu stronach, zaczynając od tylnej części siekaczy.Używając Ron Jur, usuń kość pokrywającą jamę nosową, wykonując to po jednej stronie. Przewijaki węchowe stają się widoczne jako pomarańczowe lub brązowe organy położone w tylnej części nosa; delikatnie usuń przewijaki za pomocą pincety.Używając igły o rozmiarze 26 G, wyizoluj błonę śluzową węchową znajdującą się na przegrodzie, wycinając tkankę wzdłuż trzech linii: łuku blaszki prostopadłej, blaszki CRI oraz stropu jamy nosowej. Pobierz biopsje z obu stron i przenieś je do szalki Petriego wypełnionej pożywką A-D-M-E-M ham F 12. Procedura ta nie powinna trwać dłużej niż 10 minut od rozpoczęcia eutanazji.Aby usunąć śluz, należy dwukrotnie przenieść biopsje do szalek Petriego wypełnionych pożywką. Zgodnie z wytycznymi odpowiednich lokalnych komisji etycznych, procedurę tę powinien przeprowadzić lekarz laryngolog, a każdy pacjent ambulatoryjny powinien podpisać formularz świadomej zgody. Należy użyć sztywnego endoskopu o kącie 0 stopni lub 30 stopni. Należy zbadać obie jamy nosowe i ocenić prawdopodobną obecność polipów lub jakichkolwiek zmian zapalnych.Wybierz odpowiednią jamę nosową, biorąc pod uwagę skrzywienie przegrody. Za pomocą aplikatora watowanego nanieś znieczulenie miejscowe, takie jak lidokaina z epinefryną, na 10 minut, dbając o dokładne pokrycie obszaru. Kleszczykami etmoidalnymi pobierz biopsję o powierzchni dwóch milimetrów kwadratowych albo u nasady przyśrodkowej części małżowiny środkowej, albo z obszaru grzbietowo-przyśrodkowego przegrody.Tutaj pokazujemy biopsję pobraną z obszaru korzenia. Biopsja błony węchowej jest następnie przenoszona za pomocą sterylnej igły do sterylnej probówki o pojemności dwóch mililitrów wypełnionej jednym mililitrem DMEM hem F 12. Odwróć probówkę do góry nogami, aby upewnić się, że biopsja jest zanurzona w pożywce hodowlanej.Włóż probówkę do chłodzącego pojemnika i przetransportuj ją do laboratorium badawczego. Na tym etapie biopsja może być wykorzystana bezpośrednio do porównawczych badań molekularnych skoncentrowanych na konkretnych chorobach mózgu lub poddana obróbce w celu generowania komórek macierzystych. Przemyj biopsje ludzkie lub szczurze oraz DMEM ham F 12 i inkubuj biopsje w szalce Petriego wypełnionej jednym mililitrem pasty.Inkubowano w dwóch roztworach przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie, przy użyciu mikroszpatułki i pod mikroskopem stereoskopowym z dyfrakcyjnym oświetleniem odgórnym, nabłonek węchowy człowieka lub szczura oddzielono od leżącej poniżej błony właściwej. Nabłonek węchowy jest półprzezroczysty na czarnym tle w porównaniu do błony właściwej, która ma prążkowany, pomarańczowo-brązowy kolor na białym tle.Nabłonek ma kolor szary, a blaszka właściwa (lamina propria) brązowy po oczyszczeniu; przenieś blaszkę właściwą do szalki Petriego wypełnionej pożywką DMEM/F-12. Jeśli tkanka pochodzi od gryzonia, potnij blaszkę właściwą na małe kawałki za pomocą dwóch igieł o rozmiarze 25 G. Następnie przenieś kawałki do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 1 ml kolagenazy 1 A; użyj sterylnej plastikowej pipety, aby rozdzielić tkankę.Następnie inkubuj probówkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Aby przerwać dysocjację, delikatnie potrząśnij probówką, dodaj mililitry PBS pozbawionego wapnia i magnezu, a następnie wiruj przy 200 G przez pięć minut. Resuspenduj osad komórkowy w pożywce hodowlanej i wysiej na plastikowe naczynia hodowlane.Jeśli tkanka pochodzi od człowieka, należy pokroić cytrynę na trzy do czterech odpowiednich kawałków. Każdy pasek należy umieścić w osobnej dołku o średnicy 2 cm w płytce czterodołkowej, a następnie przykryć tkankę sterylnymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 1,3 cm.Następnie do każdej płytki hodowlanej dla obu typów tkanek dodaj 500 µL pożywki hodowlanej. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Po pięciu do siedmiu dniach hodowli komórki macierzyste zaczną naciekać na płytkę hodowlaną.Po dwóch tygodniach komórki powinny osiągnąć konfluencję. Po osiągnięciu konfluencji należy przeprowadzić pasaż i przenieść komórki do kolb hodowlanych w celu wygenerowania sfer komórek macierzystych.Przesiewać komórki z gęstością 16 000 komórek na centymetr kwadratowy do uprzednio przygotowanych kolbek co dwa dni. Dostarczać komórkom 0,2 mililitra na centymetr kwadratowy medium suplementowanego. Po dwóch do pięciu dniach zebrać pływające sfery komórkowe, a następnie przesiewać je lub dysocjować przed szczepieniem.Model zwierzęcy terapii komórkowej w celu różnicowania komórek macierzystych węcha w komórki neuronopodobne. Hodować komórki przez 21 dni w pożywce Neurobasal zawierającej B 27, penicylinę, streptomycynę, glutaminę oraz glutaminian, dokonując wymiany pożywki co trzy dni. Komórki neuronopodobne powinny pojawić się po dwóch do trzech tygodniach, od pięciu do siedmiu dni po wysianiu.Nosowe ludzkie komórki macierzyste węchu wyrosły z eksplantu i szybko proliferowały. Pełną konfluencję można było osiągnąć w ciągu jednego lub dwóch tygodni. Kluczową cechę komórek macierzystych, gniazdowanie i ekspresję, oceniono podczas hodowli na polilizynie w bezserowym medium hodowlanym uzupełnionym o EGF i FGF2; komórki macierzyste węchu przekształciły się w sfery, które po wysianiu w medium zawierającym serum uległy różnicowaniu.W pożywce powstały populacje komórek zawierające około 50% komórek wykazujących ekspresję GFAP, do 15% komórek wykazujących ekspresję tubuliny oraz do 5% komórek wykazujących ekspresję oligo4. Gdy komórki pochodzące ze sfer hodowano w suplementowanym pożywce Neurobasal, większość populacji przekształciła się w komórki neuronopodobne wykazujące ekspresję beta III-tubuliny. Te same komórki neuronopodobne wykazywały również ekspresję MAP2.W ten sposób los komórek macierzystych mógł zostać zmodyfikowany w ciągu jednego semestru. Technika ta pozwala na łatwe generowanie i namnażanie milionów komórek macierzystych w czasie krótszym niż cztery tygodnie, co umożliwia klinicystom przeprowadzanie przyszłych autologicznych transplantacji komórek. Biopsje z refrakcji nosowej są bardzo przydatne w identyfikacji biomarkerów oraz chorób mózgu.Niedawno z sukcesem zidentyfikowaliśmy nowe geny kandydackie dla autyzmu. Utworzyliśmy już bank olfaktorycznych komórek macierzystych pobranych od osób z autyzmem oraz osób z grupy kontrolnej, który może zostać rozszerzony o inne zaburzenia mózgu u ludzi.

isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolowanie komórek macierzystych śluzówki nosowej u gryzoni lub ludzi

Opisano zoptymalizowany protokół izolacji komórek macierzystych z gruczołu ślinowego myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne i mechaniczne oraz umożliwia izolację salisfer zawierających komórki o charakterystyce komórek macierzystych.

Izolacja komórek macierzystych gruczołów ślinowych myszy

Ten film demonstruje szczegółowy protokół izolowania ścian bocznych komór od mózgu dorosłej myszy i przeprowadzania enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu uzyskania pojedynczych komórek. Komórki te są następnie poddawane specyficznym warunkom hodowli, które selektywnie zwiększają proliferację nerwowych komórek macierzystych i promują ich różnicowanie w kokultury oligodendrocytów i astrocytów.

Uzyskiwanie mieszanej kultury oligodendrocytów i astrocytów z dorosłych komórek macierzystych nerwowych myszy

Komórki otoczki węchowej (OEC) to komórki grzebienia nerwowego, które umożliwiają wzrost pierwotnych neuronów węchowych. Ta specyficzna właściwość może być wykorzystana do przeszczepu komórkowego. Przedstawiamy w niniejszej pracy model transplantacji komórkowej oparty na zastosowaniu OEC w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego.

Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Rdzeń kręgowy dorosłego ssaka zawiera nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe (NSPC), które mogą być izolowane i rozwijane w hodowli. Protokół ten opisuje pobieranie, izolację, hodowlę i pasażowanie NSPC generowanych z obszaru okołokomorowego dorosłego rdzenia kręgowego od szczura i od dawców narządów po przeszczepie.

Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2), zaangażowane w zapalenie typu 2, głównie uczestniczą w odpowiedzi na infekcję robakami pasożytniczymi, choroby alergiczne, homeostazę metaboliczną i naprawę tkanek. W tym badaniu przedstawiono procedurę izolacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa i wykrywania ekspresji CD226.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

Metoda izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów z mózgów żywych szczurów jest tutaj przedstawiona w szczegółach eksperymentalnych. Pozwala to na wielokrotne pobieranie tych komórek od tych samych zwierząt bez uszczerbku dla ich dobrostanu.

Metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

W tym artykule przedstawiono uproszczony protokół rozwarstwiania i dysocjacji mysiego nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania jednojądrowego RNA.

Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

Poznaj metodę izolacji węchowych komórek macierzystych z błony śluzowej nosa gryzoni i ludzi. Technika ta umożliwia identyfikację markerów molekularnych chorób mózgu oraz potencjalne zastosowanie w terapii uszkodzeń układu nerwowego.

Izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

Przeglądaj więcej filmów