Izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja nosowych komórek macierzystych węchowych od szczurów lub ludzi w celu zidentyfikowania anomalii molekularnych lub naprawy patologicznego lub uszkodzonego mózgu. Osiąga się to poprzez wstępne chirurgiczne pobranie biopsji błony śluzowej węchowej z jamy nosowej. Następnie usuwa się nabłonek węchowy i jego nabłonkowe komórze macierzyste, aby skupić się na ektomezynchymalnych komórkach macierzystych w znajdującej się poniżej błonie własnej (lamina propria), a następnie izoluje się te komórki poprzez dysocjację tkanki gryzoni lub zbieranie komórek przerastających z ludzkich implantów hodowanych pod szkiełkami nakrywkowymi.

Ostatnim krokiem procedury jest hodowla sfer komórek macierzystych z indukcją różnicowania w komórki neuronopodobne. Ostatecznie następuje eksplantacja całej błony śluzowej węchowej oraz izolacja indywidualnych komórek macierzystych. Pływające sfery lub komórki neuronopodobne mogą być wykorzystane do identyfikacji markerów molekularnych w chorobach mózgu lub do naprawy uszkodzeń układu nerwowego.

Opisujemy metodę izolacji ludzkich i gryzoni komórek macierzystych nosa z błony śluzowej węchowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest fakt, że komórki macierzyste należą do tkanki nerwowej, są łatwo dostępne u każdej żyjącej osoby i mogą być wykorzystywane do diagnostyki lub naprawy patologicznie zmienionego mózgu. Jako chirurg laryngolog przeprowadziłem setki biopsji nosa na potrzeby badań klinicznych.

Procedura jest bezpieczna i może zostać przeprowadzona w znieczuleniu miejscowym lub ogólnym. Jestem młodym naukowcem specjalizującym się w hodowli ludzkich komórek macierzystych z nosa lub innych czynników komórek macierzystych.

Wykazują one wysoką szybkość proliferacji oraz skłonność do różnicowania się w kierunku typów komórek neuronalnych. Udowodniono ich skuteczność w zwierzęcych modelach amnezji i chorób neurodegeneracyjnych. Przed pobraniem śluzówki, przygotowano biopsje w 35 milimetrowych szalkach Petriego z pożywką DMEM/F12 w sterylnej komorze laminarnej.

Po zweryfikowaniu za pomocą ucisku palca stopy, że szczur wszedł w stan głębokiej anestezji po podaniu pentobarbitalu sodowego, przeprowadź eutanazję poprzez ścięcie głowy. Odizoluj głowę i usuń skórę. Usuń dolną szczękę za pomocą nożyczek, a następnie za pomocą własnego skalpela usuń mięśnie twarzy po obu stronach, zaczynając od tylnej części siekaczy.

Używając Ron Jur, usuń kość pokrywającą jamę nosową, wykonując to po jednej stronie. Przewijaki węchowe stają się widoczne jako pomarańczowe lub brązowe organy położone w tylnej części nosa; delikatnie usuń przewijaki za pomocą pincety.

Używając igły o rozmiarze 26 G, wyizoluj błonę śluzową węchową znajdującą się na przegrodzie, wycinając tkankę wzdłuż trzech linii: łuku blaszki prostopadłej, blaszki CRI oraz stropu jamy nosowej. Pobierz biopsje z obu stron i przenieś je do szalki Petriego wypełnionej pożywką A-D-M-E-M ham F 12. Procedura ta nie powinna trwać dłużej niż 10 minut od rozpoczęcia eutanazji.

Aby usunąć śluz, należy dwukrotnie przenieść biopsje do szalek Petriego wypełnionych pożywką. Zgodnie z wytycznymi odpowiednich lokalnych komisji etycznych, procedurę tę powinien przeprowadzić lekarz laryngolog, a każdy pacjent ambulatoryjny powinien podpisać formularz świadomej zgody. Należy użyć sztywnego endoskopu o kącie 0 stopni lub 30 stopni. Należy zbadać obie jamy nosowe i ocenić prawdopodobną obecność polipów lub jakichkolwiek zmian zapalnych.

Wybierz odpowiednią jamę nosową, biorąc pod uwagę skrzywienie przegrody. Za pomocą aplikatora watowanego nanieś znieczulenie miejscowe, takie jak lidokaina z epinefryną, na 10 minut, dbając o dokładne pokrycie obszaru. Kleszczykami etmoidalnymi pobierz biopsję o powierzchni dwóch milimetrów kwadratowych albo u nasady przyśrodkowej części małżowiny środkowej, albo z obszaru grzbietowo-przyśrodkowego przegrody.

Tutaj pokazujemy biopsję pobraną z obszaru korzenia. Biopsja błony węchowej jest następnie przenoszona za pomocą sterylnej igły do sterylnej probówki o pojemności dwóch mililitrów wypełnionej jednym mililitrem DMEM hem F 12. Odwróć probówkę do góry nogami, aby upewnić się, że biopsja jest zanurzona w pożywce hodowlanej.

Włóż probówkę do chłodzącego pojemnika i przetransportuj ją do laboratorium badawczego. Na tym etapie biopsja może być wykorzystana bezpośrednio do porównawczych badań molekularnych skoncentrowanych na konkretnych chorobach mózgu lub poddana obróbce w celu generowania komórek macierzystych. Przemyj biopsje ludzkie lub szczurze oraz DMEM ham F 12 i inkubuj biopsje w szalce Petriego wypełnionej jednym mililitrem pasty.

Inkubowano w dwóch roztworach przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie, przy użyciu mikroszpatułki i pod mikroskopem stereoskopowym z dyfrakcyjnym oświetleniem odgórnym, nabłonek węchowy człowieka lub szczura oddzielono od leżącej poniżej błony właściwej. Nabłonek węchowy jest półprzezroczysty na czarnym tle w porównaniu do błony właściwej, która ma prążkowany, pomarańczowo-brązowy kolor na białym tle.

Nabłonek ma kolor szary, a blaszka właściwa (lamina propria) brązowy po oczyszczeniu; przenieś blaszkę właściwą do szalki Petriego wypełnionej pożywką DMEM/F-12. Jeśli tkanka pochodzi od gryzonia, potnij blaszkę właściwą na małe kawałki za pomocą dwóch igieł o rozmiarze 25 G. Następnie przenieś kawałki do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 1 ml kolagenazy 1 A; użyj sterylnej plastikowej pipety, aby rozdzielić tkankę.

Następnie inkubuj probówkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Aby przerwać dysocjację, delikatnie potrząśnij probówką, dodaj mililitry PBS pozbawionego wapnia i magnezu, a następnie wiruj przy 200 G przez pięć minut. Resuspenduj osad komórkowy w pożywce hodowlanej i wysiej na plastikowe naczynia hodowlane.

Jeśli tkanka pochodzi od człowieka, należy pokroić cytrynę na trzy do czterech odpowiednich kawałków. Każdy pasek należy umieścić w osobnej dołku o średnicy 2 cm w płytce czterodołkowej, a następnie przykryć tkankę sterylnymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 1,3 cm.

Następnie do każdej płytki hodowlanej dla obu typów tkanek dodaj 500 µL pożywki hodowlanej. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co dwa do trzech dni. Po pięciu do siedmiu dniach hodowli komórki macierzyste zaczną naciekać na płytkę hodowlaną.

Po dwóch tygodniach komórki powinny osiągnąć konfluencję. Po osiągnięciu konfluencji należy przeprowadzić pasaż i przenieść komórki do kolb hodowlanych w celu wygenerowania sfer komórek macierzystych.

Przesiewać komórki z gęstością 16 000 komórek na centymetr kwadratowy do uprzednio przygotowanych kolbek co dwa dni. Dostarczać komórkom 0,2 mililitra na centymetr kwadratowy medium suplementowanego. Po dwóch do pięciu dniach zebrać pływające sfery komórkowe, a następnie przesiewać je lub dysocjować przed szczepieniem.

Model zwierzęcy terapii komórkowej w celu różnicowania komórek macierzystych węcha w komórki neuronopodobne. Hodować komórki przez 21 dni w pożywce Neurobasal zawierającej B 27, penicylinę, streptomycynę, glutaminę oraz glutaminian, dokonując wymiany pożywki co trzy dni. Komórki neuronopodobne powinny pojawić się po dwóch do trzech tygodniach, od pięciu do siedmiu dni po wysianiu.

Nosowe ludzkie komórki macierzyste węchu wyrosły z eksplantu i szybko proliferowały. Pełną konfluencję można było osiągnąć w ciągu jednego lub dwóch tygodni. Kluczową cechę komórek macierzystych, gniazdowanie i ekspresję, oceniono podczas hodowli na polilizynie w bezserowym medium hodowlanym uzupełnionym o EGF i FGF2; komórki macierzyste węchu przekształciły się w sfery, które po wysianiu w medium zawierającym serum uległy różnicowaniu.

W pożywce powstały populacje komórek zawierające około 50% komórek wykazujących ekspresję GFAP, do 15% komórek wykazujących ekspresję tubuliny oraz do 5% komórek wykazujących ekspresję oligo4. Gdy komórki pochodzące ze sfer hodowano w suplementowanym pożywce Neurobasal, większość populacji przekształciła się w komórki neuronopodobne wykazujące ekspresję beta III-tubuliny. Te same komórki neuronopodobne wykazywały również ekspresję MAP2.

W ten sposób los komórek macierzystych mógł zostać zmodyfikowany w ciągu jednego semestru. Technika ta pozwala na łatwe generowanie i namnażanie milionów komórek macierzystych w czasie krótszym niż cztery tygodnie, co umożliwia klinicystom przeprowadzanie przyszłych autologicznych transplantacji komórek. Biopsje z refrakcji nosowej są bardzo przydatne w identyfikacji biomarkerów oraz chorób mózgu.

Niedawno z sukcesem zidentyfikowaliśmy nowe geny kandydackie dla autyzmu. Utworzyliśmy już bank olfaktorycznych komórek macierzystych pobranych od osób z autyzmem oraz osób z grupy kontrolnej, który może zostać rozszerzony o inne zaburzenia mózgu u ludzi.