Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób ekstrakcji DNA z próbek tkanek zatopionych w parafinie. Próbka wykorzystana w tej demonstracji to rdzeń tkankowy o średnicy 3 mm i długości 6 mm. Choć w tym przykładzie użyto pojedynczego rdzenia, w jednej reakcji można przetworzyć większe próbki o średnicy powyżej 5 mm i długości powyżej 10 mm lub od dwóch do trzech rdzeni o rozmiarze zastosowanym w tym filmie.

Należy jednak zauważyć, że mogą być wymagane korekty protokołu, aby zapewnić całkowite usunięcie parafiny i trawienie tkanki. Zanim można będzie poddać tkankę jakimkolwiek działaniom, woskowa parafina konserwująca tkankę musi zostać rozpuszczona. Osiąga się to przy użyciu ksylenu, przy czym należy pamiętać, że ksylen i fenol są toksyczne. Wszelkie prace z tymi chemikaliami powinny być prowadzone w dygestorium; należy dodać 800 µL ksylenu do probówki zawierającej próbkę.

Następnie umieść próbkę na kołysce na 10 minut, delikatnie wstrząsając. Odwiruj próbkę z prędkością 14 000 RPM przez trzy minuty, aby uzyskać osad, a następnie usuń ksylen i rozpuść parafinę z probówki. Powtórz te kroki dwa lub trzy razy, aż parafina zostanie całkowicie rozpuszczona.

Tkanka powinna być wilgotna i miękka. Aby zwiększyć końcową wydajność izolacji DNA, ważne jest usunięcie całej parafiny. W związku z tym w przypadku większych próbek tkanki wymagane jest zastosowanie większej liczby przemyć.

Po usunięciu parafiny z próbki, tkankę należy rehydratować, aby umożliwić jej trawienie. Proces ten przeprowadza się przy użyciu serii rehydratacyjnej z etanolem. Najpierw należy dodać 800 µL 100% etanolu do próbki, wymieszać ją w wstrząsarku typu vortex, a następnie wirować z prędkością 14 000 RPM przez trzy minuty.

Usunąć nadsącz. Powtórzyć te kroki, stosując 800 µL 70% etanolu, a następnie 50% etanolu. Ostatnie wirowanie powinno trwać pięć minut, ponieważ tkanka będzie mniej zwarta i wymaga większej siły w celu utworzenia osadu.

Teraz tkankę należy poddać trawieniu, aby uwolnić DNA z komórek. Odbywa się to przy użyciu buforu lizującego, który jest roztworem zawierającym denaturatory białek, takie jak SDS, oraz proteinazę K – enzym odpowiedzialny za degradację tkanki.

Do próbki należy dodać od 200 do 500 µL buforu lizującego. W zależności od wielkości próbki, optymalną objętością jest 400 µL. Oczywiście składniki buforu lizującego, a także temperatura inkubacji wynosząca 56 °C, służą maksymalizacji aktywności białka.

Ponieważ ACE K jest białkiem, może ono degradować tkankę tylko przez określony czas; aby kontynuować reakcję, należy okresowo dodawać więcej enzymu. Rano i wieczorem do próbki dodaje się 20 µL białka ACE K o stężeniu 10 mg/mL, aż tkanka zostanie całkowicie rozpuszczona.

Gdy nie widać już więcej tkanki stałej, należy wyekstrahować DNA z buforu z pozostałościami komórkowymi. Do rozdzielenia próbki na fazę wodną i organiczną stosuje się nasycony fenol. Faza wodna zawiera DNA.

Ważne jest stosowanie fenolu nasyconego buforem, ponieważ kwasowość zwykłego fenolu nie tylko degraduje DNA, ale także odwraca kolejność warstw fazy wodnej i organicznej. Należy pamiętać, że fenol nasycony buforem jest przechowywany w dwóch fazach, przy czym fenol stanowi warstwę dolną.

Do próbki dodać taką samą objętość fenolu nasyconego buforem i kilka razy odwrócić probówkę. Następnie umieścić próbkę w wirówce i wirować z prędkością 14 000 RPM przez pięć minut, aby doprowadzić do rozdzielenia faz.

DNA i RNA będą znajdować się w górnej fazie wodnej, natomiast białka, lipidy i polisacharydy znajdują się w interfazie oraz dolnej fazie organicznej. Ostrożnie usuń warstwę wodną, nie naruszając interfazy, i przelej ją do nowej probówki. Często po pierwszym wirowaniu interfaza jest luźna i może powrócić.

Wymagane jest przeprowadzenie ekstrakcji z użyciem małych objętości wody. Protokół ponownych ekstrakcji znajduje się w tekście towarzyszącym temu filmowi. Należy powtarzać te kroki do momentu, aż faza międzyfazowa stanie się przejrzysta, co zazwyczaj udaje się osiągnąć po trzech do pięciu powtórzeniach; proces ten rozpoczyna się poprzez dodanie do próbki DNA równiej objętości fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego.

Służy to temu samemu celowi, co zastosowanie samego fenolu, ale wyostrza granicę faz, aby zmaksymalizować wydajność uzyskiwanego DNA. Powtarzaj tę procedurę raz lub dwa razy, aż granica faz stanie się wyraźna i ostra. Teraz, gdy próbka jest wolna od białek, należy usunąć wszelkie zanieczyszczenia RNA.

Osiąga się to za pomocą RNAaz. Do próbki dodaje się RNAazę A do stężenia końcowego 100 µg/ml, a następnie próbkę inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Po zdegradowaniu RNA należy usunąć enzym RNAazę A.

Procedurę oczyszczania DNA powtarza się w ten sam sposób co wcześniej. Dzięki zastosowaniu najpierw fenolu nasyconego buforem, a następnie mieszaniny fenol-chloroform-alkohol izoamylkowy, wymagana będzie mniejsza liczba etapów oczyszczania, ponieważ jedynym zanieczyszczeniem jest obecnie enzym RNA A oraz zdegradowane RNA. Teraz, gdy próbka zawiera wyłącznie DNA, należy je wytrącić z roztworu, dodając 1/10 objętości octanu sodu oraz jedną objętość izopropanolu.

Alternatywnie można dodać dwa i półtora objętości etanolu, jednak w takim przypadku wymagana będzie większa probówka. Inkubować próbkę w temperaturze -20°C przez od 30 minut do godziny lub przez całą noc, jeśli prace są prowadzone późno. Ponieważ obecnie pracuje się z DNA, należy upewnić się, że próbka pozostaje w lodzie, aby zapobiec jej degradacji.

Odwiruj próbkę z prędkością 14 000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać osad z wytrąconego DNA. Ostrożnie usuń nadsącz, uważając, aby nie zdezorganizować osadu, w celu usunięcia nadmiaru soli, które mogłyby zakłócić późniejsze eksperymenty, takie jak sekwencjonowanie. Na przykład dodaj 1 ml schłodzonego, 70% etanolu i delikatnie zresuspenduj próbkę.

Ponownie odwiruj próbkę przy 14 000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usuń nadsącz i pozostaw nadmiar etanolu do odparowania przez maksymalnie pięć minut. Ważne jest, aby nie doprowadzić do nadmiernego wysuszenia próbki.

Na koniec DNA zostaje oczyszczone i jest gotowe do resuspensji w wybranym buforze. W tym przypadku stosujemy wodę destylowaną autoklawowaną. No tak.

Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia. Po zakończeniu ekstrakcji należy ocenić jakość i ilość uzyskanego DNA. Wykonuje się to za pomocą spektrometrii, używając urządzenia NanoDrop 3000; należy ustawić typ pomiaru na kwas nukleinowy, wybrać DNA 50 jako metodę obliczeń i zainicjować instrument, używając 1,5 µL wody.

Oczyść podstawkę i wykonaj pomiar tła, używając 1,5 µL rozcieńczalnika. W tym przypadku jest to woda destylowana. Oczyść podstawkę, nanieś 1,5 µL próbki i naciśnij przycisk pomiaru. Tak. Świetnie.

W tym momencie idealny jest stosunek A260/A280 wynoszący 1,8. DNA jest gotowe do zastosowań w dalszych analizach, które obejmują między innymi: analizy mikromacierzy, komparatywną hybrydyzację genomiczną, immunoprecypitację zmetylowanego DNA oraz sekwencjonowanie.

Linki do tych protokołów są tutaj wyświetlone, jeśli nie są one potrzebne natychmiast. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.