Name: Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Poznaj protokół ekstrakcji DNA z próbek tkankowych zatopionych w parafinie. Metoda obejmuje odparafinowanie, rehydratację i trawienie białekazą K, zapewniając wysokiej jakości DNA do analiz genetycznych i epigenetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować członkom laboratorium Lam za ocenę i krytykę niniejszego filmu oraz artykułu. Praca ta była finansowana ze środków Canadian Institutes for Health Research.

1. Uwagi proceduralne
<ul>
 <li>Ksylen i fenol są toksycznymi chemikaliami i powinny być obsługiwane w dygestorium. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki materiału (MSDS).</li>
 <li>Ksylen rozpuszcza niektóre rodzaje tworzyw sztucznych; należy stosować probówki polipropylenowe, ponieważ są one odporne na te związki.</li>
 <li>Można zakupić specjalne końcówki z wewnętrznym korkiem węglowym, co zapobiega rozpuszczaniu przez ksylen gumowych elementów pipety. Alternatywnie można stosować końcówki z filtrem.</li>
</ul>
2. Usuwanie parafiny
<ol>
 <li>W dygestorium dodaj 800 μl ksylenu (VWR, CABDH6216-4) do oznakowanej probówki zawierającej preparat, a następnie umieść ją na wytrząsarku z delikatnym mieszaniem przez 5 do 15 minut, aby rozpuścić parafinę.</li>
 <li>Odwirować próbkę z maksymalną prędkością (14 000 rpm lub 16 000 x g) w mikrocentry fudze przez 3 minuty. Ostrożnie odessać nadsącz z ksylenu i przelać go do probówki z polipropylenu przeznaczonej do utylizacji odpadów ksylenowych. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.</li>
 <li>Powtarzać kroki 1 i 2 płukania ksylenem do czasu całkowitego rozpuszczenia parafiny. Zazwyczaj wymaga to od dwóch do trzech płukań, w zależności od wielkości próbki tkanki. Całkowicie rozpuszczona próbka będzie wydawać się miękka i czasami może stracić spójność strukturalną. Spójność próbki można delikatnie ocenić za pomocą końcówki pipety.</li>
</ol>
3. Rehydratacja w etanolu
<ol>
 <li>Dodać 800 μl 100% etanolu (v/v) klasy biologii molekularnej, wymieszać w wortexie, a następnie wirować przez 3 minuty przy 14 000 rpm w mikrowirowce. Usunąć znad osadu nadkład etanolowy, uważając, aby nie naruszyć osadu.</li>
 <li>Dodać 800 μl 70% etanolu (etanol 100% (v/v) rozcieńczony w wodzie destylowanej (dH2O)), wymieszać w wortexie i wirować przez 3 minuty przy 14 000 rpm. Ostrożnie usunąć nadkład etanolowy.</li>
 <li>Dodać 800 μl 50% etanolu (etanol 100% (v/v) rozcieńczony w wodzie destylowanej (dH2O)), wymieszać w wortexie i wirować przez 5 minut przy 14 000 rpm. Ostrożnie usunąć za pomocą pipety tak dużo etanolu, jak to możliwe. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie naruszyć osadu na tym etapie, ponieważ w pełni rehydratowana tkanka nie osadza się tak dobrze jak tkanka odwodniona.</li>
 <li>Po usunięciu nadkładu etanolowego suszyć osad na powietrzu przez 5 minut, uważając, aby go nie przesuszyć.</li>
</ol>
4. Trawienie tkanek
<ol>
 <li>Dodaj 200-500 μl buforu do lizy (wg poniższego składu). Resuspenduj osad za pomocą końcówki pipety lub wstrząsarki wortex. Dokładne resuspendowanie tkanki na tym etapie zapewni pełniejszą digestię próbki i lepszą wydajność izolacji DNA.</li>
 <li>Inkubuj próbki w temperaturze 56°C w łaźni wodnej lub bloku grzejnym.</li>
 <li>W przypadku rdzeni tkankowych, rano i wieczorem dodaj 20 μl proteinazy K (roztwór stokowy 20 mg/ml, Invitrogen, AM2548).</li>
 <li>Powtarzaj powyższe etapy digestii przez 2 do 5 dni, aż tkanka zostanie całkowicie rozpuszczona.</li>
</ol>
Bufor do lizy<ul>
<li> 10 mM Tris-HCl pH 8.0</li>
<li> 100 mM EDTA pH 8.0</li>
<li> 50 mM NaCl</li>
<li> 0.5% SDS</li>
<li> 200 μg/ml proteinazy K (dodać bezpośrednio przed użyciem)</li>
</ul>
5. Oczyszczanie DNA
<ol>
 <li>Dodaj taką samą objętość fenolu nasyconego buforem (Fisher, BP1750I-400) i wymieszaj przez odwracanie. Wiruj przez co najmniej 5 minut przy 14 000 rpm w mikrocentry fudze.</li>
 <li>Przenieś warstwę wodną do nowej probówki. Zwróć uwagę na interfazę: czy znajduje się tam dużo białego materiału?</li>
 <li>Powtarzaj kroki 1 i 2 w odniesieniu do frakcji wodnej, aż interfaza stanie się przejrzysta (zazwyczaj 3 lub więcej razy). Przeprowadź ekstrakcje powrotne*, gdy interfaza jest rozmyta, aby zwiększyć końcową wydajność.</li>
 <li>Gdy interfaza będzie przejrzysta, dodaj do wyekstrahowanej frakcji wodnej próbki taką samą objętość mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400). Mieszaj przez 5 minut, a następnie wiruj przez 5 minut przy 14 000 rpm. Pozwala to zredukować pozostałości fenolu i dodatkowo wyostrzyć interfazę, ułatwiając wydzielenie warstwy wodnej.</li>
 <li>Przenieś warstwę wodną do nowej probówki i potraktuj RNazą A w stężeniu 100 μg/ml przez 1 godzinę w 37°C.</li>
 <li>Powtórz kroki od 1 do 4, aby usunąć pozostałą RNazę A i zebrać frakcję wodną. Powinno wystarczyć 1 lub 2 etapy z użyciem fenolu nasyconego buforem, ponieważ ilość białka do usunięcia powinna być znacznie mniejsza niż w początkowym lizacie.</li>
</ol>
*Aby przeprowadzić ekstrakcje zwrotne, należy dodać 50-100 μl dH20 do probówki z próbką zawierającej interfazę i frakcję organiczną. Odwrócić probówkę w celu wymieszania, a następnie wirować próbkę w mikrocentryfudze przy 14 000 rpm przez 5 minut. Zebrać fazę wodną i dodać ją do wcześniej uzyskanej ekstrakcji wodnej. Kontynuować ekstrakcje zwrotne do momentu, aż interfaza stanie się przejrzysta.
6. Wytrącanie DNA
<ol>
 <li>Oszacuj objętość zebranej warstwy wodnej.</li>
 <li>Dodaj 1/10 objętości octanu sodu 3 M o pH 5.2 oraz 1 objętość 100% izopropanolu (v/v) klasy do biologii molekularnej (lub 2,5 objętości 100% etanolu).</li>
 <li>Dokładnie wymieszaj i pozostaw na lodzie lub w zamrażarce w temperaturze -20°C na 30 minut lub przez noc.</li>
 <li>Wiruj z maksymalną prędkością (14 000 rpm) w temperaturze 4°C w mikrowirówce przez 10 minut.</li>
 <li>Odlej nadsącz.</li>
 <li>Przemyj osad lodowatym 70% etanolem, aby usunąć niepożądane sole.</li>
 <li>Resuspenduj osad w wybranym buforze (zazwyczaj dH2O).</li>
</ol>
7. Oznaczenie ilości DNA
<ol>
 <li>Oznacz stężenie DNA. Stosunek A260:A280 powinien wynosić około 1,8. W przypadku niewielkich ilości DNA zaleca się pomiar przy użyciu spektrofotometru NanoDrop.</li>
 <li>Po oznaczeniu stężenia należy przeprowadzić elektroforezę w żelu, aby sprawdzić jakość próbki DNA i ustalić, czy zanieczyszczający RNA został całkowicie zdegradowany.</li>
 <li>Wyekstrahowane DNA wysokiej jakości nadaje się teraz do dalszych zastosowań lub może być przechowywane w temperaturze -20°C do późniejszego użycia. Jeśli w próbce wciąż obecny jest RNA, należy powtórzyć etapy oczyszczania i wytrącania DNA, a następnie ponownie oznaczyć stężenie i sprawdzić jakość próbek.</li>
</ol>

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Tkanki pobrane podczas biopsji lub usunięte chirurgicznie w celu analizy histopatologicznej i diagnostyki są często utrwalane w formalinie i zalewane parapiną (FFPE) w celu długoterminowego przechowywania. W obliczu rosnącego zainteresowania zrozumieniem genetycznych podstaw chorób, możliwość izolacji DNA z tych próbek stanowi niezwykle cenne źródło materiału diagnostycznego, który może zostać wykorzystany w analizach genomicznych i badaniach translacyjnych. Historycznie próbki FFPE nie były uważane za przydatne źródło do analiz molekularnych, ponieważ kwasy nukleinowe mogą ulec silnym modyfikacjom w wyniku tworzenia wiązań krzyżowych białko-kwas nukleinowy oraz białko-białko6. Jednak odkrycie, że trawienie proteazą uwalnia pofragmentowane kwasy nukleinowe, które nadają się do dalszych analiz, w tym PCR, array CGH, sekwencjonowania i profilowania metylacji, umożliwia wykorzystanie tych cennych okazów do analiz genetycznych 6.
Ekstrakcja DNA z tkanek zatopionych w parafinie jest niezawodną procedurą, która opiera się na różnicach w rozpuszczalności w celu oczyszczenia DNA. Jakość i ilość wyekstrahowanego DNA oraz sukces późniejszej amplifikacji DNA zależą od szeregu parametrów przed, w trakcie i po ekstrakcji. Obejmują one między innymi: rodzaj i ilość tkanki, typ utrwalacza użytego do konserwacji tkanki, czas utrwalania, wiek bloku parafinowego i warunki przechowywania, a także długość pożądanego fragmentu DNA do amplifikacji 1,7. Usunięcie parafiny z tkanki jest najważniejszym etapem skutecznej ekstrakcji, ponieważ nierozpuszczona parafina prowadzi do niskiej jakości próbki i inhibicji amplifikacji PCR.

<table><tbody><tr><td>Ksylen</td><td>VWR international</td><td>CABDH6216- 4</td><td>-</td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi SafeSeal 1,7 ml</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td>-</td></tr><tr><td>Mikrocentryfuga Spectrafuge 16M</td><td>Labnet International</td><td>C0160-B</td><td>-</td></tr><tr><td>Bufor do lizy</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl pH 8,&lt;br/&gt;100 mM EDTA pH 8,&lt;br/&gt;50 mM NaCl,&lt;br/&gt;0,5% SDS,&lt;br/&gt;200 &amp;#x03BC;g/ml Proteinazy K</td></tr><tr><td>Roztwór zapasowy Proteinazy K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2548</td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>Roztwór zapasowy Proteinazy K</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buforowany fenol nasycony pH 6,6/7,9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1750I-400</td><td>-</td></tr><tr><td>Fenol: chloroform: alkohol izoamylowy (25:24:1, pH 6,7/8,0)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1752I-400</td><td>-</td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Roche Group</td><td>10109169001</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>3M octan sodu pH 5,2</td><td></td><td></td><td>40,81 g NaOAc w 80 ml&lt;br/&gt;Dostosować pH do 5,2 za pomocą kwasu octowego lodowatego&lt;br/&gt;Dopełnić dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O do 100 ml&lt;br/&gt;Autoklawować</td></tr><tr><td>Spektrofotometr ND 3300</td><td>NanoDrop</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja dna z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Rozwój i progresja chorób charakteryzują się częstymi aberracjami genetycznymi i epigenetycznymi, w tym rearanżacjami chromosomowymi, przyrostami i ubytkami liczby kopii oraz metylacją DNA. Postępy w technologiach wysokoprzepustowego profilowania całego genomu, takich jak mikromacierze, znacząco poprawiły naszą zdolność do identyfikacji i wykrywania tych specyficznych zmian. Jednak wraz z dalszym rozwojem technologii, ograniczającym czynnikiem pozostaje jakość i dostępność próbek. Co więcej, informacje kliniczne oraz dane o przebiegu choroby są często zbierane lata po pierwotnym pobraniu materiału. Próbki, zazwyczaj utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE), są przechowywane w archiwach szpitalnych przez lata lub dziesięciolecia. DNA można wydajnie i skutecznie odzyskać z próbek zatopionych w parafinie, jeśli zastosuje się odpowiednią metodę ekstrakcji. Wysokiej jakości DNA wyekstrahowane z prawidłowo zakonserwowanych i przechowywanych próbek może stanowić podstawę do ilościowych analiz porównawczych tkanek zdrowych i chorych oraz generowania sygnatur genetycznych i epigenetycznych 1. Aby wyekstrahować DNA z próbek zatopionych w parafinie, rdzenie tkankowe lub tkanki mikroprzesezonowane poddaje się działaniu ksylenu, który rozpuszcza parafinę z tkanki, a następnie rehydratuje za pomocą serii przemyć etanolem. Białka oraz szkodliwe enzymy, takie jak nukleazy, są następnie trawione przez proteinazę K. Dodatek buforu lizującego, który zawiera środki denaturujące, takie jak dodecyla siarczan sodu (SDS), ułatwia trawienie 2. Kwasy nukleinowe są oczyszczane z lizatu tkankowego przy użyciu nasyconego buforem fenolu i wirowania przy wysokiej prędkości, co prowadzi do powstania roztworu dwufazowego. DNA i RNA pozostają w górnej fazie wodnej, podczas gdy białka, lipidy i polisacharydy są wydzielane odpowiednio do fazy międzyfazowej i organicznej. Pozyskanie fazy wodnej i powtarzane ekstrakcje fenolem pozwalają uzyskać czystą próbkę. Po ekstrakcjach fenolem dodaje się RNazę A w celu usunięcia zanieczyszczeń w postaci RNA. Dodatkowe ekstrakcje fenolem po inkubacji z RNazą A służą do usunięcia pozostałego enzymu. Dodatek octanu sodu i izopropanolu powoduje precypitację DNA, a wirowanie przy wysokiej prędkości jest wykorzystywane do sformowania granulatu DNA i ułatwienia usunięcia izopropanolu. Nadmiar soli przeniesiony z etapu precypitacji może zakłócać późniejsze analizy enzymatyczne, ale można go usunąć z DNA poprzez przemycie 70% etanolem, a następnie wirowanie w celu ponownego sformowania granulatu DNA 3. DNA jest resuspendowane w wodzie destylowanej lub wybranym buforze, kwantyfikowane i przechowywane w temperaturze -20°C. Oczyszczone DNA może być następnie wykorzystane w dalszych zastosowaniach, które obejmują, między innymi, PCR, komparatywną hybrydyzację genomową na mikromacierzach 4 (array CGH), immunoprecypitację zmetylowanego DNA (MeDIP) oraz sekwencjonowanie, co umożliwia integracyjną analizę próbek tkanek/guzów.

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół ekstrakcji DNA z materiału utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie. Jest to procedura wielodniowa, w ramach której skrawki tkanek są deparafinowane ksylenem, rehydratowane etanolem i traktowane proteinazą K w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA do późniejszej analizy genowo-specyficznej lub całego genomu.

Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Rozwój i progresja choroby charakteryzują się częstymi aberracjami genetycznymi i epigenetycznymi, w tym rearanżacjami chromosomalnymi, zmianami liczby kopii...

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób ekstrakcji DNA z próbek tkanek zatopionych w parafinie. Próbka wykorzystana w tej demonstracji to rdzeń tkankowy o średnicy 3 mm i długości 6 mm. Choć w tym przykładzie użyto pojedynczego rdzenia, w jednej reakcji można przetworzyć większe próbki o średnicy powyżej 5 mm i długości powyżej 10 mm lub od dwóch do trzech rdzeni o rozmiarze zastosowanym w tym filmie.Należy jednak zauważyć, że mogą być wymagane korekty protokołu, aby zapewnić całkowite usunięcie parafiny i trawienie tkanki. Zanim można będzie poddać tkankę jakimkolwiek działaniom, woskowa parafina konserwująca tkankę musi zostać rozpuszczona. Osiąga się to przy użyciu ksylenu, przy czym należy pamiętać, że ksylen i fenol są toksyczne. Wszelkie prace z tymi chemikaliami powinny być prowadzone w dygestorium; należy dodać 800 µL ksylenu do probówki zawierającej próbkę.Następnie umieść próbkę na kołysce na 10 minut, delikatnie wstrząsając. Odwiruj próbkę z prędkością 14 000 RPM przez trzy minuty, aby uzyskać osad, a następnie usuń ksylen i rozpuść parafinę z probówki. Powtórz te kroki dwa lub trzy razy, aż parafina zostanie całkowicie rozpuszczona.Tkanka powinna być wilgotna i miękka. Aby zwiększyć końcową wydajność izolacji DNA, ważne jest usunięcie całej parafiny. W związku z tym w przypadku większych próbek tkanki wymagane jest zastosowanie większej liczby przemyć.Po usunięciu parafiny z próbki, tkankę należy rehydratować, aby umożliwić jej trawienie. Proces ten przeprowadza się przy użyciu serii rehydratacyjnej z etanolem. Najpierw należy dodać 800 µL 100% etanolu do próbki, wymieszać ją w wstrząsarku typu vortex, a następnie wirować z prędkością 14 000 RPM przez trzy minuty.Usunąć nadsącz. Powtórzyć te kroki, stosując 800 µL 70% etanolu, a następnie 50% etanolu. Ostatnie wirowanie powinno trwać pięć minut, ponieważ tkanka będzie mniej zwarta i wymaga większej siły w celu utworzenia osadu.Teraz tkankę należy poddać trawieniu, aby uwolnić DNA z komórek. Odbywa się to przy użyciu buforu lizującego, który jest roztworem zawierającym denaturatory białek, takie jak SDS, oraz proteinazę K – enzym odpowiedzialny za degradację tkanki.Do próbki należy dodać od 200 do 500 µL buforu lizującego. W zależności od wielkości próbki, optymalną objętością jest 400 µL. Oczywiście składniki buforu lizującego, a także temperatura inkubacji wynosząca 56 °C, służą maksymalizacji aktywności białka.Ponieważ ACE K jest białkiem, może ono degradować tkankę tylko przez określony czas; aby kontynuować reakcję, należy okresowo dodawać więcej enzymu. Rano i wieczorem do próbki dodaje się 20 µL białka ACE K o stężeniu 10 mg/mL, aż tkanka zostanie całkowicie rozpuszczona.Gdy nie widać już więcej tkanki stałej, należy wyekstrahować DNA z buforu z pozostałościami komórkowymi. Do rozdzielenia próbki na fazę wodną i organiczną stosuje się nasycony fenol. Faza wodna zawiera DNA.Ważne jest stosowanie fenolu nasyconego buforem, ponieważ kwasowość zwykłego fenolu nie tylko degraduje DNA, ale także odwraca kolejność warstw fazy wodnej i organicznej. Należy pamiętać, że fenol nasycony buforem jest przechowywany w dwóch fazach, przy czym fenol stanowi warstwę dolną.Do próbki dodać taką samą objętość fenolu nasyconego buforem i kilka razy odwrócić probówkę. Następnie umieścić próbkę w wirówce i wirować z prędkością 14 000 RPM przez pięć minut, aby doprowadzić do rozdzielenia faz.DNA i RNA będą znajdować się w górnej fazie wodnej, natomiast białka, lipidy i polisacharydy znajdują się w interfazie oraz dolnej fazie organicznej. Ostrożnie usuń warstwę wodną, nie naruszając interfazy, i przelej ją do nowej probówki. Często po pierwszym wirowaniu interfaza jest luźna i może powrócić.Wymagane jest przeprowadzenie ekstrakcji z użyciem małych objętości wody. Protokół ponownych ekstrakcji znajduje się w tekście towarzyszącym temu filmowi. Należy powtarzać te kroki do momentu, aż faza międzyfazowa stanie się przejrzysta, co zazwyczaj udaje się osiągnąć po trzech do pięciu powtórzeniach; proces ten rozpoczyna się poprzez dodanie do próbki DNA równiej objętości fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego.Służy to temu samemu celowi, co zastosowanie samego fenolu, ale wyostrza granicę faz, aby zmaksymalizować wydajność uzyskiwanego DNA. Powtarzaj tę procedurę raz lub dwa razy, aż granica faz stanie się wyraźna i ostra. Teraz, gdy próbka jest wolna od białek, należy usunąć wszelkie zanieczyszczenia RNA.Osiąga się to za pomocą RNAaz. Do próbki dodaje się RNAazę A do stężenia końcowego 100 µg/ml, a następnie próbkę inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Po zdegradowaniu RNA należy usunąć enzym RNAazę A.Procedurę oczyszczania DNA powtarza się w ten sam sposób co wcześniej. Dzięki zastosowaniu najpierw fenolu nasyconego buforem, a następnie mieszaniny fenol-chloroform-alkohol izoamylkowy, wymagana będzie mniejsza liczba etapów oczyszczania, ponieważ jedynym zanieczyszczeniem jest obecnie enzym RNA A oraz zdegradowane RNA. Teraz, gdy próbka zawiera wyłącznie DNA, należy je wytrącić z roztworu, dodając 1/10 objętości octanu sodu oraz jedną objętość izopropanolu.Alternatywnie można dodać dwa i półtora objętości etanolu, jednak w takim przypadku wymagana będzie większa probówka. Inkubować próbkę w temperaturze -20°C przez od 30 minut do godziny lub przez całą noc, jeśli prace są prowadzone późno. Ponieważ obecnie pracuje się z DNA, należy upewnić się, że próbka pozostaje w lodzie, aby zapobiec jej degradacji.Odwiruj próbkę z prędkością 14 000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać osad z wytrąconego DNA. Ostrożnie usuń nadsącz, uważając, aby nie zdezorganizować osadu, w celu usunięcia nadmiaru soli, które mogłyby zakłócić późniejsze eksperymenty, takie jak sekwencjonowanie. Na przykład dodaj 1 ml schłodzonego, 70% etanolu i delikatnie zresuspenduj próbkę.Ponownie odwiruj próbkę przy 14 000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usuń nadsącz i pozostaw nadmiar etanolu do odparowania przez maksymalnie pięć minut. Ważne jest, aby nie doprowadzić do nadmiernego wysuszenia próbki.Na koniec DNA zostaje oczyszczone i jest gotowe do resuspensji w wybranym buforze. W tym przypadku stosujemy wodę destylowaną autoklawowaną. No tak.Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia. Po zakończeniu ekstrakcji należy ocenić jakość i ilość uzyskanego DNA. Wykonuje się to za pomocą spektrometrii, używając urządzenia NanoDrop 3000; należy ustawić typ pomiaru na kwas nukleinowy, wybrać DNA 50 jako metodę obliczeń i zainicjować instrument, używając 1,5 µL wody.Oczyść podstawkę i wykonaj pomiar tła, używając 1,5 µL rozcieńczalnika. W tym przypadku jest to woda destylowana. Oczyść podstawkę, nanieś 1,5 µL próbki i naciśnij przycisk pomiaru. Tak. Świetnie.W tym momencie idealny jest stosunek A260/A280 wynoszący 1,8. DNA jest gotowe do zastosowań w dalszych analizach, które obejmują między innymi: analizy mikromacierzy, komparatywną hybrydyzację genomiczną, immunoprecypitację zmetylowanego DNA oraz sekwencjonowanie.Linki do tych protokołów są tutaj wyświetlone, jeśli nie są one potrzebne natychmiast. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

dna-extraction-from-paraffin-embedded-material-for-genetic-epigenetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ekstrakcja DNA z materiału osadzonych w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Ten film przedstawia protokół immunoprecypitacji zmetylowanego DNA (MeDIP). MeDIP jest dwudniową procedurą, która pozwala na selektywne wyodrębnienie zmetylowanych fragmentów DNA z próbki genomowego DNA przy użyciu przeciwciał specyficznych dla 5-metylocytozyny (anti-5 mC).

Immunoprecypitacja zmetylowanego DNA

W tym filmie pokazujemy przetwarzanie FFPE lub utrwalonych formaliną skrawków zatopionych w parafinie, uzyskanych z tkanki nowotworowej przewodu pokarmowego. Etapy deparafinowania i ponownego uwodnienia umożliwiają przetworzenie próbki tkanki do kolejnych zastosowań analitycznych.

Deparafinizacja i ponowne uwodnienie skrawków tkanek: dwuetapowa procedura usuwania wosku parafinowego z preparatów tkankowych FFPE, a następnie ponowne uwodnienie tkanek

Kriosfera oferuje dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w poprzednich warunkach środowiskowych. Przedstawiono protokół zbierania i odkażania rdzeni wiecznej zmarzliny gleb i lodu. Brak egzogennych kolonii i DNA sugeruje, że wykryte mikroorganizmy reprezentują materiał, a nie zanieczyszczenie pochodzące z wiercenia lub przetwarzania.

Usuwanie materiałów egzogenicznych z zewnętrznej części zamrożonych rdzeni w celu zbadania starożytnych zbiorowisk biologicznych znajdujących się w środku

Ten zmodyfikowany protokół ekstrakcji poprawia wydajność RNA i DNA z bardziej precyzyjnie wybranych obszarów zainteresowania w histopatologicznych blokach tkankowych.

Przygotowanie utrwalonych w formalinie rdzeni tkankowych zatopionych w parafinie do ekstrakcji RNA i DNA

Ten protokół zawiera przegląd procedur izolacji RNA do transkryptomicznego profilowania tkanek węzłów chłonnych od dużych zwierząt, w tym etapy identyfikacji i wycinania węzłów chłonnych od zwierząt gospodarskich i dzikich, podejścia do pobierania próbek w celu zapewnienia spójności wśród wielu zwierząt, oraz rozważania oraz reprezentatywne wyniki dotyczące konserwacji i przetwarzania po pobraniu do analizy RNA.

Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt

Pieprzyki bąblowce to nieprawidłowe ciąże ludzkie o niejednorodnej etiologii, które można sklasyfikować według ich cech morfologicznych i wkładu rodziców w genomy trzonowców. W tym miejscu szczegółowo opisano protokoły multipleksowego mikrosatelitarnego genotypowania DNA i cytometrii przepływowej tkanek trzonowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie, wraz z interpretacją i integracją wyników.

Genotypowanie DNA mikrosatelitarnego i cytometria przepływowa Analizy ploidalne tkanek trzonowców bąblowcowych utrwalonych w formalinie

Ten protokół przedstawia metodę zwiększania procentowej zawartości guza w próbkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie.

Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza

Obecny protokół opisuje metodę pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych przy użyciu pojedynczej komórki wielokrotnego użytku. Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku umożliwia analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i statystyczną walidację wyników.

Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

Poznaj protokół ekstrakcji DNA z próbek tkankowych zatopionych w parafinie. Metoda obejmuje odparafinowanie, rehydratację i trawienie białekazą K, zapewniając wysokiej jakości DNA do analiz genetycznych i epigenetycznych.

Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Przeglądaj więcej filmów