Infekcja Trichuris muris: Model odporności typu 2 i stanu zapalnego w jelitach

Ogólnym celem tej procedury jest ustanowienie i utrzymanie naturalnego modelu zakażenia H. dubia. Najpierw myszy zostają zakażone jajami H. dubia poprzez zgłębnik żołądkowy. Po 21 dniach zakażone zwierzęta są uśmiercane, a następnie pobiera się krew, węzły chłonne krezkowe, pellety kałowe, okrężnice oraz śledziony.

Wykorzystując te próbki, można przeanalizować odpowiedź immunologiczną wygenerowaną przeciwko lustrom trików. Próbki surowicy można poddać analizie metodą ELISA w celu wykrycia przeciwciał specyficznych dla TRA.

W celu analizy odpowiedzi immunologicznej komórek można przeprowadzić restymulację komórek węzłów chłonnych in vitro. Do oceny zawartości białek można wykorzystać pellety kałowe poddane analizie Western blot, natomiast analizę ekspresji genów można przeprowadzić za pomocą analizy QPCR tkanek okrężnicy. Na koniec, wierzchołek kąbnicy może zostać wykorzystany do badań histologicznych, podczas gdy pozostała część kąbnicy może służyć do określenia liczby pasożytów u zakażonych myszy.

W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące, czy mysz jest oporna lub podatna na zakażenie Trauss MOUs, a także scharakteryzować odpowiedź immunologiczną wywołaną przeciwko pasożytowi. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak to, jakie czynniki kontrolują aktywację komórek T pomocniczych, a także jakie białka są wymagane do różnicowania komórek TH2. Jaja Trauss MOUs można namnażać w myszach z niedoborem odporności lub w szczepach genetycznie podatnych, takich jak KR, a 35 dni po zakażeniu można pobrać jaja z uśpionych myszy.

Odsłoń powierzchnię brzuszną zwierzęcia i przemyj brzuch myszy etanolem, używając sterylnej pęsety i nożyczek. Chwyć skórę brzucha i wykonaj niewielkie nacięcie. Odsłoń zawartość jamy brzusznej, zidentyfikuj kątnicę oraz proksymalną część okrężnicy, a następnie usuń je.

Przenieś organy do 10-centymetrowej szalki Petriego zawierającej DMEM uzupełniony o penicylinę i streptomycynę. Następnie, używając pęsety, rozetnij ślepkę i początkowy odcinek okrężnicy, odsłaniając światło jelita oraz nicienie. Umieść rozcięte organy w zlewce z PBS i delikatnie wstrząśnij, aby wypłukać kał.

Po wypłukaniu kątnicy przenieś ją do czystej szalki Petriego i za pomocą gładkich pęset zakrzywionych delikatnie wyjmij nicienie. Przenieś wszystkie nicienie z każdej myszy do jednego dołka płytki 6-dołkowej zawierającej 5 mL DMEM z dodatkiem antybiotyków. Umieść płytkę 6-dołkową wraz z wilgotnym ręcznikiem papierowym w pojemniku typu Tupperware i inkubuj w temperaturze 37 °C przez cztery godziny, aby umożliwić nicieniom zniesienie jaj.

Po tej inkubacji należy za pomocą pęsety wyjąć nicienie z pierwotnego dołka i przenieść je do dwóch nowych dołków zawierających DMEM. Podział nicieni w ten sposób pozwoli zmaksymalizować odzysk jaj za pomocą pipety. Pozostałe medium zawierające wydzielony antygen i jaja należy zebrać z pierwotnego dołka i przenieść do probówki Falcon o pojemności 15 ml.

Odwiruj probówkę przy 3000 RPM przez pięć minut. Następnie oddziel i zachowaj nadsącz zawierający antygen czterogodzinny, a pellet zawarty w probówce przemyj wodą sterylną. Ponownie umieść płytkę 6-dołkową z nicieniami w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj ją przez noc do następnego ranka.

Po usunięciu nicieni, zbierz zawartość dołków zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami i odwiruj nadsącz, aby wyizolować jaja. Zachowaj nadsącz zawierający antygen z inkubacji nocnej i resuspenduj jaja w wodzie. Następnie połącz te jaja z jajami uzyskanymi z czterogodzinnej inkubacji.

Przefiltruj jaja przez sito o oczkach 70 micron, aby usunąć pozostałości robaków. Następnie przenieś je do kolby o przekroju 75 centymetrów kwadratowych. Owiń kolbę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i przechowuj jaja przez sześć tygodni w temperaturze pokojowej.

Pozwoli to na dojrzewanie jaj i rozwój embrionów po sześciu tygodniach. Należy przemyć jaja, odlać wodę i policzyć żywe jaja. Przedstawiono to tutaj.

Jako przykład żywego jaja z zarodkiem oraz jaja niezdolnego do rozwoju, Reese's wygina koncentrację Exeter w stosunku 50 na 50 µL. Na tym etapie jaja można przechowywać w temperaturze 4 °C przed zakażeniem myszy. Należy upewnić się, że roztwór zawierający jaja został dokładnie wymieszany.

Przenieś pożądaną ilość inokulum do probówki z zakrętką typu snap o pojemności 14 ml i odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość. Pobierz 200 µl jaj do igły do karmienia o rozmiarze odpowiednim dla wielkości zwierzęcia, dopasowanej do strzykawki o pojemności 1 ml. Chwyć mysz za kark i podaj jaja poprzez zgłębnik do wymuszonego podawania doustnego.

Zwróć zainfekowaną mysz do klatki i pozwól na rozwój infekcji przez 21 dni. Po 21 dniach użyj nieheparynowanej strzykawki, aby pobrać krew z zainfekowanych myszy poprzez punkcję serca. Po uśpieniu zwierząt dwutlenkiem węgla próbki krwi można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Do izolacji surowicy i analizy swoistych przeciwciał IgG i IgE za pomocą metody ELISA. Odsłoń jamę brzuszną myszy zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie za pomocą pęsety wyciągnij kątnicę, posiłkując się nożyczkami lub drugą pęsetą.

Przesuń jelito cienkie w prawo, odsłaniając węzły chłonne krezkowe. Ostrożnie usuń węzły chłonne, uważając, aby nie przeciąć jelit, i umieść je w probówce Falcon o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml pożywki. Komórki węzłów chłonnych można później hodować in vitro z czterogodzinnym nadsączem antygenu S z kultur nicieni, aby przeanalizować komórkową odpowiedź immunologiczną na pasożyta.

Po pobraniu węzłów chłonnych, wyciąć kątnicę oraz okrężnicę zgodnie z wcześniejszym opisem. Używając pęsety, usunąć grudki kału z dystalnej części okrężnicy, umieszczając je w probówce tlenowej o pojemności 2 mL. Grudki można przechowywać w temperaturze -20 °C i analizować pod kątem zawartości białek metodą western blot. Za pomocą nożyczek odciąć około 1 cm proksymalnej części okrężnicy i umieścić w probówce zawierającej RNA. Następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.

Odciąć około pięciu milimetrów z końcówki kątnicy, trzymając ją pęsetą. Za pomocą strzykawki o pojemności trzech mililitrów i igły 22 G przepłukać próbkę roztworem PBS. Następnie przenieść ją do probówki typu snap cap o pojemności pięciu mililitrów zawierającej 4% paraldehydu.

Utrwaloną paraldehydem próbkę kątnicy można przechowywać w temperaturze 4°C i wykorzystać do analizy histologicznej. Pozostałą część kątnicy należy umieścić w szalce Petriego i zamrozić w temperaturze -20°C w celu uśmiercenia nicieni. Aby ułatwić ich liczenie, należy rozmrozić kątnicę, a następnie za pomocą nożyczek przenieść ją do szalki Petriego zawierającej około 5 mL wody.

Rozciąć kątnicę, aby odsłonić światło jelita, a następnie potrząsnąć, aby zebrać kał do naczynia. Umieścić oczyszczoną kątnicę w nowej płytce Petri zawierającej wodę i za pomocą gładkich zakrzywionych pęsety zeskrobać komórki nabłonka jelitowego. Przenieść kątnicę do nowej płytki Petri z wodą i rozdrzeć tkankę na małe kawałki.

Każdy obserwuje odchody, komórki nabłonka jelitowego oraz tkankę kątnicy pod mikroskopem stereoskopowym i zlicza nicienie, usuwając je w trakcie liczenia i przenosząc do nowej szalki. Tutaj pokazano, jak powinny wyglądać nicienie w kątnicy przed i po izolacji. W następstwie infekcji zwierzęta z grupy black six są w stanie kontrolować pasożyty, podczas gdy myszy KR wykazują zwiększone obciążenie pasożytami.

Podobnie podatne myszy AKR wykazują znacznie wyższe miana przeciwciał IgG specyficznych dla TRA niż myszy C57BL/6, co ustalono za pomocą testu ELISA z surowicy. W tym eksperymencie analiza Western blot wykazała, że ilość białka RelMβ specyficznego dla komórek kubkowych wzrosła w kale myszy C57BL/6, ale nie w kale myszy AKR po zakażeniu. Analiza histologiczna końcowego odcinka kątnicy wykazuje hiperplazję komórek kubkowych i produkcję śluzu u odpornych myszy TRA i C57BL/6, ale nie u podatnych myszy AKR.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak propagować jaja trismus, zakażać myszy doświadczalne oraz pobierać tkanki jelitowe, krezkę, węzły chłonne jelit oraz krew w celu analizy infekcji u myszy podatnych lub opornych.