Name: Multipleksowy PCR i test hybrydyzacji z odwróconą linią blot (mPCR/RLB) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj metodę mPCR/RLB do jednoczesnego wykrywania wielu patogenów z próbek klinicznych. Ta technika hybrydyzacji z odwróconą linią blot oferuje wysoką przepustowość, czułość i specyficzność przy niskich kosztach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Matthew O'Sullivan i Fei Zhou są laureatami stypendiów badawczych dla doktorantów medycyny przyznawanych przez Australian National Health and Medical Research Council.

Należy poświęcić szczególną uwagę projektowaniu starterów i sond. W celu zidentyfikowania konserwatywnych obszarów stanowiących odpowiednie cele, należy wykorzystać wszystkie dostępne sekwencje interesujących nas celów z baz danych, takich jak GenBank. W przypadku amplifikacji dużej liczby celów w jednym badaniu mPCR, każda amplifikowana sekwencja powinna mieć podobną długość i nie powinna przekraczać 300 par zasad, aby uniknąć konkurencji. Alternatywnym zastosowaniem tej metody jest amplifikacja jednego dłuższego celu za pomocą starterów skierowanych przeciwko regionom konserwatywnym i użycie wielu sond do identyfikacji zmienności sekwencji w obrębie amplikonu. W takim przypadku amplifikowany produkt PCR może być dłuższy. Temperatury przyłączania starterów powinny być zbliżone, a warunki PCR odpowiednio dostosowane. Należy unikać starterów, które tworzą silne struktury drugorzędowe lub dimery starterów. Do wiarygodnego przewidywania tych cech można użyć kalkulatora DNA Sigma Aldrich (<a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a>).
Sondy DNA powinny być zaprojektowane tak, aby ich temperatury hybrydyzacji były zbliżone do 60°C. W celu maksymalizacji swoistości w teście można zastosować dwie sondy dla każdego docelowego sekwencji: jedną hybrydyzującą z forwardową nicią DNA w sąsiedztwie miejsca wiązania primera reverse, a drugą z nicią reverse w sąsiedztwie miejsca wiązania primera forward. W takim przypadku oba primery (forward i reverse) muszą być modyfikowane biotyną. Jeśli dla każdego amplifikowanego celu stosowana jest tylko jedna sonda, modyfikacja biotyną jest wymagana tylko dla jednego primera.
Projektując startery i sondy do testu mPCR/RLB, zdecydowanie zaleca się stosowanie metod in silico do przewidywania produktów PCR oraz hybrydyzacji sond w celu korelacji z wynikami in vitro. Idealnie powinno się to przeprowadzać z wykorzystaniem izolatów, dla których dostępna jest sekwencja całego genomu. W tym celu można wykorzystać oprogramowanie takie jak FastPCR (dostępne pod adresem http://primerdigital.com/fastpcr.html). Słaby lub brak sygnału sondy można przewidzieć w przypadkach, gdy analiza in silico wskazuje na niedopasowania par zasad skutkujące niskimi temperaturami przyłączania sondy.
Techniki ekstrakcji DNA różnią się w zależności od badanych próbek, a warunki PCR zależą od projektu starterów. W celu uzyskania szerszych informacji na temat odczynników i warunków ekstrakcji DNA oraz PCR odsyłamy czytelników do publikacji dotyczących poszczególnych testów1-19.
Każdy test przeprowadza się z odpowiednimi kontrolami, aby uzyskać co najmniej jeden sygnał dodatni i jeden ujemny dla każdej sondy na membranie, a także kontrolę wolną od DNA. Ponadto korzystne jest umieszczenie na górze membrany sondy, która powinna być dodatnia dla wszystkich próbek (np. sondy specyficznej dla gatunku lub rodzaju w przypadku mikroorganizmów). Służy ona jako dodatnia sonda kontrolna, a także umożliwia łatwą orientację w wynikach.
1. Przygotowanie membrany
<ol>
<li>Przygotować następujące roztwory:
	<ul>
		<li>100ml 0.5M NaHCO3 (pH 8.4)</li>
 	<li>100 ml 0.5M NaHCO3</li>
		<li>20 ml 16% EDAC</li>
		<li>250 ml 0.1 M NaOH</li>
		<li>250 ml 2xSSPE</li>
		<li>250 ml 2xSSPE/0.1% SDS – umieścić w kąpieli wodnej w temperaturze 60°C</li>
		<li>250 ml 20 mM EDTA.</li></ul></li>
<li>Rozgrzać piekarnik do 60°C.</li>
<li>Oczyścić urządzenie Immunetics Miniblotter 70% etanolem.</li>
<li>Rozcieńczyć sondy oligonukleotydowe w 0.5 M NaHCO3 do końcowego stężenia 2 pmol/μl i objętości 200 μl.</li>
<li>Wyciąć membranę nylonową BiodyneC o wymiarach 15x15 cm. Za pomocą ołówka i linijki wyznaczyć pas o szerokości 0.5 cm w górnej części membrany i wpisać tam szczegóły.</li>
<li>Zamknąć membranę w plastikowej torebce z 20 ml świeżo przygotowanego 16% roztworu EDAC i inkubować na wytrząsalnej platformie w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
<li>Przemyć membranę wodą dejonizowaną przez 30 sekund.</li>
<li>Umieścić membranę w urządzeniu miniblotter tak, aby kanały biegły w poprzek membrany (równolegle do linii wyznaczonej ołówkiem). Włożyć podkładkę wspierającą i zamknąć urządzenie. Odessać płyn z kanałów.</li>
<li>Wypełnić ścieżki 1 i 45 150 μl 0.5 M NaHCO3. Wypełnić ścieżki 2-44 kolejno po 150 μl każdego roztworu sondy, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Jeśli w kanale pojawi się pęcherzyk powietrza, należy trzymać pipetę w miejscu i szybko odessać roztwór, aby pęcherzyk wypłynął do góry pipety, a następnie powtórzyć czynność. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
<li>Odessać roztwory sond, wyjąć membranę i przemyć w 250 ml 0.1 M NaOH w temperaturze pokojowej przez 9 minut.</li>
<li>Przemyć membranę w 250 ml 2xSSPE przez 30 sekund.</li>
<li>Przemyć membranę w 250 ml podgrzanego roztworu 2xSSPE/0.1% SDS w piekarniku w temperaturze 60°C przez 5 minut.</li>
<li>Jeśli membrana nie będzie natychmiast wykorzystana do hybrydyzacji, przemyć ją w 240 ml 20 mM EDTA w temperaturze pokojowej przez 20 minut (zachowując pozostałe 10ml), a następnie zamknąć membranę w plastikowej torebce z pozostałymi 10 ml 20 mM EDTA i przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C.</li>
<li>Umyć urządzenie miniblotter detergentem Pyroneg i szczoteczką. Opłukać i pozostawić do wyschnięcia.</li>
</ol>
2.	 Hybrydyzacja i detekcja
<ol>
<li>Przygotować następujące roztwory:
	<ul>
		<li>250 ml 2xSSPE/0,1% SDS – przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 60°C.</li> 
		<li>500 ml 2xSSPE/0,5% SDS – przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 60°C</li>
		<li>500 ml 2xSSPE/0,5% SDS – przechowywać w inkubatorze w temperaturze 42°C</li>
		<li>500 ml 2xSSPE – przechowywać w temperaturze pokojowej</li>
		<li>500 ml 1% SDS – początkowo przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 60°C (do kroku 3)</li>
		<li>250 ml 20 mM EDTA – przechowywać w temperaturze pokojowej (do kroku 3).</li>
 </ul>
</li>
<li>Włączyć jeden inkubator ustawiony na 60°C i jeden na 42°C. Zagotować wodę w dużym zlewce na płycie grzejnej.</li>
<li>Oczyścić aparat Immunetics Miniblotter 70% etanolem.</li>
<li>Odmierzyć 10 ml 2xSSPE/0,1% SDS do małego pojemnika. Do ponumerowanych probówek z 150 μl 2xSSPE/0,1% SDS dodać po 20 μl każdego produktu PCR.</li> 
<li>Gotować produkty PCR przez 10 min w temperaturze 100°C, używając uchwytów styropianowych. Natychmiast umieścić na lodzie na co najmniej 5 minut.</li>
<li>Przemyć membranę w pozostałych 240 ml 2xSSPE/0,1% SDS w inkubatorze 60°C przez 5 minut.</li>
<li>Umieścić membranę w urządzeniu miniblotter wraz z podkładką wspierającą. Uorientować ją tak, aby kanały biegły pionowo (prostopadle do linii narysowanej ołówkiem).</li>
<li>Odssać nadmiar cieczy z kanałów miniblottera.</li>
<li>Dodać pozostałe 150 μl 2xSSPE/0,1% SDS do pierwszego i ostatniego kanału. Do pozostałych kanałów (2-44) dodać sekwencyjnie przegotowane produkty PCR, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Umieścić miniblotter na płasko w inkubatorze 60°C na 1 godzinę, aby umożliwić zajście hybrydyzacji.</li>
<li>Odssać ciecz z każdego kanału, a następnie wyjąć membranę z miniblottera.</li>
<li>Przemyć dwukrotnie w podgrzanym roztworze 250 ml 2xSSPE/0,5% SDS w inkubatorze 60°C przez 10 minut.</li>
<li>Zwilżyć nylonową siatkę separacyjną roztworem 2xSSPE/0,5% SDS w temperaturze 42°C i za jej pomocą zwinąć membranę w rulon.</li>
<li>Umieścić zwiniętą membranę w probówce do obracania i rozwinąć ją tak, aby membrana przylegała do wewnętrznej powierzchni. Do 15 ml 2xSSPE/0,5% SDS w temperaturze 42°C dodać 3 μl koniugatu streptawidyna-peroksydaza (Roche Applied Science) i przelać do probówki do obracania. Mocno zakręcić nakrętką i inkubować w obracającym się inkubatorze w temperaturze 42°C przez 60 minut. Upewnić się, że kierunek obrotu jest taki, aby membrana nie zacisnęła się zbyt mocno. Okresowo sprawdzać szczelność.</li>
<li>Umyć miniblotter detergentem Pyroneg i wodą, opłukać i pozostawić do wyschnięcia.</li>
<li>Wyjąć membranę z probówki do obracania. Przemyć dwukrotnie w pozostałym roztworze 2xSSPE/0,5% SDS w temperaturze 42°C przez 10 minut.</li>
<li>Przemyć dwukrotnie w 2xSSPE w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
<li>Zwiększyć temperaturę inkubatora do 80°C i umieścić w nim 500 ml 1% SDS w celu wstępnego podgrzania.</li>
<li>Przygotować 15 ml roztworu detekcyjnego Amersham ECL (7,5 ml roztworu A i 7,5 ml roztworu B). Odlać 2xSSPE i dodać roztwór detekcyjny. Delikatnie kołysać ręcznie przez 2 minuty, zapewniając całkowite pokrycie membrany roztworem. Odlać roztwór chemiluminescencyjny.</li>
<li>Wyciąć dwa arkusze folii przezroczystej dopasowane do kasety naświetlającej. Umieścić membranę między dwoma arkuszami i włożyć do kasety naświetlającej.</li>
<li>Przejść do ciemni. Przy czerwonym świetle włożyć film detekcyjny ECL do kasety i naświetlać przez 5 minut. Po wyjęciu zagiąć prawy dolny róg filmu („dog-ear”), aby umożliwić prawidłową orientację podczas oglądania.</li>
<li>Wywołać film w automatycznej wywoływarce lub w kąpielach chemicznych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>W razie potrzeby powtórzyć naświetlanie z dłuższym lub krótszym czasem ekspozycji.</li>
</ol>
3.	Regeneracja membrany
<ol>
 <li>Przemyć membranę dwukrotnie w 250 ml 1% SDS w temperaturze 80°C przez 30 minut.</li>
 <li>Przemyć membranę w 240 ml 20 mM EDTA w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
 <li>Zamknąć membranę w plastikowym worku z 10 ml 20 mM EDTA i przechowywać w temperaturze 4°C do ponownego użycia.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki: 
Najlepsze efekty obserwacji uzyskuje się, kładąc film na wydrukowanej siatce lub skanując obraz i importując go do oprogramowania takiego jak BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgia). Każdy wynik sondy należy interpretować w odniesieniu do sond kontrolnych dodatnich i ujemnych. Wyniki najlepiej klasyfikować jako ujemne, słabe lub dodatnie. Wyniki dodatnie to takie, w których sygnał jest tak samo silny lub silniejszy niż w przypadku dodatniej sondy kontrolnej. Wyniki ujemne to takie, w których sygnał nie występuje lub jest równy sygnałowi z ujemnej kontroli (w przypadku sygnału tła). Wyniki słabe to takie, w których sygnał jest słabszy niż w przypadku dodatniej sondy kontrolnej, ale silniejszy niż w przypadku ujemnej kontroli. Wyniki słabe mogą być efektem mutacji punktowych prowadzących do słabego wiązania sondy lub wynikać z nieswoistych sygnałów powstałych w wyniku tworzenia dimerów starterów. Zastosowanie dwóch sond na każdy analizowany cel może poprawić specyficzność, dzięki czemu pojedynczy słaby wynik można bezpiecznie zinterpretować jako sygnał nieswoisty. W przypadku jakichkolwiek wątpliwości można przeprowadzić reakcję PCR w układzie single-plex z detekcją żelową i sekwencjonowaniem każdego amplifikowanego produktu, aby ustalić, czy wynik jest rzeczywiście dodatni. Reprezentacyjny wynik przedstawiono na rysunku 2.
<img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Schemat detekcji DNA znakowanego aminą i biotyną; chemiluminescencja na membranie nylonowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Zasady mPCR/RLB (P1) Krok 1.9. Sondy zmodyfikowane grupami aminowymi są kowalencyjnie wiązane z membraną nylonową. (P2) Krok 2.10. Produkty PCR zmodyfikowane biotyną ulegają hybrydyzacji z sondami. (P3) Krok 2.14. Streptawidyna, znakowana peroksydazą, jest inkubowana z membraną i wiąże się z biotyną. (P4) Kroki 2.19-2.21. Peroksydaza katalizuje reakcję w odczynnikach do detekcji ECL, emitując światło, na które naświetlana jest folia światłoczuła. Następnie membrana jest płukana w celu ponownego użycia. 
<img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Analiza dot blot; siatka próbek względem sond; oddziaływania molekularne; schemat; wizualizacja danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywny wynik mPCR/RLB. Próbki od 1 do 6 stanowią kontrole pozytywne – pomiędzy nimi występuje co najmniej jeden pozytywny sygnał sondy dla każdej z 43 sond. Każda sekwencja docelowa (od A do U) jest wykrywana za pomocą dwóch różnych sond w celu maksymalizacji swoistości. Sondy A1 i A2 to sondy specyficzne gatunkowo, które powinny być pozytywne dla każdej próbki i pomagają w orientacji folii. Sonda A1 jest powtórzona na dole membrany. Próbki 7 i 8 to kontrole negatywne. Należy zauważyć, że sondy Q1, Q2, T1 i T2 wykazują sygnał w kontrolach negatywnych, co wskazuje na prawdopodobne nieswoiste wiązanie starterów lub obecność produktu dimerów starterów. Wymagane byłoby przeprojektowanie tych sond lub starterów. Sondy C1, D1 i F1 wykazują smużenie na membranie, prawdopodobnie z powodu nieswoistego wychwytu koniugatu streptawidyna-peroksydaza lub substratu chemiluminescencyjnego, jednak jest to łatwo rozróżnialne od prawdziwych pozytywnych sygnałów sond. Sondy D1 i D2 mają stosunkowo słaby sygnał w porównaniu z innymi sondami, co może wynikać z większych amplikonów prowadzących do mniej wydajnej amplifikacji. Sonda J2 jest negatywna w kilku próbkach (1, 3, 4, 6, 39), w których sonda J1 jest pozytywna. Najprawdopodobniej reprezentuje to mutację w miejscu wiązania J2 dla tych próbek.

<ol><li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li>
<li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li>
<li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li>
<li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+%28mPCR%2FRLB%29+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29+typing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li>
<li>O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+transmission+in+hospitals+by+use+of+phage-derived+open+reading+frame+typing+enhanced+by+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).</li>
<li>Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+phage+locus+typing+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%2C+using+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).</li>
<li>Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+less-common+Streptococcus+pneumoniae+serotypes+by+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).</li>
<li>Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+identify+23+Streptococcus+pneumoniae+polysaccharide+vaccine+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes.</a> J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).</li>
<li>Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+serotype+identification+of+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).</li>
<li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+20+common+human+enterovirus+serotypes+by+use+of+a+reverse+transcription-PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).</li>
<li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+and+analysis+of+nonserotypeable+human+enteroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses.</a> J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).</li>
<li>Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+macroarray+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences+for+rapid+identification+of+34+mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species.</a> J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).</li>
<li>Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+polymerase+chain+reaction-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+detect+common+genital+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens.</a> Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).</li>
<li>McKechnie, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+14+genital+microorganisms+in+urine+by+use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).</li>
<li>Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay+for+rapid+simultaneous+detection+and+serovar+identification+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis.</a> J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+%28mPCR%2FRLB%29+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+%28mPCR%2FRLB%29+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li>
<li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li>
<li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+%28mPCR%2FRLB%29+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Metoda mPCR/RLB pozwala na jednoczesną detekcję dużej liczby amplikonów PCR. Dzięki wysokiej czułości detekcji opartej na sondach chemiluminescencyjnych, do amplifikacji matrycy DNA można zastosować pojedynczą reakcję multiplex PCR z dużą liczbą par starterów.
Jeśli w przypadku jednej lub większej liczby próbek nie uzyskano sygnałów sondy, przeprowadzenie elektroforezy żelowej pozostałego produktu PCR może pomóc w ustaleniu, czy problem dotyczy amplifikacji PCR, czy hybrydyzacji sondy. W sytuacjach, gdy wszystkie sygnały sond na membranie są słabe lub nieobecne, ale elektroforeza żelowa wskazuje na pomyślną amplifikację PCR, możliwe przyczyny obejmują problemy z znakowaniem membrany, nieprawidłową regenerację membrany po poprzednim użyciu, niewłaściwe temperatury podczas hybrydyzacji lub inkubacji ze streptawidyną, a także wadliwy koniugat streptawidyna-peroksydaza lub odczynnik detekcyjny.
Jeśli próbki kontrolne wskazują, że poszczególne sondy mogą generować fałszywie ujemne sygnały, można przeprowadzić pojedynczą reakcję PCR z detekcją żelową i następującym po niej sekwencjonowaniem, aby zweryfikować amplifikację produktu PCR oraz poszukać wariantów sekwencji w miejscu wiązania sondy. Słaby lub brak sygnału sondy może wynikać z dużego rozmiaru amplikonu: jeśli to możliwe, wszystkie amplikony powinny mieć podobną długość i nie przekraczać 300 bp. Wtórne struktury DNA amplikonów mogą również powodować słabe wiązanie sondy i może to wymagać ponownego zaprojektowania starterów. Można również modyfikować stężenia poszczególnych starterów lub sond w celu optymalizacji siły sygnału.
Fałszywie dodatnie sygnały wynikające z wiązania sond z nieamplifikowanymi starterami lub produktami dimerów starterów można zbadać, przeprowadzając pojedynczą reakcję PCR z detekcją żelową i następującym po niej sekwencjonowaniem. W takim przypadku konieczna może być zmiana projektu sond. Mutacje punktowe w miejscach wiązania sond mogą prowadzić do słabych lub nieobecnych sygnałów. Zastosowanie dwóch sond dla każdego amplifikowanego produktu pozwala na łatwą detekcję tego zjawiska. Cecha ta może zostać wykorzystana przy starannym zaprojektowaniu starterów i sond do wykrywania niewielkich wariacji sekwencji w docelowym DNA.
Podsumowując, choć dostępnych jest wiele metod wykrywania produktów po reakcjach multipleksowej PCR, mPCR/RLB charakteryzuje się wysoką przepustowością, niskim kosztem oraz niskimi kosztami konfiguracji. Elastyczność tej metody pozwala na jej zastosowanie w szerokim zakresie analiz.

<table><tbody><tr><td>5&amp;rsquo; sondy oligonukleotydowe modyfikowane aminą C6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>roztwór 0,5 M doprowadzony do pH 8,4</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>roztwór 0,1 M</td></tr><tr><td>bufor 20x SSPE</td><td>Amresco</td><td>0810-4L</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4390</td><td>Przygotować 10% roztwór stokowy; nie autoklawować; przechowywać maksymalnie przez 1 tydzień przed użyciem.</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Przygotować roztwór 0,5 M, dostosować pH do wartości 8,0 i wysterylizować w autoklawie</td></tr><tr><td>N-(3-dimetyloaminopropyl)-N&amp;#8242;hydrochlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropyl)karbodiimidu (EDAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7750</td><td>Tuż przed użyciem przygotować 20 ml 16% roztworu, rozpuszczając 3,2 g EDAC w 18 ml wody Millipore.</td></tr><tr><td>BiodyneC 0,45 &amp;mu;membrana nylonowa 20x20 cm</td><td>Pall Corporation</td><td>74480C</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana, oczyszczona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detergent w płynie Pyroneg</td><td>Johnson Diversey</td><td>HH12291</td><td></td></tr><tr><td>Koniugat streptawidyna-peroksydaza</td><td>Grupa Roche</td><td>11 089 153 001</td><td></td></tr><tr><td>odczynniki do detekcji Amersham ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2105</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do detekcji Amersham ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2105</td><td></td></tr><tr><td>Folia do rzutnika overhead (OHP)</td><td>Corporate Express</td><td>EXP 504 OHP</td><td></td></tr><tr><td>Amersham hyperfilm ECL wysokowydajny film chemiluminescencyjny 18x24 cm</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Materiały eksploatacyjne wykorzystane w analizie mPCR/RLB.</td></tr><tr><td>Mieszadło Hybaid&amp;rsquo;n&amp;rsquo;Inkubatory piętrowe (2) z systemem obrotowym dla butelek i nylonową siatką rozdzielczą</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBSNSRS220</td><td>Metodę można przeprowadzić w jednym inkubatorze, pod warunkiem że istnieje możliwość utrzymywania roztworów w temperaturze 42°C.&amp;#x00B0;C i 60&amp;#x00B0;C przed użyciem</td></tr><tr><td>Platforma kołysząca Belly Dancer</td><td>Stovall Life Sciences, IBI Sciences</td><td>Euro BDbo</td><td></td></tr><tr><td>Miniblotter</td><td>Immunetyka</td><td>MN100-45</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odsysanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kasetka ekspozycyjna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z36,009-0</td><td></td></tr><tr><td>Wywoływacz do filmów rentgenowskich</td><td></td><td></td><td>Można również zastosować kuwety z wywoływaczem, utrwalaczem i wodą w ciemni zamiast automatycznej wywoływarki. Zamiast filmu rentgenowskiego można również użyć obrazownika luminescencyjnego.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Wyposażenie wymagane do analizy mPCR/RLB.</td></tr></tbody></table>

wielokrotna reakcja łańcuchowa polimerazy i analiza hybrydyzacji w układzie reverse line blot (mpcr/rlb)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Analiza Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization umożliwia detekcję do 43 celów molekularnych w 43 próbkach przy użyciu jednej reakcji multiplex PCR, po której następuje hybrydyzacja sond na wielokrotnego użytku membranie nylonowej. Sondy są modyfikowane aminą na końcu 5', co pozwala na ich utrwalenie na membranie. Primery są modyfikowane biotyną na końcu 5', co umożliwia detekcję zhybrydyzowanych produktów PCR przy użyciu streptawidyny-peroksydazy i substratu chemiluminescencyjnego za pomocą filmu światłoczułego. Dzięki niskim kosztom konfiguracji i materiałów eksploatacyjnych technika ta jest niedroga (około 2 USD za próbkę), charakteryzuje się wysoką przepustowością (możliwość jednoczesnego przetwarzania wielu membran) oraz krótkim czasem realizacji (około 10 godzin). 
Technikę tę można wykorzystać na kilka sposobów. Można zaprojektować wiele sond w celu wykrycia zmienności sekwencji w obrębie jednego produktu amplifikacji lub jednocześnie amplifikować wiele produktów, używając jednej (lub więcej) sond do późniejszej detekcji. W ramach jednego testu można zastosować również połączenie obu tych podejść. Możliwość zastosowania wielu sond dla jednej sekwencji docelowej sprawia, że test jest wysoce specyficzny.
Opublikowane zastosowania mPCR/RLB obejmują wykrywanie genów oporności na antybiotyki1,2, typowanie metycylino-opornych Staphylococcus aureus3-5 oraz Salmonella sp6, molekularne serotypowanie Streptococcus pneumoniae7,8, Streptococcus agalactiae9 i enterowirusów10,11, identyfikację Mycobacterium sp12, wykrywanie patogenów narządów płciowych13-15, dróg oddechowych16 i innych17 oraz wykrywanie i identyfikację mollicutes18. Jednak wszechstronność tej techniki sprawia, że jej zastosowania są praktycznie nieograniczone i nie ograniczają się wyłącznie do analizy molekularnej mikroorganizmów.
Pięć etapów mPCR/RLB to: a) projektowanie starterów i sond, b) ekstrakcja DNA i amplifikacja PCR, c) przygotowanie membrany, d) hybrydyzacja i detekcja oraz e) regeneracja membrany.

Opisano niedrogą, wysokoprzepustową metodę jednoczesnego wykrywania do 43 celów molekularnych. Zastosowania mPCR/RLB obejmują typowanie mikrobiologiczne oraz wykrywanie wielu patogenów w próbkach klinicznych.

Wielokrotna reakcja łańcuchowa polimerazy i analiza hybrydyzacji w układzie reverse line blot (mPCR/RLB)

Analiza z wykorzystaniem seryjnej reakcji PCR i hybrydyzacji w układzie Reverse Line Blot umożliwia wykrycie do 43 celów molekularnych w 43 próbkach przy użyciu jednej seryjnej reakcji PCR...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie obecności lub braku panelu specyficznych sekwencji kwasów nukleinowych, które zostały wcześniej powielone w reakcji multiplex PCR. Jest to realizowane poprzez uprzednie unieruchomienie sond DNA znakowanych aminami na wielorazowej membranie nylonowej. Następnie produkty PCR znakowane biotyną są hybrydyzowane z sondami związanymi z membraną oraz strep TTR w peroksydazie.Do związanych produktów PCR dodaje się koniugat. Następnie wykrywa się związane produkty PCR poprzez dodanie odczynników do detekcji chemiluminescencyjnej i naświetlanie membrany na wysokoczułej kliszy rentgenowskiej. Na koniec membranę przemywa się, aby usunąć zhybrydyzowane produkty PCR, co pozwala na jej ponowne wykorzystanie w przyszłych analizach.W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące hybrydyzację produktów PCR z sondami związanymi z membraną na kliszy rentgenowskiej. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak multiplex PCR z elektroforezą w żelu, PCR w czasie rzeczywistym czy mikromacierze, jest jej wysoka przepustowość, stosunkowo krótki czas analizy, brak konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu i, co najważniejsze, niski koszt. Przed rozpoczęciem pracy należy przygotować następujące roztwory zgodnie z opisową częścią niniejszego protokołu.Aby przygotować membranę, wstępnie rozgrzej piekarnik do 60 °C. Oczyść mini-blotter 70% ethanol, rozcieńcz sondy oligonukleotydowe w 0,5 M wodorowęglanie sodu do końcowego stężenia 2 pmol/µL i objętości 200 µL. Wytnij membranę nylonową o wymiarach 15 na 15 cm; za pomocą ołówka i linijki wyznacz 0,5 cm marginesu u góry membrany i zapisz tam szczegóły eksperymentu.Umieść membranę w plastikowej torebce z 20 mililitrami świeżo przygotowanego 16% roztworu EDAC i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut, delikatnie kołysząc torebką. Przemyj membranę wodą dejonizowaną przez 30 sekund. Następnie umieść membranę w mini blotterze z kanałami biegnącymi w poprzek membrany.Następnie umieść podkładkę wspierającą i zamknij blotter. Dokładnie odessij wszelkie płyny z kanałów. Wypełnij ścieżki 1 i 45 150 µL 0,5 M wodorowęglanu sodu.Napełnij kolejno otwory od 2 do 44, używając 150 µL każdego z roztworów sond, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Jeśli w kanale pojawi się pęcherzyk powietrza, nie wyjmując pipety, szybko odessaj roztwór, aby pęcherzyk wypłynął na górę końcówki pipety, a następnie spróbuj ponownie. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Odsajuj roztwory sond. Wyjmij membranę i przemyj ją w 250 mililitrach 0,1 molarnego wodorotlenku sodu w temperaturze pokojowej przez dziewięć minut. Przemyj membranę w 250 mililitrach dwukrotnego SSPE przez 30 sekund.Następnie, jeśli membrana nie jest natychmiast używana do hybrydyzacji, należy ją dwukrotnie przemyć w 250 mililitrach podgrzanego w piecu do 60 stopni Celsjusza przez pięć minut roztworu SSPE 0,1% SDS. Membranę należy przemyć w 240 mililitrach 20 milimolowego EDTA w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie membranę należy umieścić w plastikowej torebce z pozostałymi 10 mililitrami 20 milimolowego EDTA i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Na koniec umyj mini blosser detergentem do szyjek pipeczek i pędzlem, wypłucz i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Amplifikacja PCR docelowych sekwencji nie jest opisana w tym pokazie, ale musi zostać przeprowadzona przed hybrydyzacją sondy. Przed rozpoczęciem procedury hybrydyzacji przygotuj następujące roztwory zgodnie z opisową częścią niniejszego protokołu.Włącz jeden piekarnik i ustaw go na 60 °C, a drugi na 42 °C. Zagotuj wodę w dużym zlewce na płycie grzejnej. Oczyść mini blotter 70% etanolem.Następnie odmierz 10 ml dwukrotnego SSPE 0,1%SDS do małego pojemnika. Potem dodaj 20 µl każdego produktu PCR do 150 µl dwukrotnego SSPE 0,1%SDS w ponumerowanych probówkach. Gotuj produkty PCR przez 10 minut w temperaturze 100 °C, używając uchwytów styropianowych, a następnie natychmiast umieść je na lodzie na co najmniej pięć minut.Przemyj membranę w pozostałych 240 mililitrach dwukrotnego roztworu SSPE 0,1% SDS w piecu w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez pięć minut. Umieść membranę w mini blotterze z podkładką amortyzującą. Ustaw ją tak, aby kanały biegły pionowo.Odssać nadmiar cieczy z kanałów mini blottera. Dodać pozostałe 150 µL dwukrotnego roztworu SSPE 0,1% SDS do pierwszego i ostatniego kanału. Do kanałów od drugiego do 44 kolejno dodać zagotowane produkty PCR, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.Umieść mini-blotter płasko w piecu w temperaturze 60 °C na jedną godzinę, aby umożliwić zajście hybrydyzacji. Spryskaj ciecz z każdego kanału. Następnie wyjmij membranę z mini-blottera.Przemyto dwukrotnie w uprzednio ogrzanych 250 mililitrach 2x SSPE z 0,5% SDS w piecu w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Namoczono podkład nylonowy w 2x SSPE z 0,5% SDS w temperaturze 42 °C i użyto go do zwinięcia membrany. Zwiniętą membranę umieszczono w tubie wałkowej i rozprostowano, aby zapewnić przyleganie membrany do powierzchni wewnętrznej.Dodaj 3 µL koniugatu strept AD z peroksydazą do 15 ml dwukrotnego roztworu SSPE z 0,5% SDS w temperaturze 42 °C i przelej do probówki. Mocno zakręć nakrętką i inkubuj w inkubatorze obrotowym w temperaturze 42 °C przez 60 minut. Upewnij się, że kierunek obrotu jest taki, aby membrana nie napinała się.Okresowo sprawdzać szczelność układu. Umyć mini-blotter w detergencie do szyjek pirolitycznych i wypłukać wodą, a następnie pozostawić do wyschnięcia. Zdjąć membranę z rurki wałka i dwukrotnie przemyć w pozostałych dwóch porcjach buforu SSPE z 0,5% SDS w temperaturze 42 °C przez 10 minut.Następnie przemyj dwukrotnie w dwukrotności buforu SSPE w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Rozgrzej oba piece do 80 °C i umieść 500 milliliters 1%SDS w jednym z nich w celu wstępnego ogrzania. Przygotuj roztwór ECL i inkubuj membranę w roztworze detekcyjnym ECL przez dwie minuty.Następnie naświetl membranę na film i wywołaj. W razie potrzeby powtórz naświetlanie z dłuższym lub krótszym czasem ekspozycji, aby zregenerować membranę. Przemyj ją dwukrotnie w 250 mililitrach 1% SDS w temperaturze 80 °C przez 30 minut.Następnie przemyj 240 mililitrami 20 milimolarnego EDTA w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umieść membranę w plastikowej torebce z 10 mililitrami 20 milimolarnego EDTA i przechowuj w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego użycia. Ta rycina przedstawia wyniki testu hybrydyzacji multiplex PCR reverse line blot. Próbki od jednej do sześciu reprezentują kontrole pozytywne pomiędzy nimi.Dla każdej z 43 sond występuje co najmniej jeden pozytywny sygnał. Każda sekwencja docelowa od A do U jest wykrywana za pomocą dwóch różnych sond w celu maksymalizacji specyficzności sond. Sonda jeden oraz sonda dwa to sondy specyficzne gatunkowo, które powinny być pozytywne dla każdej próbki i pomagają w orientacji filmu z sondami.Próbka jeden jest powtórzona na dole membrany. Próbki siedem i osiem stanowią kontrole negatywne. Należy zauważyć, że sondy Q1, Q2, T one i T two wykazują sygnał w kontrolach negatywnych, co wskazuje na prawdopodobne nieswoiste wiązanie starterów lub powstawanie dimerów starterów.Wymagane byłoby przeprojektowanie tych sond lub starterów; sondy C1, D1 i F1 wykazują smużenie na membranie, co prawdopodobnie wynika z nieswoistego wychwytu koniugatu peroksydazy ze streptawidyną lub substratu chemiluminescencyjnego. Można je jednak łatwo odróżnić od prawdziwie pozytywnych sond. Sygnały sond D1 i D2 są stosunkowo słabe w porównaniu z pozostałymi sondami.Może to wynikać z obecności większych amplikonów, co prowadzi do mniej wydajnej amplifikacji. Wreszcie, sonda J two jest ujemna w kilku próbkach, w których sonda J one jest dodatnia. Najprawdopodobniej oznacza to występowanie mutacji w miejscu wiązania sondy J two w tych próbkach.Po opanowaniu tej techniki, od ekstrakcji DNA po hybrydyzację PCR Pro, interpretację wyników oraz regenerację błony można przeprowadzić w czasie krótszym niż 10 godzin.

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test Multiplex PCR i hybrydyzacja Reverse Line Blot (mPCR/RLB)

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikony wszystkich organizmów w próbce są hybrydyzowane z panelem kulek sprzężonych z sondami. Do analizy typu każdej kulki oraz sygnału hybrydyzacji wykorzystywany jest instrument Luminex lub Bio-Plex.

Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

Pokazujemy prosty test multipleksowego PCR do szybkiego badania przesiewowego i typowania Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typu I-V dla opornego na metycylinę Staphylococcus aureus, i przedstawiamy niektóre z istotnych kroków i niuansów proceduralnych, które sprawiają, że jest to skuteczne w adaptacji tego testu do indywidualnych laboratoriów.

Test multipleksowy PCR do typowania gronkowcowego chromosomu kasety mec typów od I do V w gronkowca złocistego opornym na metycylinę

Linear-amplifikacja (LAM)-PCR to metoda opracowana w celu określenia dokładnych pozycji integracji wektorów wirusowych w genomie. Technika ta ewoluowała, aby stać się lepszą metodą badania dynamiki klonalnej u pacjentów z terapią genową, bezpieczeństwa biologicznego nowych technologii wektorowych, różnorodności komórek T, modeli rakowych komórek macierzystych itp.

PCR za pośrednictwem amplifikacji liniowej – lokalizacja elementów genetycznych i charakterystyka nieznanego DNA flankującego

Genetyczny test reporterowy jest dobrze znanym i potężnym narzędziem do analizowania relacji między sekwencjami DNA a ich aktywnością regulacyjną genów. Sprzężenie potencjalnych elementów regulatorowych z genami reporterowymi, które przenoszą identyfikujące znaczniki sekwencji, umożliwia masową równoległość tych testów.

Masowo równoległe testy reporterowe w hodowanych komórkach ssaków

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Poznaj metodę mPCR/RLB do jednoczesnego wykrywania wielu patogenów z próbek klinicznych. Ta technika hybrydyzacji z odwróconą linią blot oferuje wysoką przepustowość, czułość i specyficzność przy niskich kosztach.

Wielokrotna reakcja łańcuchowa polimerazy i analiza hybrydyzacji w układzie reverse line blot (mPCR/RLB)

Przeglądaj więcej filmów