Generowanie i znakowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą nanokryształów Qdot do badań śledzenia

Ogólnym celem zabiegu jest przygotowanie komórek dendrytycznych do badań obrazowych z wykorzystaniem nanokryształów Q dot. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie komórek szpiku kostnego z murn, kości udowych i piszczeli. Następnie przeprowadza się hodowle komórek szpiku kostnego, aby ułatwić różnicowanie komórek w komórki dendrytyczne w obecności GM CSF.

Następnie po ośmiu dniach komórki dendrytyczne są odzyskiwane z hodowli komórek szpiku kostnego. Ostatnim etapem zabiegu jest wybarwienie komórek fluorescencyjnymi nanokryształami Q. Ostatecznie jaskrawo zabarwione komórki dendrytyczne można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Główną zaletą stosowania tej technologii w porównaniu z innymi metodami, takimi jak stosowanie komórek dendrytycznych z tagiem GFP, jest to, że nanokryształy Q dot zachowują swoją fluorescencję nawet po barwieniu rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak aceton. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania biologów komórek dendrytycznych, takie jak właściwości migracyjne tych komórek w różnych chorobach lub w kontekście różnych chorób. Procedurę barwienia zademonstruje Maria Ali, doktorantka z mojego laboratorium.

Po złożeniu ofiary ostrożnie wypreparuj kość piszczelową i udową dwóch myszy bez przecinania końców kości. Następnie użyj bibuły, aby oczyścić wszystkie przyczepione tkanki z kości, uważając, aby ich nie złamać. W kapturze bezpieczeństwa biologicznego.

Napełnij 35-milimetrową szalkę Petriego 70% etanolem, a następnie zanurz kości w etanolu na 10 minut. Po wysterylizowaniu kości odzyskaj je z etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut na nowej szalce Petriego. Teraz przetnij kość udową pośrodku, a kość piszczelową najcieńszą końcówką.

Napełnij wnętrze kości jednym mililitrem pożywki RPMI za pomocą sterylnej strzykawki. Zebrać zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i przemyć ją dwa razy pożywką RPMI przez 10-minutowe wirowanie w temperaturze 300 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce z obracającym się wirnikiem kubełkowym. Po ostatnim płukaniu resus zawiesić komórki w dwóch mililitrach lizy CK, buforować i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania czerwonych krwinek.

Następnie dodaj 13 mililitrów RPMI plus 10% FBS i umyj komórki jeszcze dwa razy w tym podłożu z tymi samymi ustawieniami wirówki, co poprzednio. Policz komórki i dostosuj stężenie do dwa razy od 10 do piątych komórek na mililitr. Z RPMI plus 10%FBS dodaj rekombinowaną mysią G-M-C-S-F do końcowego stężenia 20 nanogramów na mililitr.

Następnie dodaj 10 mililitrów tej zawiesiny do sterylnej jakości mikrobiologicznej 10-centymetrowej szalki Petriego i kultury. Zawiesina komórek w inkubatorze dwutlenku węgla. Trzy dni później dodaj kolejne 10 mililitrów RPMI plus 10% FBS z 20 nanogramami na mililitr rekombinowanego mysiego G-M-C-S-F do każdej z przygotowanych płytek.

Trzy kolejne dni później odzyskaj 10 mililitrów zawiesiny komórek z każdej szalki Petriego, odwiruj komórki w tych samych warunkach i ponownie zawieś osad w tej samej objętości RPMI plus 10% FBS, jak odzyskano z szalek Petriego i uzupełnij nową rekombinowaną mysią G-M-C-S-F. Na koniec umieść zawiesinę komórkową z powrotem na każdej oryginalnej szalce Petriego i hoduj komórki przez dodatkowe dwa dni w inkubatorze dwutlenku węgla. Po ośmiu dniach w hodowli odzyskaj pływające i luźno przylegające komórki, myjąc szalki Petriego świeżą pożywką.

Następnie oznacz pobrane komórki za pomocą zestawu do znakowania komórek Q tracker 6 55, ściśle przestrzegając instrukcji producenta, aby oznaczyć pięć razy od 10 do jednej szóstej prądu stałego pochodzącego ze szpiku kostnego myszy nanokryształami Q o stężeniu 10 nanomolowym. Najpierw wymieszaj pięć mikrolitrów każdego ze składników zestawu A i B w probówce einor i inkubuj mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj jeden mililitr RPMI plus 10% FBS i wiruj rurkę przez 30 sekund.

Następnie dodaj pięć razy 10 do piątego. Dcs zawieszony w 0,5 mililitra RPMI plus 10% FBS do probówki einor i inkubować komórki w roztworze D w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Następnie umyj ogniwa dwa razy w RPMI plus 10% FBS w tych samych warunkach, co poprzednio, i ponownie zawieś granulkę w RPMI.

Rysunek ten pokazuje przykład fluorescencyjnej mikrofotografii prądu stałego. Bezpośrednio po oznakowaniu kropla oznakowanych komórek została osadzona na szkiełku podstawowym i przykryta szkiełkiem nakrywkowym. Następnie próbki oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Na tym rysunku widać fluorescencyjną mikrofotografię dcs po 48 godzinach, dojrzewanie in vitro. Prądy stałe hodowano przez 48 godzin w dawce 100 nanogramów na mililitr, LPS i 20 nanogramów na mililitr, TNF alfa na komorach hodowlanych w inkubatorze dwutlenku węgla. Następnie próbki przemyto PBS utrwalonym acetonem, przeciwbarwieniem DPI i oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Znakowane dcs dojrzałe in vitro analizowano za pomocą cytometrii przepływowej, komórki barwione kropkami Q dają silny sygnał w FL trzy kanały Q do barwione i niebarwione. Prądy stałe dodatkowo wybarwiono specyficznymi przeciwciałami przeciwko markerom dojrzewania, CD 86 i CD 40, a następnie komórki kontrolne izotypu analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Dodatkowo oznaczono poziomy IL 6 i tlenku azotu w supernatantach dojrzałego barwnika Q DCS i kontrolnych.

Tutaj reprezentatywny rysunek oznakowanego DCS w wypreparowanej tkance jest pokazany jako oznaczony. Dojrzałe dcs wstrzyknięto dożylnie sześciu czarnym myszom C 57. Trzy dni później myszy zostały złożone w ofierze i pobrano śledziony.

Zatrzaskowe zamrożone w OCT i ośmiomikronowe skrawki przygotowano za pomocą kriostatu. Próbki następnie utrwalono acetonem, barwnikiem przeciwstawnym DPI i oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Postępując zgodnie z tymi procedurami.

Inne metody, takie jak tworzenie antygenu lub dojrzewanie z różnymi bodźcami, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak migracja komórek dendrytycznych w odpowiedzi na różne bodźce dojrzewania.