Generowanie i znakowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą nanokryształów Qdot do badań śledzenia
June 2nd, 2011
Komórki dendrytyczne pobierają antygeny i migrują w kierunku organów odpornościowych, aby przedstawić przetworzone antygeny limfocytom T. Znakowanie nanokryształami Qdot zapewnia długotrwały i stabilny sygnał fluorescencyjny. Umożliwia to śledzenie komórek dendrytycznych w różnych narządach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Ogólnym celem zabiegu jest przygotowanie komórek dendrytycznych do badań obrazowych z wykorzystaniem nanokryształów Q dot. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie komórek szpiku kostnego z murn, kości udowych i piszczeli. Następnie przeprowadza się hodowle komórek szpiku kostnego, aby ułatwić różnicowanie komórek w komórki dendrytyczne w obecności GM CSF.
Następnie po ośmiu dniach komórki dendrytyczne są odzyskiwane z hodowli komórek szpiku kostnego. Ostatnim etapem zabiegu jest wybarwienie komórek fluorescencyjnymi nanokryształami Q. Ostatecznie jaskrawo zabarwione komórki dendrytyczne można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Główną zaletą stosowania tej technologii w porównaniu z innymi metodami, takimi jak stosowanie komórek dendrytycznych z tagiem GFP, jest to, że nanokryształy Q dot zachowują swoją fluorescencję nawet po barwieniu rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak aceton. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania biologów komórek dendrytycznych, takie jak właściwości migracyjne tych komórek w różnych chorobach lub w kontekście różnych chorób. Procedurę barwienia zademonstruje Maria Ali, doktorantka z mojego laboratorium.
Po złożeniu ofiary ostrożnie wypreparuj kość piszczelową i udową dwóch myszy bez przecinania końców kości. Następnie użyj bibuły, aby oczyścić wszystkie przyczepione tkanki z kości, uważając, aby ich nie złamać. W kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
Napełnij 35-milimetrową szalkę Petriego 70% etanolem, a następnie zanurz kości w etanolu na 10 minut. Po wysterylizowaniu kości odzyskaj je z etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut na nowej szalce Petriego. Teraz przetnij kość udową pośrodku, a kość piszczelową najcieńszą końcówką.
Napełnij wnętrze kości jednym mililitrem pożywki RPMI za pomocą sterylnej strzykawki. Zebrać zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i przemyć ją dwa razy pożywką RPMI przez 10-minutowe wirowanie w temperaturze 300 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce z obracającym się wirnikiem kubełkowym. Po ostatnim płukaniu resus zawiesić komórki w dwóch mililitrach lizy CK, buforować i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania czerwonych krwinek.
Następnie dodaj 13 mililitrów RPMI plus 10% FBS i umyj komórki jeszcze dwa razy w tym podłożu z tymi samymi ustawieniami wirówki, co poprzednio. Policz komórki i dostosuj stężenie do dwa razy od 10 do piątych komórek na mililitr. Z RPMI plus 10%FBS dodaj rekombinowaną mysią G-M-C-S-F do końcowego stężenia 20 nanogramów na mililitr.
Następnie dodaj 10 mililitrów tej zawiesiny do sterylnej jakości mikrobiologicznej 10-centymetrowej szalki Petriego i kultury. Zawiesina komórek w inkubatorze dwutlenku węgla. Trzy dni później dodaj kolejne 10 mililitrów RPMI plus 10% FBS z 20 nanogramami na mililitr rekombinowanego mysiego G-M-C-S-F do każdej z przygotowanych płytek.
Trzy kolejne dni później odzyskaj 10 mililitrów zawiesiny komórek z każdej szalki Petriego, odwiruj komórki w tych samych warunkach i ponownie zawieś osad w tej samej objętości RPMI plus 10% FBS, jak odzyskano z szalek Petriego i uzupełnij nową rekombinowaną mysią G-M-C-S-F. Na koniec umieść zawiesinę komórkową z powrotem na każdej oryginalnej szalce Petriego i hoduj komórki przez dodatkowe dwa dni w inkubatorze dwutlenku węgla. Po ośmiu dniach w hodowli odzyskaj pływające i luźno przylegające komórki, myjąc szalki Petriego świeżą pożywką.
Następnie oznacz pobrane komórki za pomocą zestawu do znakowania komórek Q tracker 6 55, ściśle przestrzegając instrukcji producenta, aby oznaczyć pięć razy od 10 do jednej szóstej prądu stałego pochodzącego ze szpiku kostnego myszy nanokryształami Q o stężeniu 10 nanomolowym. Najpierw wymieszaj pięć mikrolitrów każdego ze składników zestawu A i B w probówce einor i inkubuj mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj jeden mililitr RPMI plus 10% FBS i wiruj rurkę przez 30 sekund.
Następnie dodaj pięć razy 10 do piątego. Dcs zawieszony w 0,5 mililitra RPMI plus 10% FBS do probówki einor i inkubować komórki w roztworze D w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Następnie umyj ogniwa dwa razy w RPMI plus 10% FBS w tych samych warunkach, co poprzednio, i ponownie zawieś granulkę w RPMI.
Rysunek ten pokazuje przykład fluorescencyjnej mikrofotografii prądu stałego. Bezpośrednio po oznakowaniu kropla oznakowanych komórek została osadzona na szkiełku podstawowym i przykryta szkiełkiem nakrywkowym. Następnie próbki oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Na tym rysunku widać fluorescencyjną mikrofotografię dcs po 48 godzinach, dojrzewanie in vitro. Prądy stałe hodowano przez 48 godzin w dawce 100 nanogramów na mililitr, LPS i 20 nanogramów na mililitr, TNF alfa na komorach hodowlanych w inkubatorze dwutlenku węgla. Następnie próbki przemyto PBS utrwalonym acetonem, przeciwbarwieniem DPI i oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Znakowane dcs dojrzałe in vitro analizowano za pomocą cytometrii przepływowej, komórki barwione kropkami Q dają silny sygnał w FL trzy kanały Q do barwione i niebarwione. Prądy stałe dodatkowo wybarwiono specyficznymi przeciwciałami przeciwko markerom dojrzewania, CD 86 i CD 40, a następnie komórki kontrolne izotypu analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Dodatkowo oznaczono poziomy IL 6 i tlenku azotu w supernatantach dojrzałego barwnika Q DCS i kontrolnych.
Tutaj reprezentatywny rysunek oznakowanego DCS w wypreparowanej tkance jest pokazany jako oznaczony. Dojrzałe dcs wstrzyknięto dożylnie sześciu czarnym myszom C 57. Trzy dni później myszy zostały złożone w ofierze i pobrano śledziony.
Zatrzaskowe zamrożone w OCT i ośmiomikronowe skrawki przygotowano za pomocą kriostatu. Próbki następnie utrwalono acetonem, barwnikiem przeciwstawnym DPI i oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Postępując zgodnie z tymi procedurami.
Inne metody, takie jak tworzenie antygenu lub dojrzewanie z różnymi bodźcami, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak migracja komórek dendrytycznych w odpowiedzi na różne bodźce dojrzewania.
Przegląd
To badanie opisuje procedurę przygotowania komórek dendrytycznych do obrazowania przy użyciu nanokryształów Qdot. Metoda ta umożliwia wizualizację komórek dendrytycznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zapewniając wgląd w ich właściwości migracyjne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Mikroskopia fluorescencyjna
Tło
- Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej, prezentując antygeny limfocytom T.
- Nanokryształy Qdot oferują stabilny sygnał fluorescencyjny do śledzenia komórek.
- Ta metoda poprawia badania zachowania komórek dendrytycznych w różnych kontekstach chorobowych.
- Tradycyjne metody mogą nie zapewniać takiego samego poziomu stabilności fluorescencji.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody oznaczania komórek dendrytycznych nanokryształami Qdot.
- Ułatwienie śledzenia komórek dendrytycznych in vivo.
- Zbadanie właściwości migracyjnych komórek dendrytycznych w różnych modelach chorobowych.
Stosowane metody
- Izolacja komórek szpiku z kości myszy.
- Hodowla komórek z GM-CSF w celu różnicowania się w komórki dendrytyczne.
- Barwienie komórek dendrytycznych nanokryształami Qdot.
- Wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.
Główne wyniki
- Pomyślnie oznaczone komórki dendrytyczne wykazywały silne sygnały fluorescencyjne.
- Wykazano stabilność nanokryształów Qdot w porównaniu z tagami GFP.
- Wizualizowano dojrzewanie i migrację komórek dendrytycznych in vitro i in vivo.
- Zapewniono wgląd w mechanizmy odpowiedzi immunologicznej z udziałem komórek dendrytycznych.
Wnioski
- Technika oznaczania Qdot jest skuteczna w badaniu dynamiki komórek dendrytycznych.
- Ta metoda może poprawić zrozumienie zachowania komórek dendrytycznych w różnych chorobach.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać to podejście do zbadania różnych stymulacji dojrzewania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Labeling dendritic cells with Qdot nanocrystals enables stable, long-term fluorescence for tracking immune cell migration in preclinical models. This approach supports mechanistic de-risking in immunotherapy development by providing reliable visualization of antigen-presenting cell dynamics. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing direct observation of dendritic cell behavior in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic cell migration and antigen presentation pathways in disease models.
- Operational Value: Provides a stable fluorescent label that persists through fixation and solvent exposure, reducing signal loss during tissue processing.
- Predictive Value: Supports functional validation of dendritic cell biologics by tracking in vivo localization and maturation status.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable fluorescence readouts for assessing dendritic cell maturation and activation states.
- Operational Value: Compatible with flow cytometry and microscopy platforms, enabling high-content screening of immunomodulatory compounds.
- Assay Readiness: Produces standardized, labeled dendritic cell batches suitable for reproducible immune profiling assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates tracking of dendritic cell migration from peripheral tissues to lymphoid organs, modeling immune surveillance.
- Operational Value: Allows longitudinal imaging studies in murine models to evaluate vaccine or adjuvant-induced immune responses.
- Translational Continuity: Supports biomarker-aligned studies by correlating dendritic cell localization with functional immune outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery workflow from early target validation through preclinical immune profiling, enabling visualization of dendritic cell dynamics as a functional readout in immunomodulatory screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of dendritic cell function in antigen capture, migration, and T-cell priming.
- Screening: Enables standardized preparation of labeled dendritic cells for compound screening and immunomodulator profiling.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence and flow cytometry readouts to compare dendritic cell maturation and activation across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro dendritic cell behavior to in vivo trafficking patterns in disease-relevant murine models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for immune cell labeling applicable across multiple immunotherapy discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in dendritic cell-mediated immune responses through stable, long-term tracking.
- Operational Value: Ensures reproducibility across laboratories via standardized labeling protocol and minimal batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in immunotherapy development by providing direct visual evidence of target engagement and immune cell trafficking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated dendritic cell modulation and migration profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, sterile technique, and fluorescence microscopy.
- Dependent on access to Qdot labeling kits, flow cytometers, and cryostat equipment for tissue sectioning.
- Necessitates standardization of cell differentiation timing and labeling concentration across users.
- Adaptation to human dendritic cell models may require optimization of cytokine conditions and labeling efficiency.
- Practical limitations include potential aggregation of Qdots at high concentrations and need for careful titration to avoid cytotoxicity.
