Name: Generowanie i znakowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą nanokryształów Qdot do badań śledzenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj metodę znakowania mysich komórek dendrytycznych nanokryształami Qdot do badań śledzenia. Technika umożliwia wizualizację migracji komórek odpornościowych w różnych modelach chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została częściowo sfinansowana przez NIH w ramach grantu R15 CA137499-01 (F.B.) oraz z funduszy startowych Ohio University (F.B.).

1. Disekcja kości udowych i piszczelowych myszy oraz hodowla komórek szpiku kostnego
<ol>
<li>Uśmierć 2 myszy poprzez uduszenie CO2 i ostrożnie wypreparuj piszczele oraz uda, nie przecinając końców kości.</li>
<li>Oczyść kości ze wszystkich przylegających tkanek za pomocą ręcznika papierowego. Należy uważać, aby nie złamać kości.</li>
<li>Zesterylizuj kości poprzez zanurzenie w 70% etanolu na 10 min w szalce Petriego o średnicy 35 mm. Od tego momentu pracę należy prowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć kontaminacji kultur komórkowych.</li>
<li>Wyjmij kości z etanolu i pozostaw do wyschnięcia przez 5 min w szalce Petriego wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.</li>
<li>Przetnij kości udowe na pół, a piszczele w ich najcieńszym miejscu. Przepłucz wnętrze kości 1 ml pożywki RPMI (bez surowicy, ale z antybiotykami), używając sterylnej strzykawki w sterylnej szalce Petriego.</li> 
<li>Zawiesinę komórkową należy zebrać i przemyć 2X w pożywce RPMI poprzez wirowanie przez 10 min w probówce wirówkowej 15 ml przy 1,100 RPM w wirówce chłodzącej (4°C) z rotorem z koszyczkami odchylanymi.</li> 
<li>Po ostatnim przemyciu resuspenduj komórki w 2 ml buforu lizującego ACK i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu eliminacji erytrocytów.</li>
<li>Dodaj 13 ml pożywki RPMI z 10% FBS, resuspenduj i przemyj 2X w tej pożywce przy użyciu tych samych parametrów, które opisano w punkcie 1.6.</li> 
<li>Policz komórki, dostosuj stężenie do 2 x 105 cells/ml za pomocą RPMI 10% FBS i dodaj rm-GM-CSF (stężenie końcowe 20 ng/ml) 5.</li> 
<li>Przenieś 10 ml tej zawiesiny do sterylnej szalki Petriego o średnicy 10 cm jakości mikrobiologicznej i inkubuj w inkubatorze CO2 (37°C, 5% CO2).</li> 
<li>Po trzech dniach dodaj kolejne 10 ml pożywki RPMI 10% FBS z 20 ng/l rmGM-CSF do każdej z przygotowanych płytek.</li>
<li>Po kolejnych trzech dniach pobierz 10 ml zawiesiny komórkowej z każdej szalki Petriego, odwiruj zgodnie z opisem w punkcie 1.6, resuspenduj w tej samej objętości RPMI 10% FBS z rmGM-CSF i przelej z powrotem do szalki Petriego. Komórki inkubuj przez kolejne 2 dni w inkubatorze CO2.</li>
</ol>
2. Izolacja i znakowanie komórek DC
<ol>
<li>Po 8 dniach hodowli słabo przylegające komórki odzyskuje się poprzez przemycie szalek Petri świeżą pożywką. Protokół ten pozwala nam uzyskać około 2-4 x108 DC. Fenotyp DC można przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
<li>Zebrane komórki znakuje się następnie przy użyciu zestawu Qtracker 655 Cell Labeling Kit, ściśle według instrukcji producenta.</li>
<li>Otrzymaliśmy doskonałe wyniki, znakując mysie DC pochodzące z szpiku kostnego kropkami kwantowymi Qdots w stężeniu 10 nM. Aby to osiągnąć, równe objętości komponentów A i B zestawu Qtracker Cell Labeling Kit miesza się, inkubuje przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie natychmiast rozcieńcza 1/100 we świeżej pożywce, mieszając w wortexie przez 30 s.</li>
<li>Aby zbarwić 5 x 106 DC, należy zmieszać w probówce typu Eppendorf po 5 μl każdego z komponentów zestawu A i B i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Następnie dodaje się 1 ml RPMI z 10% FBS, inkubuje i miesza w wortexie przez 30 sekund.</li>
<li>Dodaje się 0,5 ml zawiesiny komórkowej zawierającej 5 x106 DC i inkubuje w 37°C przez 60 min.</li> 
<li>Następnie komórki przemywa się 2 razy w RPMI z 10% FBS (1 100 RPM). Komórki można resuspenderować w RPMI do dalszej hodowli lub w PBS w celu wstrzyknięcia myszom doświadczalnym.</li>
</ol>
3. Ocena oznakowanych DC
<ol>
<li>Znakowanie komórek można ocenić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym celu kroplę zawiesiny komórkowej nanosi się na szkiełko przedmiotowe, przykrywa szkiełkiem nakrywką i analizuje pod mikroskopem fluorescencyjnym, przyjmując, że kropki kwantowe (Qdots) te mają odpowiednio widma emisji 565nm oraz wzbudzenia 405–525nm (Rys. 3)</li>
<li>Na tym etapie oznakowane komórki można wykorzystać do iniekcji u zwierząt lub można indukować ich dojrzewanie poprzez inkubację przez 48 h (37°C, 5 CO2) w obecności LPS (100 ng/ml) i TNF- (20 ng/ml). Znakowanie fluorescencyjne nie jest zaburzone przez dojrzewanie komórek dendrytycznych (DC) (Rys. 4).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
W niniejszej pracy opisano sposób preparowania komórek dendrytycznych (DC) pochodzących z szpiku kostnego myszy oraz metodę ich znakowania fluorescencyjnymi kropkami kwantowymi (Qdots). Rys. 1 podsumowuje procedurę pozyskiwania komórek, natomiast Rys. 2 przedstawia procedurę ich znakowania kropkami Qdots. Jak pokazano na Rys. 3, niemal wszystkie komórki zostają znakowane tą metodą, co nie jest zaburzone przez dojrzewanie DC pod wpływem czynników zapalnych (Rys. 4). Rys. 5 wykazuje, że DC zabarwione kropkami Qdots (Rys. 5a) zachowują się podobnie do komórek niezabarwionych po podaniu koktajlu zapalnego. Obie preparacje komórkowe w podobny sposób zwiększają ekspresję cząsteczek kostymulujących (Rys. 5b) oraz produkują podobne ilości IL-6 (Rys. 5c) i tlenku azotu (Rys. 5d) po stymulacji dojrzewania. Jest to zgodne z wcześniej opublikowanymi danymi wskazującymi, że barwienie kropkami Qdots nie wpływa na zdolność DC do przekształcania się w dojrzałe komórki zdolne do wywoływania odpowiedzi immunologicznych [6]. Tak przygotowane komórki mogą być następnie wykorzystane do iniekcji u zwierząt doświadczalnych. Jak pokazano na Rys. 6, dwa dni po dożylnym wstrzyknięciu znakowanych DC myszom, udało się wykryć komórki zabarwione kropkami Qdots w śledzionie. Jest to również zgodne z wcześniej opublikowanymi danymi wykazującymi zastosowanie nanokryształów Qdots do oceny migracji DC in vivo [6] za pomocą nieinwazyjnego obrazowania i cytometrii przepływowej.
<img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="Schemat ekstrakcji szpiku kostnego myszy; komórki szpiku hodowane z GM-CSF do badania komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat blokowy generowania DC ze szpiku kostnego. Przedstawiono tutaj proces pozyskiwania DC pochodzących ze szpiku kostnego. Obie kości piszczelowe i udowe są preparowane i oczyszczane z otaczających tkanek. Końce kości pozostają nienaruszone, a wnętrza kości są płukane pożywką. Po usunięciu erytrocytów komórki szpiku kostnego są hodowane przez 8 dni w obecności GM-CSF w celu ich różnicowania w DC. 
<img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="Schemat procesu znakowania fluorescencyjnego komórek DC z wykorzystaniem mikroskopii; przedstawia procedurę krok po kroku." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat procedury znakowania. Równe ilości komponentów A i B z zestawu Qtracker Cell Labeling Kit miesza się w probówce typu Eppendorf. Komórki dendrytyczne pobiera się z 8-dniowych hodowli szpiku kostnego z dodatkiem GM-CSF i miesza z barwnikiem znakującym przez 60 min w 37°C. Następnie komórki przemywa się w pożywce, aby usunąć nadmiar cząstek znakujących.
<img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, wyróżnione struktury komórkowe, emisja czerwona, analiza mikroskopowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Mikrofotografia fluorescencyjna komórek DC bezpośrednio po znakowaniu. Kroplę znakowanych komórek nanieśli na szkiełko przedmiotowe i przykryli szkiełkiem nakrywkowym. Następnie próbki oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a obrazy zarejestrowano przy użyciu cyfrowej kolorowej kamery CCD Micropublisher 5.0 (Qimaging, Surrey, BC Kanada).
<img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="Obrazowanie komórkowe, mikroskopia fluorescencyjna, komórki barwione na czerwono i niebiesko, identyfikacja DNA, badanie mikroskopowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Mikrofotografia fluorescencyjna komórek DC po 48 h dojrzewania in vitro. Oznakowane komórki DC hodowano przez 48 h z LPS (100 ng/ml) i TNF-α (20 ng/ml) na szkiełkach przedmiotowych w inkubatorze CO2 (37°C, 5% CO2). Następnie próbki przemyto PBS (5 min, 2X), utrwalono acetonem (15 min, 4°C) i podbarwiono DAPI. Komórki oceniono pod mikroskopem fluorescencyjnym w sposób opisany powyżej. 
<img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej: histogramy CD40, CD86; stężenie IL-6, poziomy azotanów na wykresach słupkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Aktywność biologiczna dojrzałych komórek DC znakowanych kropkami kwantowymi (Qdot). Oznakowane komórki DC dojrzewające in vitro zgodnie z powyższym protokołem analizowano za pomocą cytometrii przepływowej (A) oraz (B). (A) Komórki znakowane Qdot dają silny sygnał w kanale FL3 (PercP). Histogram zacieniowany: kontrola nieznakowana. (B) Komórki DC znakowane Qdot oraz nieznakowane barwiono dodatkowo swoistymi przeciwciałami przeciwko markerom dojrzewania CD86 i CD40, a także kontrolami izotypowymi. Następnie komórki analizowano w cytometrze przepływowym FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA). Dodatkowo oznaczono poziom IL-6 (C) oraz tlenku azotu (NO) w naddatkach dojrzałych komórek DC znakowanych Qdot i w kontrolach. Poziomy IL-6 i tlenku azotu określono za pomocą analizy ELISA i testu Griessa, zgodnie z naszymi wcześniejszymi opisami 7, 8. Wszystkie dane przedstawione na tej rycinie są reprezentatywne dla dwóch lub trzech niezależnych eksperymentów, które dały podobne wyniki. Dane analizowano metodą ANOVA przy użyciu oprogramowania GraphPad.
<img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, lokalizacja białek, jądra komórkowe barwione na niebiesko, czerwone plamki sygnału." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6">
 Rycina 6. Wykrywanie znakowanych komórek DC w wypreparowanych tkankach. Znakowane dojrzałe komórki DC (1x106 komórek) wstrzyknięto dożylnie myszom C57BL/6. (A) Po dwóch dniach myszy uśmiercono, a śledziony pobrano, zamrożono gwałtownie, zatopiono w OCT i przygotowano przekroje o grubości 8 μM przy użyciu kriotomu. Następnie próbki utrwalono acetonem (15 min, 4°C) i przeciwbarwiono DAPI. Komórki oceniano pod mikroskopem fluorescencyjnym w sposób opisany powyżej. Ryc. 6a: powiększenie 40X, Ryc. 6b: powiększenie 100X, Ryc. 6C: powiększenie 400X.

<ol><li>Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Bonasio, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+migration+and+function+of+circulating+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation, migration and function of circulating dendritic cells.</a> Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+instructive+role+of+dendritic+cells+on+T+cell+responses%3A+lineages%2C+plasticity+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics.</a> Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).</li>
<li>Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R. J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-infiltrating+dendritic+cell+precursors+recruited+by+a+beta-defensin+contribute+to+vasculogenesis+under+the+influence+of+Vegf-A%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A.</a> Nat Med. 10, 950-958 (2004).</li>
<li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Noh, Y. W., Lim, Y. T., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+near-infrared+fluorescent+semiconductor+nanocrystals%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals.</a> Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).</li>
<li>Benencia, F., Courreges, M. C., Conejo-Garcia, J. R., Mohamed-Hadley, A., Zhang, L., Buckanovich, R. J., Carroll, R., Fraser, N., Coukos, G., Franco, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV+oncolytic+therapy+upregulates+interferon-inducible+chemokines+and+recruits+immune+effector+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer.</a> Mol Ther. 12, 789-802 (2005).</li>
<li>Gilboa, E., Vieweg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+with+mRNA-transfected+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells.</a> Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).</li>
<li>Grolleau-Julius, A., Abernathy, L., Harning, E., Yung, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+murine+dendritic+cell+antitumor+dysfunction+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging.</a> Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).</li>
<li>Yrlid, U., Svensson, M., Johansson, C., Wick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+infection+of+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells%3A+influence+on+antigen+presentation+and+initiating+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).</li>
<li>Lutz, M. B., Schnare, M., Menges, M., Rossner, S., Rollinghoff, M., Schuler, G., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li>
<li>Benencia, F., Courreges, M. C., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+tumor+antigen+vaccination+using+dendritic+cells%3A+comparison+of+RNA+electroporation+and+pulsing+with+UV-irradiated+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells.</a> J Transl Med. 6, 21-21 (2008).</li>
<li>Probst, H. C., Tschannen, K., Odermatt, B., Schwendener, R., Zinkernagel, R. M., Van Den Broek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+CD11c-DTR%2FGFP+mice+after+in+vivo+depletion+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells.</a> Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).</li>
<li>Fainaru, O., Adini, A., Benny, O., Adini, I., Short, S., Bazinet, L., Nakai, K., Pravda, E., Hornstein, M. D., D'Amato, R. J., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+support+angiogenesis+and+promote+lesion+growth+in+a+murine+model+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis.</a> Faseb J. 22, 522-529 (2008).</li>
<li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S., Rainer, S., Jamal, O. S., Munro, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+dendritic+cells+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Vascular dendritic cells and atherosclerosis.</a> Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).</li>
<li>Nakai, K., Fainaru, O., Bazinet, L., Pakneshan, P., Benny, O., Pravda, E., Folkman, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+augment+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells augment choroidal neovascularization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).</li>
<li>Huarte, E., Cubillos-Ruiz, J. R., Nesbeth, Y. C., Scarlett, U. K., Martinez, D. G., Buckanovich, R. J., Benencia, F., Stan, R. V., Keler, T., Sarobe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+dendritic+cells+delays+ovarian+cancer+progression+by+boosting+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity.</a> Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).</li>
<li>Fernandez Pujol, B., Lucibello, F. C., Zuzarte, M., Lutjens, P., Muller, R., Havemann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+derived+from+peripheral+monocytes+express+endothelial+markers+and+in+the+presence+of+angiogenic+growth+factors+differentiate+into+endothelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells.</a> Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).</li>
<li>Gottfried, E., Kreutz, M., Haffner, S., Holler, E., Iacobelli, M., Andreesen, R., Eissner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+tumour-associated+dendritic+cells+into+endothelial-like+cells%3A+an+alternative+pathway+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis.</a> Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).</li>
<li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+vascular+dendritic+cells+in+atherosclerotic+arteries+suggests+their+involvement+in+local+immune-inflammatory+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions.</a> Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).</li>
<li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-accumulation+of+dendritic+cells+and+natural+killer+T+cells+within+rupture-prone+regions+in+human+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques.</a> J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Mysie komórki dendrytyczne (DCs) linii mieloidalnej były szeroko wykorzystywane w celu określenia skuteczności i ulepszenia szczepionek opartych na DCs, badania oddziaływań między DCs a limfocytami T lub rozwoju DCs, a także określenia ich roli w różnych chorobach 9-11. W niniejszym materiale pokazujemy, jak generować DCs z prekursorów odzyskanych z szpiku kostnego piszczeli i kości udowych. Odzyskujemy kości bez odcinania końców, co pozwala nam na ich sterylizację poprzez zanurzenie w 70% etanolu, zmniejszając tym samym prawdopodobieństwo kontaminacji. Aby zróżnicować DCs z komórek szpiku kostnego, stosujemy wyłącznie GM-CSF, zgodnie z wcześniejszym opisem 5. Chociaż niektóre protokoły wykorzystują również IL-4, zgłaszano, że cytokina ta nie jest konieczna przy pracy z wysokimi stężeniami GM-CSF 12. Rzeczywiście, wykazaliśmy wcześniej, że DCs te są zdolne do indukowania odpowiedzi immunologicznych 13. Należy również pamiętać, aby z 8-dniowych kultur odzyskiwać wyłącznie słabo przylegające komórki, przepłukując szalki Petriego medium, ponieważ komórki przytwierdzone wykazują fenotyp bardziej zbliżony do monocytów. Przedstawiamy tutaj znakowanie DCs fluorescencyjnymi cząsteczkami Qdot. Znakowanie to posiada pewne zalety w stosunku do innych metod. Po pierwsze, cząsteczki Qdot są łatwo wbudowywane do komórek. Po drugie, sygnał fluorescencyjny jest bardzo silny i nie ulega zmianie podczas dojrzewania DCs. Po trzecie, fluorescencja nie zanika, gdy komórki lub tkanki są utrwalane rozpuszczalnikami takimi jak aceton, w przeciwieństwie do sytuacji, gdy do znakowania DCs używa się GFP 14, co daje większą elastyczność przy wyborze protokołów barwienia. Wreszcie, silny sygnał fluorescencyjny generowany przez te cząsteczki umożliwia wizualizację komórek mimo autofluorescencji tkanek. Jak opisano wcześniej 6, barwienie Qdot nie wpłynęło na zdolność tych komórek do dojrzewania. Wykazujemy tutaj, że DCs zabarwione Qdot zachowują się podobnie jak DCs niezabarwione, zwiększając ekspresję cząsteczek kostymulujących oraz produkując IL-6 i tlenek azotu w odpowiedzi na bodźce zapalne. Choć DCs są komórkami wyspecjalizowanymi w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznych, wykazano, że biorą one udział w stanach patologicznych, takich jak nowotwory i miażdżyca 4, 15, 16. Twierdzono również, że uczestniczą one w procesie angiogenezy 17, 18, a nawet sugerowano ich strukturalny udział w tworzeniu nowych naczyń 19, 20. Zatem metody pozwalające na śledzenie DCs in vivo i określanie ich lokalizacji geograficznej w różnych tkankach 4, 21, 22 są bardzo cenne.

<table><tbody><tr><td>Myszy C57BL/6</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td>Samice, wiek 6-8 tygodni</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-antymykotyk</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy ACK</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi GM-CSF</td><td>PeproTech Inc</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania komórek Qtracker 655</td><td>Invitrogen</td><td>Q25021MP</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd</td><td>Invitrogen</td><td>tlrl-eblps</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi TNF alpha</td><td>PeproTech Inc</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD86</td><td>BD Biosciences</td><td>553691</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD40</td><td>BD Biosciences</td><td>553791</td><td></td></tr><tr><td>System odczynników Griessa</td><td>Promega Corp.</td><td>G2930</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wychwytujące IL-6</td><td>eBioscience</td><td>13-7061-81</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało detekcyjne IL-6</td><td>eBioscience</td><td>13-7062-81</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie i znakowanie nanocząsteczkami kropek kwantowych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy na potrzeby badań śledzących

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Komórki dendrytyczne (DCs) są profesjonalnymi komórkami prezentującymi antygen (APCs), które występują w tkankach obwodowych oraz w narządach immunologicznych, takich jak grasica, szpik kostny, śledziona, węzły chłonne i kępki Peyera 1-3. Komórki dendrytyczne obecne w tkankach obwodowych monitorują organizm pod kątem obecności antygenów, które następnie pochłaniają, przetwarzają i prezentują na swojej powierzchni w kontekście cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej (MHC). Następnie obciążone antygenem komórki dendrytyczne migrują do narządów immunologicznych, gdzie prezentują przetworzony antygen limfocytom T, wywołując specyficzne odpowiedzi immunologiczne. Jednym ze sposobów oceny zdolności migracyjnych komórek dendrytycznych jest ich znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi 4.
W niniejszym opracowaniu demonstrujemy zastosowanie fluorescencyjnych nanokryształów Qdot do znakowania komórek dendrytycznych (DC) pochodzących z szpiku kostnego myszy. Zaletą takiego znakowania jest fakt, że nanokryształy Qdot charakteryzują się stabilną i trwałą fluorescencją, co czyni je idealnymi do wykrywania znakowanych komórek w odzyskanym materiale tkankowym. Aby to osiągnąć, w pierwszej kolejności komórki zostaną wyizolowane ze szpiku kostnego myszy i hodowane przez 8 dni w obecności czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów w celu indukcji różnicowania DC. Następnie komórki te zostaną znakowane fluorescencyjnymi kropkami Qdot poprzez krótką inkubację in vitro. Zbarwione komórki można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Na tym etapie komórki można wstrzyknąć zwierzętom doświadczalnym lub pozostawić do pełnego dojrzewania. in vitro inkubacja ze stymulatorami stanu zapalnego. W naszych badaniach dojrzewanie komórek DC nie determinowało utraty sygnału fluorescencyjnego, a barwienie kropkami kwantowymi (Qdot) nie wpływa na właściwości biologiczne komórek DC. Po wstrzyknięciu komórki te można zidentyfikować w organach odpornościowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po zastosowaniu standardowych procedur sekcji i fiksacji.

Komórki dendrytyczne pobierają antygeny i migrują w stronę organów odpornościowych, aby zaprezentować przetworzone antygeny limfocytom T. Markowanie nanokryształami Qdot zapewnia długotrwały i stabilny sygnał fluorescencyjny. Umożliwia to śledzenie komórek dendrytycznych w różnych organach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Generowanie i znakowanie nanocząsteczkami kropek kwantowych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy na potrzeby badań śledzących

Komórki dendrytyczne (DCs) są profesjonalnymi komórkami prezentującymi antygen (APCs), które występują w tkankach obwodowych oraz w narządach immunologicznych, takich jak grasica, szpik...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie komórek dendrytycznych do badań obrazowych z wykorzystaniem nanokryształów kropek kwantowych (Q dot). Jest to realizowane poprzez wstępną izolację komórek szpiku kostnego z mostka, kości udowych i piszczeli. Następnie tworzone są hodowle komórek szpiku kostnego w celu umożliwienia różnicowania komórek w komórki dendrytyczne w obecności GM CSF.Następnie, po ośmiu dniach, z hodowli komórek szpiku kostnego odzyskuje się komórki dendrytyczne. Ostatnim krokiem procedury jest barwienie komórek fluorescencyjnymi nanokryształami Q. W rezultacie jasno zabarwione komórki dendrytyczne można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Główną zaletą zastosowania tej technologii w porównaniu z innymi metodami, takimi jak użycie komórek dendrytycznych z tagiem GFP, jest fakt, że nanokryształy kropek kwantowych zachowują fluorescencję nawet po barwieniu rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak aceton. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania biologów zajmujących się komórkami dendrytycznymi, np. dotyczące właściwości migracyjnych tych komórek w różnych chorobach lub w kontekście różnych schorzeń. Procedurę barwienia zaprezentuje Maria Ali, doktorantka z mojego laboratorium.Po uśmierceniu zwierząt ostrożnie wypreparuj kości piszczelowe i udowe z dwóch myszy, uważając, aby nie przeciąć końców kości. Następnie za pomocą ręcznika papierowego oczyść kości z wszystkich przylegających tkanek, dbając o to, by ich nie złamać. Czynności należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Napełnić 35 milimetrową szalkę Petriego 70% etanolem, a następnie zanurzyć w etanolu kości na 10 minut. Po wysterylizowaniu kości wyjąć je z etanolu i pozostawić do wyschnięcia przez pięć minut w nowej szalce Petriego. Następnie przeciąć kość udową w połowie, a kość piszczelową w jej najcieńszej części.Wprowadź jeden mililitr medium RPMI do wnętrza kości za pomocą sterylnej strzykawki. Zbierz zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 mililitrów i przemyj ją dwukrotnie medium RPMI, odwirowując przez 10 minut przy 300 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce z rotorem z koszykami wahadłowymi. Po ostatnim przemyciu ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach buforu do lizy CK i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu eliminacji erytrocytów.Następnie należy dodać 13 mililitrów pożywki RPMI z 10% FBS i dwukrotnie wypłukać komórki w tym medium, stosując te same parametry wirowania co poprzednio. Należy policzyć komórki i dostosować ich stężenie do poziomu 2 × 10⁵ komórek na mililitr. Do pożywki RPMI z 10% FBS należy dodać rekombinowany mysi G-M-C-S-F do stężenia końcowego 20 nanogramów na mililitr.Następnie należy dodać 10 mililitrów tej zawiesiny do sterylnej szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów jakości mikrobiologicznej i inkubować zawiesinę komórkową w inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Po trzech dniach do każdej z przygotowanych szalek należy dodać kolejne 10 mililitrów pożywki RPMI z 10% FBS i 20 nanogramami na mililitr rekombinowanego mysiego G-M-C-S-F.Po kolejnych trzech dniach pobierz 10 ml zawiesiny komórkowej z każdej szalki Petriego, odwiruj komórki w tych samych warunkach, a następnie zawiesić osad w tej samej objętości medium RPMI z dodatkiem 10% FBS, która została pobrana z szalek, i uzupełnij o nowy rekombinowany mysi G-M-C-S-F. Na koniec przelej zawiesinę komórkową z powrotem do oryginalnych szalek Petriego i inkubuj komórki przez kolejne dwa dni w inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Po ośmiu dniach hodowli pobierz komórki pływające i słabo przylegające, przemywając szalki Petriego świeżym medium.Następnie należy oznakować zebrane komórki za pomocą zestawu do znakowania komórek Q tracker 6 55, ściśle przestrzegając instrukcji producenta, aby oznakować 5×10⁶ komórek dcs pochodzących z szpiku kostnego myszy nanokryształami Q w stężeniu 10 nM. Najpierw wymieszaj 5 µL każdego z komponentów zestawu A i B w probówce typu Eppendorf i inkubuj mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 1 mL pożywki RPMI z dodatkiem 10% FBS i mieszaj probówkę na wortexie przez 30 sekund.Następnie do probówki typu Eppendorf dodaj 5 × 10⁵ komórek DCsuspended w 0,5 ml RPMI z dodatkiem 10% FBS i inkubuj komórki w roztworze D w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Następnie przemyj komórki dwukrotnie w RPMI z dodatkiem 10% FBS w tych samych warunkach co poprzednio i resuspenduj osad w RPMI.Rysunek ten przedstawia przykład mikrofotografii fluorescencyjnej dcs. Bezpośrednio po znakowaniu kropla znakowanych komórek została naniesiona na szkiełko przedmiotowe i przykryta szkiełkiem cover slip. Następnie próbki oceniono przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.Na tej rycinie widoczna jest opisana fluorescencyjna mikrofotografia dcs po 48 godzinach dojrzewania in vitro. Komórki dcs hodowano przez 48 godzin z dodatkiem 100 ng/ml LPS oraz 20 ng/ml TNF-α w komorach do hodowli na szkiełkach w inkubatorze z CO2. Następnie próbki przemyto PBS, utrwalono acetonem, zabarwiono DPI i oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.W dojrzałe in vitro znakowane komórki dendrytyczne (DCs) analizowano metodą cytometrii przepływowej. Komórki barwione kropkami kwantowymi (Q-dot) dawały silny sygnał w kanale FL3; analizowano komórki barwione Q-dot oraz niebarwione. DCs dodatkowo barwiono swoistymi przeciwciałami przeciwko markerom dojrzewania, CD 86 i CD 40, a także przeciwciałami kontrolnymi izotypowymi, a następnie analizowano je metodą cytometrii przepływowej. Dodatkowo w supernatantach dojrzałych DCs znakowanych Q-dot oraz w grupach kontrolnych oznaczono poziomy IL 6 i tlenku azotu.Poniżej przedstawiono reprezentatywną figurę znakowanych DCS w wyciętym fragmencie tkanki. Dojrzałe dcs wstrzyknięto dożylnie myszom C 57 black six. Po trzech dniach myszy uśpiono i pobrano śledziony.Próbki zamrożono gwałtownie w OCT, a następnie przygotowano przekroje o grubości ośmiu mikronów przy użyciu kriostatu. Próbki utrwalono acetonem, przeciwbarwiono DPI i oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, postępując zgodnie z tymi procedurami.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak migracja komórek dendrytycznych w odpowiedzi na różne bodźce dojrzewania, można zastosować inne metody, np. ekspozycję na antygen lub dojrzewanie z wykorzystaniem różnych stymulatorów.

generation-labeling-murine-bone-marrow-derived-dendritic-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Generowaniu i oznakowywaniu komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy za pomocą nanokryształów Qdot w badaniach śledzenia

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Śledzenie komórek za pomocą MRI zyskało niezwykłą uwagę w ostatnich latach. Protokół ten opisuje znakowanie komórek dendrytycznych cząstkami bogatymi w fluor (19F), zastosowanie tych komórek in vivo oraz monitorowanie zakresu ich migracji do drenującego węzła chłonnego za pomocą 19F/1H MRI i 19F MRS.

Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego 19F / 1H

Opisujemy protokół izolacji i oczyszczania neutrofili ze szpiku kostnego myszy poprzez wirowanie w gradiacji gęstości oraz znakowanie neutrofili za pomocą barwników CellTracker. Jest to prosta, szybka, powtarzalna i ekonomiczna metoda uzyskiwania dużej liczby neutrofili do dalszych badań funkcjonalnych lub eksperymentów adoptywnych w zakresie transferu i śledzenia.

Izolacja, oczyszczanie i znakowanie neutrofili szpiku kostnego myszy do badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Po przygotowaniu zmodyfikowanego 64Cu przeciwciała monoklonalnego wiążącego się z transgenicznym receptorem mysich limfocytów T, limfocyty T są znakowane radioaktywnie in vivo, analizowane pod kątem żywotności, funkcjonalności, stabilności znakowania i apoptozy, a następnie adoptycyjnie przenoszone do myszy z reakcją nadwrażliwości typu opóźnionego w drogach oddechowych do nieinwazyjnego obrazowania za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT).

Znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora przeciwciał Cu 64w celu transportu komórek in vivo za pomocą PET / CT

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Poznaj metodę znakowania mysich komórek dendrytycznych nanokryształami Qdot do badań śledzenia. Technika umożliwia wizualizację migracji komórek odpornościowych w różnych modelach chorób.

Generowanie i znakowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą nanokryształów Qdot do badań śledzenia (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie i znakowanie nanocząsteczkami kropek kwantowych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy na potrzeby badań śledzących

Przeglądaj więcej filmów