Name: Przygotowanie żywych izolowanych komórek fotoreceptorowych kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Poznaj metodę izolacji żywych komórek fotoreceptorowych kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego. Technika umożliwia wizualizację zmian metabolicznych i sygnałowania w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez grant NEI EY014850.

1. Przygotowanie szalek pokrytych Sylgardem, komór eksperymentalnych i żyletek
<ol>
<li>Do prawidłowego siekania wyizolowanej siatkówki w celu uzyskania pojedynczych komórek fotoreceptorów potrzebne są 35 mm szalki Petriego firmy Falcon pokryte elastomerem Sylgard. Elastomer przygotowuje się zgodnie z instrukcją dostawcy, a niewielką jego ilość wlewa się do każdej szalki, aby pokryć jej dno warstwą materiału. Po pokryciu należy założyć pokrywki na szalki i je przechować. Po kilku dniach elastomer twardnieje i szalki są gotowe do użycia.</li>
<li>Wyizolowane fotoreceptory muszą przylegać do dna komory eksperymentalnej, aby pozostały unieruchomione podczas eksperymentu obrazowania. Osiąga się to poprzez pokrycie dna komór poli-L-lizyną lub poli-L-ornityną. Do każdej komory dodaje się 200 μL 0,01% roztworu jednej z tych substancji, a następnie przykrywa komory ręcznikiem papierowym, aby chronić je przed kurzem. Po wyschnięciu roztworu komory płucze się wodą destylowaną i przechowuje w zamkniętym pudełku. Należy ich użyć w ciągu 2 tygodni.</li>
<li>Aby oczyścić komory po zakończeniu eksperymentu, należy przemyć je 100% etanolem w celu usunięcia oleju z obiektywu imersyjnego oraz szczątków komórkowych. W celu usunięcia szczątków komórkowych należy użyć aplikatorów z bawełnianą końcówką i ostrożnie wyszorować dno komory. Następnie komory płucze się wodą destylowaną i pozostawia do wyschnięcia przed ponownym pokryciem.</li>
<li>Dwustronne żyletki należy pociąć na małe kawałki (8 z jednej żyletki) za pomocą metalowego przecinaka.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów
<ol>
<li>Skład roztworów zależy od gatunku. Dla płazów roztwór Ringera zawiera (w mmol/L): 110 NaCl, 2,5 KCl, 1,6 MgCl2, 1 CaCl2, 5 HEPES, pH = 7,55. Wartość pH należy dostosować do wartości końcowej za pomocą NaOH. Dla ssaków roztwór Ringera zawiera (w mmol/L): 130 NaCl, 5 KCl, 0,5 MgCl2, 2 CaCl2, 25 hemisodowego HEPES, pH = 7,40. Roztwór Ringera można przechowywać w szczelnie zamkniętym naczyniu w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.</li>
<li>Zatężony roztwór glukozy, 1 mol/L, przechowywany w temperaturze -20 °C w celu uniknięcia wzrostu bakterii.</li>
<li>W dniu eksperymentu dodać glukozę do roztworu Ringera do końcowego stężenia 5 mmol/L. Na koniec dnia należy zutylizować roztwór Ringera zawierający glukozę, ponieważ mogą w nim rozwijać się bakterie.</li>
</ol>
3. Izolacja siatkówek
<ol>
<li>Aby prawidłowo wyciąć siatkówkę, ważne jest, aby zwierzę było adaptowane do ciemności przez co najmniej 2-3 godziny przed uśmierceniem. Zwierzęta powinny być adaptowane do ciemności w odpowiednim wentylowanym pojemniku w ciemni.</li>
<li>Napełnij dwie szalki Petriego o średnicy 35 mm do połowy roztworem Ringera.</li>
<li>Uśmierć zwierzę przy słabym czerwonym świetle i usuń gałki oczne. Następnie wszystkie procedury wykonuje się w świetle podczerwonym przy użyciu mikroskopu sekcyjnego lub kamery z monitorem wideo.</li>
<li>Usuń wszelkie pozostałości tkanek z zewnętrznej powierzchni oka. Odetnij i usuń część przednią, a następnie przenieś oczodoł do jednej z szalek Petriego wypełnionych roztworem Ringera.</li>
<li>Usuń ciało szkliste i ostrożnie oddziel siatkówkę od reszty oczodołu, odrywając lub odcinając wszelkie przyczepy. Delikatnie unieś siatkówkę i całkowicie oddziel ją od oczodołu.</li>
<li>Przenieś siatkówkę do drugiej szalki Petriego za pomocą plastikowej pipety transferowej. Przechowuj szalkę z siatkówką w szczelnym, nieprzepuszczającym światła pudełku.</li>
</ol>
4. Izolacja pojedynczych komórek fotoreceptorów
<ol>
<li>Wszystkie procedury przeprowadza się w świetle podczerwonym. Odcina się niewielki fragment siatkówki i przenosi go za pomocą plastikowej pipety do szalki pokrytej Sylgardem. Objętość roztworu zawierającego fragment siatkówki powinna wynosić około 250 μL.</li>
<li>Za pomocą uchwytu chwyta się mały fragment żyletki tak, aby krawędź ostrza była ustawiona pod kątem około 45° względem uchwytu. Fragment siatkówki rozplaszcza się na warstwie Sylgardu, a następnie za pomocą ostrza drobno sieka, dbając o to, aby tkanka pozostawała przyklejona do warstwy Sylgardu.</li>
<li>Przenosi się 200 μL roztworu zawierającego komórki do komory eksperymentalnej – wszelkie pozostałe fragmenty siatkówki pozostawia się w szalce pokrytej Sylgardem. Komorę z izolowanymi komórkami przechowuje się w szczelnym, nieprzepuszczającym światła pudełku.</li>
<li>Należy odczekać 10 min, aż komórki osiądą, a następnie dodać 2-3 mL roztworu Ringera. Na tym etapie izolowane komórki można obciążyć odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym (np. Fura-2) zgodnie z protokołem wprowadzania barwnika.</li>
<li>Komórki można teraz przenieść na stolik mikroskopu w celu przeprowadzenia eksperymentów.</li>
</ol>
5. Obrazowanie fluorescencyjne
<ol>
<li>Przenieś komorę na stolik mikroskopu epifluorescencyjnego. Dostosuj perfuzję roztworu, sondy temperatury, oświetlenie podczerwone itp.</li>
<li>Zaciągnij zasłony i rozpocznij eksperyment. Włącz światło podczerwone wewnątrz obudowy mikroskopu, ustaw ostrość na dnie komory eksperymentalnej i przesuwaj stolikiem w poszukiwaniu komórek.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Ryc. 1 przedstawia morfologię zdrowych, wyizolowanych fotoreceptorów pręcikowych i czopkowych uzyskanych za pomocą tego protokołu z siatkówki salamandry (Ambystoma tigrinum). Komórki salamandry są szeroko stosowane w badaniach obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek ze względu na ich duży rozmiar oraz zdolność do przeżycia przez kilka godzin po izolacji z siatkówki. Ponadto z siatkówki salamandry można regularnie pozyskiwać zarówno fotoreceptory pręcikowe, jak i czopkowe.
Jednym z ważnych kryteriów oceny stanu zdrowia komórek jest obecność nienaruszonego elipsoidu (Rys. 1), czyli części komórki, w której skoncentrowane są mitochondria. Podczas obserwacji komórek w optyce DAPI, ta koncentracja mitochondriów daje silny sygnał fluorescencyjny (Rys. 2) ze względu na obecność NADH. Brak nienaruszonego elipsoidu jest oznaką uszkodzenia komórki, która zazwyczaj nie nadaje się do eksperymentu. Rys. 3 przedstawia uszkodzony fotoreceptor pręcikowy salamandry z obrzękniętym ciałem komórki i skondensowanym jądrem. Takie komórki wykazują znacznie słabszą fluorescencję w optyce DAPI, ale w optyce FITC widoczny jest silny sygnał FAD w obszarze elipsoidu (pochodzący od utlenionych nukleotydów flawinowych i flawoprotein). Kolejnym kryterium oceny stanu zdrowia wyizolowanych fotoreceptorów jest ich zdolność do generowania witaminy A (retinolu całkowicie-trans) w segmentach zewnętrznych po stymulacji światłem. Generowanie witaminy A wymaga znacznych ilości NADPH, co zależy od sprawności mechanizmów metabolicznych. Rysunki 4 i 5 przedstawiają tworzenie się witaminy A w segmentach zewnętrznych odpowiednio nienaruszonych fotoreceptorów pręcikowych żaby i myszy.
<img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig1.jpg" alt="Schemat fotoreceptorów typu pręcika i czopka; opisane części; obraz mikroskopowy; analiza wizualna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zdrowe pojedyncze fotoreceptory typu pręcika i czopka. Komórki zostały wyizolowane z siatkówki salamandry tygrysiej. Fototransdukcja zachodzi w segmencie zewnętrznym, a elipsoid jest gęsto wypełniony mitochondriami. Pręciki odpowiadają za widzenie w słabym świetle, a czopki za widzenie w jasnym świetle.
<img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig2.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii podczerwonej i fluorescencyjnej komórek, pokazujące struktury barwione DAPI, skala 10µm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Fluorescencja żywych pręcików i czopków salamandry. Są to komórki zaadaptowane do ciemności, wykazujące silną fluorescencję NADH w odpowiednich ellipsoidach oraz brak istotnej fluorescencji witaminy A w ich segmentach zewnętrznych. Rejestracja obrazu fluorescencyjnego reprezentuje ich pierwszą ekspozycję na światło widzialne po okresie adaptacji do ciemności.
<img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig3.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii podczerwonej i fluorescencyjnej, optyka DAPI i FITC, analiza struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Uszkodzony fotoreceptor pręcikowy salamandry. Obrzęknięte ciało komórki oraz skondensowane jądro świadczą o uszkodzeniu. Komórka jest utleniona i wykazuje minimalny sygnał NADH (optyka DAPI), lecz znacznie silniejszy sygnał FAD (optyka FITC).
<img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig4.jpg" alt="Obrazy w podczerwieni i fluorescencyjne próbki biologicznej; wpływ ekspozycji na światło na fluorescencję DAPI." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Pręcik żaby z NADH i retinolem. Jest to zdrowy fotoreceptor pręcikowy żaby wykazujący silną fluorescencję NADH w obszarze elipsoidalnym. Przed ekspozycją na światło w segmencie zewnętrznym występuje minimalna fluorescencja. Po ekspozycji na światło obserwuje się znaczny wzrost fluorescencji w segmencie zewnętrznym wynikający z tworzenia się witaminy A.
<img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig5.jpg" alt="Obrazowanie w podczerwieni i fluorescencyjne preparatu; optyka DAPI, badanie efektu ekspozycji na światło, mikroskopia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Pręcik myszy z retinolem. Przedstawiony jest zdrowy fotoreceptor typu pręcika myszy wykazujący znaczącą fluorescencję segmentu zewnętrznego po ekspozycji na światło, co wynika z tworzenia się witaminy A. Regiony elipsoidalne fotoreceptorów typu pręcika myszy nie wykazują silnego sygnału fluorescencyjnego.

<ol><li>Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Counting+Photons%3A+Trials+and+Trends+in+Vertebrate+Visual+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction.</a> Neuron. 48, 387-401 (2005).</li>
<li>Ebrey, T., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Vertebrate Photoreceptors.</a> Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).</li>
<li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+in+Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Adaptation in Vertebrate Photoreceptors.</a> Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).</li>
<li>Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin.</a> Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).</li>
<li>Saari, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+Visual+Pigment+Regeneration%3A+The+Friedenwald+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).</li>
<li>Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+Adaptation+and+the+Retinoid+Cycle+of+Vision%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision.</a> Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).</li>
<li>Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Microscopy%3A+Shedding+Light+on+the+Chemistry+of+Vision%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision.</a> Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleached+Pigment+Produces+a+Maintained+Decrease+in+Outer+Segment+Ca2%2B+in+Salamander+Rods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods.</a> J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Dependent+Changes+in+Outer+Segment+Free-Ca2%2B+Concentration+in+Salamander+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).</li>
<li>Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+the+Rods+of+Wild-Type+and+Transducin+Knock-out+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice.</a> J Physiol. 542, 843-854 (2002).</li>
<li>Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Measurement+of+Current+and+Calcium+in+the+Ultraviolet-Sensitive+Cones+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish.</a> J Physiol. 579, 15-27 (2007).</li>
<li>Matthews, H. R., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Spot+Confocal+Technique+to+Measure+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors.</a> Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).</li>
<li>Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+Calcium+Stores+Regulates+Calcium+Influx+and+Signal+Transmission+in+Rod+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors.</a> J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).</li>
<li>Krizaj, D., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Calcium+Extrusion+Mechanisms+in+the+Outer+and+Inner+Segments+of+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors.</a> Neuron. 21, 249-256 (1998).</li>
<li>Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+Magnesium+Concentration+in+Salamander+Photoreceptor+Outer+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments.</a> J Physiol. 553, 125-135 (2003).</li>
<li>Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Behavior+of+Rod+Photoreceptor+Disks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks.</a> Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).</li>
<li>Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+Microfluorometric+Studies+of+Reduction+and+Clearance+of+Retinal+in+Bleached+Rod+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).</li>
<li>Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Cycle%3A+Dependence+of+Retinol+Production+and+Removal+on+Photoproduct+Decay+and+Cell+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology.</a> J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).</li>
<li>Koutalos, Y., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluorometric+Measurement+of+the+Formation+of+All-Trans-Retinol+in+the+Outer+Segments+of+Single+Isolated+Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors.</a> Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphotoreceptor+Retinoid-Binding+Protein+Is+the+Physiologically+Relevant+Carrier+That+Removes+Retinol+from+Rod+Photoreceptor+Outer+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments.</a> Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Cycle+and+Its+Metabolic+Support+in+Gecko+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors.</a> Vision Res. 47, 363-374 (2007).</li>
<li>Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+All-Trans+Retinol+after+Visual+Pigment+Bleaching+in+Mouse+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Jeśli nie uda się uzyskać zdrowych, wyizolowanych komórek, problem leży albo w procesie izolacji lub stanie zdrowotnym siatkówki, albo w sposobie jej rozdrabniania. Zazwyczaj po usunięciu przedniej części oka oraz ciała szklistego siatkówka łatwo oddziela się od nabłonka barwnego. Jeśli tak się nie dzieje, należy spróbować ją odwarstwić, zaczynając od obwodu gałki ocznej. Jeżeli oddzielenie nadal sprawia trudności, prawdopodobną przyczyną może być niewystarczający czas adaptacji zwierzęcia do ciemności lub zbyt intensywn...

<table><tbody><tr><td>Ciemnia (100-150 ft&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Światła czerwone&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Sklepy internetowe</td></tr><tr><td>Źródła światła podczerwonego i podglądacze obrazu w podczerwieni</td><td>FJW Optical Systems, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Wyposażony w podglądacze w podczerwieni</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny zamknięty w szczelnej klatce świetlnej&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do sekcji (nożyczki, pęsety, uchwyt do ostrza)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastomer Sylgard</td><td>Essex (Charlotte, NC)</td><td>Zestaw elastomeru Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine (0,01%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine (0,1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Rozcieńczyć do 0,01%</td></tr><tr><td>Komory eksperymentalne</td><td>Warner Instruments</td><td>D3512P</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego, plastikowe pipety</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie żywych, wyizolowanych fotoreceptorów kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

W siatkówce kręgowców fototransdukcja, czyli konwersja światła na sygnał elektryczny, jest realizowana przez fotoreceptory pręcikowe i czopkowe1-4. Fotoreceptory pręcikowe odpowiadają za widzenie w słabym świetle, a czopki w świetle jasnym. Fototransdukcja zachodzi w segmencie zewnętrznym komórki fotoreceptora, który jest wyspecjalizowaną strukturą zawierającą wysokie stężenie barwnika wzrokowego, będącego głównym detektorem światła. Barwnik wzrokowy składa się z chromoforu, 11-cis-retinalu, przyłączonego do białka – opsyny. Foton pochłonięty przez barwnik wzrokowy izomeryzuje chromofor z formy 11-cis do all-trans. Ta fotoizomeryzacja powoduje zmianę konformacyjną barwnika wzrokowego, która inicjuje kaskadę reakcji kończących się zmianą potencjału błonowego, co prowadzi do transdukcji bodźca świetlnego na sygnał elektryczny. Powrót komórki do stanu spoczynku po stymulacji światłem obejmuje dezaktywację produktów pośrednich aktywowanych przez światło oraz przywrócenie potencjału błonowego. Ca2+ moduluje aktywność kilku enzymów zaangażowanych w fototransdukcję, a jego stężenie ulega zmniejszeniu podczas stymulacji światłem. W ten sposób Ca2+ odgrywa istotną rolę w regeneracji komórki po stymulacji świetlnej oraz w jej adaptacji do światła tła.
Kolejnym niezbędnym elementem procesu regeneracji jest odnowienie barwnika wzrokowego, który uległ rozkładowi podczas detekcji światła w wyniku fotoizomeryzacji jego chromoforu 11-cis do formy all-trans5-7. Regeneracja ta rozpoczyna się od uwolnienia retinalu all-trans przez fotoaktywowany barwnik, w wyniku czego pozostaje apoproteinowa opsyna. Uwolniony retinal all-trans jest szybko redukowany w reakcji z wykorzystaniem NADPH do retinolu all-trans, natomiast opsyna łączy się ze świeżym retinalem 11-cis dostarczonym do segmentu zewnętrznego, aby ponownie utworzyć barwnik wzrokowy. Retinol all-trans jest następnie transportowany z segmentu zewnętrznego do sąsiednich komórek przez wyspecjalizowany transporter – białko wiążące retinoidy międzyfotoreceptorowe (IRBP).
Obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych komórek fotoreceptorowych może być wykorzystywane do badania ich fizjologii i biologii komórki. Barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ mogą służyć do szczegółowego badania zależności między zmianami stężenia Ca2+ w segmencie zewnętrznym a odpowiedzią na światło8-12, a także do analizy roli zapasów Ca2+ w segmencie wewnętrznym w homeostazie Ca2+13,14. Barwniki fluorescencyjne mogą być również stosowane do pomiaru stężenia Mg2+15, pH oraz jako znaczniki przedziałów wodnych i błonowych16. Wreszcie, wewnętrzna fluorescencja all-trans-retinolu (witaminy A) może być wykorzystana do monitorowania kinetyki jego powstawania i usuwania w pojedynczych komórkach fotoreceptorowych17-19.

Opisano metodę przygotowania pojedynczych żywych fotoreceptorów z różnych gatunków kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta może być wykorzystana do obrazowania fluorescencji endogennych fluoroforów, takich jak NADH lub witamina A, bądź egzogennych barwników fluorescencyjnych wrażliwych na Ca2+ lub inne czynniki.

Przygotowanie żywych, wyizolowanych fotoreceptorów kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego

W siatkówce kręgowców fototransdukcja, czyli konwersja światła na sygnał elektryczny, jest realizowana przez fotoreceptory: pręciki i czopki1-4. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie pojedynczych żywych komórek fotoreceptorów do obrazowania fluorescencyjnego. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację siatkówki zaadaptowanej do ciemności. Drugim krokiem procedury jest izolacja pojedynczych żywych komórek fotoreceptorów.Trzecim krokiem procedury jest przeniesienie komórek do komory eksperymentalnej. Czwartym krokiem procedury jest umieszczenie komory na stoliku mikroskopu. Ostatnim krokiem procedury jest wybór zdrowej komórki do obrazowania fluorescencyjnego, co w efekcie pozwala uzyskać wyniki ukazujące zmiany w metabolizmie komórkowym, sygnalizacji, transporcie wewnątrzkomórkowym lub utlenianiu w czasie rzeczywistym poprzez obrazowanie fluorescencji komórek.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie fotoreceptorów kręgowców, takie jak usuwanie toksycznych produktów ubocznych czy detekcja światła. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię chorób siatkówki, ponieważ może ona być wykorzystywana do badania komórek fotoreceptorowych w mysich modelach tych schorzeń. Przed rozpoczęciem protokołu należy odpowiednio wcześniej przygotować różnorodne materiały.W pierwszej kolejności,

preparation-living-isolated-vertebrate-photoreceptor-cells-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie żywych izolowanych komórek fotoreceptorowych kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015).W niniejszym filmie zaprezentowano metodę dostarczania genów za pomocą AAV do siatkówki transgenicznej myszy, a następnie sekcję tkanek i barwienie w celu oceny integralności wewnętrznej błony ograniczającej.

Dostarczanie genów za pomocą AAV w celu wizualizacji zaburzeń integralności błony siatkówki

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy kombinatoryczne podejście do klasyfikacji typów komórek neuronalnych przed izolacją i późniejszej charakterystyki transkryptomów jednokomórkowych. Protokół ten optymalizuje przygotowanie próbek do udanego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i opisuje metodologię zaprojektowaną specjalnie w celu lepszego zrozumienia różnorodności komórkowej.

Sekwencja RNA pojedynczej komórki zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Obrazowanie tkanki siatkówki może dostarczyć informacji o pojedynczej komórce, której nie można uzyskać tradycyjnymi metodami biochemicznymi. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków siatkówki od danio pręgowanego do obrazowania konfokalnego. Fluorescencyjne czujniki kodowane genetycznie lub barwniki wskaźnikowe umożliwiają wizualizację wielu procesów biologicznych w różnych typach komórek siatkówki.

Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H2O2) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H2O2 podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Poznaj metodę izolacji żywych komórek fotoreceptorowych kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego. Technika umożliwia wizualizację zmian metabolicznych i sygnałowania w czasie rzeczywistym.

Przygotowanie żywych, wyizolowanych fotoreceptorów kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów