Name: Analiza morfologii dendrytycznych kręgosłupów w hodowanych neuronach OUN (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj analizę morfologii dendrytycznych kręgosłupów w hodowanych neuronach kory mózgowej przy użyciu GFP i mikroskopii konfokalnej. Ta metoda pozwala badać dynamikę struktur synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Kelly Jones za staranną redakcję. Praca ta była wspierana przez grant NIH R01MH 071316, Alzheimer's Association, National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) oraz National Alliance for Autism Research (NAAR) (P.P.); stypendium podoktorskie American Heart Association (D.P.S.); stypendium przeddoktorskie American Heart Association (K.M.W.).

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

Produkcja niniejszej pracy była wspierana przez MetaMorph (Molecular Devices, Inc.).

Opisane powyżej techniki szczegółowej analizy ilościowej morfologii kolców dendrytycznych, gęstości liniowej i ruchomości w utrwalonych lub żywych pierwotnych neuronach korowych koncentrują się na zrozumieniu wpływu mechanizmów postsynaptycznych, które mogą przyczyniać się do neuropatologii. Podobne podejście można zastosować do ilościowego określenia morfologii lub ruchomości kolców w każdym neuronie kolczastym, w tym w neuronach piramidalnych hipokampa, komórkach Purkinjego lub średnich neuronach kolczastych.
<p cl...

<table><tbody><tr><td>Okładka szkiełka nr 1.5, okrągła 18 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0714 (CS-18R15)</td><td></td></tr><tr><td>Okładka szkiełka nr 1.5, kwadratowa 22 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0721 (CS-22S15)</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0899</td><td>MW 70~150 Kda</td></tr><tr><td>Pożywka Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>D,L-APV (AP-5)</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-004</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-060-C 1</td><td>1M, pH 7</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>EMD Millipore</td><td>FX0415-5</td><td>36%, stopień histologiczny</td></tr><tr><td>Normalne surowica kozia</td><td>VWR international</td><td>100188-514</td><td>Jackson Immunoresearch Labs</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC21568-2500</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało kozie anty-mysie IgG (H+L) silnie adsorbowane krzyżowo</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało kozie anty-krolicze IgG (H+L) silnie adsorbowane krzyżowo</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik antyblaknący ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td>Opakowanie specjalne</td></tr><tr><td>Zamknięta komora stolika obrazującego</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-30HV</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka sterowania temperaturą</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach oun

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Kolce dendrytyczne są miejscami większości połączeń pobudzających w mózgu i tworzą komponent postsynaptyczny synaps. Struktury te są bogate w aktynę i wykazują wysoką dynamikę. W odpowiedzi na klasyczną plastyczność Hebba, a także sygnały neuromodulacyjne, kolce dendrytyczne mogą zmieniać swój kształt i liczbę, co uznaje się za kluczowe dla doprecyzowania obwodów neuronalnych oraz przetwarzania i przechowywania informacji w mózgu. Wewnątrz kolców dendrytycznych złożona sieć białek łączy sygnały pozakomórkowe z cytoszkieletem aktynowym, umożliwiając kontrolę morfologii i liczby kolców dendrytycznych. Badania neuropatologiczne wykazały, że szereg stanów chorobowych, od schizofrenii po zaburzenia ze spektrum autyzmu, charakteryzuje się nieprawidłowanią morfologią lub liczbą kolców dendrytycznych. Co więcej, niedawne badania genetyczne zidentyfikowały mutacje w licznych genach kodujących białka synaptyczne, co sugeruje, że białka te mogą przyczyniać się do aberrantnej plastyczności kolców, która częściowo leży u podstaw patofizjologii tych zaburzeń. Aby zbadać potencjalną rolę tych białek w kontrolowaniu morfologii/liczby kolców dendrytycznych, zastosowanie hodowlanych neuronów korowych oferuje kilka zalet. Po pierwsze, system ten pozwala na obrazowanie kolców dendrytycznych o wysokiej rozdzielczości w komórkach utrwalonych, a także obrazowanie poklatkowe żywych komórek. Po drugie, ten system in vitro umożliwia łatwą manipulację funkcją białek poprzez ekspresję białek zmutowanych, wyciszanie za pomocą konstruktów shRNA lub traktowanie farmakologiczne. Techniki te pozwalają badaczom na rozpoczęcie analizy roli białek związanych z chorobami oraz przewidywanie, w jaki sposób mutacje tych białek mogą funkcjonować in vivo.

Liczne niedawne badania zidentyfikowały mutacje w białkach synaptycznych powiązanych z patologiami mózgu. Pierwotne hodowle neuronów korowych zapewniają dużą elastyczność w badaniu wpływu tych białek związanych z chorobami na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych.

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

Kolce dendrytyczne są miejscami większości połączeń pobudzających w mózgu i tworzą postsynaptyczny przedział synaps. Te ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena wpływu różnych manipulacji molekularnych i farmakologicznych na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych. Osiąga się to poprzez transdukcję pierwotnych hodowli neuronów korowych za pomocą GFP, z egzogenną lub bez egzogennej ekspresji plazmidów DNA, aby zarysować morfologię neuronów oraz manipulować ekspresją i funkcją endogennych białek. W drugim kroku komórki można poddać działaniu środków farmakologicznych, a następnie utrwalić do barwienia immunocytochemicznego lub przygotować do obrazowania poklatkowego.Następnie stosuje się leczenie farmakologiczne, które umożliwi wizualizację kolców dendrytycznych oraz wywołanych zmian w ich morfologii i ruchliwości. Kolejno, za pomocą mikroskopu konfokalnego, pozyskuje się obrazy serii Z dla utrwalonych komórek lub obrazy żywych komórek pobrane w określonych punktach czasowych. Szczegółowe pomiary morfologii kolców dendrytycznych można wykonać na podstawie projekcji 2D obrazów serii Z.Uzyskane wyniki wykazują wpływ manipulacji molekularnych lub farmakologicznych na morfologię lub ruchomość kolców dendrytycznych, w oparciu o ilościową analizę morfologiczną kształtu lub ruchomości tych kolc

analysis-of-dendritic-spine-morphology-in-cultured-cns-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowli neuronów OUN

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

Źródło: Gouder, et. al. Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2015).Ten film przedstawia obrazowanie i analizę kolców dendrytycznych w transdukowanych, znakowanych immunologicznie neuronach piramidowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Szum tła jest redukowany, a dendryty są śledzone, szacując ich średnicę i długość. Automatyczna segmentacja kręgosłupa polega na...

Kwantyfikacja kolców dendrytycznych za pomocą obrazowania w mikroskopii konfokalnej

Ten artykuł opisuje działający protokół obrazowania kolców dendrytycznych z neuronów hipokampa in vitro za pomocą Mikroskopii Iluminacji Strukturalnej (SIM). Mikroskopia superrozdzielcza wykorzystująca SIM zapewnia rozdzielczość obrazu znacznie wykraczającą poza granicę dyfrakcji światła we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych, umożliwiając obrazowanie pojedynczych kolców dendrytycznych z większą szczegółowością.

Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Opisujemy dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modeli mysich: obrazowanie w czasie rzeczywistym i rozszerzoną głębię ostrości. Podczas gdy pierwsza metoda pozwala na zaawansowane śledzenie topograficzne i ilościowe określenie zakresu rozgałęzień, druga pozwala na szybką wizualizację drzewa dendrytycznego.

Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy szczegółowo protokół Golgi-Cox. Ta niezawodna metoda barwienia tkanek pozwala na wysokiej jakości ocenę cytoarchitektury w hipokampie i w całym mózgu, przy minimalnym rozwiązywaniu problemów.

Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa

Przedstawiamy protokół do oznaczania i analizowania neuronów piramidowych, który jest kluczowy dla oceny potencjalnych zmian morfologicznych w neuronach i kolcach dendrytycznych, które mogą leżeć u podstaw nieprawidłowości neurochemicznych i behawioralnych.

Znakowanie balistyczne neuronów piramidowych w wycinkach mózgu i w pierwotnej hodowli komórkowej

Kolce dendrytyczne są ważnymi cechami komórkowymi układu nerwowego. W tym miejscu opisano metody obrazowania na żywo służące do oceny struktury i funkcji kolców dendrytycznych u C. elegans. Podejścia te wspierają rozwój zmutowanych badań przesiewowych dla genów, które definiują kształt lub funkcję kolców dendrytycznych.

Obrazowanie kolców dendrytycznych u Caenorhabditis elegans

Protokół opisuje modyfikację szybkiej metody Golgiego, która może być dostosowana do dowolnej części układu nerwowego, do barwienia neuronów w hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej szczura.

Szybkie barwienie Golgiego do wizualizacji dendrytycznego kręgosłupa w hipokampie i korze przedczołowej

Kolce dendrytyczne są postsynaptycznymi przedziałami większości synaps pobudzających. Zmiany w morfologii kolców dendrytycznych występują podczas rozwoju neurologicznego, starzenia się, uczenia się oraz wielu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, co podkreśla znaczenie wiarygodnej analizy kręgosłupa dendrytycznego. Protokół ten opisuje ilościowe określanie morfologii kolców dendrytycznych w sposób dokładny i powtarzalny przy użyciu oprogramowania do automatycznej trójwymiarowej...

Kwantyfikacja dendrytycznego kręgosłupa za pomocą automatycznego oprogramowania do trójwymiarowej rekonstrukcji neuronów

Poznaj analizę morfologii dendrytycznych kręgosłupów w hodowanych neuronach kory mózgowej przy użyciu GFP i mikroskopii konfokalnej. Ta metoda pozwala badać dynamikę struktur synaptycznych.

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

Przeglądaj więcej filmów