Name: Immunoprecypitacja chromatyny z tkanki zwojów korzenia grzbietowego po urazie aksonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę immunoprecypitacji chromatyny z tkanki zwojów korzenia grzbietowego po urazie aksonów. Technika ta pozwala identyfikować miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych i modyfikacje epigenetyczne kluczowe dla regeneracji nerwów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Andrei Tedeschiemu za pomoc w przygotowaniu wstępnych eksperymentów ChIP w laboratorium oraz Ricco Lindnerowi za wkład w dopracowanie warunków przeprowadzania ChIP. Praca ta była wspierana przez Fundację Hertie, grant Fortune z Uniwersytetu w Tübingen oraz granty DFG DI 1497/1-1 (wszystkie przyznane Simone Di Giovanni).

1. Uszkodzenie nerwu kulszowego i tylnych sznurów rdzenia kręgowego
<ol>
 <li>Zwierzę umieszcza się na ręczniku chirurgicznym, pod którym przez cały czas trwania procedury znajduje się mata grzewcza, utrzymująca temperaturę ciała myszy na poziomie 37°C. Wszystkie zwierzęta są znieczulane do zabiegu poprzez ciągłą administrację izofluranu/O2. Instrumenty chirurgiczne są autoklawowane przed rozpoczęciem procedury.</li>
 <li>W przypadku urazu nerwu kulszowego, obie tylne kończyny są dokładnie golone, a depilacja jest dopełniana za pomocą ogólnego preparatu do usuwania włosów przed oczyszczeniem skóry alkoholem, a następnie trzykrotnym przemyciem Betadynem.</li>
 <li>Nerw kulszowy zostaje odsłonięty poprzez wykonanie 4 mm nacięcia skóry w połowie uda, z tyłu i równolegle do kości udowej, oraz przez rozsuniecie mięśni biceps femoris za pomocą precyzyjnej pęsety.</li>
 <li>Następnie odsłonięty nerw kulszowy zostaje uszkodzony, a skóra zamknięta za pomocą dwóch klamer chirurgicznych.</li>
</ol>
UWAGA: W celu wykonania procedury pozorowanej (sham injury) wykonuje się to samo cięcie, aby odsłonić nerw kulszowy, jednak ranę zaszywa się, pozostawiając nerw nienaruszonym.
<ol start="5">
 <li>W przypadku uszkodzenia słupów tylnych, plecy myszy są ostrożnie golone, a depilację kończy się za pomocą ogólnego preparatu do usuwania owłosienia przed oczyszczeniem skóry sprayem lub gazikiem nasączonym alkoholem.</li>
 <li>Rdzeń kręgowy zostaje odsłonięty poprzez wykonanie nacięcia o długości 2,5 cm od poziomu ok. T7 do T13. Skóra jest rozszerzana, a tkanka łączna usuwana wzdłuż kręgów od T9 do T11.</li>
 <li>Na poziomie T10 wykonuje się laminektomię.</li>
</ol>
UWAGA: W większości eksperymentów laminektomię uznaje się za uraz pozorowany (Sham).
<ol start="8">
 <li>Do tkanki dodaje się kilka kropli ksylokainy w celu znieczulenia rdzenia, a następnie usuwa oponę twardą, dbając o to, aby nie dotknąć rdzenia kręgowego.</li>
 <li>Następnie uszkadza się słup tylny i zaszywa mięśnie, ponownie dbając o to, by nie dotknąć rdzenia kręgowego. Na koniec skórę zamyka się za pomocą klipsów chirurgicznych. Buprenorfinę (0.1 mg/kg masy ciała) należy podawać dwa razy dziennie przez 48 h lub do momentu, gdy nie będzie już potrzebna.</li>
</ol>
2. Sieciowanie
<ol>
 <li>Po eutanazji myszy z uszkodzeniami wypreparować zwoje grzbietowe (DRG) L4 i L5. Zebrać łącznie 16 DRG do lodowatego roztworu HBSS z koktajlem inhibitorów proteaz (po 2 DRG uszkodzonych i 2 DRG z grupy kontrolnej sham od każdego zwierzęcia, łącznie z 4 zwierząt).</li>
 <li>Krótko odwirować DRG, a następnie ostrożnie usunąć HBSS i dodać 500 μl 1% formaldehydu w PBS z koktajlem inhibitorów proteaz; inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
KROK KRYTYCZNY. Należy użyć świeżego formaldehydu klasy do biologii molekularnej.
<ol start="3">
 <li>Dodaj 125 mM glicyny, aby przerwać utrwalanie, i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Krótko odwiruj, odessij bufor i przemyj tkankę dwukrotnie 500 μl schłodzonego do temperatury lodowej PBS + koktajlem inhibitorów proteaz.</li>
</ol>
3. Przygotowanie jąder komórkowych i fragmentacja chromatyny
<ol>
 <li>Odssać PBS, dodać 400 μl buforu lizującego z SDS, przenieść do schłodzonej rurki do mikrowirówki i rozbić tkankę, wykonując około 30 ruchów mikropestle.</li>
</ol>
KROK KRYTYCZNY. Lizą i rozbicie tkanki są niezbędne dla uzyskania dobrej wydajności sieciowanej chromatyny.
<ol start="2">
 <li>Poddaj próbkę sonikacji, stosując 8 impulsów po 10 sekund każdy, przy mocy 70% (Bandelin, Sonoplus GM70).</li>
</ol>
OSTROŻNIE. Stopień ścinania chromatyny musi zostać zoptymalizowany dla konkretnej konfiguracji sonikacji, a prawidłową fragmentację chromatyny należy sprawdzić przed przeprowadzeniem właściwego eksperymentu IP (patrz sekcja 3).
UWAGA. Fragmentację chromatyny można również przeprowadzić poprzez trawienie nukleazą mikrokokkalną (MNase). Co do zasady, fragmentacja przez sonikację jest preferowana dla utrwalonych tkanek, natomiast trawienie MNase jest wskazane dla immunoprecypitacji chromatyny z natywnych tkanek. Sieciowana, pofragmentowana chromatyna może być przechowywana w temperaturze -80° C do 2 miesięcy, jednak należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i odmrażania.
4. Analiza trawienia chromatyny (rekomendowana)
<ol>
 <li>Pobrać 10 μl próbki rozciętej chromatyny do analizy. Dodać do próbki NaCl do stężenia 200 mM i odwrócić sieciowanie poprzez inkubację w temperaturze 65° C przez 2h.</li>
 <li>Oczyścić DNA (patrz sekcja 8) i przeprowadzić elektroforezę na 1% żelu agarozowym. DNA powinno być pofragmentowane do długości około 200-1000 bp (Rysunek 1).</li>
</ol>
UWAGA. Nadmierna fragmentacja chromatyny może prowadzić do osłabienia sygnału, natomiast niepełna fragmentacja spowoduje obniżenie rozdzielczości i zwiększenie tła.
5. Immunoprecypitacja
<ol>
 <li>Wyznaczyć liczbę reakcji immunoprecypitacji (patrz UWAGA poniżej) i równomiernie podzielić próbki do nowych probówek. Uzupełnić objętość każdej z nich do 500 μl za pomocą buforu ChIP + koktajlu inhibitorów proteaz.</li>
 <li>Pobrać 5 μl rozcieńczonej próbki i przenieść do nowej probówki. Jest to próbka wejściowa (input) 1%, którą należy przechowywać w temperaturze -20° C do czasu wykorzystania (Sekcja 7).</li>
 <li>Do każdej immunoprecypitacji dodać odpowiednie przeciwciało lub kontrolę w postaci normalnego IgG i inkubować przez noc w temperaturze 4°C przy stałym mieszaniu rotacyjnym.</li>
</ol>
UWAGA. Podczas określania liczby immunoprecypitacji należy uwzględnić kontrolę dodatnią (np. przeciwciało przeciwko histonie H3) oraz kontrolę ujemną (normalna IgG). Ilość przeciwciała wykorzystywana do każdego IP różni się w zależności od przeciwciała i musi zostać określona empirycznie. Zazwyczaj mieści się ona jednak w zakresie 2-10 ?g/immunoprecypitacja.
<ol start="4">
 <li>Aby przeprowadzić immunoprecypitację kompleksu przeciwciało/białko/DNA, dodaj 30 μl magnetycznych kulek Protein G klasy ChIP i inkubuj przez 2 h w temperaturze 4°C przy stałym obracaniu.</li>
</ol>
6. Płukanie
<ol>
 <li>Aby wyizolować kompleks chromatyny związanej z koralikami, umieść probówkę na statywie magnetycznym. Odczekaj, aż roztwór stanie się klarowny, a następnie ostrożnie usuń nadsącz.</li>
 <li>Do koralików dodaj 1 ml buforu do płukania o niskim zasoleniu (bufor ChIP) i inkubuj w temperaturze 4°C przez 3-5 minut przy jednoczesnej rotacji, a następnie wyizoluj koraliki i odessaj bufor płuczący, postępując zgodnie z krokiem 6.1. Powtórz ten krok łącznie 3 razy.</li>
 <li>Do koralików dodaj 1 ml buforu do płukania o wysokim zasoleniu (bufor ChIP+ 350 mM NaCl) i inkubuj przez 3-5 minut przy jednoczesnej rotacji, a następnie wyizoluj koraliki i odessaj bufor płuczący, postępując zgodnie z krokiem 6.1.</li>
</ol>
7. Elucja i odwracanie sieciowania
<ol>
 <li>Wyjąć próbki wejściowe (input) z temperatury -20°C, dodać 150 μl buforu do elucji ChIP i odstawić w temperaturze pokojowej do kroku 7.5.</li>
 <li>Do każdej próbki IP z kroku 6.3 dodać 150 μl 1x buforu do elucji ChIP.</li>
 <li>Umieścić probówki w termomikserze i eluować chromatynę z kulek, inkubując próbki w temperaturze 65°C przez 30 minut przy delikatnym mieszaniu w vortexie.</li>
 <li>Odseparować kuleczki za pomocą statywu magnetycznego i ostrożnie przenieść eluowaną chromatynę (nadosad) do nowych probówek.</li>
 <li>Do wszystkich probówek, w tym do próbek wejściowych, dodać NaCl do stężenia 200mM oraz Proteinazę K w ilości 40 μg/reakcję i inkubować w temperaturze 65°C przez 2 godziny.</li>
</ol>
UWAGA. Etap elucji można przeprowadzić również w temperaturze pokojowej, jednak może on być mniej wydajny.
8. Odzysk DNA
<ol>
 <li>Do próbek z kroku 7.5 dodać 1 objętość fenolu/chloroformu i mieszać w wstrząsarze wierzchołkowym przez 30 sekund.</li>
 <li>Wirować z maksymalną prędkością w mikrowirowarce w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
 <li>Ostrożnie przenieść fazę wodną (górną) do nowych probówek, dodać 1 objętość chloroformu do fazy wodnej i mieszać w wstrząsarze wierzchołkowym przez 30 sekund.</li>
 <li>Wirować z maksymalną prędkością w mikrowirowarce w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
 <li>Ostrożnie przenieść fazę wodną (górną) do nowych probówek, a następnie dodać 300mM NaOAc, 20 μg/reakcję glikogenu oraz 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu.</li>
</ol>
UWAGA. Dodanie nośnika, takiego jak glikogen, jest konieczne w celu zwiększenia wydajności precypitacji stosunkowo małych fragmentów DNA.
<ol start="6">
 <li>Inkubować w temperaturze -80°C przez 2 godziny w celu wytrącenia DNA.</li>
</ol>
UWAGA. Etap wytrącania można również przeprowadzić przez noc w temperaturze -20°C.
<ol start="7">
 <li>Wirować próbki z maksymalną prędkością w mikrowirówce przez 20 minut w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć nadsącz i przemyć osady wytrąconego DNA 300 μl lodowatego 70% etanolu.</li>
 <li>Wirować próbki z maksymalną prędkością w mikrowirówce przez 10 minut w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć jak najwięcej nadsączu i pozostawić osady do wyschnięcia na powietrzu.</li>
 <li>Resuspender w 20 μl sterylnej H2O. Próbki są teraz gotowe do reakcji PCR lub DNA można przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
Przedstawiono reprezentatywny wynik eksperymentu ChIP w zwojach rdzeniowych (DRGs) po uszkodzeniu nerwu kulszowego (ryciny 1 i 2). Po pierwsze, pokazujemy DNA po fragmentacji do długości około 200-1000 bp (rycina 1). Po drugie, wykazujemy sygnał PCR po ChIP z proksymalnego promotora białka związanego ze wzrostem-43 (GAP-43) wyłącznie po uszkodzeniu nerwu kulszowego (ścieżka 4, rycina 2, 5'). Brak sygnału PCR występuje w przypadku zwierzęcia poddanego jedynie zabiegowi pozorowanemu (ścieżka 3) oraz przy użyciu normalnego serum IgG do immunoprecypitacji (IP) (ścieżki 5 i 6). Aby przetestować specyficzność przeciwciała, przeanalizowano te same próbki DNA, stosując zestaw starterów kontrolnych wykrywających region w 3'-UTR badanego genu, w którym nie oczekuje się wiązania białka. Sygnały PCR są nieobecne we wszystkich ścieżkach (ścieżki 3-6, rycina 2, 3'), z wyjątkiem sygnału wejściowego (input), reprezentującego próbki DNA bez IP jako standardowe kontrole PCR (ścieżki 1-2, rycina 2). Tę procedurę ChIP można przeprowadzić po uszkodzeniu nerwu kulszowego lub tylnych słupów rdzenia kręgowego, co przedstawiono na schemacie (rycina 3).
<img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="Elektroforeza, fragmenty DNA, schemat żelu, marker wielkości, rozdział DNA poddanego sonikacji, analiza rozmiaru." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Żel agarozowy DNA z odwróconymi wiązaniami krzyżowymi, który został poddany sonikacji w celu uzyskania odpowiedniego zakresu długości fragmentów.
<img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="Wynik immunoprecypitacji chromatyny; koniec 5'-proksymalny, 3'-UTR; analiza oddziaływań DNA-białko." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wyniki półilościowej reakcji PCR z tkanek zwojów korzeni grzbietowych (DRG) po uszkodzeniu nerwu kulszowego, wykazujące, że acetylowane p53 wiąże się z proksymalnym regionem promotora GAP-43 48 godzin po urazie nerwu kulszowego. Kontrolna reakcja PCR z tych samych tkanek DRG wykazuje, że acetylowane p53 nie wiąże się z kontrolnym regionem DNA znajdującym się w 3’-nieprzetłumaczonym regionie (UTR) genu GAP-43 (S = grupa pozorowana, I = grupa z urazem).
<img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="Schemat przekroju poprzecznego rdzenia kręgowego, przedstawiający uszkodzenie w słupie tylnym w badaniu nad urazem nerwu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Ogólny schemat przedstawiający lokalizację miejsc uszkodzeń w nerwie kulszowym oraz w słupie tylnym.

<ol><li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li>
<li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarey%2C+MF+%22Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%22">Chromatin immunoprecipitation (ChIP)</a>. , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).</li>
<li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28%26mu%3BChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li>
<li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Makwana, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li>
<li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+p53-CBP%2Fp300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression%2C+axon+outgrowth%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li>
<li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół przedstawia metodę bezpośredniego badania środowiska chromatyny podczas regeneracji aksonalnej w dorosłym układzie nerwowym po urazie aksonów. Łączy on model uszkodzenia zwojów korzeni grzbietowych (DRG) z immunoprecypitacją chromatyny w celu zbadania środowiska transkrypcyjnego i epigenetycznego po urazie obwodowego (PNS) lub ośrodkowego (CNS) układu nerwowego. Jest on szczególnie przydatny dla badaczy pragnących scharakteryzować domniemane miejsca wiązania dla konkretnego czynnika transkrypcyjnego or...

<table><tbody><tr><td>10x bufor do ChIP</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7008</td><td></td></tr><tr><td>2x bufor do elucji ChIP</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7009</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne kulki Protein G klasy ChIP</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9006</td><td></td></tr><tr><td>Statyw Magna Grip (8 pól)</td><td>EMD Millipore</td><td>20-400</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>UN 1888</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyd</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>CP10.1</td><td></td></tr><tr><td>10x roztwór glicyny</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko histonie H3 (królik)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2650</td><td></td></tr><tr><td>Normalne królice IgG</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/alkohol izoamylkowy</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z koktajlem inhibitorów proteaz</td><td>Roche Group</td><td>04 693 116 001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K (20 mg/ml)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy SDS</td><td>Upstate, Millipore</td><td>20-163</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecypitacja chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonalnym

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Aksony w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) nie regenerują się, podczas gdy aksony w obwodowym układzie nerwowym (OUN) regenerują się w ograniczonym stopniu po urazie (Teng et al., 2006). Przyjmuje się, że programy transkrypcyjne niezbędne do wzrostu neurytów i aksonów ulegają reaktywacji po urazie w OUN (Makwana et al., 2005). Jednakże narzędzia dostępne do analizy regulacji genów neuronalnych in vivo są ograniczone i często stanowią wyzwanie.
Zwoje rdzeniowe tylne (DRG) stanowią doskonały model systemu uszkodzeń, ponieważ zarówno OUN, jak i OUN są unerwione przez rozgałęziony akson pochodzący z tego samego somy. Zwoje te reprezentują wydzieloną grupę ciał komórkowych, w których zachodzą wszystkie zdarzenia transkrypcyjne, zapewniając tym samym wyraźnie zdefiniowany obszar aktywności transkrypcyjnej, który można w łatwy i powtarzalny sposób usunąć z organizmu zwierzęcia. Uszkodzenie włókien nerwowych w OUN (np. nerwu kulszowego), gdzie zachodzi regeneracja aksonalna, powinno ujawnić zestaw programów transkrypcyjnych odmiennych od tych odpowiadających na podobne uszkodzenie w OUN, gdzie regeneracja nie ma miejsca (np. w rdzeniu kręgowym). Miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych oraz modyfikacje histonów i DNA wynikające z uszkodzenia OUN lub OUN można scharakteryzować za pomocą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP).
W niniejszej pracy opisujemy protokół ChIP z wykorzystaniem utrwalonej tkanki zwojów korzeni grzbietowych (DRG) myszy po urazie aksonalnym. To potężne połączenie metod umożliwia charakterystykę pro-regeneracyjnego środowiska chromatyny niezbędnego do promowania regeneracji aksonów.

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonów. Podejście to może być wykorzystane do identyfikacji specyficznych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych oraz modyfikacji epigenetycznych histonów i DNA, które są istotne dla regeneracji uszkodzonych aksonów zarówno w obwodowym, jak i ośrodkowym układzie nerwowym.

Immunoprecypitacja chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonalnym

Aksony w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) nie regenerują się, podczas gdy aksony w obwodowym układzie nerwowym (OUN) regenerują się w ograniczonym stopniu po...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest immunoprecypitacja sieciowanych kompleksów białkowo-DNA z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu nerwu. Jest to realizowane poprzez uprzednie wywołanie uszkodzenia nerwu kulszowego lub słupa tylnego rdzenia kręgowego. Drugim krokiem jest sieciowanie próbki oraz solubilizacja kompleksu białkowo-DNA.Trzecim krokiem procedury jest immunoprecypitacja specyficznego kompleksu białko-DNA. Na koniec DNA zostaje oczyszczone i odzyskane. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące wzbogacenie fragmentów DNA powiązanych z białkiem lub modyfikacją histonów DNA.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji nerwów, takie jak to, które miejsca wiązania DNA, czynniki transkrypcyjne i modyfikacje histonów są niezbędne do regulacji genów istotnych w promowaniu regeneracji aksonalnej. Aby rozpocząć, umieść znieczulone zwierzę na stole operacyjnym. Przed przystąpieniem do dalszych czynności zapewnij utrzymanie znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu poprzez ciągłe podawanie izofluranu w tlenie za pomocą maski nosowej.Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch na uciśnięcie palca stopy w celu wywołania urazu nerwu kulszowego. Ostrożnie ogól tylną ćwiartkę i usuń pozostałe włosy za pomocą środka depilującego. Po usunięciu włosów oczyść skórę, wielokrotnie aplikując alkohol, a następnie Betadine.Wykonaj nacięcie skóry o długości 4 mm, tylnie i równolegle do kości udowej. W połowie uda, używając precyzyjnej pęsety, rozsuń mięśnie, aby odsłonić znajdujący się pod nimi biały nerw kulszowy. Po wyizolowaniu nerw może pozostać nieprzecięty, aby służyć jako kontrola pozorowana, lub zostać przecięty w celu wywołania urazu.Na koniec zbliżyć brzegi skóry i zamknąć ranę za pomocą dwóch klipsów chirurgicznych w przypadku uszkodzenia kolumny grzbietowej. Usunąć sierść z pleców i oczyścić miejsce nacięcia zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Wykonać nacięcie o długości 2,5 centymetra nad rdzeniem kręgowym, mniej więcej od T7 do T13.Za pomocą precyzyjnej pęsety przytrzymaj skórę, oddzielając tkankę tłuszczową. Następnie zabezpiecz powierzchowny tłuszcz za pomocą dwóch haków. Po odsunięciu tkanki tłuszczowej zlokalizuj naczynie krwionośne w przestrzeni między szóstym a siódmym kręgiem, aby posłużyło ono jako punkt odniesienia.Przeciąć mięśnie obustronnie nad ósmym i dziesiątym kręgiem i wprowadzić dwa haki, aby utrzymać nacięcie w otwartości. Za pomocą małych nożyczek oczyścić mięśnie nad blaszką łukową od T8 do T10, trzymając wyrostek kolczysty. Wykonać laminektomię na poziomie T10 poprzez przecięcie łączącej kostki po obu stronach.Ostrożnie unieś górną połowę kręgów, aby odsłonić znajdujący się pod nimi rdzeń kręgowy. Nanieś kilka kropli 2% Xylocaine w celu znieczulenia rdzenia kręgowego, a następnie usuń oponę twardą, uważając, aby nie dotknąć rdzenia kręgowego.Zatrzymanie procedury na tym etapie pozwoliłoby na uzyskanie pozornej kontroli chirurgicznej w celu uszkodzenia kolumny grzbietowej. Wykonaj nacięcie rdzenia kręgowego o głębokości od 0,3 do 0,4 mm. Na koniec zaszyj mięśnie i zwolnij tkankę tłuszczową powierzchowną.Zzbliżyć brzegi skóry i zamknąć ranę za pomocą klipsów chirurgicznych. Umieścić zwierzę z powrotem w klatce domowej i monitorować do czasu pełnego powrotu do zdrowia. 48 godzin po urazie uśmiercić zwierzę i pobrać zwoje korzeni grzbietowych (DRG) z poziomu L4 i L5.Pierwszym krokiem jest odsłonięcie brzusznej części kręgosłupa. Następnie należy usunąć brzuszną połowę kręgów od T 12 do L 6. Aby odsłonić rdzeń kręgowy, należy zidentyfikować zwoje rdzeniowe (DRGs) znajdujące się w przestrzeniach międzykręgowych po bokach rdzenia kręgowego.Za pomocą precyzyjnej pęsety uchwycić zwoje korzeni grzbietowych (DRG) z poziomu L4 i L5, lekko je unosząc. Odciąć tkankę jak najbliżej ciała DRG. Zebrać łącznie 16 DRG od czterech zwierząt i umieścić je w lodowatym roztworze HBSS.Krótko odwiruj DRG, dodaj 500 µL 1% formaldehydu i inkubuj próbkę przez 30 minut w 37 °C. Następnie dodaj 125 mM glicyny, aby zatrzymać utrwalanie, i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po krótkim wirowaniu odessaj bufor i przemyj tkankę dwukrotnie 500 µL lodowatego PBS z dodatkiem koktajlu inhibitorów proteaz.Następnie odessaj PBS i dodaj 400 µL buforu do lizy SDS, a tkankę rozbij, wykonując około 30 ruchów mikropestle. Następnie poddaj chromatynę sonikacji, stosując osiem 10-sekundowych impulsów przy mocy 70%. Zaleca się analizę próbki w celu potwierdzenia fragmentacji DNA do długości około 200 do 1000 par zasad.Rozdziel próbkę rozdrobnionej chromatyny w równych częściach do nowych probówek. Dla każdej planowanej reakcji immunoprecypitacji uzupełnij objętość w każdej probówce do 500 µL za pomocą buforu chip z dodatkiem koktajlu inhibitorów proteaz. Następnie pobierz 5 µL rozcieńczonej próbki i przenieś do nowej probówki.Jest to próbka 1%input, którą należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Następnie do każdej probówki należy dodać przeciwciało lub kontrolne normalne IgG i inkubować w temperaturze 4 °C z rotacją przez noc. Następnego dnia.Wykonaj immunoprecypitację kompleksu, dodając 30 µL magnetycznych kulek z białkiem G i inkubując przez dwie godziny w temperaturze 4 °C przy stałym obrocie. Następnie umieść probówkę na statywie magnetycznym, aby osadzić kompleks kulek z wiążącą się chromatyną. Po całkowitym przejaśnieniu roztworu ostrożnie usuń nadsącz i wypłucz kulki trzykrotnie w 1 mL buforu niskosolnego, inkubując po każdym płukaniu od trzech do pięciu minut w temperaturze 4 °C przy stałym obrocie.Następnie wypłucz raz jednym mililitrem buforu o wysokim zasoleniu. Na tym etapie wyjmij próbkę 1% input z temperatury -20 °C i dodaj 150 µL buforu do elucji z chipa. Odstaw probówkę w temperaturze pokojowej do późniejszego użycia.Powracając do próbek IP, dodaj 150 µL jednokrotnego buforu elucyjnego do chipowania do każdej probówki. Inkubuj próbki w temperaturze 65 °C przez 30 minut, delikatnie mieszając w wortexie, aby eluować chromatynę z kulek. Oddziel kulki za pomocą statywu magnetycznego i ostrożnie przenieś eluowaną chromatynę do nowych probówek, stosując tę procedurę dla wszystkich probówek, w tym dla próbek wejściowych (input).Dodaj 200 mM chlorku sodu oraz 40 µg proteazy K na reakcję i inkubuj w temperaturze 65 °C przez dwie godziny; po inkubacji odzyskaj DNA zgodnie ze standardowymi procedurami w celu przeprowadzenia dalszych analiz. Przedstawiono wyniki półilościowej reakcji PCR z tkanki zwojów korzeni grzbietowych (DRG) po uszkodzeniu nerwu kulszowego. Ścieżki jedna i druga pokazują sygnał PCR z próbek wejściowych.Sygnał PCR w czwartej ścieżce wskazuje, że acetylowane P 53 wiąże się z proksymalnym regionem promotora gap 43 tylko po uszkodzeniu nerwu kulszowego. Brak sygnału PCR występuje w przypadku pozorowanego uszkodzenia zwierzęcia, co widać w trzeciej ścieżce, a także przy zastosowaniu normalnego serum IgG, co pokazano w ścieżkach piątej i szóstej. Kontrolna reakcja PCR z tej samej tkanki zwojów korzeni grzbietowych (DRG) wykazuje, że acetylowane P 53 nie wiąże się z kontrolnym regionem DNA zlokalizowanym w 3'-niekodującej regionie (3'-UTR) genu gap 43.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o trzech krytycznych krokach warunkujących sukces. Należy rozpocząć od wystarczającej ilości tkanki, zapewnić efektywną fragmentację i solubilizację kompleksu białko-DNA oraz dobrać odpowiednie przeciwciało do immunoprecypitacji dla badanego białka.

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Współpraca chromatynowa z przeciwciałami z tkanki zwojowia korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonów

Prezentujemy protokół izolacji aksoplazmy z nerwu kulszowego dorosłego szczura, oparty na wycięciu pęczków nerwowych i inkubacji w medium hipotonicznym w celu uwolnienia mieliny oraz lizy struktur nieaksonalnych, a następnie ekstrakcji pozostałego materiału wzbogaconego w aksony.

Izolacja aksoplazmy z nerwu kulszowego szczura

Opisano protokół obrazowania in vivo służący do monitorowania pierwotnych aksonów sensorycznych po zmiażdżeniu korzenia grzbietowego. Procedury te wykorzystują fluorescencyjną mikroskopię szerokopolową oraz myszy transgeniczne thy1-YFP i umożliwiają wielokrotne obrazowanie regeneracji aksonów na odcinku 4 cm w obwodowym układzie nerwowym (PNS) oraz oddziaływań aksonów z granicą ośrodkowego układu nerwowego (CNS).

Obrazowanie na żywo aksonów korzeni grzbietowych po ryzotomii

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Źródło: Li, Q., et al. Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje proces regeneracji aksonów w nerwie kulszowym myszy po urazie zmiażdżenia. Izolowany nerw jest utrwalony i przygotowany do obrazowania, a białka fluorescencyjne ulegają ekspresji w neuronach w celu wizualizacji wzrostu aksonów. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego śledzi się regenerację aksonów od miejsca urazu, aby ocenić zakres...

Regeneracja aksonów w nerwie kulszowym myszy po urazie zmiażdżenia

Źródło: Li, Q. et al. Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje transfekcję neuronów DRG myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu zbadania regeneracji aksonów. Przedstawiono w nim etapy dostarczania konstruktów kwasu nukleinowego do neuronów DRG, indukowania uszkodzenia nerwu kulszowego i oceny regeneracji aksonów.

Transfekcja zwojów korzenia grzbietowego myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu wspomagania regeneracji aksonów czuciowych

Opisano paradygmat uszkodzeń wykorzystujący brzuszny rdzeń nerwowy larw Drosophila do badania regeneracji i naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Dźganie, a następnie laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna w próbkach poklatkowych i utrwalonych, w połączeniu z analizą ilościową za pomocą celowo opracowanego oprogramowania i genetyki, są wykorzystywane do badania molekularnych mechanizmów regeneracji i naprawy OUN.

Paradygmat urazów do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego u Drosophila

Ten protokół przedstawia użycie iniekcji do zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z wektorem wirusowym i równoczesnym uszkodzeniem zmiażdżenia korzenia grzbietowego u dorosłego szczura jako model do badania regeneracji aksonów czuciowych. Model ten nadaje się do badania zastosowania terapii genowej w celu promowania regeneracji aksonów czuciowych.

Iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych

Elektroporacja to skuteczne podejście do dostarczania interesujących genów do komórek. Stosując to podejście in vivo na neuronach zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy (DRG), opisujemy model do badania regeneracji aksonów in vivo.

Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

Prezentowany jest tutaj rozwój konsekwentnego pozyskiwania wysokiej jakości sekcji kriostatu zwoju korzenia grzbietowego.

Procedura kriosekcji kriosekcji zwoju korzenia grzbietowego myszy

Protokół ten opisuje system mikroprzepływowy modelujący dynamikę metaboliczną neuronów po uszkodzeniu aksonalnym, umożliwiając obrazowanie, analizę multiomiczną i mechanistyczne badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej.

Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Czubki korzeniowe grzbietowe (DRG) zawierają pierwotne ciała komórkowe neuronów czuciowych i przekazują obwodowe sygnały czuciowe do rdzenia kręgowego. Niniejszy protokół opisuje metodę rozpinania czupczyków korzeniowych grzbietowych u myszy, która wspiera standaryzowaną izolację strukturalnie nietkniętych czupczyków, identyfikację anatomiczną segmentów, intuicyjną instrukcję dla początkujących użytkowników oraz zmniejszone uszkodzenie tkanki podczas procedury.

Sekcja i odizolowanie klastrów czuciowych rdzenia kręgowego myszy

Poznaj metodę immunoprecypitacji chromatyny z tkanki zwojów korzenia grzbietowego po urazie aksonów. Technika ta pozwala identyfikować miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych i modyfikacje epigenetyczne kluczowe dla regeneracji nerwów.

Immunoprecypitacja chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonalnym

Przeglądaj więcej filmów