Name: Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli narządowej jajników i jajowodów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowej hodowli organowej jajników i jajowodów w hydrożelach alginianowych. Technika umożliwia zachowanie naturalnej architektury komórek i badanie wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez Ovarian Cancer Research Fund [grant LT/UIC/01.2011], UIC Center for Clinical and Translational Science, UIC Cancer Center oraz National Institutes of Health w ramach grantu C06RR15482.
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez AAALAC, zgodnie z protokołami opieki nad zwierzętami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na UIC. Zwierzęta biorące udział w projekcie są utrzymywane w pomieszczeniach barierowych w Laboratorium Zasobów Biologicznych (BRL) na Uniwersytecie Illinois w Chicago. BRL dysponuje pełnym personelem weterynaryjnym, który monitoruje zwierzęta co najmniej dwa razy dziennie i udziela porad w zakresie opieki nad nimi.

1. Disekcja jajnika i izolacja tkanki
<ol>
	<li>Przygotować 0,5% (w/v) roztwór alginianu sodu, sporządzony według zmodyfikowanej wersji protokołu opisanego wcześniej5, stosując sterylny PBS i podgrzewając do 37°C. Mieszać przez odwracanie lub kołysanie, nie używać wirówki typu vortex. Nabrać alginian do strzykawki 1 ml z igłą 25 G i utrzymywać w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Przygotować sterylny roztwór CaCl2 o stężeniu 10mM do sieciowania alginianu podczas enkapsulacji tkanki i ogrzać do 37°C.</li>
	<li>Przygotować 1mL pożywki hodowlanej (αMEM + 5 jednostek penicyliny i 5 μg/ml streptomycyny) na dołek w płytce 24-dołkowej dla każdego eksperymentu. Do pożywki hodowlanej dodać odpowiednie leki, peptydy lub wirusy. W przypadku transfekcji przed enkapsulacją organu, inkubować tkankę z Lipofectamine 2000 i plazmidowym DNA przez cztery godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wypreparować organy z organizmu zwierzęcia, usunąć tłuszcz lub pozostałości tkanki, delikatnie oderwać błonę kalekową otaczającą jajnik i przeciąć jajnik lub jajowód na cztery części poprzez dwukrotne przedzielenie organu. Zwierzęta zostały poddane eutanazji poprzez uduszenie CO2 z następującym zwichnięciem stawów obręczy szyjnej. W przypadku jajowodu, delikatnie rozwinąć tkankę, rozdzielając łączące ją błony i rozciągając końce rurki w przeciwnych kierunkach za pomocą pęsety przed przecięciem.</li>
	<li>Nanieść pojedynczą kroplę alginianu (~1-3 μL) na wysterylizowane włókno siatkowe.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pęsety przenieść fragment organu do kropli alginianu i wycentrować kroplę, używając pęsety lub sterylnej igły.</li>
	<li>Odwrócić kroplę zawierającą fragment organu (organoid), chwytając włókno siatkowe sterylną pęsetą i obracając je do góry nogami, aby grawitacja wymusiła uformowanie się wiszącej kropli alginianu.</li>
	<li>Stukać pęsetą o krawędź 10cm szalki Petriego zawierającej roztwór 10mM CaCl2, tak aby kropla wpadła do roztworu.</li>
	<li>Inkubować przez 2 minuty, usunąć za pomocą sterylnej łyżki z otworami, aby odprowadzić nadmiar 10mM CaCl2, i przenieść do pożywki hodowlanej. Do jednego dołka płytki 24-dołkowej zawierającego pożywkę hodowlaną można przenieść do czterech żeli alginianowych. Hodować przez określony czas.</li>
</ol>
2. Degradacja alginianu i zbieranie komórek
<ol>
	<li>W celu solubilizacji żelu alginianowego inkubować hodowle w liazie alginianowej (3,4 mg/ml) rozpuszczonej w pożywce Leibovitz's L-15 w temperaturze 37°C przez 30 minut lub do całkowitego rozpuszczenia żelu.</li>
	<li>Usunąć tkankę z lizy alginianowej.</li>
	<li>W celu wyizolowania OSE, inkubować organoid z 500 jednostkami kolagenazy w pożywce Leibovitz's L-15 przez 1 godzinę8. Wymieszać w vortexie w 2-sekundowych impulsach (2 sekundy mieszania i 2 sekundy przerwy) przy średniej mocy przez 1 minutę, a następnie w 1-sekundowych impulsach (1 sekunda mieszania i 1 sekunda przerwy) przez 1 minutę. Pozostawić fragmenty organu do opadnięcia na dno probówki do mikrocentryfugi i przenieść nadsącz pipetą do nowej, sterylnej probówki do mikrocentryfugi. Wirować przez 3 minuty przy 3000 rpm, aby uzyskać osad nabłonka powierzchni jajnika.</li>
	<li>W celu wyizolowania nabłonka jajowodu, przeciąć jajowód wzdłużnie i umieścić na plastiku do hodowli tkankowych w pożywce DMEM z dodatkiem 5 jednostek penicyliny, 5 μg/ml streptomycyny oraz 4% (v/v) FBS. W ciągu 3–5 dni komórki „wyjdą” z zrębu jajowodu i zaczną rosnąć na plastiku do hodowli tkankowych9.</li>
</ol>
3. Fixacja kultur narządowych enkapsulowanych w alginianie do przygotowania przekrojów parafinowych
<ol>
	<li>Pobrać kuleczki z enkapsulowanym alginianem z pożywki hodowlanej w wybranym punkcie czasowym.</li>
	<li>Ponownie sieciować alginian w celu utwardzenia żelu, przenosząc hodowlę do sterylnego 10mM roztworu CaCl2 na dwie minuty.</li>
	<li>Utrwalić organ enkapsulowany w alginianie w 2% paraformaldehydzie zawierającym 50 mM sacharozę, 10 mM CaCl2 oraz 50 mM kdakodylan sodu, aby zapewnić zachowanie stanu stałego żelu i pełną enkapsulację tkanki podczas utrwalania.</li>
	<li>Po obróbce tkanki zatopić cały fragment hodowli organu enkapsulowanego w alginianie w parafinie i wykonać przekroje za pomocą mikrotomu, aby uzyskać skrawki o grubości 5 μm.</li>
	<li>W przypadku wykonywania immunohistochemii alginian zostanie rozpuszczony i usunięty z preparasułu ze względu na termiczną odsłonę antygenów. Podczas standardowego barwienia hematoksyliną i eozyną alginian pozostanie i zostanie zabarwiony eozyną.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Przykład trójwymiarowej hodowli organowej jajnika i jajowodu przedstawiono na Rysunku 1. Jajniki można pociąć na fragmenty o różnych rozmiarach, a OSE proliferują i migrują, aby naprawić powierzchnię uszkodzoną podczas nacięcia skalpelem. W trakcie tego procesu zachowana zostaje prawidłowa orientacja OSE względem leżącego poniżej zrębu, przy czym OSE otula jajnik. Jak pokazano na Rysunku 2, OSE jajników przeciętych na pół otulają jajnik bardziej całkowicie w porównaniu do jajników przeciętych na ćwiartki lub ósme części. Naprawa rany powierzchni jajnika może być badana w kontekście całego organu i może rzucić światło na to, w jaki sposób owulacja i naprawa powierzchni indukują transformację powierzchni jajnika.
Punkt końcowy eksperymentu zależy od wymaganych informacji. Architekturę tkanki, morfologię komórkową i specyficzne tempo wzrostu komórek można łatwo monitorować, wykorzystując skrawki parafinaowe. Na przykład, po 7 dniach hodowli w bezserwatkowym αMEM obserwuje się pojedynczą warstwę nabłonka powierzchniowego jajnika (Rycina 3A), podczas gdy dodanie 5 μg/ml insuliny przez 7 dni indukuje hiperproliferację nabłonka powierzchniowego jajnika i tworzenie wielu warstw komórek (Rycina 3B). Proliferację komórek można zmierzyć poprzez dodanie bromodeoksyurydyny do hodowli w końcowym stężeniu 10 μM na 24 h przed utrwaleniem (wstawki 3A i 3B). W przypadku hodowli utrzymywanych w bezserwatkowym αMEM, około 3-5% OSE ulega proliferacji podczas 24-godzinnego okresu znakowania (wstawka 3A), podczas gdy proliferuje większy odsetek komórek granulosa. Dodanie insuliny do pożywki zwiększa odsetek proliferujących OSE do około 30% całkowitej liczby OSE (wstawka 3B). Immunofluorescencję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) można wizualizować przez żel alginianowy za pomocą standardowej mikroskopii po transfekcji cDNA (Rycina 3C). Chociaż organokultura w alginianie umożliwia wzrost i analizę nabłonka powierzchniowego jajnika oraz pęcherzyków pierwotnych, należy zauważyć, że dojrzałe pęcherzyki wtórne nie przeżywają w tym systemie hodowlanym (Rycina 3D). Hodowla poszczególnych pęcherzyków do momentu dojrzewania w matrycy hydrożelu alginianowego została opisana w innym opracowaniu10.
Zmiany w białkach lub RNA można analizować z całego narządu lub z konkretnych typów komórek, wykorzystując degradację enzymatyczną (Ryc. 4). Traktowanie hodowanych organoidów jajnika kolagenazą pozostawia nienaruszone leżące u podstawy podścielisko (Ryc. 4C), umożliwiając jednocześnie wzbogacenie OSE w osad komórkowy uzyskany po zabiegu, choć izolowane są również niektóre komórki z podścieliska (Ryc. 4D).
<img alt="Proces hodowli komórkowej pod mikroskopem; pokazano etapy przygotowania tkanki, sekcji i inkubacji." src="/files/ftp_upload/2804/2804fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Trójwymiarowy system hodowli jajnika myszy stosowany do namnażania OSE po zranieniu. A) Pod mikroskopem usunięto kaletkę i otaczającą ją poduszkę tłuszczową. B) Nieuszkodzony jajnik (O) z jajowodem (T) i poduszką tłuszczową (F). C) Jajnik po usunięciu kaletki i poduszki tłuszczowej (lewo) oraz rozwinięty jajowód (prawo). D) Organoidy jajnika lub jajowodu umieszczono w kropelce alginianu. E) Organoidy zamknięte w alginianie naniesiono do roztworu CaCl2, co spowodowało sieciowanie alginianu i utworzenie żelu. F) Organoid jajnika zamknięty w alginianie. G) Organoid jajowodu zamknięty w alginianie. H) Organoidy zamknięte w alginianie inkubowane w pożywce hodowlanej.
<img alt="Histologiczne próbki tkanek z czynnikami rozcieńczenia, analiza mikroskopowa intensywności barwienia tkanki." src="/files/ftp_upload/2804/2804fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Powierzchnia zregenerowana przez nabłonek powierzchni jajnika mierzona za pomocą cytokeratyny 8. Enkapsulacja organoidów jajnika przez OSE po pocięciu na ósemki, ćwiartki i połowy, hodowli w medium BSA oraz pomiarze za pomocą analizy immunohistochemicznej z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko cytokeratynie 8 (CK8).
<img alt="Obraz mikroskopii histologicznej; sekcje tkanek, immunobarwienie, analiza znakowania fluorescencyjnego." src="/files/ftp_upload/2804/2804fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. System hodowlany alginianowy umożliwia przenikanie czynników wzrostu oraz transfekcję cDNA do OSE, lecz nie wspiera szybkiego wzrostu i dojrzewania pęcherzyków. A) Organoid jajnika hodowany przez 7 dni w pożywce podstawowej, analizowany pod kątem ekspresji CK8, która znakuje OSE. Wstawka: sekcje seryjne barwione na wbudowanie BrdU. B) Dodanie insuliny do pożywek hodowlanych indukuje hiperplazję OSE. Wstawka: sekcje seryjne barwione na wbudowanie BrdU. C) Organoid jajnika transfekowany cDNA w celu ekspresji GFP. D) System hodowlany alginianowy wspiera wzrost pęcherzyków pierwotnych (czerwona grot strzałki), ale nie dojrzałych pęcherzyków wtórnych (czarna strzałka).
<img alt="Obrazy mikroskopowe przekrojów tkanek; histologia, immunofluorescencja, analiza ekspresji białek." src="/files/ftp_upload/2804/2804fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. OSE można wyizolować do analizy po hodowli. A) Organoid hodowany w medium przez okres do 2 tygodni. B) Inkapsulowany organoid traktowany alginianiazą w celu pozostawienia organoidu w stanie nienaruszonym. Jajnik zabarwiono CK8, aby zaznaczyć OSE. C) Organoid traktowany kolagenazą w celu oddzielenia OSE od leżącego pod nim zrębu. Pozostały fragment tkanki zabarwiono CK8, aby uwidocznić usunięcie powierzchni jajnika. D) Zebrane po obróbce komórki są wzbogacone o OSE, co wykazuje barwienie CK8 (czerwone). Komórki poddano przeciwbarwieniu DAPI w celu zaznaczenia jąder.

<ol><li>Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2009%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2009.</a> CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+ovarian+carcinomas%3A+a+developmental+view%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The origin of ovarian carcinomas: a developmental view.</a> Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).</li>
<li>Crum, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distal+fallopian+tube%3A+a+new+model+for+pelvic+serous+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis.</a> Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).</li>
<li>Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+ovarian+organ+culture+as+a+tool+to+study+normal+ovarian+surface+epithelial+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair.</a> Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20, 45-53 (1999).</li>
<li>Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as biomaterials.</a> Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).</li>
<li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).</li>
<li>Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+methoxychlor+and+estradiol+on+cytochrome+p450+enzymes+in+the+mouse+ovarian+surface+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium.</a> Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).</li>
<li>Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+newly+established+clonal+oviductal+cell+lines+and+differential+hormonal+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+preventing+infection+after+abdominal+vascular+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma%22%5BJournal%5D)">Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries.</a> J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Oocyte+Maturation+and+Preantral+Follicle+Culture+from+the+Luteal+Phase+Baboon+Ovary+Produce+Mature+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes.</a> Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).</li>
<li>Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Hydrogels+for+cell+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Review: Hydrogels for cell immobilization.</a> Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).</li>
<li>Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bifunctional+alginate+lyase+from+Alteromonas+sp.+strain+no.+272+and+its+action+on+saturated+oligomeric+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).</li>
<li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab Invest. 71, 510-518 (1994).</li>
<li>Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+ovarian+epithelial+carcinogenesis%3A+progress+and+problems+in+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches.</a> Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).</li>
<li>Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+human+ovarian+surface+epithelial+cells+and+adjacent+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix.</a> Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li>
<li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium%3A+biology%2C+endocrinology%2C+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).</li>
<li>Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropins+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Gonadotropins and ovarian cancer.</a> Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).</li>
<li>Fathalla, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incessant+ovulation--a+factor+in+ovarian+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia.</a> Lancet. 2, 163-163 (1971).</li>
<li>Espey, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+the+hypothesis+that+mammalian+ovulation+is+comparable+to+an+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction.</a> Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).</li>
</ol>

Brak informacji do ujawnienia.

Opracowanie trójwymiarowego systemu hodowli organów z wykorzystaniem hydrożeli alginianowych stanowi wszechstronną metodę analizy wielu różnych typów tkanek pochodzących z szerokiej gamy organizmów. Zastosowanie hodowli 3D można rozszerzyć na dziedziny inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, ponieważ zapewnia ono rusztowanie, na którym mogą rozwijać się komórki11. Obecnie w naszym laboratorium prowadzone są wstępne badania z wykorzystaniem ludzkiej tkanki jajnika i jajowodu; opisano jednak hodowlę mies...

<table><tbody><tr><td>Pożywka Leibovitz L-15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka &amp;#945;MEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>Alginian sodu</td><td>NovaMatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Włókno z siatki polipropylenowej</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>rolka o szerokości 45&quot;; oczka 0.0041&quot;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Liazą alginianowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td></td></tr><tr><td>A1603</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9697</td><td>Z &lt;em&gt;Clostridium histolyticum&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Seryjna albumina wołowa</td><td>MP Biomedicals</td><td>103700</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica wołowa</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>Gibco</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór ITS</td><td>Roche Group</td><td>11074547001</td><td>Insulina/transferyna/selenic sodu</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko cytokerytynie 8</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>TROMA-1</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1200</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoksyurydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B50002-1G</td><td>Stężenie końcowe 10 &amp;#x03BC;M</td></tr></tbody></table>

hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Rak jajnika jest piątą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworów u kobiet, a w Stanach Zjednoczonych wskaźnik śmiertelności wynosi 63%1. Typ komórek, z których wywodzą się raki jajnika, wciąż pozostaje kwestią sporną; mogą to być komórki nabłonka powierzchniowego jajnika (OSE) lub dystalnego nabłonka frędzlek jajowodów2,3. Hodowla prawidłowych komórek jako kultury pierwotnej in vitro umożliwi naukowcom modelowanie specyficznych zmian, które mogą prowadzić do raka jajnika w konkretnym nabłonku, co pozwoli na definitywne określenie typu komórek macierzystych nowotworu. Umożliwi to opracowanie dokładniejszych biomarkerów, modeli zwierzęcych z tkankowo specyficznymi zmianami genetycznymi oraz lepszych strategii zapobiegawczych skierowanych przeciwko tej chorobie.
Utrzymywanie prawidłowych komórek w hydrożelach alginianowych sprzyja krótkoterminowej kulturze in vitro komórek w ich trójwymiarowym kontekście i umożliwia wprowadzanie plazmidowego DNA, siRNA oraz małych cząsteczek. Poprzez hodowlę fragmentów organów uzyskanych dzięki strategicznym cięciom skalpelem, z jednego organu można wygenerować kilka kultur, co zwiększa liczbę eksperymentów możliwych do przeprowadzenia z jednego zwierzęcia. Cięcia te modelują aspekty owulacji prowadzące do proliferacji OSE, co jest powiązane z powstawaniem raka jajnika. Typy komórek takie jak OSE, które nie rosną dobrze na powierzchniach plastikowych, mogą być hodowane za pomocą tej metody, co ułatwia badanie prawidłowych procesów komórkowych lub najwcześniejszych zdarzeń w procesie powstawania nowotworu4.
Hydrożele alginianowe mogą być stosowane do wspomagania wzrostu wielu rodzajów tkanek5. Alginian jest liniowym polisacharydem składającym się z powtarzających się jednostek kwasu β-D-mannuronowego i kwasu α-L-guluronowego, który może być sieciowany jonami wapnia, co skutkuje łagodnym procesem żelowania, który nie uszkadza tkanek6,7. Podobnie jak inne trójwymiarowe macierze do hodowli komórkowych, takie jak Matrigel, alginian zapewnia wsparcie mechaniczne dla tkanek; jednak białka nie reagują z macierzą alginianową, w związku z czym alginian pełni funkcję syntetycznej macierzy pozakomórkowej, która nie inicjuje sygnalizacji komórkowej5. Hydrożel alginianowy unosi się w standardowej pożywce do hodowli komórkowej i wspiera architekturę wzrostu tkanek in vitro.
Przedstawiono metodę przygotowania, separacji i osadzania fragmentów jajników oraz jajowodów w hydrożelach alginianowych, które mogą być utrzymywane w kulturze do dwóch tygodni. Opisano również enzymatyczne uwalnianie komórek w celu analizy białek i próbek RNA z hodowli organów. Wreszcie, możliwe jest hodowanie pierwotnych typów komórek pochodzących od myszy bez konieczności ich nieśmiertelnienia genetycznego, co pozwala badaczom na wykorzystanie myszy z nokautem oraz myszy transgenicznych.

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Rak jajnika jest piątą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworów u kobiet i charakteryzuje się 63-procentowym wskaźnikiem śmiertelności w Stanach Zjednoczonych1. Typ komórek, z których wywodzi się...

Niniejsza procedura opisuje propagację prawidłowych komórek nabłonkowych jajnika i przewodów jajowodowych w formie trójwymiarowej hodowli organowej. Najpierw wypreparuj jajnik, tkankę tłuszczową wokół macicy (UCT) oraz część macicy z myszy. Następnie usuń kaletkę i rozdziel błony przewodów jajowodowych za pomocą pęsety, a każdy jajnik lub fragment UCT przetnij na dwa do czterech kawałków, określanych jako organoidy.Na koniec zamknij organoid w kropelce alginianu na fragmencie włókna siatkowego. Ponieważ OSC i TEC hodowane w zdefiniowanych mediach zachowują normalne cechy komórkowe w swojej natywnej architekturze trójwymiarowej. Immunohistochemia na sekcjach tkankowych, analiza RNA oraz analiza białek mogą dostarczyć informacji na temat wpływu OSC i TEC w raku jajnika.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjną dwuwymiarową hodowlą unieśmiertelnionych komórek jest możliwość hodowli komórek w kontakcie z podścielającą je macierzą zewnątrzkomórkową i komórkami zrębu, bez konieczności unieśmiertelnienia genetycznego, które mogłoby zmienić szlaki komórkowe. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie raka jajnika, takie jak zdefiniowanie wczesnych zdarzeń w procesie powstawania nowotworu oraz określenie, z jakiego typu komórek wywodzą się surowicze raki jajnika. Choć metoda ta pozwala na pogłębienie wiedzy o raku jajnika, można ją zastosować również w innych układach, takich jak hodowla mieszków jajnikowych oraz hodowla wysepek beta trzustki.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ usunięcie kaletki oraz błon uc bez uszkodzenia jajników i UCT jest wymagające. Najpierw należy przygotować 0,5% roztwór alginianu w sterylnym PBS i podgrzać go do 37 °C, mieszając poprzez odwracanie lub kołysanie. Następnie należy nabrać alginian do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 25G, utrzymując temperaturę 37 °C.Następnie przygotuj 10 mM roztwór chlorku wapnia do sieciowania alginianu po enkapsulacji tkanki i podgrzej go do 37 °C. Przygotuj również po 1 ml pożywki hodowlanej na każdą studzienkę w płytce 24-dołkowej dla każdego eksperymentu, uwzględniając w pożywce odpowiednie leki, peptydy lub wirusy. Podczas wycinania narządów z organizmu zwierzęcia usuń wszelką tkankę tłuszczową lub pozostałości tkanek.Ostrożnie usuń błonę otaczającą jajnik, a następnie przetnij jajnik lub UCT na cztery części, przecinając organ w poprzek, aby delikatnie rozwinąć tkankę jajowodu. Rozdziel łączące je błony i rozciągnij końce rurki w przeciwnych kierunkach, używając pęsety.Przed wycięciem nanieś jedną kroplę alginianu o objętości około 2 µL na wysterylizowane włókno siatki. Za pomocą sterylnej pęsety przenieś fragment organu do kropli alginianu, a następnie wycentruj kroplę, aby odwrócić kroplę zawierającą organoid. Odwróć włókno siatki i pozwól, aby siła grawitacji wymusiła spłynięcie alginianu w formie wiszącej kropli na krawędzi 10 cm szalki Petriego zawierającej 10 mM roztwór chlorku wapnia.Stuknij pęsetą, aby kropla wpadła do roztworu. Inkubuj przez dwie minuty. Usuń za pomocą sterylnej łyżki z otworami, aby usunąć nadmiar 10 millimolar calcium chloride, i przenieś do pożywki hodowlanej na określony czas.Aby przeprowadzić solubilizację żelu alginianowego, inkubuj kultury w roztworze liazy alginianowej o stężeniu 3,4 mg/mL rozpuszczonej w pożywce Ovitz L 15 w temperaturze 37 °C przez 30 minut lub do całkowitego rozpuszczenia żelu.Następnie należy usunąć tkankę z alginiany liazy. Aby zebrać OSE, inkubuje się organoid z 500 jednostkami kolagenazy w medium Ovitz ISS. L 15 przez jedną godzinę, a następnie miesza w wortexie w dwusekundowych impulsach przy średniej mocy przez jedną minutę, a następnie przez jedną sekundę.Krótko homogenizuj (pulsuj) przez jedną minutę. Pozostaw fragmenty organów, aby opadły na dno probówki do mikrocentryfugi, a następnie pipetuj nadosad do nowej, sterylnej probówki do mikrocentryfugi i wiruj przez trzy minuty przy 3000 RPM, aby wytrącić nabłonek powierzchni jajnika w formie osadu. Na koniec, w celu zebrania nabłonka jajowodowego, przetnij probówkę wzdłuż i umieść ją na plastiku do hodowli tkanek na okres od trzech do pięciu dni.Komórki wyjdą ze zwojaka cewkowego i zaczną rosnąć na plastiku do hodowli tkankowych. W wybranym punkcie czasowym należy zebrać kuleczki z alginianem z medium hodowlanego. Aby utwardzić żel, należy przenieść hodowlę do sterylnego 10 millimolar calcium chloride roztworu na dwie minuty.Następnie należy utrwalić organ zamknięty w alginianie, upewniając się, że żel pozostaje stały i w pełni otacza tkankę podczas procesu utrwalania. Można w ten sposób hodować typy komórek, takie jak OSC, które nie rosną prawidłowo na powierzchniach plastikowych. Zastosowanie tej metody ułatwia badanie normalnych procesów komórkowych lub najwcześniejszych zdarzeń w procesie powstawania nowotworu.Pod mikroskopem usunięto kalekę oraz otaczającą ją poduszkę tłuszczową, a następnie przygotowano je do inkubacji w postaci organoidów enkapsulowanych w alginianie w pożywce hodowlanej. OSC regenerowały powierzchnię uszkodzoną nacięciem skalpelem w zależności od czasu i odległości.Analiza immunohistochemiczna z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko cytokeratynie 8 wskazuje, że jajniki przekrojone na pół są bardziej całkowicie otoczone tkanką w porównaniu do jajników przekrojonych na ćwiartki lub ósmy. Architekturę tkanki, morfologię komórkową oraz specyficzne tempo wzrostu komórek można łatwo monitorować przy użyciu skrawków parafinowych. Przykładowo, po siedmiodniowej hodowli w bezserowym MEM obserwuje się pojedynczą warstwę nabłonka powierzchniowego jajnika.Podczas gdy dodatek insuliną w stężeniu 5 µg/mL przez siedem dni indukuje hiperproliferację nabłonka powierzchniowego jajnika i tworzenie wielu warstw komórek, tutaj immunofluorescencja zielonego białka fluorescencyjnego jest wizualizowana przez żel alginianowy za pomocą standardowej mikroskopii po transfekcji cDNA. Chociaż hodowla organów w alginianie umożliwia wzrost i analizę nabłonka powierzchniowego jajnika oraz pęcherzyków pierwotnych, należy zauważyć, że dojrzałe pęcherzyki wtórne nie przeżywają w tym systemie hodowlanym.Zmiany w białkach lub RNA można analizować w całym narządzie lub w konkretnych typach komórek, wykorzystując degradację enzymatyczną. Traktowanie hodowanych organoidów jajnika kolagenazą pozostawia nienaruszoną leżącą u podstawytkankę śródmiąższową, umożliwiając jednocześnie wzbogacenie osadu komórkowego uzyskanego po zabiegu w nabłonek powierzchniowy jajnika. Technika ta może zostać wykonana w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli jest prowadzona prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu pełnej sterylności przez cały czas. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować dodatkowe metody, takie jak immunohistochemia, western blotting oraz macierze transkrypcyjne, aby odpowiedzieć na kolejne pytania, np. dotyczące tego, w jaki sposób morfologia komórek i architektura tkanki wpływają na wczesne zdarzenia transformacyjne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić trójwymiarową hodowlę alginianową jajnika i jajowodu.

alginate-hydrogels-for-three-dimensional-organ-culture-ovaries

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Hydrożele alginianu do trójwymiarowej kultury narządowej jajników i jajowodów

Opisano nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci interpenetrującej z fibryny i alginianu. System ten łączy wsparcie strukturalne z degradacją proteolityczną, aby wspierać rozwój niedojrzałych pęcherzyków w celu wytworzenia dojrzałych oocytów. Metoda ta może być stosowana do hodowli agregatów komórkowych w celu utrzymania kontaktów międzykomórkowych bez ograniczania ekspansji.

Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Ten film opisuje protokoły hermetyzacji kompleksów wzgórko-oocytów świń (COC) w kulkach fibrynowo-alginianowych w celu stworzenia hodowli 3D. Ten system dojrzewania in vitro utrzymuje normalną komunikację między komórkami, zapewniając dojrzewanie oocytów i zachowując ich żywotność.

Hodowla 3D COC świń: procedura kapsułkowania kompleksów oocytów cumulusa w kulkach hydrożelowych z polimeru fibrynowo-alginianowego

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Tutaj prezentujemy adaptację metody pasywnej CLARITY i rekonstrukcji 3D do wizualizacji naczyń włosowatych jajników i naczyń włosowatych pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy.

Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY

Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Ten protokół opisuje tworzenie trójwymiarowych (3D) organoidów tkankowych z pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka powierzchniowego jajnika (hOSE). Protokół obejmuje izolację hOSE ze świeżo pobranych jajników, ekspansję komórkową hOSE, procedury krioprezerwacji-rozmrażania oraz wyprowadzanie organoidów. Uwzględniono immunofluorescencję, analizę ilościową i prezentację użyteczności jako platformy przesiewowej.

Organoidy nabłonka powierzchni jajników człowieka jako platforma do badania regeneracji tkanek

Protokół ten opisuje nowatorski trójwymiarowy (3-D) model hodowli wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków preantralnych z jajnika myszy. Szczegółowo opisujemy również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przez witryfikację.

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

Opisujemy metody hodowli pęcherzyków jajników w nowej, wolnej od rusztowania agarozowej pleśni, które uzupełniają gametogenezę in vitro .

Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Poznaj metodę trójwymiarowej hodowli organowej jajników i jajowodów w hydrożelach alginianowych. Technika umożliwia zachowanie naturalnej architektury komórek i badanie wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Przeglądaj więcej filmów