Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu
26 lipca 2011
W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest ułatwienie wizualizacji fluorescencyjnych neuronów w grubych skrawkach mózgu. Osiąga się to poprzez uprzednie osadzenie mózgu w uchwycie aeros plug. Drugim krokiem procedury jest pocięcie mózgu na grube skrawki za pomocą kompresowanego tomografu.
Trzecim krokiem procedury jest optyczne wyjaśnianie skrawków mózgu w gradiencie glicerolu. Ostatnim etapem procedury jest montaż wyjaśnionych skrawków mózgu na szkiełkach przedmiotowych do obrazowania fluorescencyjnego. W rezultacie można uzyskać obrazy wykazujące wysoką rozdzielczość ekspresji białek reporterowych fluorescencyjnych w neuronach w grubych skrawkach mózgu, przy użyciu mikroskopii epi-fluorescencyjnej lub konfokalnej.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cienkie skrawki, seryjna mikroskopia fluorescencyjna czy obrazowanie wielofotonowe, jest to, że jest ona znacznie szybsza, mniej pracochłonna i nie wymaga kosztownych ani zaawansowanych technik mikroskopowych. Aby rozpocząć, należy pobrać tkankę mózgu myszy, która została utrwalona metodą NC two poprzez perfuzję przezsercową i poddana dofixacji przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 4 °C. Następnie należy przygotować 2% roztwór agarozy o wysokiej wytrzymałości i niskim punkcie żelowania w PBS i podgrzewać go w kuchence mikrofalowej aż do rozpuszczenia.
Przenieś roztopiony agaros do probówki i umieść go w bloku grzejnym o temperaturze 40°C, aby wyrównać temperaturę. Podczas wyrównywania temperatury agarosu, przyklej utrwaloną tkankę mózgu do tłoka strzykawki do próbek. Używając kleju Sano Aate, zanurz zamontowaną tkankę w nasyconym roztworze sacharozy w PBS, aby pokryć powierzchnię mózgu, a następnie wsuń tłok do obudowy tłoka. Pipetuj ciepły agaros do wnętrza tłoka, całkowicie pokrywając tkankę mózgu i dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
Na koniec unieruchom strzykawkę z preparatem w bloku chłodzącym przez około jedną minutę. Aby ustawić aros, zamocuj strzykawkę z preparatem zawierającą zatopioną tkankę mózgu w uchwycie kompresyjnym. Wyrównaj krawędź ostrza tak, aby znajdowała się blisko wylotu strzykawki z preparatem, a następnie napełnij zbiornik buforowy roztworem PBS.
Obróć mikrometr. Przesuń go do przodu o grubość jednego przekroju, aby wysunąć zatopioną tkankę mózgową z strzykawki z próbką. Aby wykonać pierwszy przekrój, naciśnij przycisk start na jednostce sterującej.
Powtarzaj proces wysuwania zatopionej tkanki i naciskania przycisku start, aby uzyskać pożądaną liczbę przekrojów. Zbierz przekroje za pomocą pipety transferowej i przenieś je do szklanej fiolki inhalacyjnej wypełnionej PBS. Pipetą odessaj większość PBS z zebranych przekrojów i zastąp go 10% roztworem glicerolu w PBS. Delikatnie kołysz fiolką w temperaturze 4 °C na laboratoryjnym wytrząsarce rotacyjnej, aż przekroje opadną na dno.
Kontynuuj stopniowe oczyszczanie, powtarzając proces znikania i uzupełniania roztworami glicerolu o stężeniach 25%, 50%, a następnie 75%. Odpipetuj roztwór 75% glicerolu i zastąp go roztworem 90% glicerolu. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza, a następnie doprowadzić do równowagi w temperaturze czterech stopni Celsius z delikatnym kołysaniem.
Po maksymalnym przejaśnieniu przekroje nie będą już tonąć, lecz wykażą wyporność neutralną. Za pomocą pęsety wytnij z dwustronnej taśmy klejącej otwarty prostokąt z marginesem od dwóch do trzech milimetrów, dopasowany do pola widzenia szkiełka przedmiotowego o wymiarach 25 by 75 mm. Rozmieść przekroje mózgu na szkiełku w obrębie wyznaczonego marginesu.
Ostrożnie opuść szkiełko nakrywkę na taśmę klejącą. Uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza i wywierając nacisk w celu stworzenia szczelności, odessaj nadmiar glicerolu, a następnie zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywki, nakładając bezbarwny lakier do paznokci. Po wyschnięciu uszczelnienia preparat można przechowywać w kasecie na preparaty w temperaturze 4 °C lub poddać obrazowaniu.
Należy niezwłocznie przeprowadzić badanie z użyciem mikroskopii epifluorescencyjnej. Wzorzec ekspresji wektora wirusowego kodującego eGFP można zaobserwować w coronalnym przekroju tkanki mózgu myszy o grubości 200 µm. Poniżej, zaznaczony obszar obrazu epifluorescencyjnego przedstawiono w wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii konfokalnej, aby ukazać pojedyncze neurony warstwy V kory mózgowej.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat przygotowywania utrwalonych, grubych skrawków mózgu do szybkiego i wysokorozdzielczego obrazowania fluorescencyjnego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodę obrazowania neuronów znakowanych fluorescencyjnie w półgrubych skrawkach mózgu. Technika ta obejmuje fiksację, krojenie oraz optyczne przejaśnianie tkanki mózgowej, co umożliwia wizualizację pojedynczych komórek i sieci neuronalnych przy użyciu standardowych metod obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Obrazowanie fluorescencyjne jest kluczowe dla badania struktur neuronalnych.
- Grube skrawki mózgu stanowią wyzwanie w zakresie wizualizacji.
- Techniki utrudniania optycznego poprawiają jakość obrazowania.
- Standardowe metody mikroskopowe mogą być stosowane do tkanek poddanych utrudnianiu optycznemu.
Cel badania
- W celu uproszczenia wizualizacji fluorescencyjnych neuronów w grubych skrawkach mózgu.
- W celu zaprezentowania metody umożliwiającej obrazowanie o wysokiej rozdzielczości.
- W celu przedstawienia protokołu, który może być łatwo replikowany w warunkach badawczych.
Zastosowane metody
- Osadzanie tkanki mózgowej w uchwycie do wtyczek aeros.
- Przygotowywanie grubych przekrojów mózgu przy użyciu kompresyjnego tomografu.
- Optyczne klarowanie przekrojów w gradiencie glicerolu.
- Montowanie sklarowanych przekrojów na szkiełkach przedmiotowych do obrazowania.
Główne wyniki
- Obrazy o wysokiej rozdzielczości przedstawiające ekspresję białek fluorescencyjnych w neuronach.
- Skuteczna wizualizacja sieci neuronalnych w grubych skrawkach.
- Kompatybilność z mikroskopią epifluorescencyjną oraz konfokalną.
- Wykazanie skuteczności zastosowanej techniki obrazowania.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia szybki i skuteczny sposób wizualizacji neuronów.
- Usprawnia ona możliwość badania sieci neuronalnych w nienaruszonej tkance.
- Podejście to może być korzystne w różnych zastosowaniach badawczych w dziedzinie neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokorozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne w półgrubych skrawkach mózgu umożliwia szybką i skalowalną analizę architektury neuronalnej oraz znakowania molekularnego w nienaruszonym tkance. Podejście to eliminuje wąskie gardło w postaci pracochłonnego przygotowywania cienkich przekrojów oraz wysokich kosztów obrazowania wielofotonowego, wspierając efektywną walidację celów i redukcję ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania leków w neurobiologii. Kompatybilność tej metody ze standardowymi platformami mikroskopowymi zwiększa ciągłość translacyjną oraz elastyczność portfolio programów poszukiwania leków na schorzenia OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację populacji neuronalnych znakowanych genetycznie lub wirusowo in situ.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mapowanie łączności neuronalnej i wzorców ekspresji molekularnej.
- Ułatwia szybką weryfikację hipotez dotyczących podtypów neuronów i zaangażowania obwodów.
- Zmniejsza niejednoznaczność w przypisywaniu ścieżek poprzez zachowanie kontekstu tkankowego i relacji trójwymiarowych.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia powtarzalne przygotowanie półgrubych skrawków mózgu do późniejszych analiz obrazowych.
- Umożliwia ilościowe, wysokorozdzielcze odczyty ekspresji fluorescencyjnych reporterów w nienaruszonej tkance.
- Usprawnia standaryzację i skalowalność analizy poprzez minimalizację liczby ręcznych etapów sekcjonowania.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na strukturę i znakowanie neuronów w modelach przedklinicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje wyniki obrazowania do obszarów mózgu istotnych dla danej choroby oraz do podtypów neuronów.
- Zachowuje integralność tkanki na potrzeby translacyjnych badań nad biomarkerami i walidacji przedklinicznej.
- Wspiera rozwój z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez dostarczanie rzetelnych, interpretowalnych danych obrazowych w różnych modelach.
- Ułatwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć po przedkliniczną ocenę interwencji celowanych w OUN.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając szybkie obrazowanie wysokotreściowe populacji neuronalnych w genetycznie zmodyfikowanych lub transdukowanych wirusowo modelach gryzoni.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza testowanie hipotez i mapowanie szlaków w nienaruszonych tkankach mózgowych.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki obrazowania odpowiednie do analizy porównawczej.
- Analityka: Wspiera ocenę statystyczną ekspresji reporterów i rozkładu neuronów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny, powtarzalny schemat pracy, który można dostosować do różnorodnych programów badawczych nad OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu neuronalnego i mapowania obwodów.
- Wartość operacyjna: Redukuje nakład pracy, koszty oraz bariery techniczne związane z tradycyjnymi metodami obrazowania.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywną alokację zasobów w portfolio dotyczącym OUN.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i mechanizmów neurobiologicznych w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w sekcjonowaniu mózgu gryzoni, zatapianiu tkanek oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do wibrotomu lub urządzenia Compresstome oraz odczynników do przejaśniania optycznego.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania tkanek i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych reporterów fluorescencyjnych i obszarów mózgu przy zastosowaniu odpowiednich strategii znakowania.
- Ograniczenie przez nieprzezroczystość tkanek i autofluorescencję w próbkach ekstremalnie grubych lub nieprzejaśnionych.
Często zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Agarose Embedding of Fixed Mouse Brain Tissue
1:55
Sectioning the Embedded Brain Tissue Using the Compresstome
2:33
Optical Clearing of the Brain Tissue Sections
3:14
Mounting the Brain Tissue Sections for Imaging
3:53
Epifluorescent and Confocal Microscopy of Intact Thick Brain Slices
4:16
Conclusion
