Szybkie podejście do obrazowania fluorescencyjnego w wysokiej rozdzielczości w półgrubych wycinkach mózgu

Tutaj opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych wycinkach mózgu. Poprzez utrwalanie, krojenie i optyczne oczyszczanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji pojedynczych komórek i sieci neuronalnych w nienaruszonej tkance nerwowej.

Ogólnym celem tej procedury jest łatwiejsza wizualizacja neuronów fluorescencyjnych w grubych wycinkach mózgu. Osiąga się to poprzez uprzednie osadzenie mózgu w uchwycie na wtyczkę aerodynamiczną. Drugim krokiem procedury jest pokrojenie mózgu na grube plastry na ściśniętym tomie.

Trzecim krokiem zabiegu jest optyczne oczyszczenie wycinków mózgu w gradiencie glicerolu. Ostatnim etapem procedury jest zamontowanie oczyszczonych wycinków mózgu na szkiełkach w celu obrazowania fluorescencyjnego. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują ekspresję reportera białka fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w neuronach w grubych warstwach mózgu, za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cienki przekrój, seryjna mikroskopia fluorescencyjna lub obrazowanie wielofotonowe, jest to, że jest znacznie szybsza, mniej pracochłonna i nie wymaga drogiej lub wyrafinowanej techniki mikroskopowej. Aby rozpocząć, należy pobrać tkankę mózgową myszy, która została poddana fiksacji NC dwa przez perfuzję serca i była postfiksowana przez jedną do dwóch godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj 2% roztwór agro żelu o niskiej wytrzymałości w PBS i podgrzej w kuchence mikrofalowej, aż się rozpuści.

Przenieś stopiony agros do probówki i umieść blok grzewczy o temperaturze 40 stopni Celsjusza, aby zrównoważyć temperaturę, podczas gdy agros równoważy, przyklej utrwaloną tkankę mózgową do tłoka strzykawki z próbką. Za pomocą kleju Sano Aate zanurzono zamontowaną tkankę w nasyconym roztworze sacharozy PBS, aby pokryć powierzchnię mózgu, a następnie wciągnąć tłok do obudowy tłoka. Odpipetuj ciepłe aros do tłoka, całkowicie zakrywając tkankę mózgową, upewniając się, że nie wprowadzasz żadnych pęcherzyków powietrza.

Na koniec zacisnąć strzykawkę z próbką za pomocą zimnego bloku chłodzącego na około jedną minutę. Aby ustawić aros, złóż strzykawkę z próbką zawierającą osadzoną tkankę mózgową w skompresowanym domu. Dopasuj krawędź ostrza ściśle do wylotu strzykawki z próbką, a następnie napełnij zbiornik buforowy PBS.

Obróć mikrometr. Raz pokrój grubość do przodu, aby wyciągnąć osadzoną tkankę mózgową ze strzykawki z próbką. Aby wygenerować pierwszy wycinek, naciśnij przycisk start na jednostce sterującej.

Powtórz proces przesuwania osadzonej tkanki i naciskania przycisku start, aby wygenerować żądaną liczbę plasterków. Zebrać plastry za pomocą pipety transferowej i przenieść je do szklanej fiolki do inhalacji wypełnionej PBS, odpipetować większość PBS z zebranych plastrów i zastąpić 10% glicerolem w roztworze PBS. Delikatnie kołysz fiolką w temperaturze czterech stopni Celsjusza na obrotowym wytrząsarce stołowej, aż plastry opadną.

Kontynuuj stopniowe oczyszczanie, powtarzając proces dekantacji i ponownego napełniania 25, 50, a następnie 75% roztworami glicerolu. Odpipetować 75% roztwór glicerolu i zastąpić go 90% glicerolem. Uważając, aby nie wprowadzić żadnych bąbelków i równoważyć w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym kołysaniem.

Teraz, gdy plastry zostały maksymalnie oczyszczone, nie będą już tonąć, ale zamiast tego będą wykazywać neutralną pływalność. Wytnij dwustronny klej w otwarty prostokąt z dwu- lub trzymilimetrową obwódką, aby dopasować się do widocznego obszaru szkiełka mikroskopowego o wymiarach 25 na 75 milimetrów za pomocą kleszczy. Ułóż wycinki mózgu w obramowaniu na slajdzie.

Delikatnie opuść szkło nakrywkowe na taśmę klejącą. Uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza i wywierać nacisk, aby stworzyć uszczelkę, odessać nadmiar glicerolu, a następnie uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego, nakładając bezbarwny lakier do paznokci. Po wyschnięciu uszczelki szkiełko można przechowywać w pudełku na szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub zobrazować.

Natychmiast użyć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wzorzec ekspresji wektora wirusowego wyrażającego wzmocnioną GFP można zaobserwować w odcinku koronalnym tkanki mózgowej myszy o grubości 200 mikrometrów. W tym przypadku podświetlony obszar obrazu fluorescencyjnego epi jest wyświetlany w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby odsłonić poszczególne neurony korowe warstwy piątej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować stałe lub grube plasterki mózgu do szybkiego obrazowania fluorescencyjnego w wysokiej rozdzielczości.