Name: Szybkie podejście do obrazowania fluorescencyjnego w wysokiej rozdzielczości w półgrubych wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Poznaj metodę szybkiego obrazowania fluorescencyjnego neuronów w półgrubych wycinkach mózgu myszy. Technika obejmuje osadzanie, krojenie i optyczne przezroczystienie tkanek, umożliwiając wizualizację sieci neuronowych w wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana dzięki wsparciu z fundacji McNair Foundation, NARSAD oraz grantu NINDS R00NS064171-03.

1. Fixacja mózgu in situ
*Przygotować strzykawkę 10 ml (igła 28 G) wypełnioną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). 
*Przygotować strzykawkę 10 ml (igła 28 G) wypełnioną 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS. Odstawić dodatkowe 5-10 ml PFA/PBS do późniejszej fiksacji.

<ol>
<li>Wstrzyknij myszy doświadczalnej dootrzewnowo dawkę śmiertelną Avertinu lub Nembutalu.</li>
<li>Po uśpieniu myszy zwilż brzuch etanolem i przymocuj zwierzę do dna tacy wyłożonej korkiem, woskiem lub elastomerem silikonowym za pomocą szpilek sekcyjnych. Ustawiając brzuch do góry, przymocuj cztery łapy do powierzchni, rozsuwając je najszerzej jak to możliwe.</li>
<li>Chwyć skórę pęsetą na wysokości mostka i przetnij ją w poprzek, aby odsłonić wątrobę. Przetnij tkankę bocznie, a następnie w górę przez żebra i przeponę. Usuń płat tkanki żebrowej i kontynuuj cięcie, aż serce stanie się dostępne.</li>
<li>Przebij lub przetnij prawy przedsionek, aby odprowadzić krew z krwiobiegu.</li>
<li>Wypłucz pozostałą krew z układu krążenia poprzez perfuzję PBS przez lewą komorę.</li>
<li>Korzystając z tego samego otworu po igle, utrwal całą mysz poprzez następczą perfuzję PBS/PFA przez lewą komorę.</li>
</ol>
2. Disekcja i wyodrębnianie mózgu
<ol>
<li>Usuń skórę z głowy, szyi i czaszki, przecinając tkankę wokół kanału słuchowego i oczodołów, a następnie odsuń skórę w kierunku przednim, aby odsłonić czaszkę. 
*Ilustrację kroków od 2.2) do 2.5) przedstawiono na Rysunku 2</li>
<li>Za pomocą nożyczek do kości wykonaj cięcie poprzeczne od oczodołu przez małżowiny nosowe. Powtórz tę czynność po obu stronach. Cięcie poprzeczne powinno znajdować się przed oczami i opuszki węchowymi.</li>
<li>Wykonaj cięcia wzdłużne od każdego kanału słuchowego do oczodołu.</li>
<li>Za pomocą małych nożyczek do sekcji przetnij płytkę kości potylicznej nad móżdżkiem, prowadząc cięcie od jednego kanału słuchowego do drugiego.</li>
<li>Tymi samymi nożyczkami do sekcji przetnij tkankę w kierunku przednim wzdłuż linii środkowej do poziomu opuszek węchowych.</li>
<li>Za pomocą pęsety usuń każdą płytkę kostną z mózgu, uważając, aby usunąć wszelką tkankę łączną, tak aby mózg pozostał nienaruszony podczas zdejmowania kości.</li>
<li>Przetnij nerwy wzrokowe i czaszkowe, przetnij górne kręgi szyjne i przełóż mózg do utrwalacza.</li>
<li>Przeprowadź do-utrwalanie przez 1-2 hrs w 4° C. Przemyj 3 razy po 15 min w PBS.</li>
</ol>
3. Osadzanie w agarozie
<ol>
<li>Roztopić 2% agarozę typu I-B o wysokiej wytrzymałości i niskim punkcie żelowania (numer katalogowy Sigma: A0576) w soli PBS za pomocą kuchenki mikrofalowej.</li>
<li>Przenieść roztopioną agarozę do probówki. Umieścić probówkę w ciepłym inkubatorze lub łaźni wodnej (40°-41° C) do momentu wyrównania temperatury.</li>
<li>Przykleić utrwaloną tkankę mózgu do tłoka strzykawki do próbek za pomocą kleju cyjanoakrylowego (Rysunek 3A). Nanieść pędzlem cienką warstwę nasyconego roztworu sacharozy w PBS na powierzchnię tkanki mózgu, aby ułatwić późniejsze oddzielenie pierścienia agarozy od skrawków mózgu.</li>
<li>Wcisnąć tłok z tkanką mózgu do obudowy tłoka (Rysunek 3B).</li>
<li>Pipetować lub wlać ciepłą agarozę do obudowy tłoka, zakrywając tkankę mózgu. Unikać zamykania pęcherzyków powietrza w agarozie. Pęcherzyki powietrza w agarozie pogorszą jakość skrawków.</li> 
<li>Zacisnąć strzykawkę do próbek w zimnym (0° do -25° C) bloku chłodzącym na 1 minutę w celu utwardzenia agarozy (Rysunek 3C).</li> 
</ol>
4. Sekcjonowanie skrawka mózgu za pomocą urządzenia Compresstome
<ol>
<li>Zamontuj strzykawkę z próbką zawierającą tkankę mózgu w urządzeniu Compresstome (Rycina 3D).</li>
<li>Ustaw krawędź żyletki w bliskiej odległości od wylotu strzykawki z próbką (Rycina 3E).</li>
<li>Napełnij zbiornik buforowy roztworem PBS.</li>
<li>Obróć mikrometr o wartość odpowiadającą grubości jednego przekroju, aby wysunąć blok tkanki mózgu w agarozie ze strzykawki z próbką.</li>
<li>Naciśnij przycisk „start” na jednostce sterującej urządzenia Compresstome, aby rozpocząć proces sekcjonowania.</li> 
<li>Powtarzaj kroki 4.4) i 4.5), aż do uzyskania pożądanej liczby przekrojów o określonej grubości.</li> 
<li>Zbierz przekroje mózgu za pomocą pędzelka lub pipety i przenieś je do probówek lub dołków do barwienia wypełnionych PBS (Rycina 3F).</li>
</ol>
5. Przejaśnianie optyczne
<ol>
<li>Przygotować roztwór glicerolu i PBS w stężeniu 75% obj.</li>
<li>Odlać (lub odpipetować) połowę objętości buforu PBS użytego do płukania zebranych skrawków mózgu.</li>
<li>Uzupełnić usuniętą objętość roztworem glicerolu/PBS.</li>
<li>Pozostawić do osiągnięcia równowagi, delikatnie mieszając w temperaturze 4° C, aż skrawki opadną na dno.</li>
<li>Powtarzać kroki od 6.2) do 6.4), aż końcowe stężenie glicerolu osiągnie 75%.</li>
<li> Wymienić roztwór na 90% glicerol w PBS i pozostawić do osiągnięcia równowagi. 
*Uwaga: Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza podczas dodawania roztworów glicerolu. Roztwory należy wlewać powoli i delikatnie mieszać, ponieważ pęcherzyki powietrza będą zakłócać równomierną równowagę i przeniosą się na etap montowania preparatów na szkiełkach.</li>
</ol>
6. Montowanie skrawków do obrazowania
<ol>
<li>Wytnij dwustronną taśmę uszczelniającą (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) w kształcie otwartego prostokąta, dopasowanego do pola widzenia preparatu mikroskopowego (Superfrost Plus, 25 X 75 X 1 mm, kat. # 48311-703, VWR), z krawędziami o szerokości 2-3 mm.</li>
<li>Za pomocą pipety lub pędzelka umieść skrawki mózgu w centrum prostokąta z taśmy klejącej. Nadmiar glicerolu usuń delikatnie poprzez aspirację.</li>
<li>Ułóż skrawki mózgu na preparacie w pożądanej kolejności, używając pędzelka.</li>
<li>Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe (24 X 60 mm, kat. # 48383-139, VWR) na taśmę klejącą, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby zapewnić kontakt z taśmą klejącą.</li>
<li>Odsącz nadmiar glicerolu z krawędzi między preparatem a szkiełkiem nakrywowym.</li>
<li>Uszczelnij krawędzie preparatu i szkiełka nakrywkowego za pomocą bezbarwnego laku do paznokci.</li>
<li>Pozostaw do wyschnięcia przed obrazowaniem lub przechowuj długoterminowo w kasetkach do preparatów w temperaturze 4° C.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Obróbka, obrazowanie i analiza tkanki mózgowej znakowanej fluorescencyjnie stały się niezbędne w badaniach nad neurobiologią. Wiele z tych analiz wymaga zaawansowanych manipulacji genetycznych w celu uzyskania ekspresji reportera w ukierunkowanych podzbiorach neuronów, a następnie przeprowadzenia analiz obrazowych w niskiej i wysokiej rozdzielczości. Często ograniczenia eksperymentalne i techniczne uniemożliwiają uzyskanie tego typu danych z tego samego zwierzęcia lub w krótkim czasie. Przygotowanie optycznie przejaśnionych, półgrubych skrawków mózgu do obrazowania fluorescencyjnego pomaga rozwiązać ten problem. Przykład nienaruszonego grubego skrawka mózgu znakowanego genetycznie zmodyfikowanym wirusem wścieklizny zaprojektowanym do ekspresji EGFP, obrazowanego przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej oraz konfokalnej, przedstawiono odpowiednio na Rysunku 4 i Rysunku 5. Do obrazowania epifluorescencyjnego wykorzystano mikroskop Leica M205 FA, a do akwizycji obrazów konfokalnych mikroskop Zeiss LSM 510. Ze względu na względną prostotę załączonego protokołu, metoda ta pozwala na uzyskanie użytecznych danych obrazowych z tkanki wykazującej ekspresję reporterów fluorescencyjnych w czasie krótszym niż jeden dzień i jest kompatybilna z mikroskopią świetlną w niskiej i wysokiej rozdzielczości.
Jeśli badacz zdecyduje się na włączenie dodatkowych metod znakowania pośmiertnego, barwienia immunohistochemicznego lub wykonania cieńszych skrawków, protokół ulega odpowiedniemu wydłużeniu. Opisana powyżej metoda stanowi jednak prosty i stosunkowo wysokoprzepustowy sposób przesiewania wzorców ekspresji białek reporterowych in vivo w nienaruszonym mózgu.
<img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig1.jpg" alt="Schemat procesu sekcji mózgu; od perfuzji po montaż skrawków do klarowania optycznego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schemat blokowy przedstawiający procedurę fiksacji, sekcji, krojenia, klarowania i montażu półgrubych skrawków mózgu.
<img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig2.jpg" alt="Schemat czaszki z liniami od 2.2 do 2.5, ilustrujący punkty pomiarów anatomicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Schemat sekwencyjnych etapów cięcia w celu wyizolowania nienaruszonego mózgu myszy. 
<img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig3.jpg" alt="Równowaga statyczna w procesie testowania metalu przy użyciu przyłożonej siły; zawiera sprzęt i konfigurację." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Etapy montowania i krojenia tkanki mózgowej przy użyciu urządzenia Compresstome. A) Mocowanie tkanki mózgowej do tłoka tnącego za pomocą superglue. B) Wciąganie zamocowanej tkanki mózgowej do tłoka w celu zatopienia w agarozie. C) Utwardzanie wtyczki mózgowej z agarozy przy użyciu schłodzonego bloku kompresyjnego. D) Wprowadzenie wtyczki mózgowej z agarozy i tłoka do komory tnącej Compresstome. E) Wyrównanie żyletki względem urządzenia z tłokiem. F) Krojenie i zbieranie skrawków mózgu do komory z buforem Compresstome.
<img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig4.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna mózgu; obrazowanie sygnału zielonego; mapowanie aktywności neuronalnej; analiza optyczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Obrazy mikroskopii świetlnej grubego skrawka tkanki mózgowej oczyszczonej glicerolem, przechodzące przez korę czołową wykazującą ekspresję wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP). A) Przekrój czołowy mózgu myszy (grubość 200 um) oznakowany wektorem wirusowym ekspresującym EGFP i obrazowany w niskiej rozdzielczości za pomocą stereoskopu epifluorescencyjnego. Pasek skali, 2 mm. 
<img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig5.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek neuronalnych, podkreślający morfologię komórek i strukturę sieci." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5. Obraz przy dużym powiększeniu fluorescencyjnie znakowanych neuronów kory warstwy 5/6 w utransparentnionym grubym skrawku mózgu. A) Konfokalny obraz o wysokiej rozdzielczości z maksymalnej projekcji stosu Z (grubości 150 um) przez obszar zaznaczony na (Rysunku 4). Pasek skali, 25 um.

<ol><li>Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPfister%2C+H+%22The+Connectome+Project%22">The Connectome Project</a>. , (2009).</li>
<li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+genome+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244, 1288-1292 (1989).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification%2C+and+properties+of+aequorin%2C+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan%2C+Aequorea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Jian-Qiang Kong jest pracownikiem firmy Precisionary Instruments, Inc., która produkuje produkt wykorzystany w niniejszym artykule.

Ze względu na powszechne zastosowanie białek fluorescencyjnych do celowania w podgrupy neuronów w celu badania ich za pomocą mikroskopii świetlnej, nieoceniona stała się potrzeba szybkiego przesiewania, obrazowania i analizy sieci neuronalnych w nienaruszonej tkance mózgowej.
Postępy techniczne w opracowywaniu przyjaznych dla użytkownika wektorów wirusowych, technik elektroporacji in vivo oraz genetycznie modyfikowanych linii myszy zapewniają obecnie pozornie nieograniczone źródło zna...

<table><tbody><tr><td>nożyczki do kości</td><td>F.S.T.</td><td>16044-10</td><td>-lub odpowiednik</td></tr><tr><td>nożyczki do dyssekcji</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08</td><td>-lub odpowiednik</td></tr><tr><td>agaroza typu I-B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0576</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome</td><td>Precisionary Instruments</td><td>VF-200</td><td>-kompatybilne są inne wibratomy</td></tr><tr><td>dwustronna taśma klejąca</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>SA-S-1L</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka Superfrost Plus</td><td>VWR international</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>szkiełko nakrywką</td><td>VWR international</td><td>48383-139</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td>-lub odpowiednik</td></tr></tbody></table>

szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Fundamentalnym celem zarówno neuronauki podstawowej, jak i klinicznej jest lepsze zrozumienie tożsamości, składu molekularnego oraz wzorców łączności charakterystycznych dla neuronów w mózgu zdrowym i chorobowym. W tym celu ogromny wysiłek poświęcono na tworzenie wysokorozdzielczych map neuroanatomicznych1-3. Rozwój genetyki molekularnej oraz postępy w mikroskopii świetlnej umożliwiły badanie nie tylko morfologii neuronów, ale także składu molekularnego i komórkowego pojedynczych neuronów oraz powiązanych z nimi sieci4. Znaczący postępy w możliwości znakowania i manipulowania neuronami za pomocą technologii transgenicznych oraz celowania genowego u gryzoni pozwalają obecnie badaczom na dowolne „programowanie” podzbiorów neuronów5-6. Prawdopodobnie jednym z najbardziej wpływowych wkładów w współczesną neuronaukę było odkrycie i klonowanie genów kodujących białka fluorescencyjne (FPs) u bezkręgowców morskich7-8, a następnie ich inżynieria, która doprowadziła do powstania stale rozszerzającego się zestawu niezbędnych reporterów9. Wykorzystanie specyficznej dla typu komórek aktywności promotora do kierowania celowanej ekspresji FP w dyskretnych populacjach neuronów pozwala obecnie na prowadzenie badań neuroanatomicznych z precyzją genetyczną.
Inżynieria ekspresji białek FP w neuronach znacząco poprawiła nasze zrozumienie struktury i funkcji mózgu. Jednak obrazowanie pojedynczych neuronów oraz powiązanych z nimi sieci w głębokich tkankach mózgu lub w trzech wymiarach wciąż stanowi wyzwanie. Ze względu na wysoką zawartość lipidów tkanka nerwowa jest dość nieprzezroczysta i wykazuje autofluorescencję. Te wrodzone właściwości biofizyczne utrudniają wizualizację i obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych neuronów z wysoką rozdzielczością przy użyciu standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej na głębokościach przekraczających kilkanaście mikronów. Aby obejść ten problem, badacze często stosują metody obrazowania i rekonstrukcji seryjnych cienkich przekrojów10 lub dwufotonową mikroskopię skaningową11. Obecnymi wadami tych podejść są odpowiednio: pracochłonne przygotowanie tkanek lub zbyt kosztowna aparatura.
W niniejszej pracy przedstawiamy stosunkowo szybką i prostą metodę wizualizacji komórek znakowanych fluorescencyjnie w utrwalonych, półgrubych skrawkach mózgu mysiego poprzez optyczne klarowanie i obrazowanie. W załączonym protokole opisujemy metody: 1) utrwalania tkanki mózgowej in situ poprzez perfuzję wewnątrzsercową, 2) wycięcia i usunięcia całego mózgu, 3) zatapiania mózgu w agarozie, 4) precyzyjnego przygotowania półgrubych skrawków przy użyciu nowoczesnego wibratomu, 5) klarowania tkanki mózgowej przy użyciu gradientu glicerolu oraz 6) montowania na szkiełkach przedmiotowych do mikroskopii świetlnej i rekonstrukcji stosu z (Rysunek 1).
Do przygotowania skrawków mózgu zastosowaliśmy stosunkowo nowe urządzenie o nazwie „Compresstome” VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Jest to półautomatyczny mikrotom wyposażony w zmotoryzowany system posuwu i wibracji ostrza, o funkcjach zbliżonych do innych wibrotomów. W przeciwieństwie do innych wibrotomów, tkanka do cięcia jest osadzona w agarozy wewnątrz cylindra ze stali nierdzewnej. Tkanka jest wysuwana z cylindra na pożądaną grubość i przecinana przez przesuwające się do przodu wibrujące ostrze. System z zastosowaniem cylindra z agarozą umożliwia powtarzalne mocowanie tkanki, jej wyrównanie oraz precyzyjne cięcie. W naszych doświadczeniach „Compresstome” pozwala na uzyskanie wysokiej jakości skrawków tkankowych do elektrofizjologii, immunohistochemii oraz bezpośredniego mocowania i obrazowania utrwalonej tkanki. W połączeniu z metodą przezrocznienia optycznego demonstrujemy tutaj przygotowanie półgrubych utrwalonych skrawków mózgu do wysokorozdzielczego obrazowania fluorescencyjnego.

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Podstawowym celem zarówno neuronauki podstawowej, jak i klinicznej jest lepsze zrozumienie tożsamości, składu molekularnego oraz wzorców łączności, które są ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ułatwienie wizualizacji fluorescencyjnych neuronów w grubych skrawkach mózgu. Osiąga się to poprzez uprzednie osadzenie mózgu w uchwycie aeros plug. Drugim krokiem procedury jest pocięcie mózgu na grube skrawki za pomocą kompresowanego tomografu.Trzecim krokiem procedury jest optyczne wyjaśnianie skrawków mózgu w gradiencie glicerolu. Ostatnim etapem procedury jest montaż wyjaśnionych skrawków mózgu na szkiełkach przedmiotowych do obrazowania fluorescencyjnego. W rezultacie można uzyskać obrazy wykazujące wysoką rozdzielczość ekspresji białek reporterowych fluorescencyjnych w neuronach w grubych skrawkach mózgu, przy użyciu mikroskopii epi-fluorescencyjnej lub konfokalnej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cienkie skrawki, seryjna mikroskopia fluorescencyjna czy obrazowanie wielofotonowe, jest to, że jest ona znacznie szybsza, mniej pracochłonna i nie wymaga kosztownych ani zaawansowanych technik mikroskopowych. Aby rozpocząć, należy pobrać tkankę mózgu myszy, która została utrwalona metodą NC two poprzez perfuzję przezsercową i poddana dofixacji przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 4 °C. Następnie należy przygotować 2% roztwór agarozy o wysokiej wytrzymałości i niskim punkcie żelowania w PBS i podgrzewać go w kuchence mikrofalowej aż do rozpuszczenia.Przenieś roztopiony agaros do probówki i umieść go w bloku grzejnym o temperaturze 40°C, aby wyrównać temperaturę. Podczas wyrównywania temperatury agarosu, przyklej utrwaloną tkankę mózgu do tłoka strzykawki do próbek. Używając kleju Sano Aate, zanurz zamontowaną tkankę w nasyconym roztworze sacharozy w PBS, aby pokryć powierzchnię mózgu, a następnie wsuń tłok do obudowy tłoka. Pipetuj ciepły agaros do wnętrza tłoka, całkowicie pokrywając tkankę mózgu i dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.Na koniec unieruchom strzykawkę z preparatem w bloku chłodzącym przez około jedną minutę. Aby ustawić aros, zamocuj strzykawkę z preparatem zawierającą zatopioną tkankę mózgu w uchwycie kompresyjnym. Wyrównaj krawędź ostrza tak, aby znajdowała się blisko wylotu strzykawki z preparatem, a następnie napełnij zbiornik buforowy roztworem PBS.Obróć mikrometr. Przesuń go do przodu o grubość jednego przekroju, aby wysunąć zatopioną tkankę mózgową z strzykawki z próbką. Aby wykonać pierwszy przekrój, naciśnij przycisk start na jednostce sterującej.Powtarzaj proces wysuwania zatopionej tkanki i naciskania przycisku start, aby uzyskać pożądaną liczbę przekrojów. Zbierz przekroje za pomocą pipety transferowej i przenieś je do szklanej fiolki inhalacyjnej wypełnionej PBS. Pipetą odessaj większość PBS z zebranych przekrojów i zastąp go 10% roztworem glicerolu w PBS. Delikatnie kołysz fiolką w temperaturze 4 °C na laboratoryjnym wytrząsarce rotacyjnej, aż przekroje opadną na dno.Kontynuuj stopniowe oczyszczanie, powtarzając proces znikania i uzupełniania roztworami glicerolu o stężeniach 25%, 50%, a następnie 75%. Odpipetuj roztwór 75% glicerolu i zastąp go roztworem 90% glicerolu. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza, a następnie doprowadzić do równowagi w temperaturze czterech stopni Celsius z delikatnym kołysaniem.Po maksymalnym przejaśnieniu przekroje nie będą już tonąć, lecz wykażą wyporność neutralną. Za pomocą pęsety wytnij z dwustronnej taśmy klejącej otwarty prostokąt z marginesem od dwóch do trzech milimetrów, dopasowany do pola widzenia szkiełka przedmiotowego o wymiarach 25 by 75 mm. Rozmieść przekroje mózgu na szkiełku w obrębie wyznaczonego marginesu.Ostrożnie opuść szkiełko nakrywkę na taśmę klejącą. Uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza i wywierając nacisk w celu stworzenia szczelności, odessaj nadmiar glicerolu, a następnie zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywki, nakładając bezbarwny lakier do paznokci. Po wyschnięciu uszczelnienia preparat można przechowywać w kasecie na preparaty w temperaturze 4 °C lub poddać obrazowaniu.Należy niezwłocznie przeprowadzić badanie z użyciem mikroskopii epifluorescencyjnej. Wzorzec ekspresji wektora wirusowego kodującego eGFP można zaobserwować w coronalnym przekroju tkanki mózgu myszy o grubości 200 µm. Poniżej, zaznaczony obszar obrazu epifluorescencyjnego przedstawiono w wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii konfokalnej, aby ukazać pojedyncze neurony warstwy V kory mózgowej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat przygotowywania utrwalonych, grubych skrawków mózgu do szybkiego i wysokorozdzielczego obrazowania fluorescencyjnego.

a-rapid-approach-to-high-resolution-fluorescence-imaging-semi-thick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Szybkie podejście do wysokorozdzielczego obrazowania fluorescencyjnego w półgrubych śledzionach mózgu

Źródło: Etienne, F.  i wsp. Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do badania przyciągania procesów mikroglejowych w kierunku wstrzykniętego związku w wycinkach mózgu. Zawiera przegląd przygotowywania wycinków mózgu myszy, wstrzykiwania związku testowego chemoatraktantu i obrazowania znakowanego fluorescencyjnie mikrogleju w celu wizualizacji ich...

Mikroskopia dwufotonowa do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związku w wycinku mózgu myszy

Źródło: Shimojo, H., et al. Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)W tym filmie kultury warstw korowych z transgenicznych zarodków myszy są wykorzystywane do monitorowania ekspresji genów za pomocą obrazowania trójwymiarowego. Obrazy bioluminescencji, fluorescencji i jasnego pola są wykorzystywane do wizualizacji ekspresji genów w czasie rzeczywistym podczas różnicowania neuronów w tkance natywnej.

Monitorowanie ekspresji genów w czasie rzeczywistym w wycinkach mózgu za pomocą obrazowania trójwymiarowego

Prezentowana tutaj jest zmodyfikowana metoda rolkowa do hodowli i przerywanego obrazowania w wysokiej rozdzielczości wycinków mózgu gryzoni przez wiele tygodni z precyzyjną zmianą położenia na fototrawionych szkiełkach nakrywkowych. Żywotność neuronów i morfologia warstw są dobrze zachowane. Zapewnione są zastosowania tego w pełni zamkniętego systemu wykorzystującego wirusy do ekspresji specyficznej dla typu komórki.

Zmodyfikowana metoda rurki rolkowej do precyzyjnie zlokalizowanego i powtarzalnego obrazowania przerywanego podczas długotrwałej hodowli wycinków mózgu w systemie zamkniętym

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Wprowadzamy powtarzalną i stabilną metodę zapisu optycznego dla wycinków mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie. W artykule opisano barwienie barwnikiem wrażliwym na napięcie oraz rejestrację sygnałów optycznych przy użyciu konwencjonalnych preparatów plastrów hipokampa.

Szerokokątny zapis optyczny pojedynczych fotonów w wycinkach mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Obecny protokół zapewnia krok po kroku procedurę szybkiego i jednoczesnego oczyszczania optycznego, wieloetapowego znakowania i wolumetrycznej rekonstrukcji 3D dziesiątek pośmiertnych odcinków ludzkiego mózgu poprzez połączenie (SWITCH - H2O2 - Pozyskiwanie antygenu R- 2,2'-tiodieetanol [TDE]) KRÓTKA technika transformacji tkankowej z obrazowaniem mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego w rutynowym protokole wysokoprzepustowym.

Optyczne oczyszczanie i znakowanie w mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych w wielkoskalowym obrazowaniu ludzkiego mózgu

Poznaj metodę szybkiego obrazowania fluorescencyjnego neuronów w półgrubych wycinkach mózgu myszy. Technika obejmuje osadzanie, krojenie i optyczne przezroczystienie tkanek, umożliwiając wizualizację sieci neuronowych w wysokiej rozdzielczości.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Przeglądaj więcej filmów