Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie stopnia wchłaniania nanocząsteczek przez guzy z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego. Jest to realizowane poprzez wstępne usunięcie skorupki i inkubację embrionów ptasich. Drugim krokiem jest wytworzenie ksenoprzeszczepów guzów w błonie chorioalantoidalnej (CAM) i pozostawienie ich do wzrostu przez około jeden tydzień.

Trzecim krokiem procedury jest dożylne wstrzyknięcie nanocząsteczek do organizmu myszy oraz przeprowadzenie obrazowania konfokalnego in vivo w czasie rzeczywistym w obrębie ksenoprzeszczepu guza. Ostatnim etapem procedury jest wycięcie i sekcjonowanie guza. W końcowej fazie na podstawie uzyskanych obrazów określa się ilościowo stopień pobrania nanocząsteczek przez guz, co umożliwia przeprowadzenie wtórnej analizy nowotworu.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość generowania obrazów o wysokiej rozdzielczości, co pozwala na ocenę dynamiki gromadzenia się nanocząstek w guzach na poziomie mikroskopowym. Co więcej, dzięki zastosowaniu tego systemu modelowego, pojedynczy badacz jest w stanie przeanalizować bardzo dużą liczbę grup eksperymentalnych w ciągu dwóch tygodni. Ponadto błona Cory Alloid embrionów Shells jest łatwo dostępna dla manipulacji fizycznych oraz obrazowania nieinwazyjnego.

Moje laboratorium koncentruje się na opracowywaniu nanocząsteczek do celowanego obrazowania molekularnego i dostarczania leków w terapii nowotworów. Poszukiwania szybkiego i niedrogiego modelu ksenoprzeszczepu, w którym można przeprowadzić szczegółowe analizy poboru, doprowadziły nas do wykorzystania zarodka kurczego w skorupce. W niniejszej pracy wykorzystujemy obrazowanie intravitalne o wysokiej rozdzielczości do oceny poboru nanocząsteczek przez ludzkie ksenoprzeszczepy nowotworowe w zmodyfikowanym modelu zarodka kurczego w skorupce.

Do niniejszego protokołu należy przygotować zapłodnione zarodki kurczęce w czwartym dniu inkubacji. Stosując standardową metodę, należy upewnić się, że zarodki są zapłodnione i żywe poprzez sprawdzenie tętna, a następnie inkubować je w temperaturze 38 °C przy wilgotności względnej co najmniej 60% aż do dziewiątego dnia inkubacji, kiedy to zarodki są gotowe do inokulacji komórkami nowotworowymi.

Zmontuj mikroinjektor, łącząc igłę o rozmiarze 18 G z strzykawką o pojemności 1 mL za pomocą odcinka rurki Tigon o długości od 5 do 6 cali. Ostrożnie wprowadź ścięcie igły do rurki. Około 4 do 5 cali rurki powinno wystawać poza końcówkę igły.

Następnie należy zaciągnąć zawiesinę komórek nowotworowych przez rurkę do strzykawki i ją odwrócić. Ostrożnie opukać bok strzykawki i nacisnąć tłok, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie należy wstawić szklaną igłę do mikroiniekcji na końcu rurki i naciskać tłok, aż zawiesina komórek dotrze do końcówki igły.

Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, powoli i ostrożnie wstrzyknij od 10 000 do 100 000 komórek nowotworowych do przestrzeni śródmiąższowej wewnątrz CAM. Komórki powinny utworzyć widoczny bolus wewnątrz CAM; komórki osadzone na powierzchni CAM można usunąć, delikatnie przykładając chusteczkę typu Kimwipe lub aplikator bawełniany. Teraz przenieś embriony z powrotem do inkubatora w temperaturze 38 °C przy wilgotności co najmniej 60%.

Należy pozwolić guzowi rosnąć i unaczynić się przez maksymalnie siedem dni, aż osiągnie średnicę co najmniej pięciu milimetrów przed obrazowaniem. Nanocząsteczki muszą być znakowane barwnikiem fluorescencyjnym kompatybilnym z mikroskopem intravitalnym i przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsius w PBS, gdzie pozostają stabilne przez co najmniej jeden rok. Następnie nanocząsteczki należy wirować przez jedną minutę, aby odwirować wszelkie agregaty przed pobraniem ich do mikroinjektora. Teraz, używając PBS do rozcieńczenia nanocząsteczek, należy przygotować stężenie robocze 1 mg/mL, aby ostatecznie wstrzyknąć 50 µg nanocząsteczek w objętości 50 µL.

Następnie przeprowadź iniekcje w 16. dniu rozwoju embrionalnego. Sprawdź, czy guzy są w wystarczającym stopniu unaczynione, aby wybrać do iniekcji dożylnych embriony z najlepiej rozwiniętymi guzami. Wstrzyknij fluorescencyjną dekstrynę o niskiej masie cząsteczkowej, której widmo jest odmienne od widma komórek nowotworowych i nanocząsteczek.

Następnie należy poddać dekstrynę wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym i wybrać zarodki z najlepiej unaczynionymi guzami. Po wybraniu zarodków, za pomocą przygotowanego mikroinjektora, należy wstrzyknąć co najmniej 200 µL przygotowanych nanocząsteczek. Odwrócić strzykawkę.

Ostrożnie opukaj bok i naciśnij tłok, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie włóż długą, stożkową szklaną igłę do mikroiniekcji do końca rurki i naciskaj tłok, aż roztwór nanocząsteczek dotrze do końcówki igły. Tępa igła nie przebije ektodermy, natomiast igła zbyt ostra i cienka pęknie podczas wprowadzania do tkanki.

Następnie dożylnie wstrzyknij od 30 do 200 µL nanocząsteczek do zarodków w miejscu oddalonym od strony przeznaczonej do wizualizacji; obrazowanie należy przeprowadzić bezpośrednio po wstrzyknięciu nanocząsteczek. W odniesieniu do guzów opisanych w następnej sekcji, należy rozpocząć od przygotowania jednostki obrazującej zarodki. Najpierw nanieś cienką warstwę smaru próżniowego wokół obwodu portu obrazującego na spodniej stronie pokrywy.

Następnie na porcie należy zamocować szklaną lamellkę o średnicy 18 mm. Teraz należy umieścić embrion w urządzeniu w taki sposób, aby lamellka znajdowała się nad obszarem przeznaczonym do obrazowania. Powoli opuszczać pokrywę urządzenia, aż lamellka zetknie się z embrionem, a następnie przykręcić pokrywę.

Następnie umieść szalkę z embrionem w jednostce obrazującej wypełnionej wodą o temperaturze 37 °C. Jednostka ta utrzyma embrion w stałej pozycji pod konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym z dyskiem obrotowym. Sprawdź, czy w komorze środowiskowej panuje temperatura 37 °C.

Następnie ustaw jednostkę obrazującą na stoliku tak, aby okienko szkiełka nakrywnego znajdowało się bezpośrednio pod obiektywem mikroskopu. Przystąp do obrazowania. Pozyskaj stosy obrazów o wysokiej rozdzielczości guza oraz otaczających go naczyń krwionośnych bezpośrednio po wstrzyknięciu, a następnie w odstępach godzinnych.

Następnie obrazy będą odzwierciedlać szczegółowe zmiany strukturalne zachodzące w naczyniach krwionośnych guza. Zarodek można obrazować w sposób ciągły do 36 godzin bez konieczności wymiany kąpieli wodnej. W celu ilościowego określenia wychwytu nanocząstek wirusowych na podstawie obrazów, należy użyć pakietu oprogramowania, takiego jak velocity.

Najpierw należy wybrać guz i oddzielić go od otaczającego zrębu. Wybór jest ułatwiony dzięki oznakowaniu guza fluorescencyjną dekstryną. Następnie oblicz średni sygnał fluorescencji nanocząsteczek w guzie oraz w reprezentatywnych obszarach przyległego zrębu.

Następnie oblicz stosunek średniego sygnału. Wzmocnij selekcję guza względem średniego sygnału. Wzmocnij selekcję zrębu.

Wartość stosunku większa niż jeden wskazuje, że nanocząsteczki lokalizują się preferencyjnie w guzie. Komórki raka jelita grubego HT 29 wstrzyknięto, aby utworzyć kłębek o średnicy około 1 mm w obrębie błony żółtkowej w dziewiątym dniu. Po siedmiu dniach inkubacji zarodki kurczęce otrzymały dożylny wstrzyk z dekstryną o niskiej masie cząsteczkowej w celu potwierdzenia unaczynienia guza.

Dożylne podanie nanocząstek CPMV LOR 6 47 lub pegylowanych nanocząstek CPMV LOR 6 47, a następnie obrazowanie konfokalne w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości, wykazało, że zarówno nanocząstki CPMV, jak i pegylowane nanocząstki CPMV szybko znakowały cały układ naczyniowy. W ciągu 12 godzin po wstrzyknięciu ilościowe oznaczenie sygnału fluorescencyjnego w obszarach guza w porównaniu z obszarami zrębu wykazało, że pobieranie pegylowanych nanocząstek CPMV przez guz było około trzykrotnie wyższe niż w przypadku nanocząstek CPMV. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić wysokorozdzielcze obrazowanie intravitalne w celu oceny pobierania nanocząstek przez ksenoprzeszczepy guzów w modelu embrionu ptaka – od przygotowania embrionów ptaków, przez ksenoprzeszczepianie komórek nowotworowych i dożylne wstrzykiwanie nanocząstek, aż po ocenę pobierania nanocząstek przez guzy za pomocą intravitalnego obrazowania konfokalnego w czasie rzeczywistym.