Name: Ocena wychwytu nanocząstek w nowotworach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania przyżyciowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny wychwytu nanocząstek w nowotworach człowieka przy użyciu obrazowania przyżyciowego w modelu zarodka ptaka. Technika umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było wspierane przez grant CCSRI nr 700537 oraz grant CIHR nr 84535 dla JDL oraz granty NIH/NCI nr CA120711-01A1 i CA120711-01A1 dla AZ. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z regulacjami i wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee na University of California San Diego oraz Animal Care and Use na University of Western Ontario.

1. Inokulacja guza do błony prawidłowej (CAM) zarodka ptaka
<ol>
<li>Przygotować zapłodnione embriony kurcząt pozbawione skorup zgodnie z opisem8.</li>
<li>W 9. dniu rozwoju embrionalnego złożyć mikroinżektor, używając igły o rozmiarze 18G podłączonej do strzykawki 1 mL. Odciąć kawałek rurki Tygon o długości 5-6 cali (średnica wewnętrzna 1/32", średnica zewnętrzna 3/32", grubość ścianki 1/32") i ostrożnie wsunąć ścięty koniec igły do rurki. Z końcówki igły powinno wystawać około 4-5 cali rurki (Rycina 1a).</li>
<li>Napełnić strzykawkę i rurkę zawiesiną komórkową. Następnie wstawić szklaną igłę do mikroiniekcji na końcu rurki i ostrożnie usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
<li>Wstrzyknąć do embrionów w 9. dniu rozwoju (Rycina 1b) pod stereomikroskopem z oświetlaczem od 10 000 do 100 000 komórek nowotworowych w formie bolusa do błony CAM (Rycina 1c). Wstrzykiwać komórki powoli, upewniając się, że igła znajduje się w odpowiednim miejscu, aby komórki utworzyły widoczny bolus wewnątrz błony CAM. Komórki, które skapią na powierzchnię błony CAM, można usunąć za pomocą chusteczki Kimwipe lub innego aplikatora.</li>
<li>Przenieść embriony z powrotem do inkubatora z nawilżaczem w temperaturze 38°C i wilgotności 60%, pozwalając na wzrost i unaczynienie guza (do 7 dni).</li>
</ol>
2. Przygotowanie nanocząsteczek
<ol>
<li>Aby przygotować nanocząsteczki CPMV znakowane fluorescencyjnie do wstrzyknięcia do zarodka kurczaka, należy rozcieńczyć nanocząsteczki wirusowe (syntetyzowane zgodnie z metodą 8) w PBS, pH 7.4, do stężenia 100 μg/ml. Przed użyciem mieszaninę należy dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex i odwirować przez jedną minutę w celu usunięcia ewentualnych agregatów. W zależności od koniugatów i stopnia agregacji pomocne może być również sonikowanie. Zapasy fluorescencyjnie znakowanych CPMV są stabilne przez co najmniej 1 rok przy przechowywaniu w temperaturze 4°C w ciemności. Stan zapasów należy okresowo sprawdzać, nakładając kilka kropli na szkiełko przedmiotowe i weryfikując obecność fluorescencji. Do określenia, czy cząsteczki pozostały nienaruszone po koniugacji, można również zastosować transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM).</li>
<li>Krótko mówiąc, jeden mikrogram nanocząsteczek wirusowych (w końcowej objętości 2 μl) można nanieść na siatki pokryte miedzią. Następnie należy dodać taką samą objętość 2% octanu uranylu na 1 minutę przed obserwacją w mikroskopie elektronowym (Philips EM 410).</li>
</ol>
3. Dożylne wstrzyknięcie nanocząstek wirusowych znakowanych fluorescencyjnie
<ol>
<li>W 16. dniu złożyć mikroinżektor zgodnie z powyższym opisem. Nabrać pożądaną objętość nanocząsteczek wirusowych przez rurkę do strzykawki (&gt; 200 μL). Ostrożnie usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Wprowadzić szklaną igłę do mikroiniekcji na koniec rurki. Upewnić się, że igła jest jak najdłuższa i jak najbardziej zwężająca się (Rycina 2a). Jeśli igła będzie zbyt tępa, nie przebije się przez ektodermę i nie przeniknie do naczynia. Jeśli igła będzie zbyt ostra, końcówka ulegnie zmiażdżeniu podczas penetracji tkanki.</li>
<li>Wstrzyknąć dożylnie 100 μl roztworu dekstranu fluoresceinowego o stężeniu 1 mg/ml (MW 70,000 Da, Invitrogen) do zarodka z nowotworem, w miejscu oddalonym od obszaru docelowego do wizualizacji (Rycina 3d). Prawidłowe kaniulowanie żyły błony żółtkowej (CAM) jest widoczne poprzez przejaśnienie krwi na drodze przepływu wstrzykiwanej substancji (Rycina 2b). Ocenić przeciek naczyniowy 1 godzinę po iniekcji.</li>
<li>Wstrzyknąć dożylnie 50 μl roztworu o stężeniu 1 mg/ml CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) lub pegylowanego CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) do zarodków z nowotworami wykazującymi przeciek naczyniowy, w miejscu oddalonym od obszaru docelowego do wizualizacji.</li>
<li>Obrazować nowotwory natychmiast oraz co godzinę po iniekcji, używając mikroskopu odwróconego Zeiss Examiner Z1 wyposażonego w dysk wirujący Yokogawa oraz kamerę EM-CCD Hamamatsu ImagEM 9100-12.</li>
</ol>
4. Obrazowanie intravitalne w czasie rzeczywistym
<ol>
<li>Aby złożyć jednostkę do obrazowania zarodków, nanieś cienką warstwę smaru próżniowego wokół obwodu portu obrazowania na spodniej stronie pokrywy jednostki do obrazowania zarodków, a następnie dopasuj szklaną lamellkę o średnicy 18 mm do portu.</li>
<li>Ustaw zarodek w taki sposób, aby lamellka zakrywała wybrany obszar do obrazowania. Powoli opuszczaj pokrywę, aż lamellka zetknie się z zarodkiem, a następnie przykręć pokrywę do jednostki, aby ją unieruchomić (Rysunek 2c).</li>
<li>Wlej wodę podgrzaną do 37°C do jednostki do obrazowania zarodków, poza naczynie zawierające zarodek, a następnie umieść całą jednostkę na stole pionowego mikroskopu konfokalnego z wewnętrzną komorą środowiskową ustabilizowaną w temperaturze 37°C.</li>
<li>Umieść jednostkę do obrazowania zawierającą zarodek pod konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym z dyskiem obrotowym (Rysunek 2e). Jednostka do obrazowania unieruchomi zarodek i utrzyma stałe pole widzenia podczas przechwytywania obrazów, co umożliwi wykonanie zarówno trójwymiarowych stosów Z, jak i obrazów time-lapse. Obrazy trójwymiarowe time-lapse pozyskujemy i analizujemy za pomocą pakietu oprogramowania Volocity firmy Perkin Elmer (dawniej Improvision) (Rysunek 3a). Pozyskaj wysokorozdzielczy trójwymiarowy stos obrazów guza i otaczających go naczyń krwionośnych, aby przeprowadzić szczegółowe analizy strukturalne w określonych punktach czasowych. Pozyskuj trójwymiarowe stosy w regularnych odstępach czasu, aby mapować szczegółowe zmiany strukturalne w unaczynieniu guza. Obrazuj guzy co godzinę po wstrzyknięciu.</li>
<li>Ilościowo określ pobór nanocząsteczek wirusowych, obliczając średni sygnał Alexa Fluor (AF) 647 w wybranych obszarach guza lub w zrębie (obszarze pozaguzowym) przy użyciu oprogramowania do kwantyfikacji obrazu, takiego jak Volocity (Perkin Elmer). Stosunek guza do zrębu obliczono, dzieląc średni sygnał AF 647 w guzie przez średni sygnał AF 647 w zrębie. Stosunek guz/zrąb wyższy niż 1 wskazuje na to, że nanocząsteczki są pobierane przez guz.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
W opisanym tutaj przykładzie wstrzyknięto komórki raka jelita grubego HT-29, aby utworzyć kuleczkę o wielkości około 1mm w obrębie błony błony treściowej (CAM) 9-dniowych zarodków kurzych (Rysunek 1b). Po inokulacji zarodki hodowano przez 7 dni w inkubatorze z nawilżaniem, aby umożliwić odpowiedni wzrost i unaczynienie guza (Rysunek 1c). Zarodom wstrzyknięto dożylnie dekstran o niskiej masie cząsteczkowej w celu potwierdzenia unaczynienia guza, a następnie guzy zobrazowano za pomocą mikroskopu odwróconego Zeiss AxioExaminer Z1 (Rysunek 2d).
Po dożylnym podaniu nanocząstek CPMV-AF 647 lub CPMV-PEG-AF 647 (rycina 3a i b), wysokorozdzielcze obrazowanie konfokalne w czasie rzeczywistym (rycina 2e) wykazało, że zarówno nanocząstki CPMV, jak i CPMV-PEG szybko oznakowały całe układ naczyniowy, jednak pobranie CPMV-PEG przez guz było około 3 razy wyższe niż w przypadku CPMV po 12 godzinach (rycina 3a). Względne pobranie nanocząstek przez guz określono przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu (Volocity firmy Perkin Elmer). Wybrano obszary zainteresowania w obrębie guza oraz poza nim (w przedziale zrębowym), a następnie określono średnią intensywność fluorescencji dla każdego z nich. Dane przedstawiono jako stosunek guza do zrębu.
<img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="Układ do wstrzykiwania mikroigłą i angiogeneza w embrionie kurczaka; strzykawka, cewka, wzrost naczyń krwionośnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1.Mikrowstrzykiwanie guzów do błony CAM embrionu ptaka. (a) Aparatura do mikrowstrzykiwania składa się z komponentów wskazanych na schemacie. (b) Embriony ptaków w 9. dniu są gotowe do inokulacji guzem, gdy błona CAM rozprzestrzeni się, pokrywając całą powierzchnię. (c) W 16. dniu guz urośnie do średnicy do 1 cm (linia przerywana) i będzie gotowy do wstrzyknięcia nanocząsteczek.
<img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="Analiza błony chorioallantoicznej; badanie wzrostu guza; mikroskopia; ustawienie badania optycznego; miejsce wstrzyknięcia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2">
 Rysunek 2.Wstrzykiwanie nanocząstek i obrazowanie intravitalne. Wstrzykiwanie pod mikroskopem sekcyjnym przedstawiające (a) końcówkę igły mikroinjektora przygotowaną do wstrzyknięcia do żyły CAM oraz (b) igłę mikroinjektora wprowadzoną do żyły (wskazaną strzałką) i nanocząstki wstrzykiwane do przepływu krwi (widoczne poprzez przejaśnienie krwi). (c) Jednostka obrazująca zawierająca embrion ptaka z szkiełkiem podstawowym stykaćcym się bezpośrednio z CAM. (d) Przed wstrzyknięciem nanocząstek unaczynienie guza jest oceniane za pomocą obrazowania intravitalnego po wstrzyknięciu dekstranu fluoresceiny. (e) Jednostka obrazująca zawierająca embrion umieszczonego na stoliku pionowego mikroskopu konfokalnego w komorze z regulowaną temperaturą ustawioną na 37°C.
<img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna, wykres; analiza guza CPMV, celowanie wirusowe, wyniki porównania intensywności." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3">
 Rysunek 3. Wizualizacja intravitalna pobierania nanocząsteczek w ludzkich guzach. Guzy są wizualizowane 7 godzin po wstrzyknięciu (a) CPMV-AF647 oraz (b) CPMV-PEG-AF647. d) Wycięcie guza z zarodka ptaka do dalszej analizy.

<ol><li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).</li>
<li>Judenhofer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+PET-MRI%3A+a+new+approach+for+functional+and+morphological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging.</a> Nat Med. 14, 459-465 (2008).</li>
<li>Weissleder, R., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+the+era+of+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging in the era of molecular oncology.</a> Nature. 452, 580-589 (2008).</li>
<li>Chambers, A. F., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+for+experimental+metastatic+ability+of+heterologous+tumor+cells+in+the+chick+embryo+after+DNA-mediated+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer.</a> Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).</li>
<li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rat+glioma+growth%2C+invasion%2C+and+vascularization+in+a+novel+chick+embryo+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model.</a> Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+tumor+cell+intravasation+and+subsequent+metastasis+via+regulation+of+in+vivo+tumor+cell+motility+by+the+tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151.</a> Cancer cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nature medicine. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Leong, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Chatterji, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock%3B+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).</li>
<li>Brunel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+viral+nanoparticles+for+biomedicine%3A+the+impact+of+PEG+chain+length+on+VNP+cell+interactions+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo.</a> Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMV+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Błona pozarodłowa (CAM) embrionu ptaka jest użytecznym modelem do oceny dynamiki naczyniowej i farmakokinetyki ludzkich guzów. Struktura i położenie CAM umożliwiają wysokiej jakości akwizycję obrazów i pozwalają na implementację wielu rodzajów ksenoprzeszczepów nowotworowych bez konieczności przeprowadzania inwazyjnych procedur chirurgicznych. Ponadto ksenoprzeszczepy nowotworowe zaimplantowane w błonę pozarodłową ulegają unaczynieniu w ciągu 7 dni, oferując szybki, niedrogi i półwysokoprzepustowy sposób oceny akumulacji nanocząsteczek w tkance nowotworowej. Ponieważ ksenoprzeszczepy nowotworowe zaimplantowane w CAM bezskorupkowych zarodków kurzych są dostępne dla optyki o wysokiej rozdzielczości pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego, można łatwo uzyskać kontekstowe i czasowe informacje dotyczące poboru nanocząsteczek przez unaczynienie guza. Ksenoprzeszczepy nowotworowe w tym modelu mają tendencję do wzrostu bocznego w obrębie CAM, co skutkuje powstaniem guzów, które są duże, ale ich głębokość pozostaje mniejsza niż 200 µm. Dzięki temu są one szczególnie odpowiednie do obrazowania intravitalnego, ponieważ standardowe mikroskopy epifluorescencyjne mogą efektywnie penetrować całą masę guza. W przeciwieństwie do tego, guzy zaimplantowane w miejscach powierzchownych lub ortotopowych u myszy proliferują trójwymiarowo, co utrudnia dokładną lokalizację nanocząsteczek głęboko wewnątrz tych guzów za pomocą technik nieinwazyjnych. Wykorzystaliśmy ten model do oceny poboru kropek kwantowych, liposomów i nanocząsteczek tlenku żelaza w kilku ludzkich ksenoprzeszczepach nowotworowych, wskazując na potencjał tego modelu do analizy in vivo szerokiej gamy formulacji nanocząsteczek.

<table><tbody><tr><td>Zapłodnione jaja kurcząt rasy leghorn</td><td>Frey`s Hatchery, St. Jacobs</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>narzędzie rotacyjne Dremel</td><td>Dremel</td><td></td><td>Można użyć dowolnego modelu</td></tr><tr><td>tarcze tnące Dremel nr 36 </td><td>Dremel</td><td>409</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Sportsman</td><td>Berry Hill</td><td>1550HA</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Sportsman </td><td>Berry Hill</td><td>1502EA</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>70% (obj./obj.)</td></tr><tr><td>Łódeczki wagowe polistyrenowe </td><td>VWR international</td><td>12577-01</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowe szalki Petriego</td><td>Simport</td><td>25378-115</td><td></td></tr><tr><td>Gumowy pojemnik Rubbermaid z pokrywką </td><td>Guillevin</td><td>RH3-228-00-BLU</td><td>otwory wywiercone w ściankach bocznych</td></tr><tr><td>Pionowa wyciągarka do pipet</td><td>Instrumenty David Kopf</td><td>model 720</td><td>Ustawienia: 16,3 (grzałka) i 2,3 (elektrozawór)</td></tr><tr><td>&lt;p&gt;Kapilary szklane borokrzemianowe sodowe &lt;/p&gt;</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF100-58-10</td><td>&lt;p&gt;(średnica zewnętrzna 1,0 mm; średnica wewnętrzna 0,58 mm; 10 cm)&lt;/p&gt; długość)</td></tr><tr><td>1X Dulbecco&amp;rsquo;podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s </td><td>Invitrogen</td><td>14190250</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>bufor fosforanowy (D-PBS) (1X), ciecz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, 0,05% (1X) z EDTA 4Na, roztwór</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td>Inaktywacja termiczna</td></tr><tr><td>Komora countingowa (hemocytometr)</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-090</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna</td><td>VWR international</td><td>25607-856</td><td></td></tr><tr><td>przewód Tygon R-3603 </td><td>VWR international</td><td>63009-983</td><td>50 ft (średnica wewnętrzna 1/32 cala, średnica zewnętrzna 3/32 cala, grubość ścianki 1/32 cala)</td></tr><tr><td>Igły podskórne do zastrzyków, igły o rozmiarze 18G</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td>Opakowanie 100 szt.</td></tr><tr><td>strzykawki 1 ml do iniekcji</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Opakowanie 100 sztuk</td></tr><tr><td>Oświetlacz do mikroskopu światłowodowego</td><td>Amscope</td><td>HL250-AY</td><td>150 W</td></tr><tr><td>chusteczki Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>10805-905</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; nasiona (California black-eye no. 5)</td><td>Burpee</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>Lampy do uprawy wewnątrz pomieszczeń</td><td>SunLite, Gardener&amp;rsquo;zaopatrzenie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ester metylo-PEO4-NHS</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>PI22341</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-NHS, ester sukkcynimidylowy PEG, MW 2000</td><td>NANOCS</td><td>PEG1-0002</td><td></td></tr><tr><td>kwas karboksylowy Alexa Fluor 647 (ester sukcynimidylowy)</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>ester succinimidy Oregon Green 488 * izomer 6 *</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan jednowodorowy dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379980</td><td>K2HPO4 (do buforu fosforanowego)</td></tr><tr><td>Wodorofosforan potasu jednowodny </td><td></td><td>P5655</td><td>KH2PO4 (do buforu fosforanowego)</td></tr><tr><td>kolumna do chromatografii wykluczania Superose 6</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0673-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;Chromatograf KTA Explorer 100</td><td>GE Healthcare</td><td>WS-AKTA100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;zestaw wysokoprzepływowy KTA</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1154-85</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor SW 28 Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342204</td><td>Wirówka z koszem z wahadłowymi uchwytami</td></tr><tr><td>rotor 50.2 Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>337901</td><td>Kąt stały</td></tr><tr><td>Centryfugowe jednostki filtrujące Amicon Ultra-15 </td><td>EMD Millipore</td><td>UFC910008</td><td>próg odcięcia 100 kDa</td></tr><tr><td>Generator gradientu</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dekstran, fluoresceina, 70 000 MW, anionowy</td><td>Invitrogen</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop fluorescencyjny z dyskiem obrotowym</td><td>Quorum Technologies</td><td>Brak danych</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny szerokopolowy </td><td>Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Kamera EM-CCD Hamamatsu ImagEM 9100-12</td><td>Quorum; Hamamatsu</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Komora temperaturowa do mikroskopu </td><td>Tworzywa precyzyjne</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Smar próżniowy </td><td>VWR international</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe nr 1 (18 mm)</td><td>VWR international</td><td>16004-300</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie Volocity</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obudowa zarodka kurczaka</td><td></td><td>wykonany na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki precyzyjne</td><td>VWR international</td><td>25608-203</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>BioShop Canada</td><td>FOR201.500</td><td>Stosować w dygestorium</td></tr><tr><td>Optymalne cięcie </td><td>Fisher Scientific</td><td>1437365</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura (OCT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formy plastikowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038217</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka przylepne VWR VistaVision HistoBond</td><td>VWR International</td><td>16004-406</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie Prolong Gold z użyciem DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe noże do kriostatu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-634-2</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica Microsystems</td><td>14047033518</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Obecne technologie obrazowania nowotworów, takie jak USG, MRI, PET i CT, nie są w stanie dostarczyć obrazów o wysokiej rozdzielczości niezbędnych do oceny wychwytu nanocząsteczek w guzach na poziomie mikroskopowym1,2,3, co podkreśla użyteczność odpowiedniego modelu ksenoprzeszczepu do przeprowadzania szczegółowych analiz wychwytu. W niniejszej pracy wykorzystujemy obrazowanie intravitalne o wysokiej rozdzielczości do oceny wychwytu nanocząsteczek w ludzkich ksenoprzeszczepach nowotworowych w zmodyfikowanym modelu zarodka kurczaka bez skorupki. Model zarodka kurczaka jest szczególnie odpowiedni do tych analiz in vivo , ponieważ wspiera wzrost ludzkich nowotworów, jest stosunkowo tani i nie wymaga znieczulenia ani operacji 4,5. Komórki nowotworowe tworzą w pełni unaczynione ksenoprzeszczepy w ciągu 7 dni po implantacji w błonę chorioallantoiczną (CAM) 6. Powstałe guzy są wizualizowane za pomocą nieinwazyjnego obrazowania w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości, które może być kontynuowane przez maksymalnie 72 godziny przy niewielkim wpływie na systemy gospodarza lub nowotworu. Nanocząsteczki o szerokim zakresie rozmiarów i formulacji, podane w miejscu oddalonym od guza, mogą być wizualizowane i ilościowo określane podczas przepływu przez krwiobieg, ekstrawazacji z nieszczelnego unaczynienia guza i akumulacji w miejscu nowotworu. Opisujemy tutaj analizę nanocząsteczek pochodzących z wirusa mozaiki fasoli (CPMV) znakowanych bliskopodczerwonymi barwnikami fluorescencyjnymi i/lub polimerami glikolu polietylenowego (PEG) 7, 8, 9,10,11. Po podaniu dożylnym te wirusowe nanocząsteczki są szybko internalizowane przez komórki śródbłonka, co skutkuje globalnym znakowaniem naczyń krwionośnych zarówno poza guzem, jak i w jego obrębie7,12. PEGylacja wirusowych nanocząsteczek zwiększa ich okres półtrwania w osoczu, wydłuża czas ich krążenia, a w konsekwencji wzmacnia ich akumulację w nowotworach poprzez efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR) 7, 10,11. Szybkość i stopień akumulacji nanocząsteczek w guzie są mierzone w czasie przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Technika ta zapewnia metodę zarówno wizualizacji, jak i ilościowego określania dynamiki nanocząsteczek w ludzkich nowotworach.

Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Obecne technologie obrazowania nowotworów, takie jak ultrasonografia, MRI, PET i CT, nie są w stanie dostarczyć obrazów o wysokiej rozdzielczości niezbędnych do oceny nanocząsteczek ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie stopnia wchłaniania nanocząsteczek przez guzy z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego. Jest to realizowane poprzez wstępne usunięcie skorupki i inkubację embrionów ptasich. Drugim krokiem jest wytworzenie ksenoprzeszczepów guzów w błonie chorioalantoidalnej (CAM) i pozostawienie ich do wzrostu przez około jeden tydzień.Trzecim krokiem procedury jest dożylne wstrzyknięcie nanocząsteczek do organizmu myszy oraz przeprowadzenie obrazowania konfokalnego in vivo w czasie rzeczywistym w obrębie ksenoprzeszczepu guza. Ostatnim etapem procedury jest wycięcie i sekcjonowanie guza. W końcowej fazie na podstawie uzyskanych obrazów określa się ilościowo stopień pobrania nanocząsteczek przez guz, co umożliwia przeprowadzenie wtórnej analizy nowotworu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość generowania obrazów o wysokiej rozdzielczości, co pozwala na ocenę dynamiki gromadzenia się nanocząstek w guzach na poziomie mikroskopowym. Co więcej, dzięki zastosowaniu tego systemu modelowego, pojedynczy badacz jest w stanie przeanalizować bardzo dużą liczbę grup eksperymentalnych w ciągu dwóch tygodni. Ponadto błona Cory Alloid embrionów Shells jest łatwo dostępna dla manipulacji fizycznych oraz obrazowania nieinwazyjnego.Moje laboratorium koncentruje się na opracowywaniu nanocząsteczek do celowanego obrazowania molekularnego i dostarczania leków w terapii nowotworów. Poszukiwania szybkiego i niedrogiego modelu ksenoprzeszczepu, w którym można przeprowadzić szczegółowe analizy poboru, doprowadziły nas do wykorzystania zarodka kurczego w skorupce. W niniejszej pracy wykorzystujemy obrazowanie intravitalne o wysokiej rozdzielczości do oceny poboru nanocząsteczek przez ludzkie ksenoprzeszczepy nowotworowe w zmodyfikowanym modelu zarodka kurczego w skorupce.Do niniejszego protokołu należy przygotować zapłodnione zarodki kurczęce w czwartym dniu inkubacji. Stosując standardową metodę, należy upewnić się, że zarodki są zapłodnione i żywe poprzez sprawdzenie tętna, a następnie inkubować je w temperaturze 38 °C przy wilgotności względnej co najmniej 60% aż do dziewiątego dnia inkubacji, kiedy to zarodki są gotowe do inokulacji komórkami nowotworowymi.Zmontuj mikroinjektor, łącząc igłę o rozmiarze 18 G z strzykawką o pojemności 1 mL za pomocą odcinka rurki Tigon o długości od 5 do 6 cali. Ostrożnie wprowadź ścięcie igły do rurki. Około 4 do 5 cali rurki powinno wystawać poza końcówkę igły.Następnie należy zaciągnąć zawiesinę komórek nowotworowych przez rurkę do strzykawki i ją odwrócić. Ostrożnie opukać bok strzykawki i nacisnąć tłok, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie należy wstawić szklaną igłę do mikroiniekcji na końcu rurki i naciskać tłok, aż zawiesina komórek dotrze do końcówki igły.Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, powoli i ostrożnie wstrzyknij od 10 000 do 100 000 komórek nowotworowych do przestrzeni śródmiąższowej wewnątrz CAM. Komórki powinny utworzyć widoczny bolus wewnątrz CAM; komórki osadzone na powierzchni CAM można usunąć, delikatnie przykładając chusteczkę typu Kimwipe lub aplikator bawełniany. Teraz przenieś embriony z powrotem do inkubatora w temperaturze 38 °C przy wilgotności co najmniej 60%.Należy pozwolić guzowi rosnąć i unaczynić się przez maksymalnie siedem dni, aż osiągnie średnicę co najmniej pięciu milimetrów przed obrazowaniem. Nanocząsteczki muszą być znakowane barwnikiem fluorescencyjnym kompatybilnym z mikroskopem intravitalnym i przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsius w PBS, gdzie pozostają stabilne przez co najmniej jeden rok. Następnie nanocząsteczki należy wirować przez jedną minutę, aby odwirować wszelkie agregaty przed pobraniem ich do mikroinjektora. Teraz, używając PBS do rozcieńczenia nanocząsteczek, należy przygotować stężenie robocze 1 mg/mL, aby ostatecznie wstrzyknąć 50 µg nanocząsteczek w objętości 50 µL.Następnie przeprowadź iniekcje w 16. dniu rozwoju embrionalnego. Sprawdź, czy guzy są w wystarczającym stopniu unaczynione, aby wybrać do iniekcji dożylnych embriony z najlepiej rozwiniętymi guzami. Wstrzyknij fluorescencyjną dekstrynę o niskiej masie cząsteczkowej, której widmo jest odmienne od widma komórek nowotworowych i nanocząsteczek.Następnie należy poddać dekstrynę wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym i wybrać zarodki z najlepiej unaczynionymi guzami. Po wybraniu zarodków, za pomocą przygotowanego mikroinjektora, należy wstrzyknąć co najmniej 200 µL przygotowanych nanocząsteczek. Odwrócić strzykawkę.Ostrożnie opukaj bok i naciśnij tłok, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie włóż długą, stożkową szklaną igłę do mikroiniekcji do końca rurki i naciskaj tłok, aż roztwór nanocząsteczek dotrze do końcówki igły. Tępa igła nie przebije ektodermy, natomiast igła zbyt ostra i cienka pęknie podczas wprowadzania do tkanki.Następnie dożylnie wstrzyknij od 30 do 200 µL nanocząsteczek do zarodków w miejscu oddalonym od strony przeznaczonej do wizualizacji; obrazowanie należy przeprowadzić bezpośrednio po wstrzyknięciu nanocząsteczek. W odniesieniu do guzów opisanych w następnej sekcji, należy rozpocząć od przygotowania jednostki obrazującej zarodki. Najpierw nanieś cienką warstwę smaru próżniowego wokół obwodu portu obrazującego na spodniej stronie pokrywy.Następnie na porcie należy zamocować szklaną lamellkę o średnicy 18 mm. Teraz należy umieścić embrion w urządzeniu w taki sposób, aby lamellka znajdowała się nad obszarem przeznaczonym do obrazowania. Powoli opuszczać pokrywę urządzenia, aż lamellka zetknie się z embrionem, a następnie przykręcić pokrywę.Następnie umieść szalkę z embrionem w jednostce obrazującej wypełnionej wodą o temperaturze 37 °C. Jednostka ta utrzyma embrion w stałej pozycji pod konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym z dyskiem obrotowym. Sprawdź, czy w komorze środowiskowej panuje temperatura 37 °C.Następnie ustaw jednostkę obrazującą na stoliku tak, aby okienko szkiełka nakrywnego znajdowało się bezpośrednio pod obiektywem mikroskopu. Przystąp do obrazowania. Pozyskaj stosy obrazów o wysokiej rozdzielczości guza oraz otaczających go naczyń krwionośnych bezpośrednio po wstrzyknięciu, a następnie w odstępach godzinnych.Następnie obrazy będą odzwierciedlać szczegółowe zmiany strukturalne zachodzące w naczyniach krwionośnych guza. Zarodek można obrazować w sposób ciągły do 36 godzin bez konieczności wymiany kąpieli wodnej. W celu ilościowego określenia wychwytu nanocząstek wirusowych na podstawie obrazów, należy użyć pakietu oprogramowania, takiego jak velocity.Najpierw należy wybrać guz i oddzielić go od otaczającego zrębu. Wybór jest ułatwiony dzięki oznakowaniu guza fluorescencyjną dekstryną. Następnie oblicz średni sygnał fluorescencji nanocząsteczek w guzie oraz w reprezentatywnych obszarach przyległego zrębu.Następnie oblicz stosunek średniego sygnału. Wzmocnij selekcję guza względem średniego sygnału. Wzmocnij selekcję zrębu.Wartość stosunku większa niż jeden wskazuje, że nanocząsteczki lokalizują się preferencyjnie w guzie. Komórki raka jelita grubego HT 29 wstrzyknięto, aby utworzyć kłębek o średnicy około 1 mm w obrębie błony żółtkowej w dziewiątym dniu. Po siedmiu dniach inkubacji zarodki kurczęce otrzymały dożylny wstrzyk z dekstryną o niskiej masie cząsteczkowej w celu potwierdzenia unaczynienia guza.Dożylne podanie nanocząstek CPMV LOR 6 47 lub pegylowanych nanocząstek CPMV LOR 6 47, a następnie obrazowanie konfokalne w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości, wykazało, że zarówno nanocząstki CPMV, jak i pegylowane nanocząstki CPMV szybko znakowały cały układ naczyniowy. W ciągu 12 godzin po wstrzyknięciu ilościowe oznaczenie sygnału fluorescencyjnego w obszarach guza w porównaniu z obszarami zrębu wykazało, że pobieranie pegylowanych nanocząstek CPMV przez guz było około trzykrotnie wyższe niż w przypadku nanocząstek CPMV. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić wysokorozdzielcze obrazowanie intravitalne w celu oceny pobierania nanocząstek przez ksenoprzeszczepy guzów w modelu embrionu ptaka – od przygotowania embrionów ptaków, przez ksenoprzeszczepianie komórek nowotworowych i dożylne wstrzykiwanie nanocząstek, aż po ocenę pobierania nanocząstek przez guzy za pomocą intravitalnego obrazowania konfokalnego w czasie rzeczywistym.

evaluation-nanoparticle-uptake-tumors-real-time-using-intravital

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ocena przyjęcia nanocząstek w guzach w czasie rzeczywistym przy użyciu obrazowania in vivo

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Opisujemy nowatorską technikę obrazowania in vivo, która łączy fluorescencyjne chimeryczne myszy z oknami wewnątrzczaszkowymi i mikroskopią 2-fotonową o wysokiej rozdzielczości. Ta platforma obrazowania wspomaga badania dynamicznych zmian w tkance mózgowej i mikrokrążeniu na poziomie pojedynczej komórki, po patologicznych urazach i jest przystosowana do oceny wewnątrzczaszkowego dostarczania i dystrybucji leków.

Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Ten artykuł szczegółowo opisuje procedury analizy obrazowania optycznego nanocząsteczki HerDox, ukierunkowanej na nowotwór.  W szczególności opisano tutaj szczegółowe zastosowanie wielomodowego urządzenia do obrazowania do wykrywania celowania w guz i oceny penetracji guza.

Analiza celowanych nanocząstek białek wirusowych dostarczanych do guzów HER2+

Ten protokół określa kroki wymagane do przeprowadzenia walidacji ex vivo eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów w bliskiej podczerwieni in vivo na myszach przy użyciu nanociał znakowanych fluoroforem i konwencjonalnych przeciwciał.

Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Słabe zrozumienie skuteczności nanoleków in vivo utrudnia ich kliniczne tłumaczenie. Opisano tutaj procedury oceny zachowania in vivo nanoleków przeciwnowotworowych na poziomie ogólnoustrojowym, tkankowym, jednokomórkowym i subkomórkowym u myszy immunokompetentnych z nowotworem. Podejście to może pomóc naukowcom w zidentyfikowaniu obiecujących nanoleków przeciwnowotworowych do zastosowania klinicznego.

Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

Obrazowanie żywych komórek to potężne narzędzie do wizualizacji dynamicznych procesów. Badanie nieruchomych komórek dostarcza jedynie statycznych obrazów, co może prowadzić do błędnej interpretacji i zamieszania co do procesu. W pracy przedstawiono metodę badania wychwytu, uwalniania leków i lokalizacji wewnątrzkomórkowej nanocząstek liposomalnych w żywych komórkach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek in vitro do badania chemioterapeutyków dostarczanych przez nanocząstki na bazie lipidów

Opisana tutaj jest metoda wykorzystania embrionów danio pręgowanego do badania zdolności funkcjonalizowanych nanocząsteczek do celowania w ludzkie komórki rakowe in vivo. Metoda ta pozwala na ocenę i wybór optymalnych nanocząstek do przyszłych badań na dużych zwierzętach oraz w badaniach klinicznych.

Celowanie in vivo w ksenoprzeszczepowane ludzkie komórki rakowe za pomocą funkcjonalizowanych fluorescencyjnych nanocząstek krzemionki u danio pręgowanego

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.

Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Poznaj metodę ilościowej oceny wychwytu nanocząstek w nowotworach człowieka przy użyciu obrazowania przyżyciowego w modelu zarodka ptaka. Technika umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Przeglądaj więcej filmów