Name: Identyfikacja i analiza mysich progenitorów erytroidalnych za pomocą testu cytometrycznego przepływowego CD71 / TER119 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 32 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do identyfikacji mysich progenitorów erytroidalnych za pomocą markerów CD71 i TER119. Technika ta umożliwia analizę etapów dojrzewania erytroblastów w tkankach hematopoetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy centrum cytometrii przepływowej UMass: Richardowi Konzowi, Tedowi Giehlowi, Barbarze Gosselin, Yuehua Gu i Tammy Krupoch. Praca ta była finansowana przez NIH/NHLBI RO1 HL084168 (M.S.) oraz NIH CA T32-130807 (J.R.S.). Wykorzystano również zasoby wspierane przez grant Diabetes Endocrinology Research Center DK32520.

1. Pobieranie tkanek
<ol>
<li>Przygotować probówki zawierające od 2 do 5 ml zimnego buforu do barwienia (fosforanowy bufor solny (PBS) z dodatkiem 0,2% BSA i 5mM glukozy). Przed pobraniem tkanek przechowywać probówki w lodzie.</li>
<li>Uśmiercić myszy zgodnie z odpowiednim, zatwierdzonym protokołem (np. inhalacja CO2 z następującym po niej zwichnięciem kręgów szyjnych).</li>
<li>Pobrać krew poprzez punkcję serca do probówek do pobierania krwi z EDTA lub heparyną w celu późniejszej analizy, np. hematokryty, liczby retikulocytów lub morfologii krwi (CBC).</li>
<li>Pobrać śledzionę i kości, umieszczając tkanki z każdej myszy w oddzielnej probówce przygotowanej w kroku 1. Łatwy dostęp do śledziony znajduje się po lewej stronie. W celu pobrania szpiku kostnego należy pobrać jedną lub obie kości udowe. Pobrane tkanki przechowywać w lodzie.</li>
<li>W razie potrzeby zważyć śledzionę. U myszy wykazujących odpowiedź na stres erytropoetyczny prawdopodobnie wystąpi znaczny wzrost masy śledziony.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek śledziony
<ol>
<li>Używając uprzednio zwilżonego tłoka strzykawki 3 ml, delikatnie przeciśnij śledzionę lub jej fragment (idealnie 0,1 g lub mniej, co odpowiada około 108 komórek) przez sterylne sito komórkowe o oczkach 40 μm (Fisherbrand, numer katalogowy 2363547 lub inny), umieszczone na probówce stożkowej 50 ml. Podczas tej procedury trzymaj probówkę w lodzie. Przepłucz komórki przez sito, używając łącznie 2 ml buforu do barwienia.</li>
<li>Delikatnie pipetuj przefiltrowaną zawiesinę komórkową, aby rozbić ewentualne małe skupiska. W razie potrzeby ponownie przefiltruj komórki.</li>
<li>Przemyj komórki dwukrotnie poprzez wirowanie i resuspenduj w zimnym buforze.</li>
<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Typowa wydajność wynosi 1-2 x 108 komórek ze śledziony. Do analizy cytometrycznej odmierz od 1 do 2 milionów komórek na próbkę, przenosząc je do probówek do barwienia FACS (BD Falcon, polistyrenowe probówki z okrągłym dnem, 352008) lub do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U (BD Falcon 353910). Objętość barwienia próbki wynosi 20 μl, aby uzyskać końcowe stężenie komórek od 0,5 do 1 x 107 komórek/ml lub 1-2 x 106 komórek/ 20 μl próbki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek szpiku kostnego
<ol>
<li>Przygotować strzykawki o pojemności 1 lub 3 ml z założonymi igłami 26G, uprzednio napełnione zimnym buforem do barwienia.</li>
<li>Usunąć mięśnie przyczepione do kości udowej, aby wyraźnie uwidocznić kość.</li>
<li>Używając ostrych nożyczek chirurgicznych, odciąć oba końce kości udowej tak blisko końców kości, jak to możliwe. Powinno to odsłonić mały otwór na każdym z odciętych końców, prowadzący do jamistej części szpiku kostnego, która przebiega przez całą długość kości udowej.</li>
<li>Używając strzykawek przygotowanych w kroku 1, wprowadzić igłę przez jeden z tych otworów i delikatnie wypłukać szpik przez otwór po drugiej stronie do probówki.</li>
<li>Rozdzielić wypłukane komórki poprzez delikatne pipetowanie, a następnie przefiltrować przez sito 40 μm, analogicznie do procedury dla śledziony opisanej powyżej (patrz sekcja 2.1).</li>
<li>Przemyć komórki dwukrotnie poprzez wirowanie w zimnym buforze do barwienia.</li>
<li>Policzyć komórki i resuspender zgodnie z opisem w sekcji 2.4. Typowa wydajność wynosi około 107 komórek na jedną kość udową.</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek wątroby płodowej
<ol>
<li>Aby przygotować samice myszy w określonej dobie ciąży, należy zestawić myszy do kojarzenia wieczorem, a następnie sprawdzić obecność czopów pochwowych następnego dnia przed godziną 10:0; dzień wykrycia czopu pochwowego uznaje się za dzień 0,5. Personel weterynaryjny może pomóc badaczom nieznajomym z tą techniką w identyfikacji ciężarnych samic. Ciążę można również określić poprzez monitorowanie masy ciała myszy.</li>
<li>Samice myszy w określonej dobie ciąży są uśmiercane między 12,5 a 14,5 dniem ciąży. Rogi macicy są usuwane do szalki Petriego zawierającej lodowatą pożywkę hodowlaną lub bufor barwiący.</li>
<li>Z każdej macicy wyjmuje się zarodki i wypreparowuje wątrobę płodową. W przypadku zarodków w 12,5 dniu rozwoju (E12,5) lub młodszych wymagane jest użycie mikroskopu stereotypowego.</li>
<li>Wątroby można dysocjować mechanicznie poprzez pipetowanie w buforze, a następnie przetwarzać pojedynczo w płytkach 96-dołkowych lub łączyć w pule, w zależności od wymagań eksperymentalnych.</li>
<li>Wątroba płodowa w dniu E13,5 zawiera ok. 107 komórek. Komórki przemywa się dwukrotnie w buforze barwiącym i resuspendTime w objętości 20 μl, tak aby uzyskać stężenie 1-2 x 106 komórek/próbkę do analizy cytometrycznej.</li>
</ol>
5. Barwienie przeciwciałami do cytometrii przepływowej
<ol>
<li>Przygotować mieszaninę wstępną do barwienia przeciwciałami pierwszorzędowymi, przeznaczoną dla wszystkich próbek z wyjątkiem próbek kontrolnych, zawierającą następujące składniki:
<ul>
<li>ChromePure Rabbit IgG (Jackson, 015-00-03) do końcowego stężenia 20μg/ml. Należy sprawdzić stężenie roztworu zapasowego na butelce (może ono być zmienne). Jest on stosowany do blokowania receptorów Fc w komórkach mysich; jako alternatywa można zastosować mysie IgG lub szczurze IgG. Wybór gatunku zależy od potencjalnej obecności w protokole barwienia przeciwciał wtórnych skierowanych przeciwko pierwszorzędowym przeciwciałom szczurzym/mysim/kroliczym; w takim przypadku gatunków tych nie można stosować jako przeciwciał blokujących. Alternatywnie, zamiast oczyszczonego IgG można zastosować 5% serum królika. Kolejną alternatywą jest użycie przeciwciał monoklonalnych lub fragmentów Fab skierowanych przeciwko mysim receptorom Fc. Poniższy podstawowy protokół nie obejmuje żadnych przeciwciał wtórnych, zatem można zastosować IgG każdego z trzech wymienionych gatunków.</li>
<li>CD71-FITC, rozcieńczone 1:20 (stężenie zapasowe 0.5mg/ml, BD-Biosciences, 5326)</li>
<li>Ter19-PE, rozcieńczone 1:20 (stężenie zapasowe 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 53673)</li>
<li>Wszelkie dodatkowe przeciwciała skierowane przeciwko interesującym epitopom powierzchniowym, np. przeciwciała przeciwko Fas lub FasL (patrz 1,2). Delikatnie wymieszać roztwór przeciwciał, odwracając probówkę 2-3 razy.</li>
</ul>
</li>
<li>Dodać 20 μl mieszaniny wstępnej do każdej próbki komórek i delikatnie resuspenderć komórki.</li>
<li>Przygotować kontrolne próbki komórek w następujący sposób:
<ul>
<li>'Nebarwione': komórki te pozostawia się w buforze do barwienia w celu określenia tła autofluorescencji komórek.</li>
<li>Kontrole 'pojedynczego koloru': jedna taka kontrola jest wymagana dla każdego przeciwciała/koloru użytego w protokole. Komórki w tych kontrolach barwi się albo bezpośrednio sprzężonym przeciwciałem pierwszorzędowym, albo zarówno przeciwciałem pierwszorzędowym, jak i sprzężonym przeciwciałem wtórnym. Kontrole te służą do korekcji nakładania się widm pomiędzy kanałami.</li>
<li>Kontrole 'fluorescencji minus jeden' (FMO): jedna taka kontrola jest wymagana dla każdego przeciwciała/koloru w protokole: komórki barwi się wszystkimi kolorami/przeciwciałami z protokołu z wyjątkiem koloru/przeciwciała, dla którego przygotowywana jest kontrola FMO. Kontrola FMO dla konkretnego kanału pozwala określić rzeczywiste tło dla tego kanału. Może ona zawierać niespecyficzne przeciwciało tego samego izotypu, sprzężone z tym samym znacznikiem fluorescencyjnym co przeciwciało testowe (kontrola izotypowa).</li>
</ul>
</li>
<li>Inkubować próbki i odpowiednie kontrole w barwniku z przeciwciałami pierwszorzędowymi na lodzie przez 45 min do 1 godziny w ciemności (przykryć wiadro z lodem folią aluminiową).</li>
<li>Po zakończeniu inkubacji wypłukać komórki, dodając 3ml buforu do barwienia do każdej probówki z próbką i wirując przez 3 min do 5 min przy około 40 x g w temperaturze 4°C. W przypadku użycia płytek 96-dołkowych, wypłukać komórki trzykrotnie w objętości 20 μl.</li>
<li>Jeśli dotyczy, zastosować barwienie przeciwciałami wtórnymi. Procedurę aplikacji i płukania przeprowadzić analogicznie jak w przypadku barwienia pierwszymi przeciwciałami.</li>
<li>Jeśli dotyczy, na koniec inkubacji zastosować barwienie Aneksyną V, używając buforu HEPS zgodnie z instrukcją producenta. Barwienie to przeprowadza się przez 15 minut w temperaturze pokojowej lub przez 1 godzinę na lodzie.</li>
<li>Komórki resuspenderć do analizy cytometrycznej w roztworze do barwienia zawierającym nieprzenikający do wnętrza komórek barwnik DNA, aby wykluczyć martwe komórki. Dostępnych jest kilka barwników DNA, w tym jodek propidyny, 7-amino-aktynomycyna D (7AAD) lub DAPI. Wybór zależy od dostępnych kanałów, uwzględniając kanały zajęte przez specyficzne barwienie przeciwciałami oraz kanały dostępne w cytometrze przepływowym. 7AAD pozyskuje się z BD-Biosciences (5925) i stosuje zgodnie z instrukcją producenta. Dla barwienia DAPI przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 1mg/ml w dimetyloformamidzie (DMF) z proszku (Roche, nr kat. 236276), przechowywać w -20°C i rozcieńczać 1:10 0 do 1:15 00 w buforze do barwienia.</li>
</ol>
6. Sortowanie przepływowe
<ol>
<li>Komórki znakuje się przeciwciałami przeciwko CD71, Ter19, markerami linii komórkowych oraz barwnikiem żywotności, zgodnie z opisem dla analizy cytometrycznej (sekcja 5). Stężenie komórek podczas znakowania może zostać zwiększone do 5 x 107/ml. </li>
<li>Aby przygotować główną mieszaninę markerów linii (lineage master mix), wymieszać równe objętości każdego z następujących przeciwciał:
<ul>
<li>FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30, BD Pharmingen 53848</li>
<li>FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B20 RA3-6B2, BD Pharmingen 53087</li>
<li>FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C1, BD Pharmingen 53061</li>
<li>FITC Rat Anti-Mouse CD1b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 57396</li>
<li>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 53126 </li>
<li>Stosować główną mieszaninę w rozcieńczeniu 1:80 (co odpowiada rozcieńczeniu 1:40 dla każdego z poszczególnych roztworów przeciwciał o stężeniu 0,5 mg/ml).</li>
</ul>
</li>
<li>Stosować warunki sortowania przy niskim ciśnieniu i szerokie dysze. W przypadku urządzenia Aria (BD Biosciences) stosujemy dyszę 10 μ i ciśnienie 20 psi.</li>
<li>Bufor do zbierania: PBS z dodatkiem 20% płodowej surowicy bydlęcej (Fetal Bovine Serum). </li>
<li>Aby sprawdzić czystość posortowanych populacji, należy ponownie przeanalizować niewielką alikwot z każdej próbki w buforze zawierającym barwnik żywotności (7AAD lub podobny).</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki: 
Barwienie CD71/Ter119 szpiku kostnego lub śledziony osobników dorosłych pozwala zidentyfikować sekwencję rozwojową czterech podgrup, oznaczonych jako ProE, EryA, EryB i EryC (Rysunek 1) 1. Morfologicznie odpowiadają one coraz bardziej dojrzałym erytroblastom. Rysunek 1 przedstawia sekwencję bramkowania na etapie analizy danych, która pozwala wykluczyć bardzo małe zdarzenia (w tym jądra komórkowe, erytrocyty), komórki zagregowane oraz komórki martwe.
Ekspresję białek powierzchniowych komórek dla każdej z tych podgrup można mierzyć jednocześnie, dodając odpowiednie przeciwciała w tym samym czasie, co barwienie na Ter19 i CD71. Rysunek 1 przedstawia przykład ekspresji powierzchniowej receptora śmierci Fas 1. Pomiar ten przeprowadzono u myszy wstrzykniętych Epo oraz u myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną. Wyraźnie widać, że Epo hamuje ekspresję Fas w populacji EryA in vivo 1.
Można również zmierzyć ekspresję białek wewnątrzkomórkowych lub status cyklu komórkowego dla komórek w każdej podgrupie. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywną analizę cyklu komórkowego świeżo pobranych komórek szpiku kostnego. Pomiary te wymagają, oprócz barwienia powierzchni komórek przeciwciałami CD71 i Ter19, utrwalenia i permeabilizacji komórek w celu znakowania wewnątrzkomórkowego (patrz sekcja Dyskusja).
W wątrobie płodowej komórki nieerytroidalne są najpierw wykluczane poprzez bramkowanie (gating) na komórki „Lin-”, które są negatywne pod względem CD41, Mac-1, Gr-1, B20 i CD3 (Rysunek 3). Pozostałe komórki są podzielone na 6 podgrup, od S0 do S5. Dokładny wzorzec komórek w wątrobie płodowej zależy od wieku embrionalnego (patrz sekcja Dyskusja). Przedstawiono reprezentacyjną analizę cyklu komórkowego dla podgrupy S3 w wątrobie płodowej w stadium E13,5 (Rysunek 4).
<img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="Analiza cytometryczna etapów rozwoju erytroblastów; porównanie ekspresji Fas; traktowanie roztworem soli fizjologicznej vs. Epo." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1">
 Rycina 1. Podzbiory erytroidalne CD71/Ter19 w śledzionie myszy. A. Strategia bramkowania: Komórki śledziony zostały przetworzone i znakowane przeciwciałami skierowanymi przeciwko CD71, Ter19 i Fas. Niniejszy rysunek przedstawia strategię analizy po etapie akwizycji danych. Histogram I pokazuje wszystkie zarejestrowane zdarzenia. Brama diagonalna reprezentuje zdarzenia, które prawdopodobnie są pojedynczymi komórkami, z wyłączeniem dubletów lub większych agregatów. Komórki w tej bramie są dalej analizowane w histogramie II. Tutaj wykluczone zostają zdarzenia bardzo małe, prawdopodobnie jądra komórkowe lub debris. Wyselekcjonowane komórki przedstawiono w histogramie III, w którym komórki DAPI-dodatnie, będące prawdopodobnie apoptycznymi komórkami z przepuszczalną błoną, zostają wykluczone z dalszej analizy. Histogram IV przedstawia wynikową populację żywych komórek śledziony. Brama ProE zawiera CD71wysokiTer19pośredni komórki. Ter19wysoki komórki są dalej analizowane na histogramie V. Tutaj CD71wysoki komórki dzielą się na mniej dojrzałe, duże erytroblasty „EryA” (CD71wysokiTer19wysokiFSCwysoki) oraz mniejszych, bardziej dojrzałych erytroblastów „EryB” (CD71wysokiTer19wysokiFSCniski). Najbardziej dojrzałym podtypem erytroblastów jest EryC (CD71niskiTer19wysokiFSCniski). Histogram VI przedstawia ekspresję Fas na powierzchni komórek, konkretnie w podgrupie EryA, u myszy w stanie podstawowym (wstrzykiwanych solą fizjologiczną) oraz u myszy, którym wstrzyknięto pojedynczą dawkę Epo. Barwienie przeciwciałem Fas przeprowadzono jednocześnie z barwieniem CD71/Ter19. B. Preparaty cytospinowe komórek wyselekcjonowanych z każdej z wskazanych subpopulacji. Komórki barwiono giemsą oraz diaminobenzydyną; ta druga generuje brązowe zabarwienie w obecności hemoglobiny. Dane z cytospinu zostały pierwotnie opublikowane w pracy Liu. i wsp.., Blood. 206 Jul 1;108(1):123-3. Epub 206 Mar 9.
<img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="Schemat cytometrii przepływowej; markery CD71, Ter119; analiza cyklu komórkowego komórek szpiku kostnego; fazy G1, S, G2/M." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Analiza cyklu komórkowego CD71wysokiTer19wysoki erytroblasty w szpiku kostnym myszy. Myszy otrzymywały dożylnie BrdU, a śledzionę lub szpik kostny pobierano od 30 do 60 minut później. Komórki utrwalono i permeabilizowano, a następnie, oprócz barwienia na CD71 i Ter119, poddano barwieniu na wbudowanie BrdU w replikujący się DNA z użyciem przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko BrdU (protokół utrwalania, permeabilizacji i barwienia na BrdU przebiegał zgodnie z instrukcją producenta). Komórki BrdU-dodatnie znajdują się w fazie S cyklu. Komórki w interfazie są BrdU-ujemne i mogą zostać rozróżnione na fazy G1 lub G2/M przy użyciu barwnika DNA 7AAD.
<img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="Schemat cytometrii przepływowej, bramkowanie dla żywych komórek linii ujemnych; analiza stadiów erytroblastów E13, E14." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Subpopulacje erytroidalne CD71/Ter19 w wątrobie płodowej myszy. A. Strategia bramkowania: Komórki wątroby płodowej znakowano przeciwciałami przeciwko CD71, Ter19 oraz koktajlem przeciwciał znakowanych FITC skierowanych przeciwko markerom linii nieerytroidalnych („Lin”). Analizowano ekspresję Lin w komórkach żywych (negatywnych dla 7AAD), a następnie komórki Lin- podzielono na podgrupy erytroidalne od S0 do S5. Młodsza wątroba płodowa (E13) składa się z mniej dojrzałych erytroblastów, co objawia się brakiem komórek w dojrzałych podgrupach S4/S5. B. Preparaty cytospinowe komórek wyizolowanych z każdej z indicated podgrup. Komórki barwiono giemsą oraz diaminobenzydyną; ta druga generuje brunatne zabarwienie w obecności hemoglobiny. Dane z cytospinu zostały pierwotnie opublikowane w Pop i wsp.., PLoS Biol 8(9): e10484. doi:10.1371/journal.pbio.10484 .
<img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="Analiza cytometryczna z zastosowaniem CD71, Ter119, BrdU i 7AAD; wyróżniono fazy cyklu komórkowego G1, S i G2M." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Analiza cyklu komórkowego subpopulacji erytroidalnych wątroby płodowej. Wstrzyknięto BrdU ciężarnym myszom, a po 30–60 minutach pobrano wątroby płodów, utrwalono je, poddano permeabilizacji i barwiono przeciwciałami przeciwko CD71, Ter19 i BrdU. Przedstawiono stan cyklu komórkowego komórek S3.

<ol><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li>
<li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li>
<li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li>
<li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a%28-%2F-%295b%28-%2F-%29+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li>
<li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li>
<li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid+dysplasia%2C+megaloblastic+anemia%2C+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li>
<li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li>
<li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells%3A+where+flow+meets+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li>
<li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li>
<li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez komisję IACUC University of Massachusetts Medical School.

Metodologia cytometrii przepływowej umożliwia jednoczesne badanie dowolnej funkcji komórkowej, którą można wykryć za pomocą specyficznego przeciwciała lub liganda sprzężonego z fluorescencją, w tym markerów powierzchni komórki, ekspresji białek, przeżywalności komórek, sygnalizacji komórkowej z użyciem przeciwciał fosfospecyficznych 3 oraz stanu cyklu komórkowego. Pomiary te mogą być wykonywane w każdej z kilku podgrup specyficznych dla etapu różnicowania w kontekście świeżo wyizolowanej tkanki erytropoetyczne...

<table><tbody><tr><td>Fas-biotyna</td><td>BD Biosciences</td><td>554256</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-APC</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S868</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitko do komórek 40 &amp;mu;m </td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe probówki z okrągłym dnem do barwienia FACS </td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery U </td><td>BD Biosciences</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>ChromePure Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>CD71-FITC (stężenie zapasowe 0.5mg/ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>553266</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-PE (stężenie zapasowe 0.2mg/ml) </td><td>BD Biosciences</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>7AAD </td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Proszek DAPI </td><td>Roche Group</td><td>236276</td><td></td></tr><tr><td>FITC szczurze przeciwmysie CD41 MWReg30</td><td>BD Biosciences</td><td>553848</td><td></td></tr><tr><td>FITC szczurze przeciwmysie CD45R/B220 RA3-6B2</td><td>BD Biosciences</td><td>553087</td><td></td></tr><tr><td>FITC szczurze przeciwmysie CD411b/Mac-1 M1/70</td><td>BD Biosciences</td><td>557396</td><td></td></tr><tr><td>FITC szczurze przeciwmysie Ly-6G i Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5</td><td>BD Biosciences</td><td>553126</td><td></td></tr><tr><td>FITC chomikowe przeciwmysie CD3e 145-2C11 </td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw APC BrdU Flow</td><td>BD Biosciences</td><td>557892</td><td></td></tr><tr><td>Aneksyna V-biotyna</td><td>BD Biosciences</td><td>556418</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej cd71/ter119

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Badania nad erytropoezą mają na celu zrozumienie procesu powstawania krwinek czerwonych z wcześniejszych progenitorów hematopoetycznych i erytroidalnych. W szczególności tempo powstawania krwinek czerwonych jest regulowane przez hormon erytropoetynę (Epo), której synteza jest wyzwalana przez hipoksję tkankową. Zagrożenie dla odpowiedniego utlenowania tkanek skutkuje gwałtownym wzrostem poziomu Epo, co napędza zwiększenie tempa erytropoezy – proces ten znany jest jako odpowiedź na stres erytropoetyczny. Wynikający z tego wzrost liczby krążących krwinek czerwonych poprawia dostarczanie tlenu do tkanek. Sprawna odpowiedź na stres erytropoetyczny jest zatem kluczowa dla przeżycia i regeneracji w warunkach fizjologicznych i patologicznych, takich jak przebywanie na dużych wysokościach, anemia, krwotok, chemioterapia czy transplantacja komórek macierzystych.
Mysz jest kluczowym modelem w badaniach nad erytropoezą i jej odpowiedzią na stres. Definitywna (typu dorosłego) erytropoeza u myszy zachodzi w wątrobie płodowej między 12,5 a 15,5 dniem embrionalnym, w śledzionie noworodka oraz w śledzionie i szpiku kostnym dorosłych osobników. Klasyczne metody identyfikacji progenitorów erytroidalnych w tkankach opierają się na zdolności tych komórek do tworzenia kolonii erytrocytów po wysianiu w półstałych mediach zawierających Epo. Ich potomstwo w postaci prekursorów erytroidalnych jest identyfikowane na podstawie kryteriów morfologicznych. Żadna z tych klasycznych metod nie umożliwia uzyskania dużej liczby komórek erytroidalnych specyficznych dla konkretnego stopnia różnicowania do badań molekularnych. Przedstawiamy tutaj metodę cytometryczną do identyfikacji i badania progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stopnia różnicowania, bezpośrednio w kontekście świeżo wyizolowanej tkanki mysiej. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych komórek CD71 i Ter119 oraz na parametrze „forward-scatter” w cytometrii przepływowej, który jest funkcją wielkości komórki. Analiza CD71/Ter119 może być wykorzystana do badania progenitorów erytroidalnych podczas ich odpowiedzi na stres erytropoetyczny in vivo, na przykład u myszy z anemią lub myszy utrzymywanych w warunkach niskiego poziomu tlenu. Może być również stosowana do badania progenitorów erytroidalnych bezpośrednio w tkankach genetycznie zmodyfikowanych dorosłych myszy lub embrionów, w celu oceny specyficznej roli zmodyfikowanej ścieżki molekularnej w erytropoezie.

Metoda cytometrii przepływowej do identyfikacji i analizy molekularnej mysich progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stadium różnicowania, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodowej myszy. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych CD71, Ter119 oraz wielkości komórek.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Badanie erytropoezy ma na celu zrozumienie, w jaki sposób krwinki czerwone powstają z wcześniejszych progenitorów hematopoetycznych i erytroidalnych. W szczególności tempo...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja prekursorów czerwonych krwinek bezpośrednio w świeżo pobranej tkance myszy. Pozwala to na badanie ich właściwości molekularnych w okresach, gdy układ erytropoetyczny u tych myszy ulega zmianom. Na przykład, podczas rozwoju embrionalnego lub w odpowiedzi na stres hipoksyczny, najpierw izoluje się tkankę krwiotwórczą z wątroby płodowej, śledziony lub szpiku kostnego myszy, a następnie dysocjuje ją do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.Następnie komórki znakuje się przeciwciałami przeciwko markerom powierzchni komórki CD 71 i TER 119 oraz innymi interesującymi markerami, na przykład w celu pomiaru przeżywalności komórek lub stanu cyklu komórkowego; tak przygotowaną zawiesinę znakowanych komórek analizuje się za pomocą analizatora cytometrii przepływowej, co pozwala na zidentyfikowanie specyficznych subpopulacji erytroblastów na różnych etapach dojrzewania. Te konkretne subpopulacje mogą zostać oczyszczone poprzez sortowanie komórek. Następnie dla każdej subpopulacji dojrzewających erytroblastów można przeprowadzić analizy komórkowe i molekularne.Zdolność do identyfikacji erytroblastów na konkretnych etapach dojrzewania bezpośrednio w świeżo wyizolowanych tkankach krwiotwórczych daje nam możliwość badania komórek w fizjologicznej korze. Metoda ta pozwala zatem na badanie odpowiedzi in vivo erytroblastów na różnych etapach dojrzewania. Gdy myszy są poddawane bodźcom, następuje przyspieszenie tempa erytropoezy.Na przykład warunki hipoksji naśladujące dużą wysokość lub wstrzyknięcie hormonu erytropoetyny. Wykorzystujemy wieloparametrową cytometrię przepływową, aby zidentyfikować erytroblasty w złożonym środowisku tkankowym i jednocześnie badać ich sygnalizację przeżycia oraz status cyklu komórkowego. Możemy również sortować erytroblasty na konkretnych etapach dojrzewania bezpośrednio z tkanki świeżej i badać poziomy ekspresji ich genów, stan chromatyny lub inne funkcje molekularne.Definitywna erytropoeza u myszy zachodzi w śledzionie i szpiku kostnym dorosłego osobnika. W związku z tym tkanki te zostaną pobrane od uśpionej myszy. Po eutanazji myszy należy pobrać krew poprzez punkcję serca do probówek z EDTA lub heparyną; krew ta zostanie wykorzystana później do oznaczenia hematokrytu, liczby retikulocytów lub pełnej morfologii krwi (CBC).Umieścić pobraną śledzionę i kość udową w oddzielnych probówkach zawierających zimny bufor barwiący (staining Buffer). W razie potrzeby przechowywać pobrane tkanki w lodzie. Zważyć śledzionę.U myszy wykazujących stres erytropoetyczny prawdopodobnie wystąpi znaczny wzrost masy śledziony. Następnie, z pobranych tkanek przygotowuje się komórki śledziony i komórki szpiku kostnego zgodnie z procedurami zaprezentowanymi wcześniej dla zarodka myszy. Erytropoeza definitywna zachodzi w wątrobie płodowej między 12,5 a 15,5 dniem embryonicznym.Ciążne myszy samice z określonym czasem poczęcia są przygotowywane do pozyskania komórek wątroby płodowej w dniach od 12,5 do 14,5 ciąży. Ciążne myszy samice są uśmiercane, a rogi macicy przenoszone do szalki Petriego z lodem. Stosuje się zimną pożywkę hodowlaną lub bufor barwiący.Do sekcji wątroby płodowej z dnia embrionalnego 12.5 lub wcześniejszego w celu wyjęcia embrionów z macicy wymagany jest stereomikroskop. Najpierw należy oddzielić każdy zarodek od rogu macicy. Następnie ostrożnie wycina się ścianę macicy, aby uwolnić embrion znajdujący się w pęcherzyku owodniowym.Ostrożnie odwarstw błonę owodniową. Wątroba płodu to największa czerwona tkanka brzuszna, znajdująca się poniżej znacznie mniejszego serca. Aby wypreparować wątrobę płodu, należy użyć pęsety, aby unieruchomić embrion po obu stronach wątroby, a następnie delikatnie wypchnąć wątrobę z jamy brzusznej do medium.Ostrożnie przeniesiono wątrobę do probówki zawierającej świeży bufor barwiący. Po wycięciu wszystkich wątrób płodowych i przeniesieniu ich do probówki ze świeżym buforem barwiącym, wątroby zdysocjowano mechanicznie poprzez pipetowanie, a następnie przefiltrowano zdysocjowane komórki przez nylonowe sito o oczkach 40 µm. Komórki przemyto dwukrotnie poprzez wirowanie, odrzucając nadsącz i resuspendując materiał w buforze barwiącym.Po drugim przemyciu barwi się komórki trypanem niebieskim i zlicza je za pomocą hemocytometru. Wątroba płodowa w stadium E 13.5 zawiera około 10⁷ komórek. Następnie resuspendsuje się komórki w stężeniu od 1 do 2 × 10⁶ komórek na 200 µl próbki w celu przeprowadzenia analizy cytometrycznej.Na potrzeby niniejszego protokołu wideo barwienie przeciwciałami do cytometrii przepływowej zostanie zaprezentowane wyłącznie na komórkach wątroby płodowej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować mieszaninę wstępną do barwienia przeciwciałami pierwszorzędowymi zawierającą następujące składniki: oczyszczone króliki IgG do blokowania receptorów FC w komórkach mysich, CD 71 FETR one 19 PE oraz przeciwciało skierowane przeciwko białku powierzchniowemu komórki fast. Należy delikatnie wymieszać roztwór przeciwciał, odwracając probówkę dwa do trzech razy, a następnie dodać 200 µL mieszaniny wstępnej do wcześniej przygotowanej próbki komórek wątroby płodowej i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby resuspenderować komórki.Następnie należy przygotować sześć kontrolnych próbek komórek. Próbkę niebarwioną, w której komórki pozostają w buforze do barwienia w celu określenia tła autofluorescencji komórek, oraz próbki jednobarwne dla każdego przeciwciała lub barwnika użytego w protokole w celu skorygowania nakładania się widm między kanałami, którymi w tym eksperymencie są TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotyna i streptawidyna A PC oraz kontrolę fluorescence minus one (FMO) dla fast biotin, która zapewnia rzeczywiste tło dla tego kanału, gdzie komórki są barwione wszystkimi kolorami lub przeciwciałami przewidzianymi w protokole z wyjątkiem fast biotin. Próbkę oraz odpowiednie kontrole należy inkubować w barwniku z przeciwciałami pierwszorzędowymi na lodzie przez 45 minut do jednej godziny w ciemności.Po zakończeniu inkubacji należy wyprać komórki, dodając trzy mililitry buforu barwiącego do każdej probówki z próbką, a następnie wirować przez trzy do pięciu minut z prędkością około 400 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie należy dodać strep avid in a PC i inkubować probówki w lodzie przez 30 do 45 minut. Po zakończeniu inkubacji komórki należy wyprać w ten sam sposób, co podczas barwienia pierwszym przeciwciałem.Na koniec resuspendować komórki w roztworze barwiącym zawierającym nieprzenikający do wnętrza komórek barwnik DNA seven a a d w celu wykluczenia martwych komórek. Próbki są teraz gotowe do analizy cytometrycznej. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest prawidłowa analiza bramkowania zdarzeń cytometrycznych, umożliwiająca wiarygodną identyfikację subpopulacji erytroblastów.Wymaga to starannego przygotowania urządzenia, wszystkich odpowiednich próbek kontrolnych, precyzyjnej kompensacji nakładania się widm oraz późniejszego bramkowania w celu wykluczenia martwych komórek, agregatów i zdarzeń o bardzo małych rozmiarach. Na początku analizy danych próbka niebarwiona oraz próbki kontrolne jednobarwne są wykorzystywane do ustawienia kompensacji nakładania się widm dla każdej kombinacji kolorów.W tym przykładzie pokażemy, w jaki sposób fluorescencja FITC przenika do kanału PE oraz jak to nakładanie się widm jest korygowane po kompensacji. Najpierw, korzystając z niebarwionej kontroli, definiujemy obszar FITC-dodatni i PE-ujemny. Następnie, używając kontroli jednobarwnej FITC, możemy zwizualizować przenikanie widmowe do kanału PE.Po przeprowadzeniu kompensacji cyfrowej w oprogramowaniu FlowJo, sygnał spillover fit E w kanale PE zostaje zminimalizowany. Po kompensacji można usunąć martwe komórki, agregaty oraz zdarzenia o małej wielkości. Agregaty i dublety komórkowe są usuwane poprzez wykreślenie wysokości rozproszenia światła w przód (FSC-H) względem powierzchni rozproszenia światła w przód (FSC-A) i wybranie zdarzeń znajdujących się wewnątrz wąskiej bramki diagonalnej.Martwe komórki są usuwane poprzez selekcję komórek wykazujących brak sygnału dla barwnika DAPI, który jest nieprzenikalny dla błony komórkowej i wiąże się z DNA. Brama dla żywych komórek DAPI-ujemnych wyklucza również bardzo małe zdarzenia, takie jak jądra komórkowe lub detrytus, które charakteryzują się bardzo niskim rozproszeniem światła w przód (forward scatter). Następnie przedstawimy strategię bramkowania dla komórek wątroby płodowej.Świeżo zebrane komórki znakowano przeciwciałem CD 71 TUR one 19 oraz koktajlem przeciwciał znakowanych ZI skierowanych przeciwko markerom linii nieerytroidalnej. W tym przykładzie próbki zostały już poddane kompensacji w celu usunięcia nakładania się widm, a następnie wyselekcjonowano bramkę, aby wykluczyć agregaty, martwe komórki oraz zdarzenia o bardzo małej wielkości. Wykorzystujemy próbkę FMO, która zawiera wszystkie barwniki z wyjątkiem barwienia fitzy dodatniego dla danej linii, aby wykreślić histogram fitzy i zdefiniować bramkę dla komórek ujemnych pod względem linii; następnie stosujemy tę bramkę do próbki komórek wątroby płodowej, która została zabarwiona markerami linii sprzężonymi z ZI.Komórki lineage-ujemne są selekcjonowane i naniesione na wykres z CD 71 na osi Y oraz TER 19 na osi X. Na osi X komórki są teraz gotowe do podziału na podgrupy od S0 do S5. Podgrupa S0 z ubytkiem Lin zawiera głównie komórki o potencjale CFUE przed wystąpieniem zależności od EPO.Podzbiór S1 zawiera komórki CFUE zależne od EPO, znajdujące się głównie w fazie S cyklu komórkowego. Komórki podzbioru S2 utraciły zdolność do tworzenia kolonii i zaczynają wykazywać ekspresję hemoglobiny. Komórki podzbioru S3 to w większości erytroblasty bazofilne, natomiast podzbiory S4 i S5 zawierają erytroblasty późne. Przedstawiono tutaj strategię analizy po pozyskaniu danych z komórek śledziony, które zostały przetworzone i znakowane przeciwciałami skierowanymi przeciwko CD 71 i TER 119, a także histogram receptora śmierci Fas.Na jednym z nich pokazano wszystkie zarejestrowane zdarzenia, gdzie bramka diagonalna reprezentuje zdarzenia będące prawdopodobnie pojedynczymi komórkami, z wyłączeniem dubletów lub większych agregatów. Komórki znajdujące się w tej bramce są następnie analizowane na drugim histogramie. Bardzo małe zdarzenia, będące prawdopodobnie jądrami komórkowymi lub debrisem, zostają wykluczone.Wyselekcjonowane komórki przedstawiono na histogramie trzecim, gdzie wykluczono z dalszej analizy komórki DAPI-dodatnie, które prawdopodobnie są przepuszczalne przez błonę komórki apoptotycznej. Histogram czwarty przedstawia wynikową populację żywotnych komórek śledziony. Brama pro eGate zawiera komórki CD 71 high TER one 19 Intermediate; komórki tur R one 19 high są dalej analizowane na histogramie piątym.Tutaj komórki o wysokiej ekspresji CD 71 są podzielone na mniej dojrzałe, duże komórki z obszaru A (erytroblasty) oraz mniejsze, bardziej dojrzałe erytroblasty z obszarów B. Najbardziej dojrzałym podzbiorem erytroblastów jest ARI C. Ekspresję białek powierzchniowych komórek dla każdego z tych podzbiorów można zmierzyć jednocześnie, dodając odpowiednie przeciwciała w tym samym czasie co TER R 19 i CD 71. Histogram barwienia 6 przedstawia ekspresję powierzchniową receptora śmierci Fas, konkretnie w podzbiorze A u myszy w stanie podstawowym oraz u myszy po wstrzyknięciu pojedynczej dawki Epo.Wyniki wskazują, że EPO hamuje szybką ekspresję w tym obszarze. Dla komórek w każdym podzbiorze można również zmierzyć populacyjną ekspresję białek wewnątrzkomórkowych in vivo lub status cyklu komórkowego. W tej reprezentatywnej analizie cyklu komórkowego myszom wykonano wtrysk BRDU dootrzewnowo, a szpik kostny pobrano od 30 do 60 minut później.Oprócz barwienia na CD 71 i TER one 19, komórki poddano barwieniu na wbudowanie BRDU do replikującego się D-N-A-B-R-D-U; komórki dodatnie pod kątem BRDU znajdują się w fazie S cyklu. Komórki w interfazie są ujemne pod kątem BRDU i mogą zostać rozdzielone na fazy G one lub G two M. Przy użyciu DNAD seven A A D komórki mogą być sortowane z każdej z podgrup PRO E area A A B oraz A EC.Tutaj są one przedstawione w preparatach cytologicznych wykazujących sekwencyjne dojrzewanie, objawiające się zmniejszeniem rozmiaru komórek, kondensacją jądra oraz nasileniem brązowego zabarwienia odzwierciedlającego ekspresję hemoglobiny. Na koniec przedstawiono reprezentacyjną analizę cyklu komórkowego podzbioru S3 w wątrobie płodowej myszy w dniu E 13.5. Ciężarnym myszom wstrzyknięto BRDU.Wątroby płodowe pobrano, a po 30 do 60 minutach utrwalono, przepuszczalno i barwiono przeciwciałami przeciwko CD 71, TER one 19 oraz BRDU. Analizie poddano status cyklu komórkowego komórek S3, w której komórki w fazie S są dodatnie pod kątem BRDU, a zawartość DNA określono poprzez barwienie barwnikiem DNA seven A a d.Opisane przez nas podejście cytometryczne pozwala na jednoczesne badanie funkcji komórkowych, takich jak ekspresja markerów powierzchniowych i innych białek, przeżywalność komórek, sygnalizacja komórkowa z wykorzystaniem przeciwciał fosfospecyficznych oraz status cyklu komórkowego. Pozwala nam to zatem badać odpowiedzi molekularne erytroblastów, będących odmiennym stadium dojrzewania, na szeroki zakres bodźców lub efekt mutacji genetycznych. Należy zauważyć, że podgrupy dojrzewania w cytometrii przepływowej są definiowane w oparciu o ekspresję markerów powierzchniowych oraz rozpraszanie przednie.Stwierdziliśmy, że ogólnie komórki w każdym podzbiorze odpowiadają podobnemu stadium morfologicznemu erytroblastów w szerokiej gamie modeli mysich. Zalecamy jednak zweryfikowanie tego podczas badania nowego modelu mysiego. Poprzez sortowanie komórek z każdego podzbioru i analizę ich morfologii. Komórki z każdego podzbioru można również sortować do analizy RNA lub transkryptomu; w eksperymentach sortowania należy stosować niskie ciśnienia sortowania oraz szerokie dysze, aby zminimalizować naprężenia ścinające działające na komórki.Zalecamy również sprawdzanie czystości i żywotności komórek po każdym eksperymencie sortowania. Wreszcie, podczas wykrywania zmiany w częstotliwości występowania danej subpopulacji, ważne jest określenie, czy wynika ona z rzeczywistej zmiany liczby komórek w tej subpopulacji, czy z przesunięć w innych subpopulacjach. Dlatego, oprócz pomiaru częstotliwości subpopulacji, zawsze konieczne jest również zmierzenie bezwzględnej liczby komórek w każdej z nich.

identification-analysis-mouse-erythroid-progenitors-using-cd71ter119

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja i analiza prążkoródek erytrocytarnych myszy z wykorzystaniem przepływowej cytometrii CD71/TER119

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę identyfikacji populacji enukleujących się ortochromatycznych erytroblastów za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, zapewniając wizualizację procesu enukleacji erytroblastów.

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Prezentujemy system hodowli erytroblastów wątroby in in vitro u myszy płodowej, który analizuje wczesne i późne stadia końcowej erytropoezy. System ten ułatwia analizę funkcjonalną określonych genów na różnych etapach rozwoju.

System hodowli wątroby płodu myszy do analizy funkcji genów docelowych we wczesnych i późnych stadiach erytropoezy terminalnej

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Tutaj prezentujemy nasz protokół wytwarzania indukowanych erytroidalnych progenitorów (iEPs) z dorosłych fibroblastów myszy za pomocą bezpośredniego przeprogramowania linii (DLR) sterowanego czynnikiem transkrypcyjnym.

Bezpośrednie przeprogramowanie linii dorosłych fibroblastów myszy na erytroidalnych progenitorów

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Modelowanie erytropoezy daje cenną szansę na zrozumienie biologicznego znaczenia aktorów w tym procesie i ocenę nowych podejść terapeutycznych, które mogą złagodzić wady różnicowania. W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę skutecznego różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ ex vivo.

Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do identyfikacji mysich progenitorów erytroidalnych za pomocą markerów CD71 i TER119. Technika ta umożliwia analizę etapów dojrzewania erytroblastów w tkankach hematopoetycznych.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Przeglądaj więcej filmów