Identyfikacja i analiza mysich progenitorów erytroidalnych za pomocą testu cytometrycznego przepływowego CD71 / TER119

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja prekursorów krwinek czerwonych bezpośrednio w świeżo pobranej tkance myszy. To pozwala nam badać ich właściwości molekularne w okresach, gdy układ erytropoetyczny u tych myszy ulega zmianom. Na przykład podczas rozwoju embrionalnego lub podczas odpowiedzi na stres hipoksyjny pierwsza tkanka krwiotwórcza jest izolowana z wątroby płodu myszy lub dorosłej śledziony lub szpiku kostnego i dysocjowana do zawiesiny pojedynczej komórki.

Następnie komórki są znakowane przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórki CD 71 i TER one 19, a następnie wszelkimi innymi markerami będącymi przedmiotem zainteresowania, na przykład w celu pomiaru przeżycia komórki lub stanu cyklu komórkowego, znakowana zawiesina komórek jest następnie analizowana za pomocą analizatora cytometrii przepływowej i identyfikowane są specyficzne podzbiory erytroblastów na różnych etapach dojrzewania. Te specyficzne podzbiory mogą być oczyszczane przez sortowanie komórek. Następnie można przeprowadzić analizę komórkową i molekularną dla każdej podgrupy dojrzewania erytroblastów.

Możliwość identyfikacji erytroblastów w określonych fazach dojrzewania bezpośrednio w świeżo wyizolowanych tkankach krwiotwórczych daje nam możliwość badania komórek w korze fizjologicznej. Metoda ta pozwala nam zatem badać wysokie erytroblasty o różnych etapach dojrzewania, reagujące in vivo. Kiedy myszy są poddawane bodźcom, przyspieszają klatkę erytropoetyczną

Na przykład stany niedotlenienia, które naśladują dużą wysokość lub wstrzyknięcie hormonu erytropoetyny. Wykorzystujemy wieloparametrową cytometrię przepływową do identyfikacji pęcherzyków w złożonym środowisku tkankowym i jednoczesnego badania ich przeżycia sygnalizacyjnego i stanu cyklu komórkowego. Możemy również sortować erytroblasty ich specyficzne etapy dojrzewania bezpośrednio ze świeżej tkanki i badać ich poziomy ekspresji genów, status chromatyny lub inne funkcje molekularne.

Ostateczna erytropoeza myszy ma miejsce w śledzionie i szpiku kostnym dorosłej myszy. Dlatego tkanki te zostaną pobrane od myszy poddanej eutanazji. Po eutanazji myszy pobrano krew przez nakłucie serca do probówek do pobierania krwi EDTA lub heparyny, krew ta zostanie później wykorzystana do zliczania hematokrytu, liczby retikulocytów lub analizy CBC.

Pobraną śledzionę i kość udową należy umieścić w oddzielnych probówkach zawierających zimne barwienie. Bufor. W razie potrzeby przechowuj zebrane tkanki na lodzie. Zważ śledzionę.

Myszy poddawane reakcji na stres erytropoetyczny prawdopodobnie wykazują znaczny wzrost masy śledziony. Następnie komórki śledziony i komórki szpiku kostnego są przygotowywane z pobranych tkanek za pomocą procedur zademonstrowanych wcześniej na zarodku myszy. Ostateczna erytropoeza ma miejsce w wątrobie płodu między 12,5 a 15,5 dniem embrionalnym.

Samice myszy w ciąży w czasie są przygotowane do uzyskania komórek wątroby płodu w dniach od 12,5 do 14,5 ciąży. Samice myszy w ciąży są poddawane eutanazji, a rogi macicy są usuwane na szalkę Petriego zawierającą lód. Zimna pożywka hodowlana lub bufor barwiący.

Mikroskop preparacyjny jest wymagany do wypreparowania wątroby płodu od 12,5 dnia embrionalnego lub młodszego w celu usunięcia zarodków z macicy. Najpierw oddziel każdy koralik od rogu. Następnie delikatnie wytnij ścianę macicy, aby uwolnić zarodek, który znajduje się w jej worku owodniowym.

Delikatnie oderwij błonę owodniową. Wątroba płodu jest największą czerwoną tkanką brzuszną znajdującą się pod znacznie mniejszym sercem. Aby wypreparować wątrobę płodu, użyj kleszczy, aby unieruchomić zarodek po obu stronach wątroby i delikatnie wypchnij wątrobę z brzucha do pożywki.

Delikatnie przenieś wątrobę do probówki zawierającej świeży bufor barwiący. W końcu wątroby płodu zostały wypreparowane i przeniesione do probówki zawierającej świeże barwienie. Bufor dysocjuje wątroby mechanicznie przez pipetowanie, a następnie przefiltrować zdysocjowane komórki przez 40-mikronową siatkę nylonową do płukania komórek dwukrotnie przez wirowanie, odrzucając supernatant i zawiesinę resus w buforze barwiącym.

Po drugim praniu wybarwić komórki błękitem trianowym i policzyć za pomocą hemocytometru. Wątroba płodu w E 13,5 ma około 10 do siódmej. Komórki ponownie zawieszają komórki w ilości od jednej do dwóch komórek od 10 do szóstej na próbkę o objętości 200 mikrolitrów do analizy cytometrycznej przepływowej.

Na potrzeby niniejszego protokołu wideo barwienie przeciwciałami do cytometrii przepływowej zostanie zademonstrowane tylko na komórkach wątroby płodu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować pierwszorzędowy premiks do barwienia przeciwciał zawierający następujące, oczyszczone królicze IgG do blokowania receptorów FC w komórkach myszy CD 71 FETR one 19 PE i przeciwciało skierowane szybko na białko powierzchniowe komórki. Delikatnie wymieszaj roztwór przeciwciała, odwracając probówkę dwa do trzech razy, dodaj 200 mikrolitrów pierwotnego barwnika przeciwciałami, wstępnie zmieszanego z wcześniej przygotowaną próbką komórek wątroby płodu i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić komórki.

Następnie przygotuj te sześć próbek z komórek kontrolnych. Niebarwiona próbka, w której komórki pozostawia się w buforze barwiącym w celu zapewnienia autofluorescencji tła komórek, pojedynczego koloru dla każdego przeciwciała lub koloru użytego w protokole w celu skorygowania nakładania się widma między kanałami, które w tym doświadczeniu to TUR jeden 19 PE CD 71 fz fast, biotyna i streptawidyna A PC i siedem fluorescencji A A DA minus jedna kontrola dla szybkiej biotyny, który zapewnia prawdziwe tło dla tego kanału, w którym komórki są barwione wszystkimi kolorami lub przeciwciałami w protokole, z wyjątkiem szybkiej biotyny. Inkubować próbkę i odpowiednie kontrole w pierwszorzędowym barwieniu przeciwciał na lodzie przez 45 minut do jednej godziny w ciemności.

Pod koniec inkubacji umyć komórki, dodając trzy mililitry buforu barwiącego do każdej probówki z próbką i wirować przez trzy do pięciu minut przy około 400-krotności grawitacji w czterech stopniach Celsjusza. Następnie nałóż paciorkowiec w komputerze i inkubuj probówki na lodzie przez 30 do 45 minut. Po zakończeniu inkubacji umyj komórki jak w przypadku pierwszego barwienia przeciwciałami.

Na koniec ponownie zawieś komórki w roztworze barwiącym zawierającym nieprzepuszczalną komórkę, barwnik DNA siedem a d, aby wykluczyć martwe komórki. Próbki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest prawidłowa analiza bramkowania zdarzeń cytometrii przepływowej, pozwalająca na wiarygodną identyfikację podzbiorów erytroblastów.

Wymaga to starannego ustawienia maszynowego wszystkich prawidłowych próbek kontrolnych, starannej kompensacji nakładania się widma i późniejszego bramkowania, które wyklucza martwe komórki, agregaty i bardzo małe zdarzenia. Na początku analizy danych. Niebarwiona próbka i pojedyncze próbki kontrolne koloru są używane do ustawienia kompensacji nakładania się widma dla każdej kombinacji kolorów.

W tym przykładzie pokażemy, w jaki sposób fluorescencja fit e rozlewa się do kanału PE i jak to nakładanie się widma jest korygowane po kompensacji. Najpierw, używając niebarwionej kontroli, definiujemy region dodatni i ujemny pasowania E. Następnie, korzystając z kontroli pojedynczego koloru fit E, możemy zwizualizować rozlanie się widma do kanału PE.

Po cyfrowej kompensacji za pomocą oprogramowania FlowJo zminimalizowany jest sygnał rozlewowy E w kanale PE. Po skompensowaniu martwych komórek można usunąć agregaty i małe zdarzenia. Agregacje i dublety komórek są usuwane przez wykreślenie wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu i wybranie zdarzeń w wąskiej bramie ukośnej.

Martwe komórki są usuwane przez wybór komórek, które są ujemne dla nieprzepuszczalnej dla komórek dapi A nieprzepuszczalnej dla DNA umiera. Ujemna bramka komórek żywotnych DAPI wyklucza również bardzo małe zdarzenia, takie jak jądra lub szczątki, które mają bardzo niskie rozproszenie do przodu. Następnie pokażemy strategię bramkowania dla komórek wątroby płodu.

Świeżo pobrane komórki oznaczono pod kątem CD 71 TUR one 19 i koktajlu przeciwciał znakowanych ZI skierowanych na nieerytroidalne markery liniowe. W tym przykładzie próbki zostały już skompensowane pod kątem nakładania się widma, a następnie bramkowane w celu wykluczenia agregacji, martwych komórek i bardzo małych zdarzeń. Używamy próbki FMO, która zawiera wszystkie kolory z wyjątkiem dodatniej plamy fitzy linii, aby wykreślić histogram fitzy i zdefiniować ujemną bramę komórkową linii, a następnie stosujemy tę bramkę do próbki komórek wątroby płodu, która została wybarwiona sprzężonymi markerami linii ZI.

Komórki ujemne linii są wybierane i wykreślane z CD 71 na osi Y i TER 19. Na osi A komórki są teraz gotowe do podzielenia na podzbiory od zera do S pięć. Podzbiór zerowy S zubożony w Lin w dużej mierze zawiera komórki z potencjałem CFUE przed wystąpieniem uzależnienia od EPO.

Podzbiór S one zawiera komórki CFUE zależne od EPO, głównie w fazie S cyklu komórkowego. S dwie podgrupy komórki utraciły potencjał tworzenia kolonii i zaczynają wyrażać hemoglobinę Komórki podzbioru S3 są w dużej mierze zasadochłonne, erytroblasty S cztery i S podzbiory pięć zawierają późne erytroblasty. Poniżej przedstawiono strategię analizy po pozyskaniu danych z komórek śledziony przetworzonych i znakowanych przeciwciałami skierowanymi na CD 71 i TER one 19, a także szybki histogram receptora śmierci.

Jeden pokazuje wszystkie nabyte zdarzenia, w których bramka ukośna reprezentuje zdarzenia, które prawdopodobnie są pojedynczymi komórkami, z wyłączeniem dubletów lub większych agregatów. Komórki w tej bramce są dalej analizowane na histogramie drugim tutaj. Bardzo małe zdarzenia, prawdopodobne jądra lub szczątki są wykluczone.

Bramkowane komórki są pokazane na histogramie trzecim, gdzie komórki DAPI dodatnie, które prawdopodobnie są przepuszczalnymi przez błonę komórkami apoptozą, są wyłączone z dalszej analizy. Histogram czwarty pokazuje uzyskaną populację żywotnych komórek śledziony. Pro eGate zawiera CD 71 o wysokim TER, 19 komórek pośrednich tur R jeden 19 wysokich komórek jest dalej analizowany na histogramie piątym.

Tutaj wysokie komórki CD 71 są podzielone na mniej dojrzałe erytroblasty o dużym obszarze i mniejsze, bardziej dojrzałe erytroblasty AB. Najbardziej dojrzałym podzbiorem erytroblastów jest ARI C. Ekspresję białek powierzchniowych komórek można mierzyć jednocześnie dla każdej z tych podgrup, dodając odpowiednie przeciwciała w tym samym czasie co TER, R one 19 i CD 71. Histogram barwienia szósty pokazuje szybką ekspresję receptora śmierci na powierzchni komórki, szczególnie w obszarze, podzbiór A u myszy w stanie podstawowym i myszach, którym wstrzyknięto pojedynczą dawkę E ppo.

Wyniki wskazują, że EPO hamuje szybką ekspresję w tym obszarze. Populacyjną ekspresję białek wewnątrzkomórkowych lub stan cyklu komórkowego można również zmierzyć dla komórek w każdym podzbiorze. W tej reprezentatywnej analizie cyklu komórkowego myszom wstrzyknięto BRDU do otrzewnowej, a szpik kostny pobrano 30 do 60 minut później.

Oprócz barwienia na CD 71 i TER one 19, komórki były barwione w celu włączenia BRDU do ich replikujących się komórek D-N-A-B-R-D-U, dodatnich komórek znajdujących się w fazie S cyklu. Komórki interfejsu są BRDU ujemne i mogą być rozdzielone na G jedną lub G dwie fazy M. Za pomocą DNAD można posortować siedem komórek A, A, D z każdego z podzbiorów PRO E, obszaru A, A, B i A, EC.

Tutaj są one pokazane w preparatach cytozyny wykazujących sekwencyjne dojrzewanie ze zmniejszającą się wielkością komórek, kondensacją jądrową i rosnącym brązowym zabarwieniem, odzwierciedlającym ekspresję hemoglobiny. Na koniec przedstawiono reprezentatywną analizę cyklu komórkowego podzbioru S3 w wątrobie płodu E 13,5. Ciężarnym myszom wstrzyknięto BRDU.

Wątroby płodów pobrano od 30 do 60 minut później po utrwalonej trwałej ondulacji i wybarwiono przeciwciałami przeciwko CD 71, TER one 19 i BRDU. Stan cyklu komórkowego komórek S3 jest analizowany w miejscu, w którym znajdują się komórki fazy S. Zawartość BRDU dodatniego i DNA określa się ilościowo przez barwienie dla barwnika DNA siedem A a d.

Opisywane przez nas podejście cytometryczne pozwala na jednoczesne badanie funkcji komórkowych, takich jak ekspresja markerów powierzchniowych komórek i innych białek, przeżycie komórki, sygnalizacja komórkowa przy użyciu przeciwciał specyficznych dla fosso i status cyklu komórkowego. Pozwala to zatem na zbadanie odpowiedzi molekularnych erytroblastów, innego etapu dojrzewania na szeroki zakres bodźców czy wpływu mutacji genetycznych. Należy zauważyć, że podzbiory dojrzewania cytometrii przepływowej są zdefiniowane pod względem ekspresji markera powierzchni komórki i rozproszenia do przodu.

Odkryliśmy, że ogólnie rzecz biorąc, komórki w każdym podzbiorze odpowiadają podobnemu stadium morfologicznemu erytroblastu w wielu różnych modelach mysich. Zalecamy jednak sprawdzenie tego podczas badania nowego modelu myszy. Sortując komórki z każdego podzbioru i badając ich morfologię, komórki z każdego podzbioru można również sortować do analizy RNA lub transkryptomu, eksperymenty sortowania wykorzystują niskie ciśnienie sortowania i szerokie nosy, aby zminimalizować sam stres na komórkach.

Zalecamy również sprawdzenie czystości i żywotności komórek po każdym eksperymencie sortowania. Wreszcie, podczas wykrywania zmiany częstości danego podzbioru, ważne jest, aby określić, czy jest to spowodowane rzeczywistą zmianą liczby komórek w tym podzbiorze, czy też jest to spowodowane zmianami w innych podzbiorach. W związku z tym, oprócz pomiaru częstości podzbiorów, zawsze konieczne jest również zmierzenie bezwzględnej liczby komórek w każdym podzbiorze.