Name: Transdukcja komórek ludzkich za pomocą ekotropowego lentiwirusa skompleksowanego z polimerami w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Poznaj metodę transdukcji komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem z kompleksacją polimerową w celu bezpiecznego wprowadzania onkogenów. Technika zwiększa efektywność transdukcji i minimalizuje ryzyko biologiczne w badaniach nad rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez California Institute for Regenerative Medicine.

1. Produkcja, zbiór i mrożenie lentiwirusa
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem protokołu skonsultuj się z instytucjonalnym specjalistą ds. bezpieczeństwa i stosuj zalecane przez niego wytyczne dotyczące bezpieczeństwa.</li>
	<li>Dzień 1. Do produkcji wirusa należy użyć zdrowych, szybko rosnących komórek 293T. Wysiać komórki w zagęszczeniu 5 x 106 
	komórek na płytkę 10 cm. Do produkcji wirusa stosować medium dla 293T bez antybiotyków (DMEM z wysoką zawartością glukozy z 10% FBS i 4 mM L-glutaminą).</li>
	<li>Dzień 2. Późnym popołudniem przeprowadzić transfekcję komórek 293T w następujący sposób (podane wartości dotyczą jednej płytki 10 cm). 
	Wszystkie odczynniki należy ogrzać do temperatury pokojowej. Do probówki do mikrocentryfugi pipetować 375 μl OptiMEM, a następnie dodać 25 μl 
	Fugene HD. Należy dopilnować, aby nierozcieńczony Fugene nie miał kontaktu z powierzchnią ścianek probówki.</li>
	<li>W probówce do mikrocentryfugi wymieszać:
		<ul>
			<li>5 μg plazmidu transferowego (Slc7a1, wektor docelowy lub fluorescencyjny wektor kontrolny)</li>
			<li>3,75 μg plazmidu opakowującego (pCMV-dR8.91 lub psPax2)</li>
			<li>1,25 μg plazmidu otoczki (pMD2.G dla pantropowych, pHCMV-EcoEnv dla ekotropowych)</li>
			<li>bezserwatkowe OptiMEM do objętości 100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>Połączyć zawartość obu probówek i inkubować mieszaninę przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wymienić medium w komórkach 293T na 10 ml świeżego medium dla 293T bez antybiotyków. Dodać kroplami do płytki mieszaninę Fugene/plazmid i inkubować przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2.</li>
	<li>Dzień 3. Wymienić medium w komórkach 293T na 10 ml świeżego medium dla 293T bez antybiotyków. Należy robić to ostrożnie, 
	ponieważ komórki 293T przylegają słabo i mogą zostać oderwane przy zbyt silnym pipetowaniu medium na 
	monowarstwę. Inkubować przez dwa dni w inkubatorze z nawilżaniem w celu produkcji wirusa.</li>
	<li>Dzień 5. Zebrać wirusa i przefiltrować za pomocą filtra 0,45 mm o niskim wiązaniu białek. Użyć natychmiast lub rozdzielić 
	na jednorazowe alikwoty i zamrozić w temperaturze -80°C. Miano zamrożonego wirusa pantropowego i ekotropowego należy ponownie wyznaczyć odpowiednio po sześciu miesiącach i jednym miesiącu przechowywania.</li>
	<li>Miano wirusa wyznaczyć w następujący sposób, używając komórek stosunkowo podatnych na transdukcję. Przeprowadzić transdukcję komórek fluorescencyjnym wirusem kontrolnym przez noc, stosując rozcieńczenia szeregowe (np. 1:10, 1:100, 1:1000) w świeżym medium z 6 μg/ml PB. Następnego dnia wymienić na świeże medium. Po transdukcji odczekać dwa dni, aż komórki zaczną eksprimować białko fluorescencyjne, a następnie określić frakcję komórek transdukowanych za pomocą FACS. Obliczyć miano w jednostkach transformujących (TU) na ml, opierając się na rozcieńczeniach, które dają &lt; 15% transdukcji, aby zminimalizować liczbę zdarzeń wielokrotnej transdukcji. 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="Wzór na obliczenie miana, równanie do ilościowego oznaczenia wirusa, analiza matematyczna w wirusologii." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">
	</li>
</ol>
2. Transdukcja ludzkich komórek docelowych mysim receptorem retrowirusowym Slc7a1
<ol>
	<li>Wybierz wielokrotność infekcji (MOI) = 2, aby zapewnić transdukcję większości komórek. W przypadku komórek docelowych opornych na transdukcję, takich jak HDF, wymagane będzie wyższe MOI; w takim przypadku rozcieńczamy nadsącz wirusowy jedynie 1:2, aby osiągnąć transdukcję większości komórek.</li>
	<li>Przeprowadź transdukcję komórek docelowych przez noc, używając nadsączu wirusowego rozcieńczonego w świeżej pożywce hodowlanej z dodatkiem 6 μg/ml PB, co zwiększa wydajność transdukcji poprzez wzmocnienie oddziaływań elektrostatycznych między wirusem a komórką docelową.1 Idealnie należy użyć minimalnej objętości wirusa, np. 1 ml dla płytki 35 mm, ponieważ dyfuzja jest czynnikiem ograniczającym wydajność transdukcji.</li>
	<li>Hoduj komórki przez co najmniej 48 godzin po usunięciu wirusa przed ich transdukcją wirusem ekotropowym, aby zapewnić wystarczającą ekspresję receptora Slc7a1.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Jeśli jest to pożądane, można zastosować blastycydynę do selekcji stabilnie transdukowanych komórek wykazujących ekspresję Slc7a1. Należy wcześniej wyznaczyć krzywą przeżywalności dla blastycydyny, aby określić najniższe skuteczne stężenie, zazwyczaj między 2 – 10 μg/ml, które w ciągu 7 dni zabije wszystkie nietransdukowane komórki docelowe. Około 2 dni po usunięciu wirusa Slc7a1 przenieś transdukowane komórki do pożywki zawierającej blastycydynę. Hoduj komórki w pożywce z blastycydyną przez 7 dni; po tym czasie wszystkie pozostałe komórki będą stabilnie eksponować receptor retrowirusowy, co umożliwi ich transdukcję wirusem ekotropowym oraz zamrożenie banku komórek jako stabilnej linii wykazującej ekspresję Slc7a1 do przyszłego wykorzystania.</li>
</ol>
3. Miareczkowanie kompleksu polimerowego w celu określenia toksyczności
<ol>
	<li>Dzień 1. Wysiać komórki w zagęszczeniu 5000 komórek/dołek na płytce 96-dołkowej, zapewniając co najmniej trzy powtórzenia dla każdej grupy eksperymentalnej. Uwzględnić komórki nietransdukowane w medium kompletnym w celu uzyskania wartości bazowej dla zdrowych komórek, a także próbki składające się z komórek w medium bezsurowiczym w celu wywołania zatrzymania wzrostu jako kontrolę. Równolegle wysiać komórki w odpowiednim formacie (np. płytka 24-dołkowa) do analizy wydajności transdukcji metodą mikroskopową lub FACS dla każdego warunku eksperymentalnego.</li>
	<li>Dzień 2. Przetransdukować komórki na płytkach przygotowanych zarówno do analiz MTT, jak i FACS wirusem kodującym GFP, przy MOI wynoszącym 0,5, aby przetransdukować ~40% komórek docelowych. Przetestować różne stężenia CS/PB (np. 50, 100, 200, 400, 600 i 800 mg/ml każdego składnika), a także 6 μg/ml PB, aby określić optymalne ilości. Przygotować kompleksy polimerowe zgodnie z opisem w Części 4 poniżej.</li>
	<li>Dzień 3. Usunąć medium zawierające wirusa i zastąpić je świeżym medium. Przenieść płytki do inkubatora z nawilżaniem.</li>
	<li>Dzień 5. Przeanalizować płytkę FACS w celu określenia wydajności transdukcji dla każdego stężenia polimeru. </li>
	<li>Dzień 6. Usunąć medium ze wszystkich dołków płytki MTT i zastąpić je 100 μl roztworu MTT (1 mg/ml MTT w medium kompletnym). Inkubować przez trzy godziny w inkubatorze z nawilżaniem, aby umożliwić redukcję MTT w mitochondriach metabolicznie aktywnych komórek.</li>
	<li>Usunąć roztwór MTT i zastąpić go 200 ml rozpuszczalnika MTT (0,1 N HCl, 0,1% Igepal CA-630 w izopropanolu). </li>
	<li>Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub do momentu rozpuszczenia całego fioletowego osadu formazanu MTT. Odczytać absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek przy 570 nm, odejmując odczyt tła przy 690 nm. </li>
	<li>Wybrać optymalne stężenie polimeru, które zapewnia maksymalne zwiększenie wydajności transdukcji (określone metodą FACS) przy minimalnym wpływie na aktywność metaboliczną (określoną metodą MTT). Dla HDF wybrano 100 μg/ml CS/PB na podstawie danych przedstawionych w Reprezentatywnych Wynikach poniżej.</li>
</ol>
4. Transdukcja ekotropowa z kompleksowaniem polimerowym
<ol>
	<li>Przygotować sterylne, filtrowane roztwory stokowe PB oraz chondroitynosiarczanu o stężeniu 20 mg/ml w wodzie. Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
	<li>Przenieść nadnadkład wirusowy do probówki do mikrocentryfugi i rozcieńczyć do pożądanego stężenia końcowego (np. MOI wynoszące 2) świeżą pożywką hodowlaną. Następnie dodać po równych objętościach PB oraz chondroitynosiarczanu (stężenia określone w kroku 3 powyżej), delikatnie potrząsając probówką po każdym dodaniu w celu wymieszania. Mieszanina wirusowa natychmiast stanie się mętna w wyniku tworzenia się osadów. Inkubować mieszaninę wirusową w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić tworzenie się kompleksów.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z komórek docelowych wykazujących ekspresję receptora, zastąpić ją mieszaniną wirusową i inkubować przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2. Po usunięciu mieszaniny wirusowej dwukrotnie przemyć powierzchnię komórek roztworem PBS, aby wspomóc usuwanie kompleksów wirusowych. Całkowite usunięcie nie jest konieczne; nie zaobserwowano negatywnego wpływu pozostałych kompleksów polimerowych na kondycję komórek.</li>
</ol>
5. Weryfikacja specyficzności transdukcji ekotropowej
<ol>
	<li>Przy pierwszej produkcji wirusa ekotropowego, z perspektywy bezpieczeństwa zaleca się zweryfikowanie, czy wirus nie jest w stanie transdukować niezmodyfikowanych komórek ludzkich. Transdukować komórki ludzkie ekotropowym lentiwirusem w stosunkowo wysokim stężeniu (rozcieńczenie nadsączu wirusowego w świeżej pożywce jedynie 1- do 2-krotnie) przez noc, stosując 6 μg/ml PB lub zoptymalizowane stężenie CS/PB.</li>
	<li>Usunąć pożywkę zawierającą wirusa i zastąpić ją świeżą pożywką. Po inkubacji komórek przez 2 dni zweryfikować ekspresję transgenu za pomocą FACS, wykorzystując wektory fluorescencyjne i/lub za pomocą RT-PCR z użyciem starterów specyficznych dla transgenu.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Ryc. 1A przedstawia proces produkcji lentiwirusa, a Ryc. 1B pokazuje transdukcję ludzkich komórek ekotropowym lentiwirusem, w tym wstępną transdukcję mysim receptorem retrowirusowym Slc7a1. Do miareczkowania wirusa używamy ludzkiej linii komórkowej rabdomiosarkomy stabilnie transdukowanej Slc7a1 (Slc-hRMS). Przy użyciu fluorescencyjnych wektorów kontrolnych do monitorowania wydajności transdukcji rutynowo osiągamy wydajność transdukcji Slc-hRMS wirusem ekotropowym &gt; 90%, co pokazano na Ryc. 2A i 2B. Stopnie transdukcji HDF są zazwyczaj niższe, ponieważ komórki nie zostały poddane selekcji blastycydyną w celu ekspresji receptora (Ryc. 2C). Miana lentiwirusa ekotropowego stanowią zazwyczaj 10-20% miana wirusa pseudotypowanego VSV, kiedy są mierzone na Slc-hRMS (Ryc. 2D).
Jeden cykl zamrażania i rozmrażania redukuje miano wirusa ekotropowego o 16 - 3%, co odpowiada utracie miana podczas pojedynczego cyklu zamrażania i rozmrażania wirusa pseudotypowanego VSV (p &gt; 0.05). W przeciwieństwie do wcześniejszych doniesień,2 nie zaobserwowano pozytywnego wpływu błyskawicznego zamrażania w suchym lodzie na miano wirusa. Zamiast tego uzyskano wyższe miana obu pseudotypów po rozmrożeniu poprzez zwykłe umieszczenie probówek z wirusem w zamrażarce -80°C (dane nie zostały przedstawione). 
Test żywotności MTT pozwala na czułe wykrywanie zahamowania wzrostu w komórkach docelowych. Transdukcja wirusem wraz z stężeniami CS/PB do 800 μg/ml nie wpływa na metabolizm HDF (Ryc. 3A). Ekspozycja na CS/PB bez wirusa również nie wykazuje toksycznego działania na komórki (dane nie pokazano). Analiza FACS komórek HDF poddanych transdukcji wirusem wraz z różnymi stężeniami CS/PB wykazuje zwiększenie wydajności transdukcji w porównaniu do samego PB (Ryc. 3B). Maksymalne zwiększenie występuje przy stężeniu 100 μg/ml CS/PB (Ryc. 3C), co jest wartością kilkukrotnie niższą od wcześniej raportowanych.3 Zatem istotna jest optymalizacja warunków dla każdego konkretnego typu komórek docelowych.
Kompleksowanie z CS/PB zwiększa obserwowany miano około 3-krotnie w Slc-hRMS (Ryc. 4A, p &lt; 0.01). W praktyce przekłada się to na silniejszy efekt w zakresie wydajności transdukcji przy niskich stężeniach wirusa niż przy stężeniach wyższych (Ryc. 4B), co najprawdopodobniej wynika z wielokrotnej transdukcji komórek oraz nasycenia receptorów przy wyższych stężeniach wirusa.
Transdukcja wirusem ekotropowym jest specyficzna dla komórek wykazujących ekspresję receptora dla mysiego retrowirusa. Podczas transdukcji niemodyfikowanych ludzkich komórek wirusem ekotropowym nie zaobserwowano fluorescencji wyższej niż tło w komórkach nietransdukowanych, niezależnie od zastosowania PB lub CS/PB, co pokazano na Ryc. 5A. Mikroskopowo HDF nie wykazują transdukcji w przypadku braku receptora (Ryc. 5B), podczas gdy wcześniejsza transdukcja receptorem prowadzi do powstania komórek fluorescencyjnych (Ryc. 5C).
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="Schemat procesu produkcji lentiwirusa, przedstawiający etapy transdukcji komórek 293T oraz otrzymywania nadsączu wirusowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny widok (A) procesu produkcji wirusa oraz (B) transdukcji ludzkich komórek mysim receptorem retrowirusowym, a następnie lentiwirusem ekotropowym.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="Wykresy cytometrii przepływowej, analiza procentowa komórek GFP+, mikroskopia fluorescencyjna, wykres słupkowy miana wirusa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wysokoefektywna transdukcja ludzkich komórek ekotropowym lentiwirusem kodującym GFP. Komórki zostały wstępnie poddane transdukcji mysim receptorem retrowirusowym Slc7a1. (A) Ludzka linia komórkowa rabdomiosarkoma wyselekcjonowana blastycydyną pod kątem Slc7a1 (Slc-hRMS), transdukowana (niebieski) lub nietransdukowana (różowy) GFP. (B) Mikrografia fluorescencyjna komórek Slc-hRMS poddanych transdukcji ekotropowej (4X). (C) HDF transdukowane (niebieski) i nietransdukowane (różowy) ekotropowym lentiwirusem GFP; komórki zostały poddane transdukcji Slc7a1 dwa dni przed transdukcją ekotropową. (D) Miano lentiwirusa pseudotypowanego VSV-G oraz lentiwirusa ekotropowego, zmierzone na komórkach Slc-hRMS.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="Wpływ stężenia polimeru na ekspresję GFP; wykresy absorbancji, cytometrii przepływowej i % GFP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Optymalizacja stężeń siarczanu chondroityny/polybrene (CS/PB) w ludzkich fibroblastach skórnych. (A) Żywotność HDF mierzona testem MTT po transdukcji w obecności samego PB lub z różnymi stężeniami CS/PB. (B) Zwiększenie wydajności transdukcji w HDF przy różnych stężeniach CS/PB, mierzone za pomocą FACS. (C) Ilościowa ocena zwiększenia wydajności transdukcji, wykazująca, że maksymalna transdukcja występuje przy stężeniu 100 μg/ml CS/PB.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="Analiza wydajności transdukcji genów w funkcji miana, wykres słupkowy i wykres punktowy, porównanie efektu polybrene." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wpływ 400 μg/ml CS/PB na transdukcję Slc-hRMS za pomocą ekotropowego lentiwirusa. (A) Wzmocnienie miana oraz (B) krotność zmiany szybkości transdukcji w porównaniu do zastosowania samego polybrene w stężeniu 6 μg/ml.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="Wykres intensywności GFP z cytometrii przepływowej wraz z obrazami mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiającymi rozkład komórek GFP+." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Brak transdukcji ekotropowej HDF w przypadku braku mysiego receptora retrowirusowego Slc7a1. (A) Wykres FACS ludzkich fibroblastów BJ, nietransdukowanych (różowy) lub transdukowanych (niebieski) ekotropowym lentiwirusem GFP, w obu przypadkach przy braku receptora Slc7a1. Ludzkie fibroblasty BJ transdukowane ekotropowym lentiwirusem GFP, bez (B) oraz z (C) przedtransdukcją receptorem Slc7a1 (4X).

<ol><li>Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+polymers+modulate+retrovirus+transduction+via+membrane+charge+neutralization+and+virus+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation.</a> Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).</li>
<li>Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-+to+large-scale+production+of+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Small- to large-scale production of lentivirus vectors.</a> Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).</li>
<li>Landazuri, N., LeDoux, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+of+retroviruses+with+charged+polymers+enhances+gene+transfer+by+increasing+the+rate+that+viruses+are+delivered+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells.</a> J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).</li>
<li>Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).</li>
<li>Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EOS+lentiviral+vector+selection+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).</li>
<li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+nondividing+cells+using+pseudotyped+defective+high-titer+HIV+type+1+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+to+the+center+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Journey to the center of the cell.</a> Cell. 105, 697-700 (2001).</li>
<li>Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+tropism+of+lentiviral+vectors+through+pseudotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping.</a> Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).</li>
<li>Schambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+murine+ecotropic+envelope%3A+increased+biosafety+and+convenience+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research.</a> Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).</li>
<li>Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+human+embryonic+stem+cells+by+ecotropic+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors.</a> Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+a+novel+human+gene+homologous+to+the+murine+ecotropic+retroviral+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor.</a> Virology. 185, 10-17 (1991).</li>
<li>Cepko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+preparation+and+concentration+of+retrovirus+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).</li>
<li>Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+of+retrovirus+with+cationic+and+anionic+polymers+increases+the+efficiency+of+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer.</a> Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).</li>
<li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Rekombinowany ekotropowy gammaretrowirus oparty na mysim wirusie białaczki Moloneya (MLV) oraz jego receptor mSlc7a1 są dobrze poznane i powszechnie dostępne, będąc wykorzystywanymi od ponad 20 lat do dostarczania transgenów do komórek mysich. Ekotropowy gammaretrowirus był również stosowany w ostatnim czasie do dostarczania onkogenów do komórek ludzkich; w kontekście przeprogramowania komórkowego uznanym jest zastosowanie mSlc7a1 w celu uniknięcia generowania wirusa amfotropowego przenoszącego ludzkie onkogeny.4,5 Jednakże lentiwirusy zapewniają znaczące zalety w stosunku do gammaretrowirusów w transdukcji opornych populacji komórek,6 w tym komórek pierwotnych, które często są pożądanymi celami przeprogramowania, ponieważ lentiwirusowy kompleks przedintegracyjny umożliwia transdukcję komórek niedzielących się.7 
Lentiwirusy produkowano z wykorzystaniem kilkudziesięciu różnych pseudotypów, w tym MLV, w celu zmiany tropizmu wirusa, toksyczności i innych właściwości.8 Ekotropowy lentiwirus pseudotypowany MLV był stosowany do transdukcji komórek mysich,9 lecz rzadko używano go w odniesieniu do komórek ludzkich.10 Proponujemy zatem wykorzystanie ekotropowego lentiwirusa pseudotypowanego MLV jako bezpiecznego, kosztowo efektywnego i wysoce wydajnego nośnika do dostarczania znanych lub podejrzewanych onkogenów, w tym czynników reprogramowania komórkowego, do komórek ludzkich.
Należy podkreślić, że niniejszy protokół nie eliminuje całkowicie konieczności wytwarzania i stosowania pantropowego lentiwirusa; zamiast tego oddziela on onkogen(y) od wirusa pantropowego, chroniąc badaczy przed potencjalną samoinkulacją wirusami związanymi z nowotworami. Białko mSlc7a1 i jego ludzki homolog hSlc7a1 są powszechnie ekspresjonowanymi transporterami aminokwasów o nieznanej tumorigeniczności i braku zdolności do nadawania selektywnej przewagi wzrostu komórkom biorcy,11 co sprawia, że mSlc7a1 wiąże się z relatywnie niskim ryzykiem w przypadku wbudowania w wirusa amfotropowego. Ten dodatkowy krok może być szczególnie użyteczny w laboratoriach nieposiadających dedykowanych pomieszczeń do hodowli wirusów lub tkanek o wymaganym poziomie bezpieczeństwa biologicznego.
W niektórych sytuacjach możliwe może być całkowite wyeliminowanie użycia wirusa pantropowego poprzez bezpośrednią transfekcję plazmidu Slc7a1 do komórek docelowych; jednak wiele komórek, które stanowiłyby przydatne cele dla tej techniki, jest jednocześnie opornych na transfekcję. Jako alternatywę, możliwość izolacji komórek transdukowanych Slc7a1 poprzez selekcję blastycydyną oznacza, że pseudotypowany VSV-G lentiwirus może zostać użyty jednorazowo w celu wygenerowania banku komórek wykazujących ekspresję receptora, po czym w rutynowy sposób można stosować wirusa ekotropowego do transdukcji tych komórek w wielu eksperymentach. Badacze powinni zawsze przestrzegać instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa pracy z dowolnym lentiwirusem, niezależnie od jego tropizmu.
Miana wirusa ekotropowego uzyskane przy zastosowaniu tego protokołu są umiarkowanie niższe niż w przypadku wirusa pseudotypowanego VSV, zazwyczaj stanowią 10-20% miana wirusa pantropowego, co jest zgodne z poprzednimi badaniami.9 Miana te mierzono w ludzkich komórkach stabilnie transdukowanych Slc7a1, zatem niższe zaobserwowane miano wirusa ekotropowego może wynikać częściowo ze zróżnicowanej ekspresji genu receptora w komórkach docelowych. Niemniej jednak miana wirusowe osiągnięte w naszym protokole są więcej niż wystarczające dla większości zastosowań i prowadzą do transdukcji większości komórek, w niektórych przypadkach &gt; 90% komórek.
Techniki oparte na wirowaniu są powszechnie stosowane do zagęszczania cząstek wirusowych. Jednakże wirowanie trwa kilka godzin, generuje zakaźne aerozole i może prowadzić do znacznej utraty cząstek wirusowych.12 Jako alternatywę można zastosować kompleksowanie z CS/PB w celu zwiększenia transdukcji bez zmiany tropizmu wirusa.3 Metoda ta jest szybka (5 minut) i niedroga (0,03 USD na 10 ml wirusa), a jednocześnie mniej więcej trzykrotnie zwiększa obserwowany miano. Nie jest wymagany specjalistyczny sprzęt ani zastrzeżone odczynniki; zaobserwowano minimalną toksyczność ostrą po narażeniu HDF na CS/PB, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami na innych liniach komórkowych.13 Potencjalną wadą tego protokołu jest fakt, że niektóre widoczne mikroskopowo kompleksy polimerowe przylegają do komórek przez kilka dni hodowli. Nie można wykluczyć możliwości, że kompleksy te, mimo braku wyraźnej toksyczności dla komórek, mogą wywierać subtelniejszy wpływ na procesy komórkowe.
W niniejszym opracowaniu opisano metodologię bezpiecznej i wydajnej transdukcji ludzkich komórek czynnikami onkogennymi. Podejście to powinno okazać się bardzo użyteczne dla badaczy zajmujących się onkogenami oraz biologią komórek macierzystych, w tym komórek iPS.

<table><tbody><tr><td>pLenti6/UbC/mSlc7a1</td><td>Addgene</td><td>17224</td><td>Mysi receptor MLV</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Otoczka VSV-G</td></tr><tr><td>pCMV-dR8.91</td><td>Addgene</td><td></td><td>Laboratorium D. Trono&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;
&lt;br/&gt;Plazmid pakujący (równoważny plazmid psPax2 jest dostępny w Addgene, nr kat. 12260)</td></tr><tr><td>pHCMV-Ec&amp;#8211;nv</td><td>Addgene</td><td>15802</td><td>Otoczka ekotropowa</td></tr><tr><td>FUGW</td><td>Addgene</td><td>14883</td><td>Plazmid kontrolny GFP</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Roche Group</td><td>04 709 705 001</td><td></td></tr><tr><td>Bromek heksadymetryny (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan chondroityny, sól sodowa z chrząstki rekina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4384</td><td></td></tr><tr><td>Blastycydyna S</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2647100</td><td></td></tr><tr><td>Bromek metyltiazoliodifenylo-tetrazoliu (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr></tbody></table>

transdukcja komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem w kompleksie z polimerem w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Badania nad biologią komórek macierzystych i komórek nowotworowych często wymagają transdukcji wirusowej ludzkich komórek za pomocą znanych lub podejrzewanych onkogenów, co budzi poważne kwestie bezpieczeństwa personelu laboratoryjnego. Lentiwirusy pantropowe, takie jak powszechnie stosowany pseudotyp VSV-G, stanowią cenne narzędzie do badania funkcji genów, ponieważ mogą transdukować wiele typów komórek, w tym komórki niedzielące się. Jednak badacze mogą chcieć uniknąć produkcji i wirowania wirusów pantropowych kodujących onkogeny ze względu na wymogi dotyczące wyższego poziomu bezpieczeństwa biologicznego oraz kwestie bezpieczeństwa. Znane jest, że kilka silnych onkogenów, w tym c-Myc oraz duży antygen T SV40, zwiększa wydajność produkcji indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Wszystkie pozostałe znane zmiany genetyczne indukujące iPSC (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28 oraz utrata funkcji p53) są również powiązane z nowotworami, co sprawia, że one także budzą stosunkowo wysoki niepokój w kwestii bezpieczeństwa.
Choć wirusy związane z nowotworami są przydatne w badaniu przeprogramowania komórkowego i pluripotencji, muszą być one używane w sposób bezpieczny. Aby rozwiązać te problemy z biobezpieczeństwem, prezentujemy metodę transdukcji ludzkich komórek ekotropowym lentiwirusem, kładąc dodatkowy nacisk na obniżenie kosztów i wygodę obsługi. Wyprodukowaliśmy ekotropowego lentiwirusa o wystarczająco wysokim mianie, aby przetransdukować ponad 90% ludzkich komórek wykazujących ekspresję receptora i narażonych na działanie wirusa, co potwierdza skuteczność tego podejścia.
Lentiwirusy są często zagęszczane poprzez ultrawirowanie, jednak proces ten trwa kilka godzin i może prowadzić do powstania aerozoli zakaźnych dla pracowników laboratoriów biomedycznych. Alternatywnie cząstki wirusowe można bezpieczniej osadzać na komórkach poprzez kompleksowanie z chondroitynosiarczanem i polybrenem (CS/PB). Technika ta zwiększa funkcjonalny miano wirusa nawet 3-krotnie w komórkach stabilnie ekspresujących receptor retrowirusa mysiego, przy pomijalnym wzroście czasu i kosztów. Transdukcja ludzkich fibroblastów skóry (HDFs) jest maksymalnie wzmocniona przy stężeniach CS/PB około 4-krotnie niższych niż optymalna wartość zgłaszana wcześniej dla linii komórek nowotworowych, co sugeruje, że stężenie polimeru powinno być miareczkowane dla konkretnego typu komórek docelowych. Opisujemy zatem zastosowanie bromku metyltiazolodifenylo-tetrazoliu (MTT) do oceny toksyczności polimeru w nowym typie komórek. Obserwujemy równoważną żywotność HDFs po transdukcji wirusowej z użyciem kompleksowania polimerowego lub standardowej dawki polybrenu (PB, 6 μg/ml), co wskazuje na minimalną toksyczność ostrą.
W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie ekotropowego lentiwirusa do nadekspresji onkogenów w komórkach ludzkich, co pozwala na zmniejszenie ryzyka biologicznego i zwiększenie wydajności transdukcji. Przedstawiamy również wykorzystanie kompleksowania polimerowego w celu usprawnienia transdukcji, przy jednoczesnym uniknięciu wirowania cząsteczek wirusowych, które mogłoby prowadzić do powstania aerozoli.

Lentiwirusy są cennym narzędziem badawczym w analizie funkcji genów; jednak badacze mogą chcieć uniknąć produkcji pantropowych lentiwirusów kodujących znane lub podejrzewane onkogeny. Jako alternatywę przedstawiamy bezpieczniejszy protokół wykorzystania ektropowych lentiwirusów w komórkach ludzkich zmodyfikowanych w celu ekspresji ektropowego receptora mSlc7a1.

Transdukcja komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem w kompleksie z polimerem w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego

Badania nad biologią komórek macierzystych i nowotworowych często wymagają transdukcji wirusowej komórek ludzkich przy użyciu znanych lub przypuszczalnych onkogenów, co budzi poważne kwestie bezpieczeństwa w odniesieniu do...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wprowadzenie onkogenów lub innych potencjalnie niebezpiecznych genów do ludzkich komórek przy użyciu lentiwirusa echotropowego. Osiąga się to poprzez produkcję pantropowego lentiwirusa kodującego receptor retrowirusowy mysi oraz echotropowego lentiwirusa kodującego gen zainteresowania; komórki są transdukowane receptorem retrowirusowym mysim, co czyni je podatnymi na transdukcję wirusem echotropowym. Następnie komórki są transdukowane wirusem echotropowym w celu wprowadzenia onkogenu, wykorzystując kompleksowanie polimerowe z polybrewiną i siarczanem chondroityny w celu zwiększenia wydajności transdukcji; wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizy FACS wykazują selektywną transdukcję ludzkich komórek za pomocą lentiwirusa tropowego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transdukcja gamma-retrowirusowa, jest fakt, że cząsteczki lentiwirusowe mogą skuteczniej transdukować wiele typów komórek, w tym komórki niedzielące się, takie jak komórki macierzyste. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem i komórkami macierzystymi, np. w zrozumieniu funkcji potencjalnych onkogenów. Przed rozpoczęciem tej procedury należy skonsultować się z instytucjonalnym inspektorem ds. bezpieczeństwa i postępować zgodnie z zalecanymi przez niego wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa.Pracę należy rozpocząć w komorze z laminarnym przepływem powietrza, wykorzystując kulturę zdrowych, szybko rosnących komórek 2 9 3 T. W warunkach aseptycznych należy zawiesić 5 × 10⁶ komórek 2 9 3 T w 10 ml pożywki dla komórek 2 9 3 T bez antybiotyków. Zawiesinę komórkową należy przenieść pipetą do 10-centymetrowej płytki hodowlanej, a następnie inkubować płytkę przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Następnego dnia, w późnych godzinach popołudniowych, należy rozpocząć transfekcję. Najpierw pobrać alikwot Optum oraz plazmidy transfer packaging i envelope i pozostawić je do ogrzania do temperatury pokojowej. Odpipetować 375 µL Optum do probówki do mikrocentryfugi, a następnie dodać 25 µL odczynnika do transfekcji FUgene HD. Należy upewnić się, że odczynnik FUgene jest pipetowany bezpośrednio do medium i nie dotyka ścianki probówki.Następnie, w drugiej probówce do mikrocentryfugi, połącz 5 µg plazmidu transferowego, 3,75 µg plazmidu pakującego oraz 1,25 µg plazmidu otoczki w odpowiedniej ilości Optum, aby doprowadzić objętość do 100 µL. Następnie dodaj Opti-Fuji do probówki zawierającej mieszaninę plazmidów i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. W ciągu ostatnich kilku minut inkubacji bardzo delikatnie odessij pożywkę z płytki zawierającej komórki 293T i zastąp ją 10 ml świeżej pożywki dla komórek 293T bez antybiotyków.Na koniec dodawaj kroplami mieszaninę plazmidów z genem FU do medium na płytce 10 centymetrów. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 °C i 5% carbon dioxide i inkubuj przez noc. Następnego dnia bardzo delikatnie odessaj medium z płytki i zastąp je świeżym medium 2 9 3 T bez antybiotyków.Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkanek i inkubuj przez kolejne dwa dni. Trzy dni po transfekcji odessaj z płytki pożywkę zawierającą wirusa i przefiltruj ją, korzystając z filtra o porach 0,45 mikrona o niskim wiązaniu białek. Po przefiltrowaniu wirusa przygotuj rozcieńczenia seryjne wirusa kontrolnego z białkiem fluorescencyjnym w świeżej pożywce bez antybiotyków z dodatkiem 6 µg/mL polybrene i wykorzystaj te rozcieńczenia do transdukcji komórek odpowiedniej linii komórkowej. Następnego dnia, w płytce 24-dołkowej, wymień pożywkę na świeżą, pozbawioną antybiotyków, a następnie kontynuuj inkubację przez kolejne dwa dni, aby umożliwić komórkom ekspresję białka fluorescencyjnego.Na podstawie uzyskanych wyników należy wyznaczyć frakcję komórek przetransdukowanych dla każdego rozcieńczenia wirusa. Następnie należy obliczyć miano w jednostkach transformujących na mililitr, opierając się na rozcieńczeniach, w których poziom transdukcji wyniósł mniej niż 15%, aby zminimalizować liczbę zdarzeń wielokrotnej transdukcji. Przyjmuje się, że miano innych niefluorescencyjnych lentiwirusów wytworzonych równolegle jest zbliżone do miana wirusa fluorescencyjnego.Aby przeprowadzić transdukcję komórek docelowych, należy rozpocząć od wybrania wielokrotności infekcji (MOI) większej niż dwa, aby zapewnić transdukcję większości komórek. Najpierw rozcieńczyć nadsącz wirusowy do wymaganej wielokrotności infekcji w świeżej, kompletnej pożywce hodowlanej. Następnie dodać polybrene do stężenia 6 µg/mL, uzyskując objętość końcową 1 mL.Odssać pożywkę z 35 milimetrowej szalki z komórkami docelowymi i dodać jeden mililitr rozcieńczonego supernatantu wirusowego. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 24 do 48 godzin, aby umożliwić wystarczającą ekspresję receptora SLC seven A one, jeśli jest to pożądane. W celu wyselekcjonowania stabilnie przetransdukowanych komórek wykazujących ekspresję SLC seven A one, zastosować selekcję antybiotykową z użyciem blastecyny zgodnie z instrukcjami zawartymi w procedurze pisemnej.Aby rozpocząć ocenę toksyczności, należy przygotować roztwór zapasowy siarczanu chondroityny o stężeniu 20 mg/ml oraz roztwór zapasowy Poly brain w wodzie o stężeniu 20 mg/ml, a następnie poddać je filtracji sterylnej. Nadmiar roztworów zapasowych można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.Następnie należy określić liczbę kultur komórkowych w płytkach 96-dołkowych niezbędnych do dokładnego określenia toksyczności kompleksu polimerowego. Przy użyciu testu MTT należy sprawdzić co najmniej sześć stężeń siarczanu chondroityny i poly green w trzech powtórzeniach. Dodatkowo należy uwzględnić komórki niepoddane redukcji oraz komórki hodowane w pożywce bezsurowiczej.Należy dodać medium, aby zapewnić punkt odniesienia dla zdrowych komórek oraz w celu kontroli zatrzymania wzrostu odpowiednio. Po ustaleniu liczby wymaganych dołków, wysiać 5 000 komórek docelowych do każdego dołka płytki 96-dołkowej; równolegle wysiać komórki na płytkę 24-dołkową w celu przeprowadzenia analizy mikroskopowej lub opartej na faktach w zakresie wydajności transdukcji w każdym z warunków eksperymentalnych, a następnie pozostawić oba zestawy komórek do wzrostu przez noc. Następnego dnia dodać alikwot roztworu zapasowego siarczanu chondroityny oraz alikwot roztworu zapasowego poly-L-lizyny.Następnie rozcieńcz wirusa kodującego GFP w pożywce bez antybiotyków zawierającej 6 µg/mL poly-L-lizyny do wielokrotności zakażenia (MOI) wystarczającej do transdukcji około 10 do 50% komórek docelowych w studni. Upewnij się, że przygotowano wystarczającą ilość rozcieńczonego wirusa dla każdego warunku badawczego oraz studni kontrolnych na każdej płytce. Opisz zestaw probówek, przypisując każdą do badanej stężenia siarczanu chondroityny oraz polimeru poly-L-lizyny.Następnie do probówek nanieś odpowiednie alikwoty zawiesiny wirusowej dla każdego z trzech powtórzeń w każdej grupie badawczej. Kolejno do każdej probówki pipetuj wymaganą objętość roztworu stokowego siarczanu chondroityny oraz poly brain, aby uzyskać odpowiednie stężenia testowe. Bezpośrednio po dodaniu siarczanu chondroityny i poly green delikatnie strząśnij probówkę, aby wymieszać zawartość.Pozostaw mieszaniny wirusa z chondroitynosiarczanem i Poly Green do inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Mieszanina może stać się mętna w wyniku tworzenia się osadów wirusowych. Po inkubacji odessaj medium z dołków płytki 96-dołkowej.Następnie do dołków dodać zaplanowaną mieszaninę wirusa, chondroitynosiarczanu i poly green. Do odpowiednich dołków pipetować również kontrolę oraz medium bezsurowicze. Powtórzyć tę procedurę dla płytki 24-dołkowej i inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkanek.Następnie odessać pożywkę zawierającą wirusa z płytek i zastąpić ją świeżą pożywką. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze na 48 godzin. Po upływie 48 godzin wyjąć płytkę 24-dołkową i wykorzystać analizę FACS do oceny wydajności transdukcji dla każdego stężenia siarczanu chondroityny i poly brain.Następnego dnia odessać pożywkę ze wszystkich studni płytki 96-dołkowej i zastąpić ją 100 µL roztworu MTT; inkubować przez trzy godziny w inkubatorze z nawilżaniem, aby umożliwić redukcję MTT w mitochondriach metabolicznie aktywnych komórek. Po trzech godzinach odessać roztwór MTT i zastąpić go 200 µL roztworu rozpuszczalnika.Inkubować płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub do momentu, aż utworzy się fioletowy MTT i rozpuści się osad. Odczytać absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek przy 570 nanometrach, odejmując tło odczytane przy 690 nanometrach. Optymalne stężenie polimeru zapewni maksymalne zwiększenie wydajności transdukcji, co zostanie określone na podstawie faktów, przy minimalnym wpływie na aktywność metaboliczną hdfs, określoną za pomocą testu MTT.100 µg/mL siarczanu chondroityny. Poly brain to optymalne stężenie polimeru ustalone za pomocą tej metody. Najpierw przygotować odpowiednią ilość mieszaniny 100 µg/mL siarczanu chondroityny, poly green i nadsączu wirusowego, aby przetransdukować wymaganą liczbę naczyń 35 mm z komórkami HDF wykazującymi ekspresję receptora SLC7A1. Inkubować mieszaninę przez pięć minut, aby umożliwić utworzenie się kompleksów polimerowych.Następnie odessać pożywkę z receptorowych komórek eksprymujących białka docelowe i zastąpić ją mieszaniną wirusową; inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, a następnie usunąć mieszaninę wirusową. Powierzchnię komórek przemyć dwukrotnie PBS, aby wspomóc usuwanie kompleksów wirusowych. Całkowite usunięcie nie jest konieczne, ponieważ nie zaobserwowano negatywnego wpływu pozostałych kompleksów polimerowych na kondycję komórek.Ten obraz z mikroskopu fluorescencyjnego ilustruje wystarczającą transdukcję ludzkich komórek mięsaka, stabilnie wykazujących ekspresję SLC7A1, za pomocą wirusa tropowego przy zastosowaniu fluorescencyjnych wektorów kontrolnych do monitorowania wydajności transdukcji. Ilościowe określenie fluorescencji za pomocą analizy FACS wykazuje wydajność transdukcji przekraczającą 90%. Tempo transdukcji HDFS jest zazwyczaj niższe, ponieważ komórki nie zostały poddane selekcji w kierunku ekspresji receptora; miana atropowego lentiwirusa są zazwyczaj o 10 do 20% niższe niż w przypadku wirusa pseudotypowanego VSV, co zmierzono na S-L-C-H-S-C. Test żywotności MTT umożliwia czułe wykrywanie zahamowania wzrostu w komórkach docelowych, co widać tutaj w przypadku transdukcji wirusem w obecności stężeń siarczanu chondroityny.Poly brain w stężeniu do 800 µg/mL nie wpływa na metabolizm HDF. Analiza FACS komórek HDF przetransdukowanych wirusem z dodatkiem różnych stężeń siarczanu chondroityny. Poly green wykazuje zwiększenie wydajności transdukcji w porównaniu do zastosowania samego poly green.Maksymalne wzmocnienie występuje przy stężeniu 100 µg/mL. W przypadku chondroitynosiarczanu w mózgu wartości te były kilkukrotnie niższe niż raportowane wcześniej. Z tego względu istotna jest optymalizacja warunków kompleksowania chondroitynosiarczanu dla każdego konkretnego typu komórek.Poly brain zwiększa obserwowany miano, w przybliżeniu trzykrotnie w S-L-C-H-S-C. W praktyce przekłada się to na większy wpływ na wydajność transdukcji przy niskich stężeniach wirusa niż przy stężeniach wyższych, co najprawdopodobniej wynika z transdukcji wielu komórek oraz nasycenia receptorów przy wyższych stężeniach wirusa. Transdukcja wirusem tropowym jest specyficzna dla komórek wykazujących ekspresję receptora retrowirusowego neuronów.Podczas transdukcji niemodyfikowanych ludzkich komórek wirusem tropowym, analiza FACS oraz obserwacje mikroskopowe nie wykazały fluorescencji przekraczającej niezredukowany poziom tła. Komórki HDFS nie wykazują transdukcji w przypadku braku receptora, podczas gdy transdukcja uprzednia z receptorem prowadzi do powstania komórek fluorescencyjnych. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zweryfikować, czy wirus nie będzie transdukował zmodyfikowanych ludzkich komórek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania tropistycznego lentiwirusa do dostarczania potencjalnie niebezpiecznych genów do ludzkich komórek, w tym zastosowania kompleksowania polimerowego w celu zwiększenia wydajności transdukcji.

transduction-human-cells-with-polymer-complexed-ecotropic-lentivirus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wprowadzenie złożonego z polimerami ekotropowego lentiwirusa do ludzkich komórek w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego

Lentiwirusowe wektory ekspresyjne są najskuteczniejszymi nośnikami do stabilnej ekspresji różnych cząsteczek efektorowych lub konstruktów reporterowych w dzielących się i niedzielących się komórkach ssaków oraz w całych organizmach. Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący pakowania lentiwirusowych konstruktów ekspresyjnych w pseudowirusowe cząstki oraz transdukcji komórek docelowych przy użyciu tych cząstek.

Pakowanie konstruktów ekspresyjnych lentiwektorów opartych na HIV lub FIV oraz transdukcja pseudotypowanych cząsteczek wirusowych VSV-G

Interferencja RNA (RNAi) posiada wiele zalet w porównaniu z nokautem genów i jest szeroko stosowana jako narzędzie w badaniach nad funkcjami genów. Wynalezienie technologii RNAi opartej na wektorach DNA umożliwiło długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów, a także zwiększyło wykonalność wyciszania genów in vivo.

Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Opisujemy metodę modyfikacji genetycznej pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą transgenu przy użyciu niewirusowego systemu transpozonu piggyBac. Limfocyty T zmodyfikowane z wykorzystaniem systemu transpozonu piggyBac wykazują stabilną ekspresję transgenu.

Modyfikacja pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą systemu transpozonalnego piggyBac

Tutaj używamy transdukcji retrowirusowej i transfekcji konkategomerycznej, aby stworzyć linię komórkową, która może wyrażać składniki wektora lentiwirusowego (LV) przy braku tetracykliny. Ten LV koduje GFP i jest pseudotypowany glikoproteiną SVGmu, która jest specyficzna dla receptora na komórkach dendrytycznych.

Linia komórkowa regulowana tetracykliną wytwarza wektory lentiwirusowe o wysokim mianie, które są specyficznie ukierunkowane na komórki dendrytyczne

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli są trudne do transdukcji. Protokół ten opisuje produkcję lentiwirusów i ich koncentrację, a także optymalne warunki hodowli niezbędne do osiągnięcia wysoce wydajnych transdukcji w tych komórkach poprzez różnicowanie do pseudostratyfikowanego nabłonka.

Optymalna produkcja lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

Tutaj prezentujemy protokół modulacji ekspresji transgenu za pomocą przełącznika pojedynczego genu pEUI(+) przez leczenie tebufenozydem.

Przełącznik pojedynczego genu oparty na receptorze ekdyzonu do celowej ekspresji transgenu z solidnością, odwracalnością i znikomą nieszczelnością

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Protokół ten opisuje przeprogramowanie in vivo mysich komórek rakowych na komórki dendrytyczne typu 1 w mikrośrodowisku guza poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych PU.1, IRF8 i BATF3.

Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

Tu opisujemy metodę wizualizowania opartych na komórkach, lokalizacji subkomórkowej i analizy ilościowej ognisk wzbogaconych poli(ADP-rybozą) (PAR) w fiksowanych komórkach ssaków. Ten test umożliwia ilościową ocenę miejsc aktywacji PARP indukowanej uszkodzeniem DNA, w tym związaną z naprawą po wycinaniu zasad lub naprawą pojedynczych rozerwaniach łańcucha, w jądrach komórek narażonych na genotoksyczne substancje.

Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym

Poznaj metodę transdukcji komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem z kompleksacją polimerową w celu bezpiecznego wprowadzania onkogenów. Technika zwiększa efektywność transdukcji i minimalizuje ryzyko biologiczne w badaniach nad rakiem.

Transdukcja komórek ludzkich za pomocą ekotropowego lentiwirusa skompleksowanego z polimerami w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego (Wideo) | JoVE Journal

Transdukcja komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem w kompleksie z polimerem w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego

Przeglądaj więcej filmów