Transdukcja komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem w kompleksie z polimerem w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wprowadzenie onkogenów lub innych potencjalnie niebezpiecznych genów do ludzkich komórek przy użyciu lentiwirusa echotropowego. Osiąga się to poprzez produkcję pantropowego lentiwirusa kodującego receptor retrowirusowy mysi oraz echotropowego lentiwirusa kodującego gen zainteresowania; komórki są transdukowane receptorem retrowirusowym mysim, co czyni je podatnymi na transdukcję wirusem echotropowym. Następnie komórki są transdukowane wirusem echotropowym w celu wprowadzenia onkogenu, wykorzystując kompleksowanie polimerowe z polybrewiną i siarczanem chondroityny w celu zwiększenia wydajności transdukcji; wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizy FACS wykazują selektywną transdukcję ludzkich komórek za pomocą lentiwirusa tropowego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transdukcja gamma-retrowirusowa, jest fakt, że cząsteczki lentiwirusowe mogą skuteczniej transdukować wiele typów komórek, w tym komórki niedzielące się, takie jak komórki macierzyste. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem i komórkami macierzystymi, np. w zrozumieniu funkcji potencjalnych onkogenów. Przed rozpoczęciem tej procedury należy skonsultować się z instytucjonalnym inspektorem ds. bezpieczeństwa i postępować zgodnie z zalecanymi przez niego wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa.

Pracę należy rozpocząć w komorze z laminarnym przepływem powietrza, wykorzystując kulturę zdrowych, szybko rosnących komórek 2 9 3 T. W warunkach aseptycznych należy zawiesić 5 × 10⁶ komórek 2 9 3 T w 10 ml pożywki dla komórek 2 9 3 T bez antybiotyków. Zawiesinę komórkową należy przenieść pipetą do 10-centymetrowej płytki hodowlanej, a następnie inkubować płytkę przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

Następnego dnia, w późnych godzinach popołudniowych, należy rozpocząć transfekcję. Najpierw pobrać alikwot Optum oraz plazmidy transfer packaging i envelope i pozostawić je do ogrzania do temperatury pokojowej. Odpipetować 375 µL Optum do probówki do mikrocentryfugi, a następnie dodać 25 µL odczynnika do transfekcji FUgene HD. Należy upewnić się, że odczynnik FUgene jest pipetowany bezpośrednio do medium i nie dotyka ścianki probówki.

Następnie, w drugiej probówce do mikrocentryfugi, połącz 5 µg plazmidu transferowego, 3,75 µg plazmidu pakującego oraz 1,25 µg plazmidu otoczki w odpowiedniej ilości Optum, aby doprowadzić objętość do 100 µL. Następnie dodaj Opti-Fuji do probówki zawierającej mieszaninę plazmidów i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. W ciągu ostatnich kilku minut inkubacji bardzo delikatnie odessij pożywkę z płytki zawierającej komórki 293T i zastąp ją 10 ml świeżej pożywki dla komórek 293T bez antybiotyków.

Na koniec dodawaj kroplami mieszaninę plazmidów z genem FU do medium na płytce 10 centymetrów. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 °C i 5% carbon dioxide i inkubuj przez noc. Następnego dnia bardzo delikatnie odessaj medium z płytki i zastąp je świeżym medium 2 9 3 T bez antybiotyków.

Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkanek i inkubuj przez kolejne dwa dni. Trzy dni po transfekcji odessaj z płytki pożywkę zawierającą wirusa i przefiltruj ją, korzystając z filtra o porach 0,45 mikrona o niskim wiązaniu białek. Po przefiltrowaniu wirusa przygotuj rozcieńczenia seryjne wirusa kontrolnego z białkiem fluorescencyjnym w świeżej pożywce bez antybiotyków z dodatkiem 6 µg/mL polybrene i wykorzystaj te rozcieńczenia do transdukcji komórek odpowiedniej linii komórkowej. Następnego dnia, w płytce 24-dołkowej, wymień pożywkę na świeżą, pozbawioną antybiotyków, a następnie kontynuuj inkubację przez kolejne dwa dni, aby umożliwić komórkom ekspresję białka fluorescencyjnego.

Na podstawie uzyskanych wyników należy wyznaczyć frakcję komórek przetransdukowanych dla każdego rozcieńczenia wirusa. Następnie należy obliczyć miano w jednostkach transformujących na mililitr, opierając się na rozcieńczeniach, w których poziom transdukcji wyniósł mniej niż 15%, aby zminimalizować liczbę zdarzeń wielokrotnej transdukcji. Przyjmuje się, że miano innych niefluorescencyjnych lentiwirusów wytworzonych równolegle jest zbliżone do miana wirusa fluorescencyjnego.

Aby przeprowadzić transdukcję komórek docelowych, należy rozpocząć od wybrania wielokrotności infekcji (MOI) większej niż dwa, aby zapewnić transdukcję większości komórek. Najpierw rozcieńczyć nadsącz wirusowy do wymaganej wielokrotności infekcji w świeżej, kompletnej pożywce hodowlanej. Następnie dodać polybrene do stężenia 6 µg/mL, uzyskując objętość końcową 1 mL.

Odssać pożywkę z 35 milimetrowej szalki z komórkami docelowymi i dodać jeden mililitr rozcieńczonego supernatantu wirusowego. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 24 do 48 godzin, aby umożliwić wystarczającą ekspresję receptora SLC seven A one, jeśli jest to pożądane. W celu wyselekcjonowania stabilnie przetransdukowanych komórek wykazujących ekspresję SLC seven A one, zastosować selekcję antybiotykową z użyciem blastecyny zgodnie z instrukcjami zawartymi w procedurze pisemnej.

Aby rozpocząć ocenę toksyczności, należy przygotować roztwór zapasowy siarczanu chondroityny o stężeniu 20 mg/ml oraz roztwór zapasowy Poly brain w wodzie o stężeniu 20 mg/ml, a następnie poddać je filtracji sterylnej. Nadmiar roztworów zapasowych można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

Następnie należy określić liczbę kultur komórkowych w płytkach 96-dołkowych niezbędnych do dokładnego określenia toksyczności kompleksu polimerowego. Przy użyciu testu MTT należy sprawdzić co najmniej sześć stężeń siarczanu chondroityny i poly green w trzech powtórzeniach. Dodatkowo należy uwzględnić komórki niepoddane redukcji oraz komórki hodowane w pożywce bezsurowiczej.

Należy dodać medium, aby zapewnić punkt odniesienia dla zdrowych komórek oraz w celu kontroli zatrzymania wzrostu odpowiednio. Po ustaleniu liczby wymaganych dołków, wysiać 5 000 komórek docelowych do każdego dołka płytki 96-dołkowej; równolegle wysiać komórki na płytkę 24-dołkową w celu przeprowadzenia analizy mikroskopowej lub opartej na faktach w zakresie wydajności transdukcji w każdym z warunków eksperymentalnych, a następnie pozostawić oba zestawy komórek do wzrostu przez noc. Następnego dnia dodać alikwot roztworu zapasowego siarczanu chondroityny oraz alikwot roztworu zapasowego poly-L-lizyny.

Następnie rozcieńcz wirusa kodującego GFP w pożywce bez antybiotyków zawierającej 6 µg/mL poly-L-lizyny do wielokrotności zakażenia (MOI) wystarczającej do transdukcji około 10 do 50% komórek docelowych w studni. Upewnij się, że przygotowano wystarczającą ilość rozcieńczonego wirusa dla każdego warunku badawczego oraz studni kontrolnych na każdej płytce. Opisz zestaw probówek, przypisując każdą do badanej stężenia siarczanu chondroityny oraz polimeru poly-L-lizyny.

Następnie do probówek nanieś odpowiednie alikwoty zawiesiny wirusowej dla każdego z trzech powtórzeń w każdej grupie badawczej. Kolejno do każdej probówki pipetuj wymaganą objętość roztworu stokowego siarczanu chondroityny oraz poly brain, aby uzyskać odpowiednie stężenia testowe. Bezpośrednio po dodaniu siarczanu chondroityny i poly green delikatnie strząśnij probówkę, aby wymieszać zawartość.

Pozostaw mieszaniny wirusa z chondroitynosiarczanem i Poly Green do inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Mieszanina może stać się mętna w wyniku tworzenia się osadów wirusowych. Po inkubacji odessaj medium z dołków płytki 96-dołkowej.

Następnie do dołków dodać zaplanowaną mieszaninę wirusa, chondroitynosiarczanu i poly green. Do odpowiednich dołków pipetować również kontrolę oraz medium bezsurowicze. Powtórzyć tę procedurę dla płytki 24-dołkowej i inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkanek.

Następnie odessać pożywkę zawierającą wirusa z płytek i zastąpić ją świeżą pożywką. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze na 48 godzin. Po upływie 48 godzin wyjąć płytkę 24-dołkową i wykorzystać analizę FACS do oceny wydajności transdukcji dla każdego stężenia siarczanu chondroityny i poly brain.

Następnego dnia odessać pożywkę ze wszystkich studni płytki 96-dołkowej i zastąpić ją 100 µL roztworu MTT; inkubować przez trzy godziny w inkubatorze z nawilżaniem, aby umożliwić redukcję MTT w mitochondriach metabolicznie aktywnych komórek. Po trzech godzinach odessać roztwór MTT i zastąpić go 200 µL roztworu rozpuszczalnika.

Inkubować płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub do momentu, aż utworzy się fioletowy MTT i rozpuści się osad. Odczytać absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek przy 570 nanometrach, odejmując tło odczytane przy 690 nanometrach. Optymalne stężenie polimeru zapewni maksymalne zwiększenie wydajności transdukcji, co zostanie określone na podstawie faktów, przy minimalnym wpływie na aktywność metaboliczną hdfs, określoną za pomocą testu MTT.

100 µg/mL siarczanu chondroityny. Poly brain to optymalne stężenie polimeru ustalone za pomocą tej metody. Najpierw przygotować odpowiednią ilość mieszaniny 100 µg/mL siarczanu chondroityny, poly green i nadsączu wirusowego, aby przetransdukować wymaganą liczbę naczyń 35 mm z komórkami HDF wykazującymi ekspresję receptora SLC7A1. Inkubować mieszaninę przez pięć minut, aby umożliwić utworzenie się kompleksów polimerowych.

Następnie odessać pożywkę z receptorowych komórek eksprymujących białka docelowe i zastąpić ją mieszaniną wirusową; inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, a następnie usunąć mieszaninę wirusową. Powierzchnię komórek przemyć dwukrotnie PBS, aby wspomóc usuwanie kompleksów wirusowych. Całkowite usunięcie nie jest konieczne, ponieważ nie zaobserwowano negatywnego wpływu pozostałych kompleksów polimerowych na kondycję komórek.

Ten obraz z mikroskopu fluorescencyjnego ilustruje wystarczającą transdukcję ludzkich komórek mięsaka, stabilnie wykazujących ekspresję SLC7A1, za pomocą wirusa tropowego przy zastosowaniu fluorescencyjnych wektorów kontrolnych do monitorowania wydajności transdukcji. Ilościowe określenie fluorescencji za pomocą analizy FACS wykazuje wydajność transdukcji przekraczającą 90%. Tempo transdukcji HDFS jest zazwyczaj niższe, ponieważ komórki nie zostały poddane selekcji w kierunku ekspresji receptora; miana atropowego lentiwirusa są zazwyczaj o 10 do 20% niższe niż w przypadku wirusa pseudotypowanego VSV, co zmierzono na S-L-C-H-S-C. Test żywotności MTT umożliwia czułe wykrywanie zahamowania wzrostu w komórkach docelowych, co widać tutaj w przypadku transdukcji wirusem w obecności stężeń siarczanu chondroityny.

Poly brain w stężeniu do 800 µg/mL nie wpływa na metabolizm HDF. Analiza FACS komórek HDF przetransdukowanych wirusem z dodatkiem różnych stężeń siarczanu chondroityny. Poly green wykazuje zwiększenie wydajności transdukcji w porównaniu do zastosowania samego poly green.

Maksymalne wzmocnienie występuje przy stężeniu 100 µg/mL. W przypadku chondroitynosiarczanu w mózgu wartości te były kilkukrotnie niższe niż raportowane wcześniej. Z tego względu istotna jest optymalizacja warunków kompleksowania chondroitynosiarczanu dla każdego konkretnego typu komórek.

Poly brain zwiększa obserwowany miano, w przybliżeniu trzykrotnie w S-L-C-H-S-C. W praktyce przekłada się to na większy wpływ na wydajność transdukcji przy niskich stężeniach wirusa niż przy stężeniach wyższych, co najprawdopodobniej wynika z transdukcji wielu komórek oraz nasycenia receptorów przy wyższych stężeniach wirusa. Transdukcja wirusem tropowym jest specyficzna dla komórek wykazujących ekspresję receptora retrowirusowego neuronów.

Podczas transdukcji niemodyfikowanych ludzkich komórek wirusem tropowym, analiza FACS oraz obserwacje mikroskopowe nie wykazały fluorescencji przekraczającej niezredukowany poziom tła. Komórki HDFS nie wykazują transdukcji w przypadku braku receptora, podczas gdy transdukcja uprzednia z receptorem prowadzi do powstania komórek fluorescencyjnych. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zweryfikować, czy wirus nie będzie transdukował zmodyfikowanych ludzkich komórek.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania tropistycznego lentiwirusa do dostarczania potencjalnie niebezpiecznych genów do ludzkich komórek, w tym zastosowania kompleksowania polimerowego w celu zwiększenia wydajności transdukcji.