Transdukcja komórek ludzkich za pomocą ekotropowego lentiwirusa skompleksowanego z polimerami w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wprowadzenie onkogenów lub innych potencjalnie niebezpiecznych genów do komórek ludzkich za pomocą lentiwirusa echotropikalnego. Osiąga się to poprzez wytwarzanie lentiwirusa pantropicznego, kodującego receptor retrowirusa myszy, a także echo lentiwirusa tropikalnego kodującego gen zainteresowania komórek jest transdukowany za pomocą receptora retrowirusa myszy, co czyni je podatnymi na transdukcję wirusem echotropicznym. Następnie komórki są transdukowane wirusem echotropikalnym w celu wprowadzenia onkogenu za pomocą kompleksowania polimeru z poli mózgiem i siarczanem chondroityny w celu zwiększenia transdukcji, uzyskuje się wyniki, które pokazują selektywną transdukcję komórek ludzkich za pomocą lentiwirusa tropikalnego na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej i faktów.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transdukcja retrowirusowa gamma, jest to, że cząsteczki lentiwirusa mogą skuteczniej transdukować wiele typów komórek, w tym komórki niedzielące się, takie jak komórki macierzyste. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem i komórkami macierzystymi, takie jak zrozumienie funkcji potencjalnych onkogenów. Przed rozpoczęciem tej procedury skonsultuj się z instytucjonalnym urzędnikiem ds. bezpieczeństwa i postępuj zgodnie z zalecanymi przez niego wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa.

Zacznij od hodowli zdrowych, szybko rosnących 2, 9, 3 limfocytów T pracujących w kapturze do hodowli tkankowej. W warunkach aseptycznych resus zawiesić pięć razy 10 z 6 2 9 3 limfocytów T w 10 mililitrach pożywki 2 9 3 T wolnej od antybiotyków. Zawiesinę komórkową należy pipetować na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej i inkubować płytkę przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego dnia rozpocznij transfekcję późnym popołudniem. Najpierw zebrać podwielokrotność Optum oraz opakowanie transferowe i plazmidy kopertowe i pozwolić im ogrzać się do temperatury pokojowej, pipetować 375 mikrolitrów optimum do mikroprobówki wirówkowej, a następnie dodać 25 mikrolitrów odczynnika do transfekcji genu FU HD. Upewnij się, że odczynnik genu FU jest pipetowany bezpośrednio do pożywki i nie dotyka boku probówki.

Następnie, w drugiej mikroprobówce wirówkowej, połącz pięć mikrogramów plazmidu transferowego, 3,75 mikrograma plazmidu opakowaniowego i 1,25 mikrograma plazmidu otoczkowego w wymaganej ilości optymalnej, aby doprowadzić objętość do 100 mikrolitrów. Następnie dodać zmieszany Optum Fuji do probówki zawierającej mieszaninę plazmidów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. W ciągu ostatnich kilku minut inkubacji bardzo delikatnie odessać pożywkę z płytki zawierającej 2 9 3 limfocyty T i zastąpić ją 10 mililitrami świeżej, wolnej od antybiotyków pożywki 2 9 3 T.

Na koniec dodaj kroplami mieszankę plazmidu genu FU do pożywki 10-centymetrowej płytki. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i inkubuj przez noc. Następnego dnia bardzo delikatnie odessać pożywkę z płytki i zastąpić świeżą, wolną od antybiotyków pożywką 2 9 3 T.

Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych i inkubuj przez kolejne dwa dni, trzy dni po transfekcji odessać pożywkę zawierającą wirusa z płytki i przefiltrować ją za pomocą filtra o niskiej zawartości białka o grubości 0,45 mikrona. Po ściślejszym przefiltrowaniu wirusa do ciaślszego wirusa, należy wykonać seryjne rozcieńczenia fluorescencyjnego wirusa kontrolnego w świeżych pożywkach wolnych od antybiotyków z sześcioma mikrogramami na mililitr polimózgu i użyć tego rozcieńczenia do transdukcji komórek odpowiedniej linii komórkowej. Następnego dnia na 24-dołkowej płytce zmień pożywkę na świeżą, wolną od antybiotyków, a następnie kontynuuj inkubację przez kolejne dwa dni, aby umożliwić komórkom ekspresję białka fluorescencyjnego.

Wykorzystaj fakty, aby określić frakcję transdukowanych komórek dla każdego rozcieńczenia wirusa. Następnie oblicz miano w jednostkach transformujących na mililitr w oparciu o rozcieńczenia, które dają mniej niż 15% transdukcji, aby zminimalizować wielokrotne zdarzenia transdukcji. Zakłada się, że sikory innego lentiwirusa niefluorescencyjnego wytwarzanego równolegle są podobne do cycki wirusa fluorescencyjnego.

Aby przetoczyć komórki docelowe: Zacznij od wybrania infekcji multiplikatywnej większej niż dwie, aby upewnić się, że większość komórek zostanie transdukowana. Najpierw należy rozcieńczyć supernatant wirusa do wymaganej liczby infekcji w świeżej, kompletnej pożywce hodowlanej. Uzupełniony sześcioma mikrogramami na mililitr poli mózgu do końcowej objętości jednego mililitra.

Odessać pożywkę z 35-milimetrowej szalki komórek docelowych i dodać jeden mililitr rozcieńczonego supinianu wirusa. Inkubacja inkubatora kultur tkankowych przez 24 do 48 godzin, aby umożliwić wystarczającą ekspresję SLC siedem A jeden receptor, jeśli jest to pożądane. Użyj selekcji antybiotyków z blasterem sein, aby wybrać stabilnie transdukowane komórki wykazujące ekspresję SLC siedem A jeden zgodnie z instrukcjami w pisemnej procedurze.

Aby rozpocząć oznaczanie toksyczności, przygotuj roztwór podstawowy 20 miligramów na mililitr siarczanu chondroityny i roztwór podstawowy 20 miligramów na mililitr. Polimózg w wodzie i sterylnym filtrze. Nadmiar roztworów podstawowych można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu, gdy będą potrzebne.

Następnie określ liczbę 96 kultur komórkowych studzienki potrzebnych do dokładnego określenia toksyczności kompleksu polimerowego. Stosując test MTT, należy zbadać co najmniej sześć stężeń siarczanu chondroityny i zieleni poli w trzech egzemplarzach. Ponadto niezredukowane komórki i komórki hodowane w surowicy wolne.

Należy dołączyć pożywkę, aby zapewnić punkt odniesienia dla zdrowych komórek i odpowiednio kontrolować zatrzymanie wzrostu. Po ustaleniu liczby wymaganych studzienek, płytka 5 000 komórek docelowych w każdym dołku 96-dołkowej płytki w równoległych komórkach płytkowych na 24-dołkowej płytce w celu mikroskopowej lub opartej na faktach analizy wydajności transdukcji w każdym warunku eksperymentalnym, pozwala obu zestawom komórek rosnąć przez noc. Następnego dnia należy podać podwielokrotność roztworu podstawowego siarczanu chondroityny i podwielokrotność roztworu podstawowego poli mózgu.

Następnie rozcieńczyć wirusa kodującego GFP w pożywce wolnej od antybiotyków zawierającej sześć mikrogramów na mililitr polimózgu do wielu infekcji wystarczających do transdukcji około 10 do 50% komórek docelowych na studzienkę. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość rozcieńczonego wirusa dla każdego warunku testowego oraz studzienki kontrolne na każdej płytce. Oznacz zestaw probówek z każdym stężeniem siarczanu chondroityny i polimeru poli green, który ma być testowany.

Następnie porcjować wystarczającą ilość zawiesiny wirusa dla każdego stanu w trzech egzemplarzach do probówek. Następnie odpipetować wymaganą objętość siarczanu chondroityny i roztworu podstawowego poli mózgu, aby uzupełnić badane stężenia do każdej z probówek po kolei. Natychmiast po dodaniu siarczanu chondroityny i polizieleni przesuń probówkę do wymieszania.

Pozostawić mieszaniny poli-zielonego siarczanu chondroityny wirusa do inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Mieszanina może stać się mętna, gdy tworzą się osady wirusowe. Po inkubacji odessać pożywkę z dołków płytki 96-dołkowej.

A następnie zgodnie z planem dodaj do studzienek mieszaninę siarczanu chondroityny i siarczanu chondroityny do studzienek. Również kontrola pipet i pożywka wolna od surowicy do odpowiednich studzienek. Powtórz proces inkubacji na 24-dołkowej płytce przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych.

Następnie odessać pożywkę zawierającą wirusa z płytek i zastąpić ją świeżą pożywką. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze na 48 godzin Po 48 godzinach. Usuń płytkę 24-dołkową i wykorzystaj fakty do analizy skuteczności transdukcji każdego siarczanu chondroityny i stężenia poli mózgu.

Następnego dnia. Odessać pożywkę ze wszystkich studzienek na 96-dołkowej płytce i zastąpić 100 mikrolitrami kultury roztworu MTT na trzy godziny w wilgotnym inkubatorze, aby umożliwić redukcję MTT w mitochondriach metabolicznie aktywnych komórek. Po trzech godzinach odessać roztwór MTT i zastąpić go 200 mikrolitrami roztworu rozpuszczalnika.

Inkubować płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy utworzy się cały fioletowy MTT i osad się rozpuści. Odczytaj chłonność na czytniku mikropłytek przy 570 nanometrach, odejmując odczyt tła jako 690 nanometrów. Optymalne stężenie polimeru spowoduje maksymalne wzmocnienie transdukcji, zgodnie z faktami, przy minimalnym wpływie na aktywność metaboliczną, jak określono za pomocą MTT dla hdfs.

100 mikrogramów na mililitr siarczanu chondroityny. Poly brain jest optymalnym stężeniem polimeru określonym tą metodą. Po pierwsze, przygotuj wystarczającą ilość 100 mikrogramów na mililitr siarczanu chondroityny poli zielonej wirusowej mieszanki sup natant, aby wyprowadzić wymaganą liczbę 35-milimetrowych szalek SLC siedem A jeden receptor eksprymujący komórki HDF Inkubuj mieszaninę przez pięć minut, aby umożliwić utworzenie kompleksów polimerowych.

Następnie odessać pożywkę z komórek docelowych wykazujących ekspresję receptora i zastąpić mieszanką wirusową inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla po usunięciu mieszanki wirusowej. Dwukrotnie umyj powierzchnię komórek PBS, aby pomóc w usunięciu kompleksów wirusowych. Całkowite usunięcie nie jest konieczne, ponieważ nie zaobserwowano żadnego negatywnego wpływu resztkowych kompleksów polimerowych na zdrowie komórek.

Ten obraz z mikroskopu fluorescencyjnego ilustruje wystarczającą transdukcję ludzkich komórek mięsaka, stabilnie wyrażając SLC siedem A z wirusem tropikalnym przy użyciu fluorescencyjnych wektorów kontrolnych do monitorowania wydajności transdukcji. Kwantyfikacja fluorescencji za pomocą analizy faksowej wykazuje skuteczność transdukcji większą niż 90% Szybkość transdukcji HDFS jest na ogół niższa, ponieważ komórki nie zostały odsunięte na bok w selekcji do ekspresji receptora, sikory atropowego lentiwirusa to na ogół 10 do 20% pseudotypowego wirusa VSV mierzono na S-L-C-H-S-C. Test żywotności MTT pozwala na czułe wykrycie zatrzymania wzrostu w komórkach docelowych, jak pokazano tutaj, transdukcji z wirusem oraz stężeń siarczanu chondroityny.

Poly brain do 800 mikrogramów na mililitr nie mają wpływu na metabolizm HDF. Faksowa analiza HDFS transdukowanego wirusem oraz różnymi stężeniami siarczanu chondroityny. Poly green wykazuje poprawę transdukcji w porównaniu z samą poli zielenią.

Maksymalne wzmocnienie następuje przy 100 mikrogramach na mililitr. Siarczan chondroityny poli mózg kilkakrotnie niższy niż wcześniej podawane wartości. Dlatego ważne jest, aby zoptymalizować warunki dla każdego typu kompleksacji komórek za pomocą siarczanu chondroityny.

Poly brain zwiększa obserwowane miano, mniej więcej trzykrotnie w S-L-C-H-S-C. W praktyce ma to większy wpływ na wydajność transdukcji przy niskich stężeniach wirusa niż przy wyższych stężeniach, co najprawdopodobniej wynika z wielu transdukowanych komórek i nasycenia receptorów przy wyższych stężeniach wirusa. Transdukcja wirusem tropikalnym jest specyficzna dla komórek wykazujących ekspresję receptora retrowirusa neuronów.

Podczas transdukcji niezmodyfikowanych komórek ludzkich fluorescencja wirusa tropikalnego większa niż niezredukowane tło nie została zaobserwowana, jak to widać w analizie faksowej pod mikroskopem. HDFS nie wykazują transdukcji przy braku receptora, podczas gdy transdukcja pret z receptorem powoduje powstawanie komórek fluorescencyjnych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o sprawdzeniu, czy wirus nie będzie transdukował na zmodyfikowanych komórkach ludzkich.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać lentiwirusa tropikalnego do dostarczania potencjalnie niebezpiecznych genów do komórek ludzkich, w tym stosowania kompleksowania polimerów w celu zwiększenia transdukcji.