Ocena rozwoju i funkcji gruczołu sutkowego w modelach mysich

Ta metoda opisuje, jak analizować i oceniać rozwój i funkcję gruczołu sutkowego u myszy. Wycięte gruczoły sutkowe są oceniane pod kątem stopnia rozwoju przy użyciu całej góry, podczas gdy wyrzut mleka jest oceniany za pomocą testu skurczu komórek mioepitelialnych opartego na oksytocynie.

Ogólnym celem tej procedury jest ocena rozwoju gruczołu sutkowego u myszy typu dzikiego i zmutowanego. Osiąga się to poprzez najpierw preparację myszy w celu odsłonięcia gruczołów sutkowych. Następnie gruczoły sutkowe są odpowiednio zbierane i rozprowadzane na szkiełkach, uspokajają lum.

Barwienie jest następnie wykorzystywane do analizy stopnia rozwoju nabłonka. Na koniec przeprowadza się analizę skurczów mięśniowo-nabłonkowych po ekspozycji na oksytocynę, INEA J. Ostatecznie uzyskane wyniki pokażą, czy przewody gruczołu sutkowego i pęcherzyki płucne uformowały się prawidłowo i czy nabłonek mięśniowy można skłonić do skurczu i wyrzucenia mleka po ekspozycji na oksytocynę. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z rozwojem i różnicowaniem gruczołu sutkowego, takie jak wpływ mutacji genu lub nokautu na morfologię i funkcję gruczołu sutkowego.

Wizualna demonstracja tej metody zapewnia prawidłowe wypreparowanie gruczołu sutkowego, ponieważ zarówno montaż otworu, jak i test oparty na oksytocynie wymagają dobrze przygotowanych gruczołów sutkowych. Słabe rozwarstwienie gruczołu może skutkować brakiem niektórych przewodów nabłonkowych lub obecnością obcych tkanek, takich jak skóra lub tkanka mięśniowa Co najmniej jeden dzień przed rozwarstwieniem. Przygotuj roztwór ałunu CalMin, rozpuszczając jeden gram CalMin i 2,5 grama siarczanu glinowo-potasowego w 500 mililitrach wody destylowanej.

Gotuj roztwór przez 20 minut w litrowej kolbie, dostosuj końcową objętość do 500 mililitrów wodą. Przefiltruj roztwór przez papier watman i dodaj kilka ziaren tiolu jako środek konserwujący. Następnie wstaw roztwór do lodówki po zabarwieniu.

Roztwór ałunu węglowego można wlać z powrotem do butelki bulionowej i ponownie użyć wiele razy w ciągu kilku tygodni. Przygotuj świeży roztwór, gdy kolor stanie się wyblakły. Aby rozpocząć sekcję gruczołów pamięci, poświęć mysz za pomocą inhalacji dwutlenku węgla.

Jeśli to możliwe, unikaj zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ może ono uszkodzić główne naczynia krwionośne w szyi i spowodować gromadzenie się krwi wokół gruczołu sutkowego. Po pierwsze, utrudnienie jego rozwarstwienia na styropianie owiniętym folią. Połóż mysz na plecach i rozłóż cztery kończyny.

Mocno przypnij wszystkie cztery kończyny za pomocą igieł o rozmiarze od 16 do 20. Spryskaj mysz obficie 70% etanolem za pomocą kleszczy. Podciągnij skórę brzucha w linii środkowej i wykonaj małe nacięcie ostrymi nożyczkami, zaczynając od nacięcia.

Przeciąć skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając nakłuwania jamy brzusznej lub klatki piersiowej. Przetnij skórę na przednich nogach do nacięcia w linii środkowej, uzyskując kształt litery Y. W ten sam sposób przetnij skórę na tylnych kończynach.

Za pomocą kleszczy hemostatycznych. W razie potrzeby delikatnie oderwij skórę brzucha i klatki piersiowej z boku myszy. Delikatnie przeciąć tkankę spojówkową.

Przymocuj skórę do pianki polistyrenowej za pomocą igieł o rozmiarze od 16 do 20, odsłaniając gruczoły pamięci przyczepione do spodniej strony skóry. Wypreparuj jeden gruczoł na raz za pomocą kleszczy. Delikatnie unieś interesujący Cię gruczoł sutkowy i przetnij między gruczołem a skórą małymi ostrymi nożyczkami, zaczynając od zewnątrz w kierunku kręgosłupa zwierzęcia.

Pamiętaj, aby ciąć ostrożnie, aby na gruczole nie pozostały żadne kawałki skóry ani mięśni. Wszystkie gruczoły sutkowe można usunąć za pomocą tego protokołu, ale gruczoły sutkowe brzuszne numer cztery są najlepsze do całego montażu. Po wycięciu gruczołu sutkowego z myszy należy rozprowadzić go bezpośrednio na szkiełku podstawowym.

Postaraj się go maksymalnie spłaszczyć. Zachowując oryginalny kształt in situ, gruczoł ładnie przyklei się do szkiełka. Po prawidłowym rozciągnięciu w dygestoriach zamocuj dławnicę, zanurzając suwak w słoiku z hałasem samochodowym.

Utrwalacz przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Alternatywnie napraw gruczoł na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj chusteczkę w 70% etanolu przez 15 minut.

Następnie nawadniaj go stopniowo w wodzie, usuwając połowę roztworu etanolu ze słoika i zastępując go wodą podwójnie destylowaną. Inkubować przez pięć minut. Powtórz trzy razy, płucz i destylowaną wodę przez pięć minut.

Następnie następnego dnia zabarwić gruczoł w ałunach węglowych w temperaturze pokojowej w temperaturze pokojowej, usunąć plamę z ałunu węglowego do ponownego użycia i stopniowo odwadniać zabarwioną tkankę za pomocą seryjnych kąpieli etanolowych przez pięć minut każda. Następnie oczyść tkankę z ksylenu przez noc po oczyszczeniu, zanurz gruczoł sutkowy w salicylanie metylu, trzymając salicylan metylu w dygestorium, aż zdjęcia będą gotowe do wykonania. Rozwój gruczołu sutkowego można określić ilościowo, licząc liczbę rozgałęzień lub bocznych odgałęzień wzdłuż części przewodów, można ocenić długość przewodów pierwotnych lub stosunek powierzchni nabłonka do tkanki tłuszczowej.

Drugi esej używany do oceny rozwoju i funkcji gruczołu sutkowego polega na wystawieniu gruczołu na działanie oksytocyny i ocenie wyrzutu mleka do przewodów nabłonkowych. Aby wykonać ten test, świeżo karmione młode powinny zostać odsadzone od matki, a matka powinna być trzymana w izolacji przez jedną godzinę. Następnie złóż w ofierze matkę i odsłoń gruczoły sutkowe zgodnie z opisem dla rozwarstwienia gruczołu sutkowego.

Zostaw je jednak w zwierzęciu. Rozpocznij test za pomocą pipety transferowej, aby równomiernie upuścić od trzech do pięciu mililitrów roztworu PBS lub oksytocyny bezpośrednio na interesujący nas gruczoł sutkowy. Do tej procedury zaleca się użycie gruczołów piersiowych z jednej strony jako kontroli, a z drugiej strony do zbadania wyrzutu mleka.

Inkubować gruczoły przez jedną minutę i usunąć roztwory, ostrożnie odsysając je pipetą transferową, monitorować wprowadzanie mleka do przewodów, nagrywać na taśmie wideo lub wykonywać zdjęcia przed i po ekspozycji na PBS lub oksytocynę. Oto przykłady pamięci myszy. W otworze gruczołu znajdują się przewody nabłonkowe oznaczone strzałkami, a węzeł chłonny oznaczony grotem strzały można łatwo zaobserwować w ładnie rozłożonej całej gruczole sutkowym.

Słabo rozłożysty gruczoł sutkowy może oderwać się od zjeżdżalni i zapaść się, czyniąc ją bezużyteczną. Nieprawidłowo wycięty gruczoł sutkowy może mieć brakujące części lub pozostałe w nim fragmenty mięśni lub skóry. Wyrzut mleka wywołany oksytocyną można zaobserwować u kaczek z nabłonkiem po ekspozycji na oksytocynę.

Jeżeli jednak kaczki są już napełnione mlekiem na początku badania z powodu nieodpowiednio długiego okresu utajenia po ostatnim ssaniu młodych, trudno jest zaobserwować dalszą akumulację mleka u kaczek po ekspozycji na oksytocynę. Alternatywnie, krótki okres utajenia po ssaniu młodych zapobiegnie gromadzeniu się wystarczającej ilości mleka w pęcherzykach płucnych, aby można było prawidłowo zaobserwować w przewodach po ekspozycji na oksytocynę Po rozwarstwieniu gruczołów sutkowych. Zamiast montować otwory lub oceniać wyrzut mleka wywołany oksytocyną, gruczoły sutkowe można zamrozić, poddać kriosekcji i znakować immunologicznie pod kątem dowolnej liczby białek rezydujących w gruczołach sutkowych.

Alternatywnie gruczoły można położyć i przygotować do western blot. Łącznie te dwie oceny pozwoliły na rozwiązanie podstawowych pytań związanych z rozwojem, różnicowaniem i funkcją gruczołów w dowolnej liczbie modeli myszy, które zostały zaprojektowane tak, aby nie zawierały kluczowych genów lub mutacji genów trzpienia.