Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena rozwoju gruczołów mlekowych u myszy typu dzikiego oraz mutantów. Cel ten osiąga się poprzez najpierw przeprowadzenie sekcji myszy w celu odsłonięcia gruczołów mlekowych. Następnie gruczoły mlekowe są odpowiednio pobierane i rozkładane na szkiełkach przedmiotowych, calm lum.

Następnie przeprowadza się barwienie w celu analizy stopnia rozwoju nabłonka. Na koniec analizuje się skurcze komórek mioepitelialnych pod wpływem ekspozycji na oksytocynę, INEA J. Ostatecznie uzyskane wyniki wykażą, czy przewody gruczołów mlekowych oraz pęcherzyki utworzyły się prawidłowo i czy można wywołać skurcz nabłonka mioepitelialnego w celu wydalenia mleka po podaniu oksytocyny. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju i różnicowania gruczołów mlekowych, takie jak wpływ mutacji genowych lub nokautu na morfologię i funkcję gruczołu mlekowego.

Wizualna prezentacja tej metody zapewnia prawidłową sekcję gruczołu piersiowego, ponieważ zarówno montaż w otworach, jak i test oparty na oksytocynie wymagają starannie przygotowanych gruczołów piersiowych. Nieprawidłowa sekcja gruczołu może skutkować brakiem niektórych przewodów nabłonkowych lub obecnością tkanek obcych, takich jak skóra lub tkanka mięśniowa. Przynajmniej jeden dzień przed sekcją przygotuj roztwór ałunu CalMin, rozpuszczając 1 g CalMin oraz 2,5 g siarczanu glinowo-potasowego w 500 ml wody destylowanej.

Gotuj roztwór przez 20 minut w kolbie o pojemności jednego litra, a następnie uzupełnij końcową objętość wodą do 500 mililitrów. Przefiltruj roztwór przez papier Watmana i dodaj kilka ziaren tiolu jako konserwant. Następnie schłodź roztwór w lodówce po przeprowadzeniu barwienia.

Roztwór ałunu węglanu można przelać z powrotem do butelki z zapasem i używać wielokrotnie przez kilka tygodni. Przygotuj świeży roztwór, gdy kolor stanie się blady. Aby rozpocząć sekcję gruczołu pamięci, uśmierć mysz poprzez inhalację dwutlenkiem węgla.

Jeśli to możliwe, unikaj zwichnięcia kręgów szyjnych, ponieważ może ono uszkodzić główne naczynia krwionośne w szyi i doprowadzić do nagromadzenia krwi wokół gruczołu piersiowego. Po pierwsze, utrudnia to sekcję na owiniętej folią piance polistyrenowej. Połóż mysz na plecach i rozstaw wszystkie cztery kończyny.

Mocno przypnij wszystkie cztery kończyny, używając igieł o rozmiarze od 16 do 20 gauge. Obficie spryskaj mysz 70% etanolem przy użyciu pęsety. Odciągnij skórę brzucha w linii środkowej i wykonaj niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami, zaczynając od miejsca nacięcia.

Naciąć skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając przebicia jam brzusznej lub klatki piersiowej. Naciąć skórę na przednich kończynach do linii cięcia środkowego, tworząc kształt litery Y. W ten sam sposób naciąć skórę na kończynach tylnych.

Używając kleszczyków hemostatycznych, w razie potrzeby delikatnie odsunąć skórę brzucha i klatki piersiowej myszy na bok. Delikatnie rozciąć tkankę łączną.

Przymocuj skórę do styropianu, używając igieł o rozmiarze od 16 do 20 G, odsłaniając gruczoły mlekowe przymocowane do wewnętrznej strony skóry. Wypreparowuj po jednym gruczole na raz, używając pęsety. Delikatnie unieś wybrany gruczoł mlekowy i przetnij tkankę między gruczołem a skórą za pomocą małych, ostrych nożyczek, kierując się od zewnątrz w stronę kręgosłupa zwierzęcia.

Należy naciąć tkankę ostrożnie, aby na gruczole nie pozostały fragmenty skóry lub mięśni. Zgodnie z tym protokołem można usunąć wszystkie gruczoły mlekowe, jednak do przygotowania preparatów całych (whole mounting) najlepiej nadają się czwarte brzuszne gruczoły mlekowe. Po wycięciu gruczołu mlekowego z myszy, należy rozłożyć go bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym.

Należy spróbować rozprostować tkankę tak bardzo, jak to możliwe. Dzięki zachowaniu oryginalnego kształtu in situ, gruczoł będzie dobrze przylegać do szkiełka. Po odpowiednim rozciągnięciu w dygestorium, należy utrwalić gruczoł, zanurzając szkiełko w słoiku z car noise.

Fiksacja przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Alternatywnie można fiksować gruczoł przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyć tkankę w 70% etanolu przez 15 minut.

Następnie stopniowo rehydratyzuj próbkę w wodzie, usuwając połowę roztworu etanolu ze słoika i zastępując ją wodą dwukrotnie destylowaną. Inkubuj przez pięć minut. Powtórz czynność trzykrotnie, a następnie płucz wodą destylowaną przez pięć minut.

Następnie barwić gruczoł w roztworze glinu z węglem przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia usunąć barwnik glinu z węglem w celu jego ponownego wykorzystania i stopniowo odwodnić zabarwoną tkankę w serii kąpieli etanolowych, po pięć minut w każdej. Następnie przejrzeć tkankę w ksylenie przez noc; po przejaśnieniu zanurzyć gruczoł mlekowy w salicylanie metylu, przechowując salicylan metylu w dygestorium aż do momentu wykonania zdjęć. Rozwój gruczołu mlekowego można określić ilościowo poprzez zliczenie liczby rozgałęzień lub odgałęzień bocznych wzdłuż fragmentów przewodów; można również ocenić długość przewodów głównych lub stosunek powierzchni tkanki nabłonkowej do tkanki tłuszczowej.

Drugi test służący do oceny rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego polega na poddaniu gruczołu działaniu oksytocyny i ocenie wydzielania mleka do przewodów nabłonkowych. Aby przeprowadzić ten test, należy odsadzić niedawno karmione szczenięta od matki, a matkę pozostawić w izolacji przez jedną godzinę. Następnie należy uśmiercić matkę i odsłonić gruczoły mlekowe zgodnie z opisem przeprowadzenia sekcji gruczołu mlekowego.

Należy jednak pozostawić je w organizmie zwierzęcia. Rozpocznij analizę, używając pipety transferowej do równomiernego naniesienia od trzech do pięciu mililitrów PBS lub roztworu oksytocyny bezpośrednio na badaną gruczoł mlekowy. W tej procedurze zaleca się wykorzystanie gruczołów piersiowych, przyjmując jedną stronę jako kontrolną, a drugą do testowania wydzielania mleka.

Inkubuj gruczoły przez jedną minutę, a następnie usuń roztwory, ostrożnie odsysając je pipetą transferową; monitoruj napływ mleka do przewodów za pomocą nagrania wideo lub wykonując zdjęcia przed i po ekspozycji na PBS lub oksytocynę. Oto przykłady pamięci myszy. W dobrze rozłożonym preparacie całej gruczołu mlekowego łatwo zaobserwować nabłonek przewodów wskazany strzałkami oraz węzeł chłonny zaznaczony grotem strzałki.

Niewłaściwie rozpostarta gruczoł mlekowy może oddzielić się od szkiełka i zapaść, co sprawi, że stanie się bezużyteczny. Niewłaściwie wycięty gruczoł mlekowy może mieć brakujące fragmenty lub pozostałe fragmenty mięśni bądź skóry. Wypływ mleka indukowany oksytocyną może być obserwowany w nabłonku kaczek po podaniu oksytocyny.

Jednakże, jeśli w początkowej fazie badania przewody mleczne są już wypełnione mlekiem z powodu niewłaściwie długiego okresu latencji po ostatnim ssaniu przez młode, dalsza akumulacja mleka w przewodach po podaniu oksytocyny jest trudna do zaobserwowania. Z kolei zbyt krótki okres latencji po ssaniu przez młode zapobiegnie nagromadzeniu w pęcherzykach wystarczającej ilości mleka, aby można ją było prawidłowo zaobserwować w przewodach po podaniu oksytocyny w trakcie sekcji gruczołów mlekowych. Zamiast montowania całych preparatów lub oceny wyrzutu mleka indukowanego oksytocyną, gruczoły mlekowe można zamrozić, poddać kriosekcjonowaniu i oznakować immunochemicznie w celu wykrycia dowolnej liczby białek obecnych w gruczołach mlekowych.

Alternatywnie gruczoły można poddać lizie i przygotować do western blottingu. Połączenie tych dwóch metod analitycznych pozwoliło na udzielenie odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju, różnicowania i funkcji gruczołów w wielu modelach mysich, w których wyeliminowano kluczowe geny lub wprowadzono mutacje genów.