Name: Ocena rozwoju i funkcji gruczołu sutkowego w modelach mysich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę oceny rozwoju i funkcji gruczołu sutkowego u myszy dzikiego typu i mutantów. Technika obejmuje preparowanie, barwienie oraz analizę skurczów miśniowych pod wpływem oksytocyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były finansowane z grantów CIHR i CBCRA przyznanych DWL. IP otrzymał finansowanie w ramach stypendiów CIHR-STP, FRSQ i CIHR. MKGS był finansowany ze stypendiów OGS i CIHR-STP. Autorzy dziękują Kevinowi Barrowi za pomoc w hodowli myszy.

1. Disekcja gruczołu mlekowego
<ol>
<li>Uśmierć mysz poprzez inhalację CO2. Jeśli to możliwe, unikaj dyslokacji szyi, ponieważ może ona uszkodzić główne naczynia krwionośne w szyi i doprowadzić do gromadzenia się krwi wokół gruczołów mlekowych, co utrudni sekcję.</li>
<li>Na styropianie owiniętym folią ułóż mysz na grzbiecie i rozszerz cztery kończyny. Mocno przypnij wszystkie cztery kończyny, używając igieł o rozmiarze od 16 do 20 G (Rysunek 1A).</li>
<li>Obficie spryskaj mysz 70% etanolem.</li>
<li>Za pomocą pęsety odciągnij skórę brzucha wzdłuż linii środkowej i wykonaj niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami.</li>
<li>Rozpocznij od nacięcia i rozetnij skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając przebicia jam brzusznej lub klatki piersiowej (Rysunek 1B).</li>
<li>Rodetnij skórę na przednich kończynach do nacięcia w linii środkowej, tworząc kształt litery „Y” (Rysunek 1B). W ten sam sposób rozetnij skórę na tylnych kończynach (Rysunek 1B).</li>
<li>Za pomocą kleszczyków hemostatycznych delikatnie odsuń skórę brzucha i klatki piersiowej na bok myszy. W razie potrzeby delikatnie przetnij tkankę łączną.</li>
<li>Przymocuj skórę do styropianu za pomocą igieł o rozmiarze od 16 do 20 G, odsłaniając gruczoły mleczne przyczepione do wewnętrznej strony skóry. Wykonaj tę czynność dla jednej strony, a następnie dla drugiej (Rysunek 1C).</li>
<li>Za pomocą pęsety delikatnie unieś interesujący Cię gruczoł mleczny i rozetnij tkankę między gruczołem a skórą małymi ostrymi nożyczkami, zaczynając od zewnątrz w stronę kręgosłupa zwierzęcia. Pamiętaj, aby ciąć ostrożnie, tak aby na gruczole nie pozostały fragmenty skóry ani mięśni. Wszystkie gruczoły mleczne (Rysunek 1) można usunąć zgodnie z tym protokołem, jednak gruczoły brzuszne (#4) są najlepsze do preparatów całych (whole mount). Gruczoły 2nd i 3rd posiadają niektóre mięśnie przeplatające i choć mogą być użyte do preparatów całych oraz histologii, mogą nie być odpowiednie do wszystkich rodzajów analiz.</li>
</ol>
2. Preparat całego organizmu
<ol>
<li>Przynajmniej jeden dzień przed sekcją przygotować roztwór karminu z ałunem, rozpuszczając 1g karminu i 2,5g siarczanu glino-potasowego w 500 ml wody destylowanej, a następnie gotując przez 20 minut w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 litra. Uzupełnić końcową objętość do 500 ml wodą. Przefiltrować przez papier Whatmana i dodać niewielką ilość tymolu (kilka ziaren) jako konserwant. Przechowywać w lodówce. Po barwieniu roztwór karminu z ałunem można przelać z powrotem do butelki z zapasem i używać wielokrotnie przez kilka tygodni. Przygotować świeży roztwór, gdy kolor stanie się blady. </li>
<li>Po wycięciu gruczołu mlekowego z myszy (krok 1), rozłożyć go bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym. Należy starać się go maksymalnie spłaszczyć, zachowując oryginalny kształt in situ. Prawidłowo rozciągnięty gruczoł będzie dobrze przylegać do szkiełka.</li>
<li>Utrwalić gruczoł, zanurzając go wraz ze szkiełkiem w utrwalaczu Carnoya (100% EtOH, chloroform, lodowaty kwas octowy; 6:3:1) na 4 godziny w słoiku w dygestorium w temperaturze pokojowej. Należy zauważyć, że inni stosowali czas 2 godziny, co wydaje się być wystarczające. Alternatywnie, gruczoły można utrwalać przez noc w temperaturze 4°C.</li>
<li>Przemyć w 70% etanolu przez 15 min. Następnie stopniowo rehydratyzować w wodzie, usuwając połowę roztworu etanolu ze słoika i zastępując ją ddH2O. Inkubować przez 5 min. Powtórzyć 3 razy. Alternatywnie można zastosować kąpiele w etanolu o stężeniach 70%, 35%, 15% oraz w wodzie przez 5 minut każda.</li>
<li>Płukać w wodzie destylowanej przez 5 minut. </li>
<li>Barwić karminem z ałunem przez noc w temperaturze pokojowej. Należy zaznaczyć, że barwienie może trwać dłużej w zależności od grubości gruczołu. </li>
<li>Usunąć barwnik karmin z ałunem do ponownego wykorzystania i stopniowo odwodnić zabarwoną tkankę w seryjnych kąpielach etanolowych (50%, 70%, 95%, 100%) po 5 min każda, a następnie przejrzyścić w ksylenie lub w nietoksycznej alternatywie, takiej jak Histo-clear, przez noc. Zarówno odwadnianie, jak i przejrzyszczanie mogą wymagać dłuższej inkubacji w przypadku grubszych próbek.</li>
<li>Zanurzyć gruczoł mlekowy w salicylanie metylu. Gruczoły mlekowe można przechowywać w salicylanie metylu w dygestorium do czasu wykonania zdjęć.</li>
<li>Zdjęcia można wykonać w dygestorium za pomocą zwykłego aparatu cyfrowego umieszczonego na statywie (używając funkcji „makro”, jeśli jest dostępna), kładąc szkiełka na stole świetlnym. Do większych powiększeń należy użyć mikroskopu stereotypowego. Alternatywnie, gruczoły mlekowe można zamknąć w medium, takim jak Permount (po kroku 2.7), co umożliwia wykonywanie zdjęć poza dygestorium chemicznym na dowolnej platformie obrazującej, pod warunkiem, że preparaty są wystarczająco cienkie.</li>
<li>W celu ilościowej oceny rozwoju gruczołu mlekowego z wykorzystaniem preparatów całych (whole mount), można ocenić takie parametry jak liczba rozgałęzień (lub odgałęzień bocznych) wzdłuż fragmentów przewodów, długość przewodów głównych lub stosunek powierzchni tkanki nabłonkowej do tłuszczowej. Na koniec, po dokumentacji fotograficznej, cały preparat gruczołu mlekowego można zalać parafiną w celu wykonania skrawków i konwencjonalnego barwienia histologicznego.</li>
</ol>
3. Wypływ mleka indukowany oksytocyną
<ol>
<li>Oddziel szczenięta od matki bezpośrednio po ich nakarmieniu. Odczekaj 1 godzinę przed przeprowadzeniem testu.</li>
<li>Uśmierć matkę i odsłoń gruczoły mlekowe zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 1.1 do 1.8), nie usuwając ich z organizmu zwierzęcia.</li>
<li>Rozpocznij test, nakraplając równomiernie PBS lub roztwór oksytocyny bezpośrednio na badany gruczoł mlekowy za pomocą pipety transferowej. Można zastosować szerokie spektrum dawek; zazwyczaj stosuje się ˜8 pg/ml (dawka fizjologiczna). Jednakże, w celu upewnienia się co do braku reakcji w genetycznie zmodyfikowanych modelach mysich, można zastosować wysokie dawki niefizjologiczne (do 1 mg/ml). W tej procedurze zaleca się stosowanie gruczołów piersiowych (#2-3), wykorzystując jedną stronę jako kontrolę (ekspozycja na PBS), a drugą stronę do testowania wydzielania mleka (ekspozycja na oksytocynę).</li>
<li>Inkubuj przez 1 minutę, a następnie usuń roztwór, ostrożnie odsysając go pipetą transferową. Napływ mleka do przewodów można monitorować za pomocą rejestracji wideo lub wykonując zdjęcia przed i po ekspozycji na PBS lub oksytocynę.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki: 
W prawidłowo przygotowanym preparacie całego narządu gruczoł mlekowy jest dobrze rozpostarty, a przewody nabłonkowe są łatwo widoczne (Rycina 2A). Jeśli gruczoł nie jest odpowiednio rozpostarty, po umieszczeniu w roztworze fixatywnym może częściowo lub całkowicie oddzielić się od szkiełka. Wówczas gruczoł stwardnieje i stanie się niezdatny do użycia (Rycina 2B). Podobnie, jeśli preparat nie został odpowiednio wypreparowany, część nabłonka może być nieobecna (Rycina 2C) lub pozostałości skóry bądź mięśni brzusznych mogą utrudniać analizę gruczołu (Rycina 2D).
W przypadku badania oksytocyny ważne jest, aby za każdym razem oddzielać ssące młode od matki na taki sam czas. W ten sposób zapewnią Państwo, że przed ekspozycją na oksytocynę w przewodach nie będzie znajdować się mleko lub jego niewielkie ilości, a jednocześnie w pęcherzykach mlecznych zgromadzi się wystarczająca ilość mleka, która będzie mogła zostać wpompowana do przewodów pod wpływem skurczów komórek mojepithelialnych (Rysunek 3A). Jeśli młode zostaną usunięte zbyt wcześnie, mleko może gromadzić się w pęcherzykach i przewodach, co utrudni monitorowanie efektu działania oksytocyny (Rysunek 3B). Z kolei jeśli eksperyment zostanie przeprowadzony zbyt szybko po usunięciu młodych, mleko nie zdąży zgromadzić się w pęcherzykach, a wywołane oksytocyną skurcze komórek mojepithelialnych nie spowodują uwalniania do przewodów ilości mleka wystarczającej do zaobserwowania (Rysunek 3C).
<img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig1.jpg" alt="Schemat anatomii myszy; zaznaczone miejsca podawania leków eksperymentalnych w badaniach farmakologicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Disekcja gruczołów mlekowych myszy. Przymocuj mysz do podłoża na grzbiecie, przypinając cztery kończyny (A). Najpierw przetnij skórę od brzucha w kierunku szyi. Następnie wykonaj nacięcia prostopadłe od środka brzucha do każdej kończyny, zgodnie z linią przerywaną (B). Delikatnie odchyl skórę na boki i przypnij ją, odsłaniając gruczoły mlekowe (C).
<img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig2.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii histologicznej przekrojów tkanki gruczołowej z różnicami w strukturze i obecności mięśni." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Preparat całego gruczołu mlekowego myszy. Przewody nabłonkowe (strzałki) oraz węzeł chłonny (grot strzałki) są wyraźnie widoczne w dobrze rozłożonym preparacie całego gruczołu mlekowego nr 4 (A). Słabo rozłożony gruczoł mlekowy może odkleić się od szkiełka i zapaść, co czyni go niezdatnym do użytku (B). Nieprawidłowo wycięty gruczoł mlekowy może mieć brakujące części (C) lub pozostałości mięśni lub skóry (D). Należy zauważyć, że 2gi i 3ci gruczoły posiadają przeplatające się mięśnie, ale nadal mogą być wykorzystane do preparatów całych lub badań histologicznych.
<img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig3.jpg" alt="Wpływ oksytocyny na unaczynienie tkanki; wyniki porównawcze; obraz mikroskopowy; badanie eksperymentalne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wypływ mleka indukowany oksytocyną można zaobserwować w przewodach nabłonkowych (strzałki) po podaniu oksytocyny (A). Jednakże, jeśli na początku badania przewody są już wypełnione mlekiem (strzałki) z powodu zbyt długiego okresu latencji po ostatnim ssaniu przez szczenięta, dalsza akumulacja mleka w przewodach (strzałki) po podaniu oksytocyny jest trudna do zaobserwowania (B). Z kolei krótki okres latencji po ssaniu przez szczenięta nie pozwoli na wystarczającą akumulację mleka w pęcherzykach, aby można go było prawidłowo zaobserwować w przewodach (strzałki) po podaniu oksytocyny (C). Obrazy wykonano przed i po podaniu oksytocyny przy użyciu aparatu cyfrowego (Cybershot, Sony).
<img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig4.jpg" alt="Schemat testu oksytocyny; preparat całego organizmu, traktowanie PBS/oksytocyną, proces barwienia karminem aluminiowym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Schematyczne przedstawienie preparowania całych organizmów oraz testów z zastosowaniem oksytocyny.

<ol><li>Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+the+lactating+breast%3A+the+latest+anatomy+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Midwifery+Womens+Health%22%5BJournal%5D)">Inside the lactating breast: the latest anatomy research.</a> J Midwifery Womens Health. 52, 556-556 (2007).</li>
<li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+stages+in+mammary+gland+development%3A+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8, 201-201 (2006).</li>
<li>Silberstein, G. B., Flanders, K. C., Roberts, A. B., Daniel, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammary+morphogenesis%3A+evidence+for+extracellular+matrix-mediated+inhibition+of+ductal+budding+by+transforming+growth+factor-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammary morphogenesis: evidence for extracellular matrix-mediated inhibition of ductal budding by transforming growth factor-beta 1.</a> Dev Biol. 152, 354-354 (1992).</li>
<li>Daniel, C. W., Robinson, S., Silberstein, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TGF-beta+in+patterning+and+growth+of+the+mammary+ductal+tree%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The role of TGF-beta in patterning and growth of the mammary ductal tree.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1, 331-331 (1996).</li>
<li>Neville, M. C., Daniel, C. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeville%2C+MC+%22The+Mammary+gland+%3A+development%2C+regulation%2C+and+function%22">The Mammary gland : development, regulation, and function</a>. , Plenum Press. New York. (1987).</li>
<li>Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alveolar+switch%3A+coordinating+the+proliferative+cues+and+cell+fate+decisions+that+drive+the+formation+of+lobuloalveoli+from+ductal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium.</a> Breast Cancer Res. 8, 207-207 (2006).</li>
<li>Anderson, S. M., Rudolph, M. C., McManaman, J. L., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+stages+in+mammary+gland+development.+Secretory+activation+in+the+mammary+gland%3A+it%27s+not+just+about+milk+protein+synthesis%21%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Key stages in mammary gland development. Secretory activation in the mammary gland: it's not just about milk protein synthesis!</a> Breast Cancer Res. 9, 204-204 (2007).</li>
<li>Reversi, A., Cassoni, P., Chini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+receptor+signaling+in+myoepithelial+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Oxytocin receptor signaling in myoepithelial and cancer cells.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10, 221-221 (2005).</li>
<li>Haslam, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+interactions+and+normal+mammary+gland+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell to cell interactions and normal mammary gland function.</a> J Dairy Sci. 71, 2843-2843 (1988).</li>
<li>Plante, I., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+levels+of+connexin43+result+in+impaired+development+of+the+mammary+gland+in+a+mouse+model+of+oculodentodigital+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Decreased levels of connexin43 result in impaired development of the mammary gland in a mouse model of oculodentodigital dysplasia.</a> Dev Biol. 318, 312-312 (2008).</li>
<li>Talhouk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterocellular+interaction+enhances+recruitment+of+alpha+and+beta-catenins+and+ZO-2+into+functional+gap-junction+complexes+and+induces+gap+junction-dependant+differentiation+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Heterocellular interaction enhances recruitment of alpha and beta-catenins and ZO-2 into functional gap-junction complexes and induces gap junction-dependant differentiation of mammary epithelial cells.</a> Exp Cell Res. 314, 3275-3275 (2008).</li>
<li>Palmer, C. A., Neville, M. C., Anderson, S. M., McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+lactation+defects+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Analysis of lactation defects in transgenic mice.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 269-269 (2006).</li>
<li>Howlin, J., McBryan, J., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pubertal+mammary+gland+development%3A+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Pubertal mammary gland development: insights from mouse models.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 283-283 (2006).</li>
<li>You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mammary+gland+development+in+prepubertal+male+rats+exposed+to+genistein+and+methoxychlor%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of mammary gland development in prepubertal male rats exposed to genistein and methoxychlor.</a> Toxicol Sci. 66, 216-216 (2002).</li>
<li>Grill, C. J., Cohick, W. S., Sherman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postpubertal+development+of+the+rat+mammary+gland+is+preserved+during+iron+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Postpubertal development of the rat mammary gland is preserved during iron deficiency.</a> J Nutr. 131, 1444-1444 (2001).</li>
<li>Hennighausen, L., Robinson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+globally%2C+act+locally%3A+the+making+of+a+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Think globally, act locally: the making of a mouse mammary gland.</a> Genes Dev. 12, 449-449 (1998).</li>
<li>Aupperlee, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+the+mechanisms+of+progesterone+regulation+of+murine+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in the mechanisms of progesterone regulation of murine mammary gland development.</a> Endocrinology. 150, 1485-1485 (2009).</li>
<li>Montero Girard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+estrogen+receptor-alpha+and+progesterone+receptor+A+expression+with+hormonal+mammary+carcinogenesis%3A+role+of+the+host+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Association of estrogen receptor-alpha and progesterone receptor A expression with hormonal mammary carcinogenesis: role of the host microenvironment.</a> Breast Cancer Res. 9, R22-R22 (2007).</li>
<li>Moore, D. M., Vogl, A. W., Baimbridge, K., Emerman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+calcium+on+oxytocin-induced+contraction+of+mammary+gland+myoepithelium+as+visualized+by+NBD-phallacidin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of calcium on oxytocin-induced contraction of mammary gland myoepithelium as visualized by NBD-phallacidin.</a> J Cell Sci. 88, 563-563 (1987).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Rozwój i funkcja gruczołu mlekowego są ściśle skoordynowane. Myszy mutanty mogą posiadać mutacje genowe, które upośledzają rozwój i funkcję gruczołu mlekowego, co podkreśla konieczność oceny architektury gruczołu13,12. Przygotowanie preparatów całych gruczołów (whole mounting), zgodnie z opisem w niniejszym artykule, można przeprowadzać na wszystkich etapach rozwoju gruczołu mlekowego. Zazwyczaj rozwój nabłonka ocenia się na początku okresu dojrzewania (˜4 tydzień życia), w połowie okresu dojrzewania (˜6 tydzi...

<table><tbody><tr><td>Karmin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan glinowo-potasowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6435</td><td></td></tr><tr><td>Tymol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>Salicylan metylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6752</td><td></td></tr><tr><td>Oksytocyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Ludzka gruczoł mlekowy składa się z 15-20 płatów, które wydzielają mleko do rozgałęzionego systemu przewodowego otwierającego się w obrębie brodawki. Płaty te składają się z wielu końcowych jednostek przewodowo-płacowych zbudowanych z pęcherzyków wydzielniczych i zbiegających się przewodów1. U myszy podczas ciąży obserwuje się podobną architekturę, w której przewody i pęcherzyki są rozmieszczone w obrębie zrębu tkanki łącznej. Nabłonek gruczołu mlekowego myszy stanowi drzewiasty system przewodów złożony z dwóch warstw komórek: wewnętrznej warstwy komórek luminalnych otoczonych zewnętrzną warstwą komórek mioepitelialnych, ograniczonych błoną podstawną2. W chwili narodzin obecne jest jedynie rudymentarne drzewo przewodowe, składające się z przewodu głównego i 15-20 odgałęzień. Wydłużanie i amplifikacja odgałęzień rozpoczynają się na początku okresu dojrzewania, około 4 tygodnia życia, pod wpływem hormonów3,4,5. W 10 tygodniu większość zrębu zostaje zainfekowana przez złożony system przewodów, które będą przechodzić cykle rozgałęziania i regresji w każdym cyklu rujowym aż do wystąpienia ciąży2. Wraz z początkiem ciąży rozpoczyna się druga faza rozwoju, polegająca na proliferacji i różnicowaniu nabłonka w celu utworzenia przypominających winogrona struktur wydzielniczych mleka, zwanych pęcherzykami6,7. Po porodzie i w trakcie laktacji mleko jest produkowane przez luminalne komórki wydzielnicze i gromadzone w świetle pęcherzyków. Wydzielanie oksytocyny, stymulowane odruchem nerwowym wywołanym ssaniem młodych, indukuje zsynchronizowane skurcze komórek mioepitelialnych wokół pęcherzyków i wzdłuż przewodów, co umożliwia transport mleka przez przewody do brodawki, gdzie staje się ono dostępne dla młodych 8. Rozwój, różnicowanie i funkcja gruczołu mlekowego są ściśle zorganizowane i wymagają nie tylko interakcji między zrębem a nabłonkiem, ale także między komórkami mioepitelialnymi a luminalnymi w obrębie nabłonka9,10,11. W związku z tym mutacje w wielu genach zaangażowanych w te interakcje mogą upośledzać albo wydłużanie przewodów podczas dojrzewania, albo tworzenie pęcherzyków we wczesnej ciąży, różnicowanie w późnej ciąży oraz aktywację wydzielniczą prowadzącą do laktacji12,13. W niniejszym artykule opisujemy, jak przeprowadzić sekcję gruczołów mlekowych myszy i ocenić ich rozwój przy użyciu preparatów całych organów (whole mounts). Demonstrujemy również, jak ocenić skurcze mioepitelialne i wydzielanie mleka za pomocą funkcjonalnego testu ex-vivo opartego na oksytocynie. W ten sposób, wykonując te dwie techniki u myszy mutantów i kontrolnych myszy typu dzikiego, można określić wpływ mutacji genowej na rozwój i funkcję gruczołu mlekowego in situ.

Ta metoda opisuje sposób preparowania oraz oceny rozwoju i funkcji gruczołów mlekowych u myszy. Wycięte gruczoły mlekowe oceniane są pod kątem stopnia rozwoju za pomocą metody całego preparatu (whole mount), natomiast wydzielanie mleka jest oceniane przy użyciu testu skurczu komórek mioepitelialnych indukowanego oksytocyną.

Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Ludzka gruczoł piersiowy składa się z 15–20 płatów, które wydzielają mleko do rozgałęzionego systemu przewodów ujściowych w obrębie sutka. Płaty te z kolei...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena rozwoju gruczołów mlekowych u myszy typu dzikiego oraz mutantów. Cel ten osiąga się poprzez najpierw przeprowadzenie sekcji myszy w celu odsłonięcia gruczołów mlekowych. Następnie gruczoły mlekowe są odpowiednio pobierane i rozkładane na szkiełkach przedmiotowych, calm lum.Następnie przeprowadza się barwienie w celu analizy stopnia rozwoju nabłonka. Na koniec analizuje się skurcze komórek mioepitelialnych pod wpływem ekspozycji na oksytocynę, INEA J. Ostatecznie uzyskane wyniki wykażą, czy przewody gruczołów mlekowych oraz pęcherzyki utworzyły się prawidłowo i czy można wywołać skurcz nabłonka mioepitelialnego w celu wydalenia mleka po podaniu oksytocyny. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju i różnicowania gruczołów mlekowych, takie jak wpływ mutacji genowych lub nokautu na morfologię i funkcję gruczołu mlekowego.Wizualna prezentacja tej metody zapewnia prawidłową sekcję gruczołu piersiowego, ponieważ zarówno montaż w otworach, jak i test oparty na oksytocynie wymagają starannie przygotowanych gruczołów piersiowych. Nieprawidłowa sekcja gruczołu może skutkować brakiem niektórych przewodów nabłonkowych lub obecnością tkanek obcych, takich jak skóra lub tkanka mięśniowa. Przynajmniej jeden dzień przed sekcją przygotuj roztwór ałunu CalMin, rozpuszczając 1 g CalMin oraz 2,5 g siarczanu glinowo-potasowego w 500 ml wody destylowanej.Gotuj roztwór przez 20 minut w kolbie o pojemności jednego litra, a następnie uzupełnij końcową objętość wodą do 500 mililitrów. Przefiltruj roztwór przez papier Watmana i dodaj kilka ziaren tiolu jako konserwant. Następnie schłodź roztwór w lodówce po przeprowadzeniu barwienia.Roztwór ałunu węglanu można przelać z powrotem do butelki z zapasem i używać wielokrotnie przez kilka tygodni. Przygotuj świeży roztwór, gdy kolor stanie się blady. Aby rozpocząć sekcję gruczołu pamięci, uśmierć mysz poprzez inhalację dwutlenkiem węgla.Jeśli to możliwe, unikaj zwichnięcia kręgów szyjnych, ponieważ może ono uszkodzić główne naczynia krwionośne w szyi i doprowadzić do nagromadzenia krwi wokół gruczołu piersiowego. Po pierwsze, utrudnia to sekcję na owiniętej folią piance polistyrenowej. Połóż mysz na plecach i rozstaw wszystkie cztery kończyny.Mocno przypnij wszystkie cztery kończyny, używając igieł o rozmiarze od 16 do 20 gauge. Obficie spryskaj mysz 70% etanolem przy użyciu pęsety. Odciągnij skórę brzucha w linii środkowej i wykonaj niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami, zaczynając od miejsca nacięcia.Naciąć skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając przebicia jam brzusznej lub klatki piersiowej. Naciąć skórę na przednich kończynach do linii cięcia środkowego, tworząc kształt litery Y. W ten sam sposób naciąć skórę na kończynach tylnych.Używając kleszczyków hemostatycznych, w razie potrzeby delikatnie odsunąć skórę brzucha i klatki piersiowej myszy na bok. Delikatnie rozciąć tkankę łączną.Przymocuj skórę do styropianu, używając igieł o rozmiarze od 16 do 20 G, odsłaniając gruczoły mlekowe przymocowane do wewnętrznej strony skóry. Wypreparowuj po jednym gruczole na raz, używając pęsety. Delikatnie unieś wybrany gruczoł mlekowy i przetnij tkankę między gruczołem a skórą za pomocą małych, ostrych nożyczek, kierując się od zewnątrz w stronę kręgosłupa zwierzęcia.Należy naciąć tkankę ostrożnie, aby na gruczole nie pozostały fragmenty skóry lub mięśni. Zgodnie z tym protokołem można usunąć wszystkie gruczoły mlekowe, jednak do przygotowania preparatów całych (whole mounting) najlepiej nadają się czwarte brzuszne gruczoły mlekowe. Po wycięciu gruczołu mlekowego z myszy, należy rozłożyć go bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym.Należy spróbować rozprostować tkankę tak bardzo, jak to możliwe. Dzięki zachowaniu oryginalnego kształtu in situ, gruczoł będzie dobrze przylegać do szkiełka. Po odpowiednim rozciągnięciu w dygestorium, należy utrwalić gruczoł, zanurzając szkiełko w słoiku z car noise.Fiksacja przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Alternatywnie można fiksować gruczoł przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyć tkankę w 70% etanolu przez 15 minut.Następnie stopniowo rehydratyzuj próbkę w wodzie, usuwając połowę roztworu etanolu ze słoika i zastępując ją wodą dwukrotnie destylowaną. Inkubuj przez pięć minut. Powtórz czynność trzykrotnie, a następnie płucz wodą destylowaną przez pięć minut.Następnie barwić gruczoł w roztworze glinu z węglem przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia usunąć barwnik glinu z węglem w celu jego ponownego wykorzystania i stopniowo odwodnić zabarwoną tkankę w serii kąpieli etanolowych, po pięć minut w każdej. Następnie przejrzeć tkankę w ksylenie przez noc; po przejaśnieniu zanurzyć gruczoł mlekowy w salicylanie metylu, przechowując salicylan metylu w dygestorium aż do momentu wykonania zdjęć. Rozwój gruczołu mlekowego można określić ilościowo poprzez zliczenie liczby rozgałęzień lub odgałęzień bocznych wzdłuż fragmentów przewodów; można również ocenić długość przewodów głównych lub stosunek powierzchni tkanki nabłonkowej do tkanki tłuszczowej.Drugi test służący do oceny rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego polega na poddaniu gruczołu działaniu oksytocyny i ocenie wydzielania mleka do przewodów nabłonkowych. Aby przeprowadzić ten test, należy odsadzić niedawno karmione szczenięta od matki, a matkę pozostawić w izolacji przez jedną godzinę. Następnie należy uśmiercić matkę i odsłonić gruczoły mlekowe zgodnie z opisem przeprowadzenia sekcji gruczołu mlekowego.Należy jednak pozostawić je w organizmie zwierzęcia. Rozpocznij analizę, używając pipety transferowej do równomiernego naniesienia od trzech do pięciu mililitrów PBS lub roztworu oksytocyny bezpośrednio na badaną gruczoł mlekowy. W tej procedurze zaleca się wykorzystanie gruczołów piersiowych, przyjmując jedną stronę jako kontrolną, a drugą do testowania wydzielania mleka.Inkubuj gruczoły przez jedną minutę, a następnie usuń roztwory, ostrożnie odsysając je pipetą transferową; monitoruj napływ mleka do przewodów za pomocą nagrania wideo lub wykonując zdjęcia przed i po ekspozycji na PBS lub oksytocynę. Oto przykłady pamięci myszy. W dobrze rozłożonym preparacie całej gruczołu mlekowego łatwo zaobserwować nabłonek przewodów wskazany strzałkami oraz węzeł chłonny zaznaczony grotem strzałki.Niewłaściwie rozpostarta gruczoł mlekowy może oddzielić się od szkiełka i zapaść, co sprawi, że stanie się bezużyteczny. Niewłaściwie wycięty gruczoł mlekowy może mieć brakujące fragmenty lub pozostałe fragmenty mięśni bądź skóry. Wypływ mleka indukowany oksytocyną może być obserwowany w nabłonku kaczek po podaniu oksytocyny.Jednakże, jeśli w początkowej fazie badania przewody mleczne są już wypełnione mlekiem z powodu niewłaściwie długiego okresu latencji po ostatnim ssaniu przez młode, dalsza akumulacja mleka w przewodach po podaniu oksytocyny jest trudna do zaobserwowania. Z kolei zbyt krótki okres latencji po ssaniu przez młode zapobiegnie nagromadzeniu w pęcherzykach wystarczającej ilości mleka, aby można ją było prawidłowo zaobserwować w przewodach po podaniu oksytocyny w trakcie sekcji gruczołów mlekowych. Zamiast montowania całych preparatów lub oceny wyrzutu mleka indukowanego oksytocyną, gruczoły mlekowe można zamrozić, poddać kriosekcjonowaniu i oznakować immunochemicznie w celu wykrycia dowolnej liczby białek obecnych w gruczołach mlekowych.Alternatywnie gruczoły można poddać lizie i przygotować do western blottingu. Połączenie tych dwóch metod analitycznych pozwoliło na udzielenie odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju, różnicowania i funkcji gruczołów w wielu modelach mysich, w których wyeliminowano kluczowe geny lub wprowadzono mutacje genów.

evaluation-of-mammary-gland-development-and-function-in-mouse-models

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena rozwoju i funkcji gruczołów sutkowych w modelach mysi

Niniejszy artykuł prezentuje procedurę opracowaną przez DeOme KB et al. (1959) oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al. (2008), służące do oczyszczania 4. podskórnej tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego w pachwinie u myszy w okresie dojrzewania, w celu przygotowania do transplantacji fragmentów gruczołu mlekowego, komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego lub komórek nowotworowych gruczołu mlekowego.

Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Celem tego protokołu jest opisanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzykiwaniu adenowirusa z ekspresją Cre do mysich gruczołów sutkowych. Takie podejście pozwala na manipulowanie zdarzeniami onkogennymi zarówno w zależności od typu komórki, jak i narządu, w sposób kontrolowany czasowo.

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

Ten artykuł opisuje metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka szczura dawcy do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami u zwierząt biorców. Metoda ta może być stosowana do badania wpływu gospodarza i/lub dawcy na rozwój nabłonka sutka i eliminuje potrzebę wstępnego oczyszczania, zwiększając w ten sposób przydatność tej techniki.

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Ten protokół opisuje skalowalne podejście do wewnątrzkanalikowego przesiewania CRISPR, umożliwiające równoległe in vivo badania nad wyłączeniem genów i aktywacją w gruczołach piersiowych myszy.

Równoległe in vivo badanie wyłączania i aktywacji genów w gruczołach piersiowych myszy

Poznaj metodę oceny rozwoju i funkcji gruczołu sutkowego u myszy dzikiego typu i mutantów. Technika obejmuje preparowanie, barwienie oraz analizę skurczów miśniowych pod wpływem oksytocyny.

Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Przeglądaj więcej filmów