Sekwencjonowanie mikroflory bakteryjnej we krwi obwodowej: nasze doświadczenia z pacjentami z zakażeniem HIV

Sekwencjonowanie mikroflory bakteryjnej translokującej do krwi obwodowej. Nasze doświadczenia z pacjentami zakażonymi HIV; nazywam się Junior Marti i pracuję jako adiunkt w Klinice Chorób Zakaźnych i Medycyny Tropikalnej na Uniwersytecie w Mediolanie we Włoszech. Przedstawimy teraz eksperymenty dotyczące wykrywania i sekwencjonowania bakteryjnego DNA z krwi obwodowej pacjentów zakażonych HIV.

Zdrowy przewód pokarmowy jest zasiedlony przez szeroką różnorodność drobnoustrojów komensalnych, które wpływają na rozwój humoralnego i komórkowego układu odpornościowego. Mikrobiota jest chroniona przed układem odpornościowym przez silną barierę śluzową; jednak w wyniku kilku stanów klinicznych, takich jak infekcje, leczenie antybiotykami, powikłania pooperacyjne, a także u pacjentów z nowotworami, zapaleniem trzustki i niedożywieniem, dochodzi do zmian w przewodzie pokarmowym.

Zakażenie HIV powoduje naruszenie bariery żołądkowo-jelitowej, co prowadzi do postępującego upośledzenia odporności śluzówkowej i przedostawania się do krążenia systemowego produktów bakteryjnych, takich jak lipopolisacharyd i fragmenty bakteryjnego DNA, które przyczyniają się do systemowej aktywacji immunologicznej; w niniejszym materiale zaprezentowane zostaną eksperymentalne etapy detekcji i sekwencjonowania bakteryjnego DNA obecnego we krwi obwodowej pacjentów zakażonych HIV. W badaniu uczestniczą: Camilla ti, rezydentka w dziedzinie chorób zakaźnych, Esther, me, doktorantka oraz ju MariaI, pracownik w okresie postdoc, wszyscy związani z Kliniką Chorób Zakaźnych i Medycyny Tropikalnej Uniwersytetu w Mediolanie. Celem naszego eksperymentu jest identyfikacja gatunków bakteryjnych w próbkach krwi obwodowej pobranych od pacjentów zakażonych HIV.

Wykorzystamy krew pełną pobraną od osób zakażonych HIV oraz od zdrowych ochotników, ponieważ u osób zdrowych występuje prawidłowa homeostaza jelitowa. Nie spodziewamy się stwierdzenia translokacji mikroflory u tych pacjentów. Pobrana od pacjentów krew pełna zostanie poddana separacji osocza.

Następnie zostanie wyekstrahowane DNA w celu przeprowadzenia reakcji PCR o szerokim zakresie dla genu 16 s rRNA PCIC. Po uzyskaniu produktu PCR zostaną przeprowadzone oczyszczanie, klonowanie oraz analiza sekwencyjna. Pierwszym etapem naszego eksperymentu jest pobranie krwi poprzez wenipunkturę, a następnie oddzielenie osocza.

Ok. 9 ml krwi pełnej pobiera się do probówek z EDTA. Probówki umieszcza się w wirówce i wiruje z prędkością 2000 RPM przez 10 minut. Wirowanie w temperaturze pokojowej umożliwia oddzielenie osocza.

Następnie zostanie przeprowadzona ekstrakcja DNA z próbek osocza. W celu zapewnienia sterylności należy odpowiednio zdezynfekować komorę z laminarnym przepływem powietrza, pipety oraz materiały niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu, umieszczając wszystkie materiały pod lampami UV na co najmniej 30 minut. Wyłącz lampy UV, przetrzyj rękawiczki środkiem dezynfekującym, nasącz kilka ręczników papierowych etanolem i umieść je w komorze, aby używać ich przy każdym wyrzucaniu końcówek. Podczas procedury ekstrakcji DNA przecieraj pipetę wilgotnymi ręcznikami papierowymi.

Można teraz przystąpić do ekstrakcji DNA. DNA jest ekstrahowane przy użyciu zestawu komercyjnego, zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, 350 µL osocza przenosi się do probówki typu eppendorf o pojemności 2 ml.

Wodę ultrapurystyczną zastosowano jako kontrolę negatywną. Do próbek dodano 10 µL lizosomów o końcowym stężeniu 1 mg/ml. Następnie próbki inkubowano przez 30 minut.

Po odwirowaniu do próbek, zgodnie z instrukcją, dodaje się w temperaturze 37 °C roztwór A, chloroform oraz roztwór B. Pojawią się trzy wyraźne fazy. Pobiera się nadsącz i dodaje do etanolu, umożliwiając wytrącenie DNA, a następnie stężenie DNA odczytuje się za pomocą spektrofotometru.

Kolejnym krokiem jest szerokozakresowa reakcja PCR polegająca na amplifikacji genu 16s rRNA. Reakcja PCR jest przeprowadzana w dedykowanym pomieszczeniu. Mieszanina PCR jest przygotowywana z wykorzystaniem tych odczynników. Mieszaninę PCR wiruje się przez 30 minut przy 500 G w temperaturze 4°C, aby uniknąć możliwnego zanieczyszczenia bakteryjną polimerazą.

Mieszaninę PCR należy następnie podzielić na alikwoty, zgodnie z liczbą próbek wymagających amplifikacji. Należy pamiętać o przygotowaniu alikwotów dla negatywnych i pozytywnych kontrol reakcji.

PROGRAMOWANIE TERMocyklera przebiega według następujących parametrów: 94 °C przez pięć minut; następnie 40 cykli obejmujących 94 °C, 55 °C oraz 72 °C przez jedną minutę; na koniec 72 °C przez 10 minut. Średni czas trwania wynosi trzy godziny.

Produkty PCR są wizualizowane na żelu AGROS 2%. Jest to żel agros 2% przedstawiający produkty PCR. Pierwsza ścieżka zawiera marker 100 bp.

Druga ścieżka to pozytywna kontrola PCR. Trzecia ścieżka zawiera negatywną kontrolę PCR. Czwarta ścieżka przedstawia próbki od pacjenta z wynikiem dodatnim w kierunku HIV, a piąta ścieżka zawiera wodę.

Ścieżka szósta przedstawia próbki od zdrowego ochotnika oraz negatywną reakcję PCR. Ścieżka siódma zawiera wodę. Kolejnym krokiem jest weryfikacja PCR.

Produkty PCR są oczyszczane przy użyciu komercyjnego zestawu, zgodnie z instrukcjami producenta. W tym kroku wykorzystuje się wiele kolumnek z filtrami. Wyniki PCR są zapisywane w arkuszu roboczym.

Przechodzimy teraz do klonowania z wykorzystaniem selekcji niebiesko-białej. Jest to technika molekularna pozwalająca na wykrycie skutecznej ligacji DNA do wektora. Wektor jest transformowany do kompetentnych komórek bakteryjnych.

Komórki kompetentne hoduje się w obecności xal. Jeśli ligacja zakończy się sukcesem, kolonia bakteryjna będzie biała. W przeciwnym razie kolonia będzie niebieska.

X-gal stosuje się do wskazania, czy komórka wykazuje ekspresję enzymu beta-galaktozydazy oraz do wizualizacji transformacji kolonii e. coli; IPTG indukuje ekspresję beta-galaktozydazy. X-gal i IPTG nanosi się poprzez mieszanie na płytki zawierające ampicylinę. Zgodnie z instrukcjami producenta przygotowuje się mieszaninę do klonowania zawierającą produkty PCR, SALT oraz wektor klonujący.

Komórki E coli są rozmrażane na lodzie. Następnie do komórek dodaje się mieszaninę do klonowania, a po przeprowadzeniu szoku termicznego płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C. Po inkubacji na płytkach rozwijają się białe i niebieskie kolonie.

Białe kolonie są pozytywne pod kątem produktów PCR. Kolonie niebieskie są negatywne pod kątem insercji produktu PCR. Wybrano 10 białych kolonii oraz jedną niebieską kolonię.

Każdą kolonię przenosi się do 2 ml płynnej pożywki LB. Kolonie z dodatkiem ampicyliny inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C. Po inkubacji kolonie wyhodowane przez noc wykorzystuje się do ekstrakcji plazmidów za pomocą komercyjnego zestawu do mini-prep.

Do kolejnego etapu wykorzystuje się minikolumny zawierające filtry. Po ekstrakcji plazmidy są wizualizowane na żelu AROS 0,7%. Jest to żel AROS 0,7% przedstawiający produkty mini prepu. Pierwsza ścieżka zawiera marker wielkości 1 kb.

Druga ścieżka zawiera niebieską kolonię kontrolną. Ścieżki od trzeciej do dwunastej zawierają kolonie białe. Wyniki zapisuje się w arkuszu roboczym; w kolejnym kroku następuje sekwencjonowanie, a plazmidy są amplifikowane.

Przygotowuje się mieszaninę z użyciem tych odczynników. Mieszaninę PCR dzieli się na alikwoty zgodnie z liczbą próbek wymagających amplifikacji. Termocykler programuje się według następujących warunków: 96 °C przez jedną minutę, 96 °C przez 10 sekund, 50 °C przez pięć sekund, 60 °C przez cztery minuty.

Przez 25 cykli. Średni czas trwania wynosi około jednej godziny. Po amplifikacji produkty PCR są oczyszczane przy użyciu kolumienek z filtrem.

Oczyszczone produkty nanosi się na płytkę, którą następnie umieszcza się w sekwenwatorze. Po uzyskaniu sekwencji poddaje się ją analizie w programie BLAST, aby zidentyfikować gatunki bakterii z każdej kolonii. Kolonie wykazujące homologię sekwencji na poziomie od 98% do 100% uznaje się za pozytywne.

Jest to przykład sekwencjonowania bakterii w osoczu jednego osobnika z dodatnim wynikiem testu na HIV. Nasze wyniki pokazują, że translokacja drobnoustrojów w chorobie HIV obejmuje florę polimikrobiologiczną. Wykazaliśmy tym samym, że pacjenci z zakażeniem HIV wykazują wysoką polimikrobiologiczną mikroflorę w krążeniu systemowym.

Poziom bakteryjnego DNA we krwi obwodowej osób zdrowych, u których wynik testu na HIV był ujemny, znajdował się poniżej granicy wykrywalności, co prawdopodobnie odzwierciedla szczelność bariery jelitowej. Nasze obecne badania koncentrują się na zrozumieniu i zbadaniu potencjalnej roli mikroflory we krwi obwodowej w warunkowaniu immunopatogenezy HIV, a być może również w odpowiedzi na terapię.