Name: Sekwencjonowanie mikroflory bakteryjnej we krwi obwodowej: nasze doświadczenia z pacjentami zakażonymi wirusem HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Poznaj metody sekwencjonowania mikroflory bakteryjnej we krwi obwodowej pacjentów zakażonych wirusem HIV. Badanie identyfikuje gatunki bakterii translokujących i ich wpływ na układ odpornościowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Gianni Scimone za doskonałą pomoc w realizacji filmu.

Obsługa próbek krwi zakażonych HIV wymaga przestrzegania kilku istotnych zaleceń.
 
 Wszystkie próbki krwi muszą być transportowane w wytrzymałych, szczelnych pojemnikach. Podczas pobierania próbki należy zachować ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia zewnętrznej strony pojemnika oraz wszelkiej dokumentacji towarzyszącej próbce.
 
 Wszystkie osoby przetwarzające zakażoną krew muszą nosić rękawiczki. Po zakończeniu obróbki próbki należy zmienić rękawiczki i umyć ręce.
 
 Obróbka próbek krwi zakażonych HIV musi być przeprowadzana w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II (biohazard cabinet hood). 
 
 Należy stosować mechaniczne pomoce do pipetowania. 
 
 Stosowanie igieł lub innych ostrych narzędzi (w tym szkła, np. pipet lub kapilar) musi być ograniczone do sytuacji, w których nie ma alternatywy.
 
 Powierzchnie laboratoryjne muszą zostać zdekontaminowane odpowiednim chemicznym środkiem dezynfekcyjnym po rozlaniu krwi oraz po zakończeniu prac.
 
 Użyte materiały zanieczyszczone muszą zostać zdekontaminowane przed ponownym użyciem lub prawidłowo zutylizowane jako odpady kliniczne.
 
 Każdy przypadek narażenia zawodowego na potencjalnie zakażoną krew lub płyny (tzn. takie, które wymagają stosowania środków ostrożności uniwersalnych) należy traktować jako nagły przypadek medyczny, ponieważ interwencje muszą zostać podjęte niezwłocznie, aby były skuteczne.
 
 Realizacja protokołu zajmuje 5 dni. Harmonogram przedstawiono szczegółowo na Ryc. 1.
 
 Gatunki bakterii są identyfikowane przy użyciu metod opisanych na Ryc. 2.

1. Pobieranie próbek
<ol>
 <li>9 ml krwi pełnej pobiera się do probówek zawierających EDTA.</li>
 <li>Probówki wiruje się przy 2000 rpm przez 10 minut w RT w celu uzyskania osocza.</li>
 <li>Osocze przenosi się do sterylnej probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA z próbek osocza
<ol>
 <li>Odpowiednio zdezynfekować komorę z laminarnym przepływem powietrza, pipety oraz materiały niezbędne do eksperymentu, aby zagwarantować sterylność.</li>
 <li>Umieścić wszystkie materiały pod lampami UV na co najmniej 30 minut.</li>
 <li>Przetrzeć rękawiczki środkiem dezynfekującym.</li>
 <li>Nasączyć kilka ręczników papierowych etanolem i umieścić je w komorze. Po każdym wyrzuceniu końcówki przetrzeć pipetę wilgotnymi ręcznikami papierowymi.</li>
</ol>
DNA jest ekstrahowane przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta (Easy-DNA Kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA).
<ol start="5">
 <li>350 μL plazmy umieszcza się w sterylnej probówce Eppendorf o pojemności 2ml.</li>
 <li>350 μL filtrowanej wody ultrapurej stosuje się jako kontrolę negatywną.</li>
 <li>Do próbek dodaje się 10 μL lizozymu (1mg/ml).</li>
 <li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Do próbek dodaje się 500 μL roztworu lizującego (Lysis Solution) i delikatnie miesza.</li>
 <li>Inkubować przez 7 minut w temperaturze 65°C.</li>
 <li>Do próbek dodaje się 900 μL chloroformu.</li>
 <li>Wymieszać intensywnie w wortexie, aż próbki osiągną jednolitą lepkość.</li>
 <li>Dodać 200 μL roztworu wytrącania (Precipitation Solution) i intensywnie wymieszać w wortexie.</li>
 <li>Wirować próbki przy 10500 rpm przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu rozdzielenia faz i utworzenia interfazy.</li>
 <li>Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1 ml 100% etanolu.</li>
 <li>Wirować próbki przy 10500 rpm przez 10 minut w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Usunąć etanol.</li>
 <li>Dodać 1ml 70% etanolu.</li>
 <li>Wirować próbki z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Usunąć etanol. Pozostałości etanolu należy usunąć za pomocą pipetora.</li>
 <li>Resuspender osad w 50 μL wody ultrapurej.</li>
 <li>Odczytać stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
</ol>
3. PCR genu 16S rRNA
Amplifikację PCR przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem 9.
<ol>
 <li>Przeprowadzić amplifikację DNA w 100 μL mieszaninie reakcyjnej składającej się z 10 μL buforu PCR 10X, 5 μL 25 mM MgCl2, 5 μL 2 mM całkowitej ilości dNTPs, 
 1 μL 50 μM startera RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT), 1 μL 50 μM startera DG74 (AGGAGGTGATCCAACCGCA), 34 μL H20 oraz 0,5 
 μL polimerazy Taq (AmpliTaq Gold, Applied Biosystem, Foster City, CA, USA).</li>
 <li>Przenieść mieszaninę PCR do filtrów, aby uniknąć możliwej kontaminacji bakteryjną polimerazą Taq.</li>
 <li>Wirować filtry (Microcon, Millipore, Billerica, MA, USA) przez 30 minut przy 500 rcf w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Rozdzielić mieszaninę PCR na aliquoty zgodnie z liczbą próbek przeznaczonych do amplifikacji (dodatnie i ujemne kontrole PCR, 
 próbki oraz ekstrahowana woda).</li>
 <li>Zastosować następujące warunki cyklera termicznego: 94°C przez 10 minut; 40 cykli po 1 minucie każdy w temperaturach 94°C, 55°C i 72°C, 
 oraz 10 min w 72°C.</li>
 <li>Wizualizować produkt PCR na 2% żelu agarozowym. Użyć drabinki DNA 100 bp. Wielkość produktu PCR wynosi około 360 bp (Rycina 3).</li>
</ol>
4. Oczyszczanie produktu PCR
Należy oczyścić wyłącznie próbki dodatnie w teście PCR. Oczyszczanie przeprowadza się przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta (PureLink PCR microkit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). 
<ol>
 <li>Dodaj 4 objętości buforu wiążącego (Binding Buffer) zawierającego izopropanol na 1 objętość produktu PCR.</li>
 <li>Przenieś produkt PCR z buforem wiążącym do kolumny.</li>
 <li>Wiruj przez 1 minutę przy 10000 rcf w temperaturze RT.</li>
 <li>Przemyj kolumnę buforem płuczącym (Wash Buffer) zawierającym etanol.</li>
 <li>Wiruj przez 1 minutę przy 10000 rcf w temperaturze RT.</li>
 <li>Wiruj z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze RT, aby osuszyć membranę krzemionkową i usunąć pozostałości buforu płuczącego z etanolem.</li>
 <li>Dodaj 10 μL wody ultrapure.</li>
 <li>Inkubuj przez 1 minutę w temperaturze RT.</li>
 <li>Wiruj z maksymalną prędkością przez 2 minuty w temperaturze RT, aby zebrać oczyszczone DNA.</li>
</ol>
5. Klonowanie
Przygotowanie szalek z pożywką Lysogeny Broth (LB)
<ol>
 <li>Rozpuścić 25 gr mieszanki LB w około 800 ml wody.</li>
 <li>Dopełnić objętość końcową do 1 L.</li>
 <li>Dodać 15 gr Bactoagaru.</li>
 <li>Autoklawować przez 20 minut.</li>
 <li>Po autoklawowaniu energicznie zamieszać roztwór w kolbie, aby wymieszać stopiony agar.</li>
 <li>Schłodzić roztwór do 50°C.</li>
 <li>Dodać ampicylinę (50 μg/ml) i mieszać do całkowitego rozpuszczenia.</li>
 <li>Wylać pożywkę na płytki do grubości około 3mm.</li>
 <li>Pozostawić płytki w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Nanieść X-Gal (40mg/ml) i IPTG (100 mM) na każdą płytkę LB i inkubować w 37°C do momentu użycia.</li>
</ol>
Transformacja komórek kompetentnych
Transformację przeprowadza się przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta (Topo TA cloning kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA).
<ol>
 <li>Przygotować mieszaninę do reakcji klonowania (1-4 μL świeżego produktu PCR, 1 μL roztworu soli, 1 μL wektora oraz wodę, jeśli jest to konieczne).</li>
 <li>Delikatnie wymieszać reakcję i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
 <li>Umieścić reakcję na lodzie.</li>
 <li>Do probówki z komórkami kompetentnymi dodać 2 μL mieszaniny z reakcji klonowania i delikatnie wymieszać.</li>
 <li>Inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
 <li>Poddać komórki szokowi termicznemu przez 30 sekund w temperaturze 42°C.</li>
 <li>Natychmiast przenieść probówkę na lód.</li>
 <li>Dodać 250 μL pożywki.</li>
 <li>Szczelnie zamknąć probówkę i inkubować w wytrząsarce poziomej w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.</li>
 <li>Wysiać 50 μL z każdej transformacji na uprzednio ogrzaną płytkę selekcyjną.</li>
 <li>Inkubować przez noc w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
Po inkubacji na płytkach rozwiną się kolonie białe i niebieskie. Kolonie białe są dodatnie pod kątem insercji produktu PCR, natomiast kolonie niebieskie są ujemne pod kątem insercji produktu PCR.
6. Analiza sekwencjonowania
Reakcja sekwencjonowania
<ol>
 <li>Przygotowuje się mieszaninę z następujących odczynników: 2,5 μl DNA, 1 μl primera (5pmol/ μl), 1,1 μl BigDye (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA ).</li>
 <li>Warunki termocyklera: 96°C przez 1 minutę; 25 cykli: 96°C przez 10 sec, 55°C przez 15 sec i 60°C przez 4 min.</li>
</ol>
Oczyszczanie kolumnowe
<ol>
 <li>Dla każdej reakcji przygotuj jedną kolumnę MicroSpin (Qiagen, , Mediolan, Włochy).</li>
 <li>Odwróć kolumnę i wymieszaj żywicę za pomocą wortexa.</li>
 <li>Odłam dno kolumny, poluzuj pokrywkę o ¼ obrotu i umieść kolumnę w probówce do mikrowirówki.</li>
 <li>Wiruj przy 3200 rpm przez 1 minutę.</li>
 <li>Przenieś kolumnę do czystej probówki do mikrowirówki.</li>
 <li>Ostrożnie nanieś pipetą całą reakcję PCR do sekwencjonowania do centrum kolumny.</li>
 <li>Wiruj przy 3200 rpm przez 1 minutę.</li>
 <li>Oczyszczone DNA zostanie eluowane do probówki (20 μl wody ultrapure).</li>
</ol>
Analiza sekwencjonowania
<ol>
 <li>Nanieś oczyszczoną próbkę (20 μl) do płytki 96-dołkowej.</li>
 <li>Włóż płytkę do sekwenatora. Automatyczne sekwenatory DNA generują czterokolorowy chromatogram przedstawiający wyniki przebiegu sekwencjonowania.</li>
 <li>Wprowadź sekwencję nukleotydową jako zapytanie do publicznych baz danych sekwencji. Przeszukiwanie jest wykonywane w bazach danych i na serwerach NCBI za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).</li>
 <li>Uwzględnij tylko bakterie wykazujące 98-100% homologii.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig1.jpg" alt="Harmonogram klonowania molekularnego: ekstrakcja DNA, PCR, klonowanie, inkubacja, sekwencjonowanie. Schemat procesu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Harmonogram procedury.
<img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig2.jpg" alt="Schemat ekstrakcji i klonowania DNA; diagram przedstawiający kroki od pobrania krwi do analizy BLAST." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Schematy blokowe całej procedury identyfikacji bakteryjnej.
<img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig3.jpg" alt="Wynik elektroforezy żelowej, prążki DNA przy 300 bp i 400 bp, wskazujące na rozdział fragmentów według wielkości." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. 2% żel agarozowy przedstawiający produkty PCR genu 16S rRNA o szerokim zakresie. Ścieżka 1 zawiera marker DNA 100bp, ścieżka 2 zawiera pozytywną kontrolę PCR, ścieżka 3 przedstawia negatywną kontrolę PCR. Ścieżka 4 przedstawia próbki od pacjenta z dodatnim wynikiem testu na HIV, a ścieżka 5 zawiera wodę. Ścieżka 6 przedstawia próbki od zdrowej osoby oraz negatywną reakcję PCR; ścieżka 7 zawiera wodę. Tylko u pacjentów z dodatnim wynikiem HIV widoczna jest pozytywna amplifikacja PCR. Woda ultrapure użyta jako kontrola negatywna podczas etapu ekstrakcji wskazuje, że nie doszło do kontaminacji.
<img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig4.jpg" alt="Żel do elektroforezy DNA; markery masy cząsteczkowej; ścieżki z prążkami DNA; wyniki analizy genetycznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Żel agarozowy 0,7% przedstawiający plazmid wyekstrahowany procedurą miniprep. Ścieżka 1 zawiera marker DNA 1 Kilobase, ścieżka 2 zawiera niebieską kolonię kontrolną, a ścieżki od 3 do 12 zawierają kolonie białe. Plazmid z niebieskiej kolonii nie zawiera wkładki z produktu PCR. Wszystkie 10 białych kolonii zawiera plazmid z prawidłową wkładką.
<img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig5.jpg" alt="Wykres identyfikacji gatunków bakteryjnych; typy kolonii, gatunki i wyniki 100% homologii." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
 Rycina 5. Przedstawia przykład analizy sekwencjonowania bakterii w osoczu jednego osobnika seropozytywnego w kierunku HIV. Nasze wyniki pokazują, że translokacja drobnoustrojów w przebiegu zakażenia HIV obejmuje florę polimikrobową, czego nie obserwuje się u osób HIV-ujemnych, co sugeruje znaczną niewydolność odporności jelitowej w kontrolowaniu translokacji bakterii.

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Macpherson, A. J., Harris, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+commensal+intestinal+bacteria+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).</li>
<li>Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+intestinal+flora+in+the+treatment+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease.</a> Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).</li>
<li>Brenchley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).</li>
<li>Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease%3A+fallout+from+a+mucosal+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe.</a> Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).</li>
<li>Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).</li>
<li>Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+associated+with+sustained+failure+in+CD4%2B+T-cell+reconstitution+in+HIV-infected+patients+on+long-term+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy.</a> AIDS. 22, 2035-2038 (2008).</li>
<li>Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).</li>
<li>Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+primers+and+probes+for+the+16S+rRNA+gene+of+most+species+of+pathogenic+bacteria%2C+including+bacteria+found+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid.</a> J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół PCR/sekwencjonowania służący do charakterystyki translokacji bakterii do krwi obwodowej u osób zakażonych wirusem HIV.
Najbardziej wiarygodne wyniki uzyskuje się przy użyciu osocza pobranego do probówek zawierających EDTA. Po pobraniu krwi osocze należy oddzielić poprzez wirowanie w ciągu 2/3 godzin, aby uniknąć hemolizy i degradacji fragmentów DNA. Próbki przechowuje się początkowo w temperaturze -20°C przez około 5 dni, a następnie w -80°C. Należy u...

<table><tbody><tr><td>Zestaw Easy-DNA</td><td>Invitrogen</td><td>K 180001</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7203</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Fluka</td><td>62970</td><td>10 &amp;#x03BC;g/mL w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold</td><td>Applied Biosystems</td><td>26478701</td><td></td></tr><tr><td>Microcon 100</td><td>EMD Millipore</td><td>42413</td><td></td></tr><tr><td>Startery PCR</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Eppendorf</td><td>C1343</td><td></td></tr><tr><td>Marker DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Purelink PCR micro</td><td>Invitrogen</td><td>K310050</td><td></td></tr><tr><td>Agar LB, proszek</td><td>Invitrogen</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>Bactoagar</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Invitrogen</td><td>11593027</td><td>10 mg/mL w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520034</td><td>40mg/mL w DMF</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Invitrogen</td><td>15529019</td><td>100mM w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania Topo TA</td><td>Invitrogen</td><td>K450002</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Purelink Quick Plasmid Miniprep</td><td>Invitrogen</td><td>K210010</td><td></td></tr><tr><td>Big dye</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kolumienkowy DyeEx 2.0</td><td>Qiagen</td><td>63204</td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie mikroflory bakteryjnej we krwi obwodowej: nasze doświadczenia z pacjentami z zakażeniem hiv

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

Zdrowy przewód pokarmowy jest fizjologicznie kolonizowany przez szeroką gamę drobnoustrojów komensalnych, które wpływają na rozwój humoralnego i komórkowego układu odporności śluzówkowej1,2.
Mikrobiota jest chroniona przed układem odpornościowym przez silną barierę śluzową. Wiadomo, że infekcje i antybiotyki zmieniają zarówno naturalną barierę przewodu pokarmowego, jak i skład bakterii rezydentnych, co może prowadzić do możliwych nieprawidłowości immunologicznych3.
HIV powoduje naruszenie bariery żołądkowo-jelitowej z postępującym upośledzeniem odporności śluzówkowej oraz przedostawaniem się do krążenia systemowego produktów bakteryjnych, takich jak lipopolisacharydy i fragmenty bakteryjnego DNA, co przyczynia się do systemowej aktywacji immunologicznej4-7. Translokacja drobnoustrojów jest zaangażowana w immunopatogenezę HIV/AIDS oraz w odpowiedź na terapię 4,8.
Naszym celem była charakterystyka składu bakterii translokujących do krwi obwodowej u pacjentów zakażonych HIV. Aby zrealizować ten cel, przeprowadziliśmy reakcję PCR dla panbakteryjnego genu 16S rRNA, a następnie wykonaliśmy analizę sekwencjonowania.
W skrócie, wykorzystywana jest krew pełna pobrana zarówno od osób zakażonych HIV, jak i od osób zdrowych. Biorąc pod uwagę, że u osób zdrowych występuje prawidłowa homeostaza jelitowa, u tych pacjentów nie spodziewa się translokacji mikroflory. Po pobraniu krwi pełnej drogą wenerpunkcji i oddzieleniu osocza, z osocza ekstrahuje się DNA, które jest następnie wykorzystywane do reakcji PCR o szerokim zakresie dla panbakteryjnego genu rybosomalnego 16S9. Po puryfikacji produktu PCR przeprowadzane są analizy klonowania i sekwencjonowania.

Nasz eksperyment pokaże, jak przeprowadzić analizę sekwencjonowania gatunków bakterii translokujących do krwi obwodowej pacjentów z dodatnim wynikiem testu na HIV.

Sekwencjonowanie mikroflory bakteryjnej we krwi obwodowej: nasze doświadczenia z pacjentami z zakażeniem HIV

Zdrowy przewód pokarmowy jest fizjologicznie kolonizowany przez szeroką gamę mikroorganizmów komensalnych, które wpływają na rozwój odpowiedzi humoralnej...

Sekwencjonowanie mikroflory bakteryjnej translokującej do krwi obwodowej. Nasze doświadczenia z pacjentami zakażonymi HIV; nazywam się Junior Marti i pracuję jako adiunkt w Klinice Chorób Zakaźnych i Medycyny Tropikalnej na Uniwersytecie w Mediolanie we Włoszech. Przedstawimy teraz eksperymenty dotyczące wykrywania i sekwencjonowania bakteryjnego DNA z krwi obwodowej pacjentów zakażonych HIV.Zdrowy przewód pokarmowy jest zasiedlony przez szeroką różnorodność drobnoustrojów komensalnych, które wpływają na rozwój humoralnego i komórkowego układu odpornościowego. Mikrobiota jest chroniona przed układem odpornościowym przez silną barierę śluzową; jednak w wyniku kilku stanów klinicznych, takich jak infekcje, leczenie antybiotykami, powikłania pooperacyjne, a także u pacjentów z nowotworami, zapaleniem trzustki i niedożywieniem, dochodzi do zmian w przewodzie pokarmowym.Zakażenie HIV powoduje naruszenie bariery żołądkowo-jelitowej, co prowadzi do postępującego upośledzenia odporności śluzówkowej i przedostawania się do krążenia systemowego produktów bakteryjnych, takich jak lipopolisacharyd i fragmenty bakteryjnego DNA, które przyczyniają się do systemowej aktywacji immunologicznej; w niniejszym materiale zaprezentowane zostaną eksperymentalne etapy detekcji i sekwencjonowania bakteryjnego DNA obecnego we krwi obwodowej pacjentów zakażonych HIV. W badaniu uczestniczą: Camilla ti, rezydentka w dziedzinie chorób zakaźnych, Esther, me, doktorantka oraz ju MariaI, pracownik w okresie postdoc, wszyscy związani z Kliniką Chorób Zakaźnych i Medycyny Tropikalnej Uniwersytetu w Mediolanie. Celem naszego eksperymentu jest identyfikacja gatunków bakteryjnych w próbkach krwi obwodowej pobranych od pacjentów zakażonych HIV.Wykorzystamy krew pełną pobraną od osób zakażonych HIV oraz od zdrowych ochotników, ponieważ u osób zdrowych występuje prawidłowa homeostaza jelitowa. Nie spodziewamy się stwierdzenia translokacji mikroflory u tych pacjentów. Pobrana od pacjentów krew pełna zostanie poddana separacji osocza.Następnie zostanie wyekstrahowane DNA w celu przeprowadzenia reakcji PCR o szerokim zakresie dla genu 16 s rRNA PCIC. Po uzyskaniu produktu PCR zostaną przeprowadzone oczyszczanie, klonowanie oraz analiza sekwencyjna. Pierwszym etapem naszego eksperymentu jest pobranie krwi poprzez wenipunkturę, a następnie oddzielenie osocza.Ok. 9 ml krwi pełnej pobiera się do probówek z EDTA. Probówki umieszcza się w wirówce i wiruje z prędkością 2000 RPM przez 10 minut. Wirowanie w temperaturze pokojowej umożliwia oddzielenie osocza.Następnie zostanie przeprowadzona ekstrakcja DNA z próbek osocza. W celu zapewnienia sterylności należy odpowiednio zdezynfekować komorę z laminarnym przepływem powietrza, pipety oraz materiały niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu, umieszczając wszystkie materiały pod lampami UV na co najmniej 30 minut. Wyłącz lampy UV, przetrzyj rękawiczki środkiem dezynfekującym, nasącz kilka ręczników papierowych etanolem i umieść je w komorze, aby używać ich przy każdym wyrzucaniu końcówek. Podczas procedury ekstrakcji DNA przecieraj pipetę wilgotnymi ręcznikami papierowymi.Można teraz przystąpić do ekstrakcji DNA. DNA jest ekstrahowane przy użyciu zestawu komercyjnego, zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, 350 µL osocza przenosi się do probówki typu eppendorf o pojemności 2 ml.Wodę ultrapurystyczną zastosowano jako kontrolę negatywną. Do próbek dodano 10 µL lizosomów o końcowym stężeniu 1 mg/ml. Następnie próbki inkubowano przez 30 minut.Po odwirowaniu do próbek, zgodnie z instrukcją, dodaje się w temperaturze 37 °C roztwór A, chloroform oraz roztwór B. Pojawią się trzy wyraźne fazy. Pobiera się nadsącz i dodaje do etanolu, umożliwiając wytrącenie DNA, a następnie stężenie DNA odczytuje się za pomocą spektrofotometru.Kolejnym krokiem jest szerokozakresowa reakcja PCR polegająca na amplifikacji genu 16s rRNA. Reakcja PCR jest przeprowadzana w dedykowanym pomieszczeniu. Mieszanina PCR jest przygotowywana z wykorzystaniem tych odczynników. Mieszaninę PCR wiruje się przez 30 minut przy 500 G w temperaturze 4°C, aby uniknąć możliwnego zanieczyszczenia bakteryjną polimerazą.Mieszaninę PCR należy następnie podzielić na alikwoty, zgodnie z liczbą próbek wymagających amplifikacji. Należy pamiętać o przygotowaniu alikwotów dla negatywnych i pozytywnych kontrol reakcji.PROGRAMOWANIE TERMocyklera przebiega według następujących parametrów: 94 °C przez pięć minut; następnie 40 cykli obejmujących 94 °C, 55 °C oraz 72 °C przez jedną minutę; na koniec 72 °C przez 10 minut. Średni czas trwania wynosi trzy godziny.Produkty PCR są wizualizowane na żelu AGROS 2%. Jest to żel agros 2% przedstawiający produkty PCR. Pierwsza ścieżka zawiera marker 100 bp.Druga ścieżka to pozytywna kontrola PCR. Trzecia ścieżka zawiera negatywną kontrolę PCR. Czwarta ścieżka przedstawia próbki od pacjenta z wynikiem dodatnim w kierunku HIV, a piąta ścieżka zawiera wodę.Ścieżka szósta przedstawia próbki od zdrowego ochotnika oraz negatywną reakcję PCR. Ścieżka siódma zawiera wodę. Kolejnym krokiem jest weryfikacja PCR.Produkty PCR są oczyszczane przy użyciu komercyjnego zestawu, zgodnie z instrukcjami producenta. W tym kroku wykorzystuje się wiele kolumnek z filtrami. Wyniki PCR są zapisywane w arkuszu roboczym.Przechodzimy teraz do klonowania z wykorzystaniem selekcji niebiesko-białej. Jest to technika molekularna pozwalająca na wykrycie skutecznej ligacji DNA do wektora. Wektor jest transformowany do kompetentnych komórek bakteryjnych.Komórki kompetentne hoduje się w obecności xal. Jeśli ligacja zakończy się sukcesem, kolonia bakteryjna będzie biała. W przeciwnym razie kolonia będzie niebieska.X-gal stosuje się do wskazania, czy komórka wykazuje ekspresję enzymu beta-galaktozydazy oraz do wizualizacji transformacji kolonii e. coli; IPTG indukuje ekspresję beta-galaktozydazy. X-gal i IPTG nanosi się poprzez mieszanie na płytki zawierające ampicylinę. Zgodnie z instrukcjami producenta przygotowuje się mieszaninę do klonowania zawierającą produkty PCR, SALT oraz wektor klonujący.Komórki E coli są rozmrażane na lodzie. Następnie do komórek dodaje się mieszaninę do klonowania, a po przeprowadzeniu szoku termicznego płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C. Po inkubacji na płytkach rozwijają się białe i niebieskie kolonie.Białe kolonie są pozytywne pod kątem produktów PCR. Kolonie niebieskie są negatywne pod kątem insercji produktu PCR. Wybrano 10 białych kolonii oraz jedną niebieską kolonię.Każdą kolonię przenosi się do 2 ml płynnej pożywki LB. Kolonie z dodatkiem ampicyliny inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C. Po inkubacji kolonie wyhodowane przez noc wykorzystuje się do ekstrakcji plazmidów za pomocą komercyjnego zestawu do mini-prep.Do kolejnego etapu wykorzystuje się minikolumny zawierające filtry. Po ekstrakcji plazmidy są wizualizowane na żelu AROS 0,7%. Jest to żel AROS 0,7% przedstawiający produkty mini prepu. Pierwsza ścieżka zawiera marker wielkości 1 kb.Druga ścieżka zawiera niebieską kolonię kontrolną. Ścieżki od trzeciej do dwunastej zawierają kolonie białe. Wyniki zapisuje się w arkuszu roboczym; w kolejnym kroku następuje sekwencjonowanie, a plazmidy są amplifikowane.Przygotowuje się mieszaninę z użyciem tych odczynników. Mieszaninę PCR dzieli się na alikwoty zgodnie z liczbą próbek wymagających amplifikacji. Termocykler programuje się według następujących warunków: 96 °C przez jedną minutę, 96 °C przez 10 sekund, 50 °C przez pięć sekund, 60 °C przez cztery minuty.Przez 25 cykli. Średni czas trwania wynosi około jednej godziny. Po amplifikacji produkty PCR są oczyszczane przy użyciu kolumienek z filtrem.Oczyszczone produkty nanosi się na płytkę, którą następnie umieszcza się w sekwenwatorze. Po uzyskaniu sekwencji poddaje się ją analizie w programie BLAST, aby zidentyfikować gatunki bakterii z każdej kolonii. Kolonie wykazujące homologię sekwencji na poziomie od 98% do 100% uznaje się za pozytywne.Jest to przykład sekwencjonowania bakterii w osoczu jednego osobnika z dodatnim wynikiem testu na HIV. Nasze wyniki pokazują, że translokacja drobnoustrojów w chorobie HIV obejmuje florę polimikrobiologiczną. Wykazaliśmy tym samym, że pacjenci z zakażeniem HIV wykazują wysoką polimikrobiologiczną mikroflorę w krążeniu systemowym.Poziom bakteryjnego DNA we krwi obwodowej osób zdrowych, u których wynik testu na HIV był ujemny, znajdował się poniżej granicy wykrywalności, co prawdopodobnie odzwierciedla szczelność bariery jelitowej. Nasze obecne badania koncentrują się na zrozumieniu i zbadaniu potencjalnej roli mikroflory we krwi obwodowej w warunkowaniu immunopatogenezy HIV, a być może również w odpowiedzi na terapię.

sequencing-bacterial-microflora-peripheral-blood-our-experience-with

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Sekwencjonowanie mikroflory bakteryjnej we krwi obwodowej: nasze doświadczenia z pacjentami zakażonymi wirusem HIV

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Opracowaliśmy model koinfekcji malarią i HIV-1 in vitro, aby zbadać wpływ Plasmodium falciparum na cykl replikacyjny HIV-1 w ludzkich pierwotnych makrofagach pochodzących z monocytów. Ten wszechstronny system można łatwo dostosować do innych typów komórek pierwotnych podatnych na zakażenie HIV-1.

Model koinfekcji In vitro do badania interakcji między Plasmodium falciparum a HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

Opisano techniki opisujące gradientową procedurę oddzielania egzosomów od cząsteczek ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Procedura ta została wykorzystana do wyizolowania egzosomów z dala od cząstek HIV w ludzkim osoczu od osób zakażonych wirusem HIV. Wyizolowane egzosomy analizowano pod kątem zawartości cytokin/chemokin.

Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1

Zakażenie tkanek ludzkich ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) ex vivo dostarcza cennego modelu 3D patogenezy wirusa. W tym miejscu opisujemy protokół przetwarzania i infekowania próbek tkanek z ludzkich migdałków i błon śluzowych żeńskich narządów płciowych wirusem HIV-1 i utrzymywania ich w kulturze na granicy faz ciecz-powietrze.

Ex vivo Zakażenie ludzkiej tkanki limfatycznej i błony śluzowej żeńskich narządów płciowych ludzkim wirusem niedoboru odporności 1 i histokultura

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół izolacji, hodowli, transfekcji i różnicowania ludzkich pierwotnych monocytów od osób zakażonych wirusem HIV i zdrowych osób kontrolnych.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Mleko matki przenosi ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), chociaż tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu. Niemowlęta karmione piersią spożywają ~105−108 leukocytów matki dziennie, chociaż komórki te są niedostatecznie zbadane. Tutaj opisujemy izolację leukocytów mleka matki i analizę ich zdolności fagocytarnej.

Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV

Poznaj metody sekwencjonowania mikroflory bakteryjnej we krwi obwodowej pacjentów zakażonych wirusem HIV. Badanie identyfikuje gatunki bakterii translokujących i ich wpływ na układ odpornościowy.

Sekwencjonowanie mikroflory bakteryjnej we krwi obwodowej: nasze doświadczenia z pacjentami z zakażeniem HIV

Przeglądaj więcej filmów