Name: Wykrywanie blaszek neurytycznych w mysim modelu choroby Alzheimera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj metody wykrywania blaszek neurytycznych w mysim modelu choroby Alzheimera przy użyciu barwienia immunohistochemicznego 4G8 oraz thioflavin S. Techniki te umożliwiają precyzyjną wizualizację złogów białka amyloidowego β.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR), rodzinę Townsend oraz Fundację Jack Brown and Family Alzheimer's Research Foundation (dla W. S.). W. S. jest posiadaczem Kanadyjskiej Katedry Badawczej w zakresie choroby Alzheimera (Canada Research Chair in Alzheimer's Disease). P. T.T. L. otrzymuje wsparcie z Natural Sciences and Engineering Research Council oraz stypendium Michael Smith Foundation for Health Research.

1.	Fiksacja mózgów myszy i kriosekcjonowanie
<ol>
<li>Myszy transgeniczne uśmierca się za pomocą dwutlenku węgla, po czym przeprowadza się dekapitację i wyodrębnia mózg.</li>
<li>Mózg przecinamy wzdłuż w linii środkowej. Połowę mózgu zamraża się gwałtownie na suchym lodzie do analizy biochemicznej. Pozostałą część zanurza się w 4% paraformaldehydzie (PFA) na co najmniej 48 godzin w temperaturze 4°C.</li> 
<li>Po utrwaleniu w 4% PFA przez co najmniej 48 godzin, półkulę mózgu przenosi się bezpośrednio do 30% roztworu sacharozy i przechowuje w temperaturze 4°C. Na tym etapie półkula mózgu powinna unosić się w roztworze sacharozy. Gdy półkula opadnie na dno, co zazwyczaj zajmuje około 48 godzin, jest gotowa do zatopienia w OCT w celu wykonania kriofragmentacji.</li>
<li>Przed kriofragmentacją nanosi się cienką warstwę OCT na uchwyt i zamraża w temperaturze -20°C. Usuwa się móżdżek z pozostałej części półkuli mózgu i umieszcza go na zamrożonej warstwie OCT. Następnie półkulę mózgu natychmiast przykrywa się OCT i pozwala powoli zamarznąć w temperaturze -20°C. Gdy OCT zatapiający mózg stanie się nieprzezroczysty, preparat jest gotowy do cięcia.</li>
<li>Ustawia się grubość każdego przekroju na 30 μm. Każdy plaster zbiera się do pojemnika z roztworem D'Olomos.</li>
</ol>
2. Procedura immunohistochemiczna dla blaszek neur upływowych (przekroje swobodnie pływające)
<ol>
<li>Przetrzymaj każdy przekrój w 8% kwasie mrówkowym przez 15 minut. Po traktowaniu kwasem mrówkowym przekrój tymczasowo stanie się nieprzezroczysty i może sprawiać wrażenie pomarszczonego.</li>
<li>Przenieś każdy przekrój do płytki i przemyj za pomocą Tx-PBS (0,3% Triton X-10 w PBS) przez 5 min x 3 razy, delikatnie wstrząsając.</li>
<li>Zablokuj endogenny nadtlenek: blokowanie w 0,5% H2O2 w Tx-PBS, temperatura pokojowa (RT), 30 min przy delikatnym wstrząsaniu.</li>
<li>Przemyj przekrój w Tx-PBS przez 10 min x 3 razy, delikatnie wstrząsając.</li>
<li>Zablokuj przekrój 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku rozpuszczonym w Tx-PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przy delikatnym wstrząsaniu.</li> 
<li>Inkubuj przekroje w przeciwciałach pierwszorzędowych (Biotinylated 4G8, 1:50-1:20, Signet) rozcieńczonych w Tx-PBS z dodatkiem 5% mleka w temperaturze 4°C przez noc przy delikatnym wstrząsaniu.</li>
<li>Przemyj przekrój w Tx-PBS przez 10 min x 3 razy, delikatnie wstrząsając.</li>
<li>Przygotuj roztwór ABC zgodnie z protokołem producenta (Elite ABC, Vector Laboratories). Inkubuj przekroje w mieszaninie ABC przez 30 min przy delikatnym wstrząsaniu.</li> 
<li>Przemyj przekrój w Tx-PBS przez 10 min x 3 razy, delikatnie wstrząsając.</li>
<li>Przygotuj 3,3'-diaminobenzydynę tetrahydrochlorek (DAB) (Vector Laboratories) zgodnie z protokołem producenta. Inkubuj przekroje w mieszaninie DAB przez 5-10 min. Na tym etapie zaobserwujesz pojawienie się brązowego zabarwienia na każdym przekroju.</li>
<li>Przemyj przekrój w Tx-PBS przez 10 min x 3 razy, delikatnie wstrząsając.</li>
<li>Wolnorefleksyjne przekroje mózgu montuje się na szkiełkach powlekanych żelatyną, aby wspomóc adhezję tkanki. Następnie przekroje są suszone na powietrzu, po czym przechodzą proces klarowania w serii ksylenu i są montowane w Entellen.</li>
<li>Blaszki są wizualizowane pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 40X i kwantyfikowane poprzez ocenę średniej liczby blaszek na przekrój dla każdej myszy.</li>
</ol>
3. Procedura barwienia tioflawiną S w celu wykrycia blaszek neurytycznych
<ol>
<li>Procedura uśmiercania myszy i wyjęcia mózgu przebiega zgodnie z opisem w sekcjach od 1.1 do 1.5.</li>
<li>Przenieś 4 do 5 przekrojów połowy mózgu na szkiełko przedmiotowe i pozostaw do całkowitego wyschnięcia przed barwieniem.</li> 
<li>Przemyj szkiełka 70% etanolem przez 1 minutę.</li>
<li>Przemyj szkiełka 80% etanolem przez 1 minutę.</li>
<li>Inkubuj szkiełka w przefiltrowanym (filtr 0,2 μm) roztworze tioflawiny S (1% w 80% etanolu) przez 15 minut. (Roztwór tioflawiny S musi być filtrowany przed każdym użyciem). Uwaga: chroń tioflawinę S przed światłem oraz chroń zabarwione szkiełka przed światłem.</li>
<li>Przemyj szkiełka 80% etanolem przez 1 minutę.</li>
<li>Przemyj szkiełka 70% etanolem przez 1 minutę.</li>
<li>Przemyj dwukrotnie wodą destylowaną.</li>
<li>Zamontuj szkiełka w wodnym medium montażowym i pozostaw do wyschnięcia w ciemności przez co najmniej 2 godziny, a następnie zabezpiecz szkiełko nakrywką za pomocą bezbarwnego lakieru do paznokci. Zabarwione przekroje należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C.</li>
<li>Blaszki wybarwione na zielono fluorescencyjnie można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przeanalizuj szkiełka w ciągu jednego tygodnia, ponieważ intensywność barwienia z czasem słabnie.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
W naszym niedawnym badaniu nad skutecznością kwasu walproinowego (VPA), leku przeciwdrgawkowego i stabilizatora nastroju, w hamowaniu tworzenia blaszki neuronicznej, zastosowaliśmy opisane powyżej procedury barwienia immunocytochemicznego oraz barwienia tioflawiną S w celu identyfikacji blaszek neuronicznych u myszy w modelu AD (3). Rysunek 1 przedstawia typową 9-miesięczną mysz transgeniczną APP23, zabarwioną przeciwciałem anty-Aβ przy użyciu biotynilowanego 4G8 i wykrytą metodą ABC. Blaszki neuroniczne są wyraźnie oznakowane przeciwciałem i wskazane białymi strzałkami. Wykorzystując barwienie tioflawiną S, wykryliśmy odkładanie się blaszek neuronicznych u 2-miesięcznych myszy transgenicznych APP23xPS (Rysunek 2). Blaszki neuroniczne zawierające Aβ, z którymi związała się tioflawina S, wykazują zieloną fluorescencję w badaniu mikroskopowym (wskazane białymi strzałkami). Wykazaliśmy, że po zastosowaniu leczenia VPA tworzenie blaszek neuronicznych jest znacząco ograniczone (3). W innym badaniu analizowaliśmy powiązania molekularne leżące u podstaw hipoksji i patogenezy AD. Ponownie, stosując zarówno immunohistochemiczne barwienie 4G8 anty-Aβ, jak i barwienie tioflawiną S, stwierdziliśmy, że hipoksja ułatwia tworzenie blaszek neuronicznych zawierających Aβ (4).
<img src="/files/ftp_upload/2831/2831fig1.jpg" alt="Schemat histologiczny mózgu; przekrój przedstawiający struktury neuronalne i zabarwione skupiska neuronów do analizy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Analiza immunohistochemiczna tworzenia się blaszek neurytowych u transgenicznych myszy z AD. Myszy APP23 w wieku 9 miesięcy zostały uśmiercone, a następnie poddane sekcji, utrwaleniu i cięciu na skrawki. Blaszki neurytczne w hipokampie wykryto przy użyciu przeciwciała anty-Aβ 4G8 i wybarwiono metodą ABC i DAB. Blaszki zobrazowano za pomocą mikroskopii świetlnej przy powiększeniu 40X. Białe strzałki wskazują neurytczne blaszki Aβ. 
<img src="/files/ftp_upload/2831/2831fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej pokazuje lokalizację białka w kolorze zielonym; analiza rozkładu komórkowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Barwienie tioflawiną S blaszek neurytycznych u myszy z modelem AD. Myszy podwójnie transgeniczne APP23xPS45 w wieku 8 tygodni uśpiono, a następnie poddano dyssekcji, utrwaleniu i sekcjonowaniu. Obecność blaszek neurytycznych w obszarze hipokampa potwierdzono za pomocą fluorescencyjnego barwienia tioflawiną S i zobrazowano za pomocą mikroskopii przy powiększeniu 40X. Białe strzałki wskazują blaszki neurytyczne zabarwione tioflawiną S.

<ol><li>Glenner, G. G., Wong, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+initial+report+of+the+purification+and+characterization+of+a+novel+cerebrovascular+amyloid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).</li>
<li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid+inhibits+Abeta+production%2C+neuritic+plaque+formation%2C+and+behavioral+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models.</a> J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).</li>
<li>Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+facilitates+Alzheimer%27s+disease+pathogenesis+by+up-regulating+BACE1+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).</li>
</ol>

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Kolumbijskiego (The University of British Columbia Animal Care and Use committee) oraz CIHR.

Immunohistochemia z wykorzystaniem biotynjlowanego przeciwciała 4G8 pozwala na swoiste barwienie blaszek neurytonalnych w modelach mysich z chorobą Alzheimera (AD). Wynik barwienia umożliwia ilościowe określenie i porównanie obciążenia blaszkami pomiędzy różnymi grupami badawczymi. Istnieje kilka kluczowych etapów, które mogą wpłynąć na końcowy efekt. Ponieważ półkule mózgu nie są perfundowane przed wyjęciem z czaszki, należy zachować szczególną ostrożność podczas procesu ekstrakcji, aby zapobiec uszkodzeniom tkanki. Ponadto, ze względu na pasywną perfuzję półkul mózgu, zaleca się ich inkubację w 4% PFA przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 4°C przed zanurzeniem w 30% roztworze sacharozy. Alternatywnie można przeprowadzić perfuzję przezsercową przed wyjęciem mózgu. Prawidłowo utrwalony mózg powinien mieć gumowatą konsystencję. W przypadku niewłaściwego utrwalenia preparaty będą łatwo rwać się w roztworze D'Olomos lub podczas procedur barwienia.
Przeciwciało monoklonalne 4G8 wykazuje reaktywność wobec reszt aminokwasowych 17-24 Aβ i rozpoznaje epitop w sekwencji rdzeniowej (VFFAE). Ponieważ 4G8 pochodzi od myszy, wykazuje tendencję do generowania silniejszego barwienia tła. W związku z tym zdecydowaliśmy się inkubować przekroje w wskazanym rozcieńczeniu, aby uzyskać rzeczywisty sygnał przy jednoczesnym zminimalizowaniu barwienia tła.
Oprócz immunobarwienia w celu wykrycia blaszek neur upływowych z użyciem przeciwciała 4G8, do identyfikacji blaszek stosuje się również metodę barwienia tioflawiną S. Tioflawina S jest jednorodną mieszaniną barwników powstającą w wyniku metylowania dehydrotiotoluidyny kwasem sulfonowym. Tioflawina S nieselektywnie wiąże struktury beta-kartki białek, takie jak te występujące w oligomerach amyloidowych. Po związaniu tioflawina ulega charakterystycznemu przesunięciu emisji widma w stronę niebieską. Z kolei wiązanie tioflawiny S z formami monomerycznymi nie powoduje przesunięcia w stronę niebieską, przez co nie można go wykryć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Barwienie tioflawiną S stanowi szybką alternatywę do przesiewowego wykrywania amyloidu, ponieważ intensywność fluorescencji pozwala na dobrą wizualizację niewielkich ilości złogów amyloidowych. Wadą barwienia tioflawiną S jest jednak brak specyficzności. Wiele innych składników tkanki zawierających rozległe struktury beta-kartki, takich jak fibrinoidy, hialina, keratyna itp., wykazuje dość duże powinowactwo do tego barwnika.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylo-pirolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558-2L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>88% kwas mrówkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ICN Biomedicals</td><td>807426</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało 4G8 znakowane biotyną</td><td>Cedarlane Labs</td><td>SIG-39240-500</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Imm PACT DAB</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X4-4</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>65037-71</td><td></td></tr><tr><td>Przeźroczniki do mikroskopu Superfrost* Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM-3050-S</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze mikrotomu MX35 Premier</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>Tioflawina S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie blaszek neurytycznych w modelu mysim choroby alzheimera

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszym zaburzeniem neurodegeneracyjnym prowadzącym do otępienia. Tworzenie blaszek neurytycznych jest jedną z patologicznych cech charakterystycznych choroby Alzheimera. Głównym składnikiem blaszek neurytycznych jest małe białko włókniste zwane białkiem amyloid β (Aβ)1, które powstaje w wyniku sekwencyjnego cięcia proteolitycznego białka prekursorowego beta-amyloidu (APP) przez β-sekretazę i γ-sekretazę. Hipoteza amyloidowa zakłada, że blaszki zawierające Aγ stanowią podstawowy mechanizm toksyczny w patologii AD2. Analiza pośmiertna obecności blaszek neurytycznych potwierdza diagnozę AD. Aby pogłębić zrozumienie neurobiologii Aγ w patogenezie AD, opracowano różne linie myszy wykazujące mutacje związane z AD w ludzkich genach APP. W zależności od ciężkości choroby, myszy te będą rozwijać blaszki neurytyczne w różnym wieku. Myszy te służą jako nieocenione narzędzia do badania patogenezy oraz opracowywania leków, które mogłyby wpływać na szlak przetwarzania APP i tworzenie blaszek neurytycznych. W niniejszym protokole stosujemy metodę immunohistochemiczną do specyficznego wykrywania blaszek neuryticznych u myszy w modelu AD. Szczegółowo omówimy przygotowanie od momentu wycięcia połowy mózgu, fiksację paraformaldehydem, kriosekcjonowanie oraz dwie metody wykrywania blaszek neurytycznych u transgenicznych myszy z AD: detekcję immunohistochemiczną z wykorzystaniem metody ABC i DAB oraz detekcję fluorescencyjną z zastosowaniem barwienia tioflawiną S.

Jedną z patologicznych cech AD jest tworzenie się blaszek neurytowych wykazujących obecność białka amyloid β. W niniejszym protokole opisujemy dwie metody wykrywania blaszek neurytowych u myszy w transgenicznym modelu AD: detekcję immunohistochemiczną z wykorzystaniem metody ABC i DAB oraz detekcję fluorescencyjną z zastosowaniem barwienia tioflawiną S.

Wykrywanie blaszek neurytycznych w modelu mysim choroby Alzheimera

Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszym zaburzeniem neurodegeneracyjnym prowadzącym do otępienia. Tworzenie się blaszek neurytycznych jest jedną z patologicznych cech charakterystycznych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie mózgów myszy z modelu AD do detekcji blaszek amyloidowych z wykorzystaniem barwienia immunohistochemicznego z przeciwciałem 4G8 oraz barwienia flawiną S. Cel ten osiąga się poprzez wyjęcie mózgu myszy z czaszki i perfuzję pasywną w 4% PFA, a następnie zanurzenie w 30% roztworze sacharozy i wykonanie kriosekcji mózgu wzdłużnie do grubości 30 mikronów. Następnie blaszki amyloidowe barwi się przy użyciu przeciwciała 4G8 i wizualizuje metodą DAB.Dodatkowo, należy barwić blaszki amyloidowe za pomocą barwienia flawiną S, a następnie wizualizować je przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie uzyskane wyniki mogą wykazać odkładanie się blaszek amyloidowych w tkankach mózgu dzięki detekcji opartej na przeciwciałach oraz barwieniu barwnikiem flawiny S. Główną zaletą tych technik w stosunku do istniejących metod jest to, że barwienie 4G8 oraz flawina S są wysoce selektywne w stosunku do blaszek amyloidowych zawierających białka beta.Chociaż zaprezentowana tutaj metoda służy do wykrywania blaszek amyloidowych w mózgach myszy transgenicznych z chorobą Alzheimera, może ona zostać zastosowana również do wykrywania blaszek amyloidowych w przebiegu choroby Alzheimera u ludzi. Po poświęceniu myszy transgenicznych za pomocą dwutlenku węgla, a następnie dekapitacji, należy wyciąć mózg i przeprowadzić jego podłużny przekrój w linii środkowej. Połowę mózgu należy zamrozić błyskawicznie na suchym lodzie w celu przeprowadzenia analizy biochemicznej, natomiast drugą połowę zanurzyć w 4% paraformaldehydzie na co najmniej 48 godzin w temperaturze 4°C.Przenieś półkulę mózgu do 30% roztworu sacharozy w temperaturze 4°C. Początkowo półkula mózgu będzie unosić się w roztworze sacharozy, jednak po 24 do 48 godzinach opadnie na dno. Przed kriosekcjonowaniem nanieś cienką warstwę OCT na guzek i pozostaw do zamrożenia w temperaturze -20°C. Oddziel móżdżek od pozostałej części półkuli mózgu.Pozostałą część umieść na warstwie zamrożonego OCT, natychmiast przykryj ją OCT i pozwól jej powoli zamarznąć w temperaturze -20 °C. Ustaw kriostat na grubość przekrojów 30 µm i zbieraj każdy plaster do pojemnika z roztworem Domo. Każdy swobodnie pływający przekrój poddaj działaniu 88% kwasu mrówkowego przez 15 minut.Przekroje będą wyglądać na skurczone. Następnie przenieś każdy przekrój na płytkę i przemyj trzykrotnie w roztworze Triton XPBS przez pięć minut przy delikatnym wstrząsaniu. Osłab aktywność endogenną za pomocą 0,5% nadtlenku wodoru w Triton XPBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu.Następnie należy przemyć skrawki trzykrotnie buforem Triton XPBS przez 10 minut podczas łagodnego wstrząsania, a następnie zablokować skrawki w 5% beztłuszczowym mleku w proszku rozpuszczonym w Triton XPBS w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę przy łagodnym wstrząsaniu. Kontynuuj inkubację skrawków z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w Triton XPBS zawierającym 5% mleka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc przy łagodnym wstrząsaniu. Próbki należy przemyć trzykrotnie buforem Triton XPBS przez 10 minut.Następnie przygotuj roztwór b, C zgodnie z protokołem producenta i inkubuj skrawki w mieszaninie A B, C przez 30 minut przy delikatnym wstrząsaniu, a następnie trzykrotnie przemyj roztworem PBS przez 10 minut. Inkubuj skrawki w świeżo przygotowanej mieszaninie DAB od pięciu do 10 minut, aż na każdym skrawku pojawi się brązowy kolor, po czym przemyj trzykrotnie roztworem PBS przez 10 minut przy delikatnym wstrząsaniu. Osadź swobodnie pływające skrawki mózgu na szkiełkach pokrytych żelatyną i wysusz na powietrzu, a następnie przeprowadź przejrzyszczanie za pomocą serii traktowań ksylenem i zamontuj w lin.Wizualizuj plakki pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 40x i określ średnią liczbę plakków na przekrój dla każdego myszy, ekstrahując tkankę mózgową z myszy zgodnie z wcześniejszym opisem. Nanieś od czterech do pięciu przekrojów połowy mózgu na szkiełko przedmiotowe i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Całkowicie odwodnij próbki w 70% etanolu przez jedną minutę, a następnie w 80% etanolu przez jedną minutę. Następnie inkubuj szkiełka w 0,1% przefiltrowanym roztworze THEOF Flavin S przez 15 minut.Dbając o ochronę roztworu Theof Flavin S oraz barwionych preparatów przed światłem, przemyj slajdy 80% etanolem przez jedną minutę, 70% etanolem przez jedną minutę oraz dwukrotnie wodą destylowaną. Następnie zamontuj preparaty w wodnym medium montażowym i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w ciemności przez co najmniej dwie godziny, po czym zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywkowego bezbarwnym lakierem do paznokci. Przechowuj zabarwione sekcje w ciemności w temperaturze 4 °C.Na koniec, w ciągu jednego tygodnia, należy zwizualizować plaques zabarwione na zielono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W naszym niedawnym badaniu nad skutecznością kwasu walproinowego, leku przeciwpadaczkowego i stabilizatora nastroju, w hamowaniu powstawania blaszek amyloidowych, wykorzystaliśmy opisane powyżej procedury barwienia immunochemicznego oraz barwienia flawiną S w celu zidentyfikowania blaszek amyloidowych u myszy w modelu AD. Typowa dziewięciomiesięczna mysz transgeniczna APP 23 została zabarwiona przeciwciałem anty-Aβ z użyciem BIOTINYLATED 4G8 i wykryta metodą ABC.Blaszki neuroretikularne są wyraźnie oznakowane przeciwciałem i wskazane białymi strzałkami. Tutaj barwienie flawiną S wykrywa złogi blaszek retikularnych u dwumiesięcznych myszy transgenicznych A PP 23 times PS. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w trzy dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest całkowite utrwalenie mózgu w 4% PFA oraz upewnienie się, że mózg całkowicie opadnie na dno 30% roztworu sacharozy.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak barwienie immunocytochemiczne białka tau, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące np. hiperfosforylacji białka tau oraz funkcji neuronalnych.

detection-of-neuritic-plaques-in-alzheimer-s-disease-mouse-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wykrywanie płytek neurofibrylarnych w myszym modelu choroby Alzheimera

Transgeniczne (Tg) modele mysie w chorobie Alzheimera (AD) stanowią doskonałą okazję do zbadania, w jaki sposób i dlaczego poziomy Aβ lub tau w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) zmieniają się wraz z postępem choroby u pacjentów. W niniejszej pracy prezentujemy udoskonaloną technikę punkcji cysterny wielkiej w celu seryjnego pobierania próbek CSF od myszy.

Technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cysterny wielkiej u myszy

Źródło: Bisht, K., et. al. Korelacyjne światło i mikroskopia elektronowa w celu zbadania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi. J. vis. exp. (2016) Ten film przedstawia wizualizację i mapowanie płytek amyloidowych znakowanych metoksy-X04 w mózgu myszy z chorobą Alzheimera sekcje wykorzystujące mikroskopię fluorescencyjną i jasne pole, umożliwiające precyzyjną korelację blaszek ze strukturami anatomicznymi w celu badania patologii choroby Alzheimera.

Wizualizacja i mapowanie blaszek amyloidowych znakowanych metoksy-X04 w sekcji mózgu myszy z chorobą Alzheimera

Źródło: Arango-Lievano, M. et. al., Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje obrazowanie dwufotonowe in vivo w celu wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie blaszek amyloidowych i naczyń mózgowych. Niebieska fluorescencja oznacza blaszki miażdżycowe, podczas gdy zielona fluorescencja podkreśla naczynia krwionośne mózgu. Mapa 3D obszaru zainteresowania i obrazowanie mozaikowe o wysokiej rozdzielczości ujawniają szczegółowe...

Obrazowanie in vivo naczyń mózgowych i blaszek amyloidowych w mysim modelu choroby Alzheimera

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Model zwierzęcy z wstrzyknięciem β amyloidu (Aβ) umożliwia podawanie określonej ilości i gatunku fragmentów Aβ oraz redukuje indywidualne różnice w każdej badanej grupie. Protokół ten opisuje wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV) bez instrumentów stereotaktycznych, umożliwiając wytwarzanie nieprawidłowości behawioralnych podobnych do choroby Alzheimera u normalnych myszy.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera

Tutaj opisujemy konfigurację, nawigację po oprogramowaniu i analizę danych dla przestrzennie i czasowo precyzyjnej metody pomiaru tonicznych i fazowych zmian zewnątrzkomórkowego glutaminianu in vivo za pomocą układów mikroelektrod połączonych enzymami (MEA).

Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

Opisane tutaj jest etapowe, behawioralne podejście przesiewowe, które może być użyte do badania przesiewowego pod kątem związków wykazujących skuteczność in vivo na poznawcze i funkcjonalne zachowania motoryczne w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Metody te są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych związków pod kątem aktywności w zadaniach pamięci krótkotrwałej i roboczej.

Ocena spontanicznej przemiany, rozpoznawania nowych obiektów i zaciskania kończyn w transgenicznych mysich modelach β amyloidu i neuropatologii tau

Obecny protokół opisuje i porównuje procedurę przeprowadzania analizy całego regionu lub podregionu zainteresowania odcinków mózgu myszy strzałkowej w celu ilościowego określenia obciążenia beta-amyloidu w transgenicznym mysim modelu choroby Alzheimera APP/PS1.

Pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy

Jedną z cech choroby Alzheimera jest podwyższony poziom peptydu Aβ1-42. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych oligomerów Aβ1-42, które upośledzają długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w hipokampie, będące komórkowym korelatem pamięci. Procedura ta jest przydatna do badania mechanizmów patologii indukowanej przez Aβ oraz do przesiewowego badania leków.

Przygotowanie oligomerów β-amyloidu1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa

Aptamery to krótkie oligonukleotydy rybo- lub deoksyrybonukleinowe, wyselekcjonowane metodami ewolucji in-vitro na podstawie powinowactwa do konkretnego celu. Aptamery są narzędziami rozpoznawania molekularnego o wszechstronnych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych i badawczych. Prezentujemy metody selekcji aptamerów przeciwko białku amyloid β, czynnikowi sprawczemu choroby Alzheimera.

Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera

Poznaj metody wykrywania blaszek neurytycznych w mysim modelu choroby Alzheimera przy użyciu barwienia immunohistochemicznego 4G8 oraz thioflavin S. Techniki te umożliwiają precyzyjną wizualizację złogów białka amyloidowego β.

Wykrywanie blaszek neurytycznych w modelu mysim choroby Alzheimera

Przeglądaj więcej filmów