Name: Nadzór nad ptasią grypą za pomocą kart FTA: rozwiązane metody terenowe, bezpieczeństwo biologiczne i problemy związane z transportem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Poznaj metodę izolacji i identyfikacji wirusa ptasiej grypy z próbek kałowych dzikich ptaków przy użyciu kart FTA. Technika umożliwia bezpieczne przechowywanie RNA bez łańcucha chłodniczego i obsługi zakaźnych wirusów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bertowi Dibbits za pomoc techniczną. Grupa Hodowli i Genomiki Zwierząt na Uniwersytecie Wageningen w Holandii gościnnie udostępniła nam swoje laboratorium. Dziękujemy personelowi Obserwatorium Ptaków w Ottenby w Szwecji za odławianie i pobieranie próbek od krzyżówek, w szczególności Magnusowi Hellströmowi, Marcusowi Danielssonowi, Christopherowi Magnussonowi i Stinie Andersson. Dziękujemy Sanne Svensson, Jonatanowi Qvistowi i Per-Axelowi Gjöres za filmowanie w Ottenby oraz Mano Camon za filmowanie w laboratorium. Daniel Bengtson dostarczył piękne fotografie kaczek do części wideo tej publikacji. Wykorzystano również bezpłatne materiały z biblioteki obrazów zdrowia publicznego CDC (PHIL; <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a>): mikrografię elektronową (nr 280; autorstwa dr. Erskine'a Palmera) oraz ilustrację (nr 11823; autorstwa Douglasa Jordana) wirusa grypy. Wsparcie finansowe zapewnili KNJV (Królewskie Holenderskie Stowarzyszenie Myśliwych), holenderskie Ministerstwo Rolnictwa, Faunafonds oraz fundacje Stichting de Eik (obie w Holandii), Szwedzka Rada Badawcza (grant nr 2007-20774) oraz finansowany przez WE projekt Newflubird. Odczynniki do izolacji RNA zostały przekazane w ramach darowizny przez firmę Ambion, Inc. Jest to wkład nr 245 z Obserwatorium Ptaków w Ottenby.

1. Odłow kaczek i pobieranie wymazów z kloaki
<ol>
 <li>Odłowić kaczki wiosłujące z rodzaju Anas (lub inne ptaki) do klatki, wabiąc je kaczami wabićmi lub pokarmem, a następnie umieścić je w oddzielnych kartonowych pudełkach. Czas transportu w pudełku powinien być ograniczony do minimum, na przykład poprzez utworzenie stacji terenowej w niewielkiej odległości od pułapki. Okoliczności logistyczne mogą się różnić w zależności od badania. Dla każdej nowej konfiguracji należy uzyskać poradę i zgodę właściwej komisji etyki ds. zwierząt. Alternatywnie można pobierać próbki od ptaków zastrzelonych przez myśliwych.</li>
 <li>Wyjąć kaczkę z pudełka, mocno przytrzymując jej skrzydła przy ciele. Pobrać świeżą odchodnią, która w większości przypadków będzie znajdować się bezpośrednio na dnie pudełka. Zebrać ją za pomocą sterylnego wymazika i nanieść ciecz na kartę Whatman FTA. W przeciwnym razie należy wykonać wymaz z kloaki.</li>
 <li>Położyć kaczkę na grzbiecie. Umożliwia to dostęp do kloaki i ułatwia pobieranie próbek. Kloaka to wystająca struktura znajdująca się pod brzuchem, blisko nasady ogona. Doświadczona osoba może jednocześnie trzymać ptaka i pobierać próbkę, w przeciwnym razie może pomóc druga osoba.</li>
 <li>Ostrożnie wprowadzić sterylny plastikowy wymazik z rayonu (Copan, Włochy) na głębokość około 1 cm i delikatnie nim zakręcić w kloace. Przetoczyć wymazik z cieczą z kloaki po powierzchni karty Whatman FTA. Po pobraniu próbki zaleca się niezwłoczne zwolnienie zwierzęcia.</li>
 <li>Suszyć karty FTA w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 h, a następnie przechowywać każdą próbkę oddzielnie w papierowych torebkach (np. kopertach). Przechowywanie jest możliwe w temperaturze pokojowej, ewentualnie z dodatkiem kulek krzemionkowych w wilgotnym klimacie. Inspektorzy ds. bezpieczeństwa biologicznego instytucji wysyłającej i odbierającej mogą zezwolić na wysyłkę kart FTA pocztą zwykłą, ponieważ patogeny stają się nieaktywne po kontakcie z powierzchnią karty FTA.</li>
</ol>
2. Izolacja RNA wirusa
<ol>
 <li>Wyodrębnić materiał z karty FTA, w tym kał/płyn z kloaki. Wyciąć trzy krążki za pomocą dziurkacza Harris 2 mm i umieścić je w dołku wolnej od RNaz płytki 96-dołkowej. Pomiędzy kolejnymi próbkami należy starannie oczyścić dziurkacz alkoholem i chusteczką Kim precision wipe (Kimtech). Zawsze należy stosować kontrole pozytywne i negatywne. Kontrola pozytywna może składać się ze szczepu laboratoryjnego świeżo naniesionego na kartę FTA lub z próbki naturalnej, o której wiadomo, że daje wynik pozytywny. Jako kontrolę negatywną należy wykorzystać krążki wycięte z pustej karty FTA. Dodatkowo należy pozostawić jeden wolny dołek dla kontroli PCR w późniejszym etapie eksperymentu (z wodą jako matrycą).</li>
 <li>Dodać 70μl roztworu do szybkiej ekstrakcji RNA (Ambion) i zgrzać płytkę termicznie (AbGene Thermo-Sealer). Inkubować przez 5 minut na potrząsarku do płytek w temperaturze pokojowej z prędkością, która nie powoduje rozlewania się cieczy (zależy to od modelu potrząsarki; należy przetestować wcześniej).</li>
 <li>Przeprowadzić izolację wirusowego RNA zgodnie z protokołami producenta przy użyciu zestawu MagMAX-96 viral RNA isolation kit (Ambion). W skrócie: do każdego dołka dodać 130μl przygotowanego roztworu lizującego/wiążącego (z zestawu). Przenieść 50μl wyekstrahowanego materiału z karty FTA do każdego dołka. Potrząsać płytką przez 1 minutę.</li>
 <li>Dodać 20μl przygotowanej mieszaniny kulek (z zestawu) do każdej próbki i wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Potrząsać z określoną prędkością przez 5 minut. Cząsteczki RNA zwiążą się z kulkami magnetycznymi.</li>
 <li>Przenieść płytkę na magnetyczny statyw 96-dołkowy w celu wychwycenia kulek. W zależności od modelu statywu magnetycznego może to zająć ponad 5 minut. Gdy roztwór stanie się całkowicie przejrzysty, usunąć i odrzucić nadsącz. Następnie zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego.</li>
 <li>Przemyć kulki dwukrotnie roztworem do mycia 1 i dwukrotnie roztworem do mycia 2 (z zestawu). W każdym z 4 etapów mycia dodać 150μl przygotowanego roztworu do mycia do każdej próbki, potrząsać przez 1 minutę z określoną prędkością, przenieść płytkę na statyw magnetyczny, wychwytywać kulki przez około 5 minut (lub do momentu, aż roztwór stanie się całkowicie przejrzysty), a następnie usunąć i odrzucić nadsącz. Następnie zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego, dodać kolejny roztwór do mycia i przeprowadzić etapy mycia w ten sam sposób. Po ostatnim etapie mycia usunąć jak najwięcej roztworu do mycia i osuszyć kulki na powietrzu w temperaturze pokojowej na potrząsarce przez 2 minuty.</li>
 <li>Dodać 50μl buforu elucyjnego (z zestawu), aby uwolnić RNA z kulek, i potrząsać przez 4 minuty na potrząsarce do płytek. Wychwycić kulki w sposób opisany wcześniej. Nadsącz zawiera teraz wyizolowane RNA, które jest gotowe do dalszych zastosowań.</li>
</ol>
3. RT-PCR genu matrycy AIV
Przeprowadź reakcję odwrotnej transkrypcji i PCR (RT-PCR) z wykorzystaniem systemu One-Step Access RT-PCR (Promega) w objętości reakcji 25 μl (zmodyfikowano na podstawie Kraus et al.18 oraz Fouchier et al.22):
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Woda wolna od nukleaz</td>
 <td>1.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor AMV/Tfl5</td>
 <td>5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs</td>
 <td>0.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>starter M52C22 (10 μM)</td>
 <td>2.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>starter M253R22 (10 μM)</td>
 <td>2.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4 (25 mM)</td>
 <td>7μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Odwrotna transkryptaza AMV (5u/μl)</td>
 <td>0.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polimeraza Tfl (5u/μl)</td>
 <td>0.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Próbka RNA</td>
 <td>5μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Warunki PCR w termocyklerze Biometra T1 są następujące: wstępna odwrotna transkrypcja przez 45 minut w 45°C, a następnie wstępna denaturacja przez 2 minuty w 94°C oraz 40 cykli obejmujących: 94°C przez 1 minutę, 56°C przez 1 minutę i 68°C przez 2 minuty. Amplifikację kończy dodatkowa elongacja przez 7 minut w 68°C.
4. Przesiewanie próbek pozytywnych pod kątem AI oraz oczyszczanie docelowych fragmentów z żelu
<ol>
 <li>W celu wstępnej selekcji nanieś 2μl produktu PCR zmieszanego z 2μl barwnika do nakładania 5x (BioRad) i 6μl wody na żel agarozowy 1% (Roche) zabarwiony 1% bromkiem etydyny (2,5μl na 100 ml żelu).</li>
 <li>Elektroforezę prowadź przez 1 godzinę przy napięciu 120V, stosując marker wielkości DNA (BioRad EZ load 100 bp ladder); obraz uzyskaj za pomocą systemu dokumentacji żeli. Przykład przedstawiono na Rysunku 1.</li>
 <li>Wybierz próbki z fragmentami amplifikowanymi w oczekiwanym zakresie wielkości (między 200 bp a 300 bp; fragment docelowy ma 244 bp). Całą objętość mieszaniny PCR (pozostało ok. 23μl) tych kandydatów zmieszaj z 6μl barwnika do nakładania 5x i nanieś na żel agarozowy zabarwiony 2% bromkiem etydyny, a następnie prowadź elektroforezę przez 2 godziny.</li>
 <li>Umieść żel na transiluminatorze UV (Bioblock Scientific) i dokonaj oceny wizualnej. Przykład przedstawiono na Rysunku 2. Wytnij skalpelem prążki o prawidłowej wielkości i umieść je w oddzielnych probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml. Oczyść fragmenty z żelu, np. za pomocą zestawu Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research).</li>
</ol>
5. Sekwencjonowanie i identyfikacja produktów PCR
<ol>
 <li>Przeprowadź sekwencjonowanie metodą Sangera fragmentów docelowych, np. na sekwenatorze kapilarnym ABI 3730 z wykorzystaniem chemii ABI Big Dye 3.1 (Applied Biosystems). Przygotuj reakcje sekwencjonowania w objętościach 10μl zawierających 10-20 ng oczyszczonego w żelu cDNA matrycowego, 1,75μl buforu rozcieńczającego 5x, 0,5μl premiksu Big Dye V3.1, 1 μl primera forward (M52C20, 10 mM) oraz ddH2O. Warunki cykliczności to: 1 min wstępnej denaturacji, a następnie 25 cykli: 10 s w 96°C, 5 s w 45°C i 4 min w 60°C. Oczyść i przygotuj reakcję sekwencjonowania zgodnie z wewnętrznymi protokołami.</li>
 <li>Zidentyfikuj otrzymane sekwencje cDNA w bazach danych nukleotydów, takich jak GenBank23, np. za pomocą narzędzi internetowych, takich jak BLAST w National Centre for Biotechnology Information (NCBI, <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a>).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Kaczki krzyżówki (Anas platyrhynchos) zostały pobrane w obserwatorium ptaków w Ottenby w grudniu 2007 roku. Od każdej kaczki pobrano próbkę na kartę FTA zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Po transporcie karty FTA były przechowywane w zamrażarce w temperaturze -20°C przez dwa lata. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano tę samą próbkę z karty FTA izolatu laboratoryjnego badanego przez Kraus et al.18, a także dziewięć jego dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych. Dwie kontrole negatywne stanowiły: i) ekstrakcję z pustej karty FTA, aby sprawdzić, czy wystąpiło zanieczyszczenie krzyżowe z dziurkacza, oraz ii) reakcję RT-PCR, w której jako matrycę zastosowano wodę wolną od nukleaz, aby sprawdzić, czy doszło do kontaminacji podczas przygotowania lub w trakcie reakcji PCR.
Przeanalizowano 84 próbki. Zdjęcie żelu z produktami PCR z tych 84 próbek znajduje się na Rysunku 1. W próbkach naturalnych można zaobserwować liczne nieswoiste prążki ze względu na obecność różnych zanieczyszczeń mikrobiologicznych w kałach. Jednak docelowy fragment dla pary starterów ma długość 244 bp. Na żel naniesiono całą objętość reakcji PCR z podzbioru próbek, w których powstały fragmenty o rozmiarze zbliżonym do prawidłowego (między 200 bp a 300 bp) (Rysunek 1). Ilustracja przedstawiająca, które prążki zostały wycięte z żelu, znajduje się w Suplementary Figure 1. Oprócz kontroli pozytywnej, dwie z tych próbek (69899 i 69912) okazały się pozytywne zgodnie z nowym protokołem. Analiza BLAST w bazie nukleotydów NCBI wykazała, że są to geny macierzy AI (Rysunek 3), podczas gdy wszystkie pozostałe prążki najbardziej przypominały sekwencje bakteryjne lub w ogóle nie dały czytelnej sekwencji.
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej, rozdział prążków DNA, analiza produktów PCR, schemat biologii molekularnej." src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zdjęcie żelu z wstępnego przesiewu produktów PCR. Naniesiono 2 μl produktu PCR kontroli dodatniej, rozcieńczenia szeregowe kontroli dodatniej, dwie kontrole ujemne oraz 84 próbki z kloaki. 48 próbek przedstawiono na górnym panelu żelu, a 48 próbek na panelu dolnym. Czerwone strzałki wskazują ścieżki żelu wykorzystane do markeru wielkości DNA 100 bp. Na ilustracji czerwone okręgi wskazują prążki w oczekiwanym zakresie wielkości. Niebieskie okręgi wskazują nieswoisty amplikon (lewy górny róg) lub artefakt w postaci dimerów starterów o wielkości poniżej 100 bp (prawy dolny róg).
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; rozdział DNA; widoczna drabina molekularna; identyfikacja próbek." src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wybór próbek z fragmentami w odpowiednim zakresie wielkości. Wybrano próbki z prążkami pomiędzy 200 bp a 300 bp (docelowy fragment 244 bp). Zielona strzałka wskazuje kontrolę pozytywną, a dwie czerwone strzałki wskazują próbki, których pozytywny wynik pod kątem AIV został potwierdzony poprzez porównanie sekwencji cDNA z bazą nukleotydową NCBI.
<img alt="Tabela wyników BLASTN dla dopasowania sekwencji nukleotydowej, pokazująca gatunki, wartości E oraz wyniki tożsamości." src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Zrzut ekranu reprezentacyjnego wyszukiwania BLAST w bazie NCBI. Jedna z sekwencji cDNA uzyskanych z wyciętych fragmentów została przeszukana w bazie nukleotydowej na stronie internetowej NCBI. Próbka została prawidłowo zidentyfikowana jako fragment genu AI Matrix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">Aby wyświetlić obraz w pełnym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej; rozdział DNA; wzór prążków; drabinka mas cząsteczkowych." src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina uzupełniająca 1"> 
Rycina uzupełniająca S1. Prążki wybranych próbek wycięte z żelu. Zdjęcie to wykonano z żelu przedstawionego na Rycini 1 po wycięciu prążków kandydujących o wielkości od 200 bp do 300 bp.

<ol><li>Pulido, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+evolution+of+avian+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BioScience%22%5BJournal%5D)">The genetics and evolution of avian migration.</a> BioScience. 57, 165-174 (2007).</li>
<li>Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza%3A+An+ecological+and+evolutionary+perspective+for+waterbird+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Waterbirds%22%5BJournal%5D)">Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists.</a> Waterbirds. 29, 243-257 (2006).</li>
<li>Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+virulence+of+the+1918+%22Spanish%22+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Philos.+Soc%22%5BJournal%5D)">The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus.</a> Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).</li>
<li>Butler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swine+flu+goes+global%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Swine flu goes global.</a> Nature. 458, 1082-1083 (2009).</li>
<li>Normile, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza.+Wild+birds+only+partly+to+blame+in+spreading+H5N1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1.</a> Science. 312, 1451-14 (2006).</li>
<li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+dynamics+of+global+H5N1+outbreaks+match+bird+migration+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Geospat.+Health%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns.</a> Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).</li>
<li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+the+spread+of+the+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+virus+in+wild+birds+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe.</a> Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+dissemination+of+H5N1+viruses+isolated+during+an+influenza+outbreak+in+migratory+waterfowl+in+Western+China%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China.</a> J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).</li>
<li>Gaidet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza+viruses+in+water+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Africa.+Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Avian influenza viruses in water birds.</a> Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+in+migratory+birds+and+evidence+of+limited+intercontinental+virus+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange.</a> PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).</li>
<li>Parmley, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+bird+influenza+survey%2C+Canada%2C+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Wild bird influenza survey, Canada, 2005.</a> Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).</li>
<li>Wallensten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+influenza+A+virus+in+migratory+waterfowl+in+northern+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).</li>
<li>Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+high-throughput+influenza+A+virus+surveillance+studies+of+wild+birds+by+use+of+molecular+diagnostic+tests%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).</li>
<li>Latorre-Margalef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+influenza+A+virus+infection+on+migrating+mallard+ducks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).</li>
<li>Runstadler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RRT-PCR+analysis+and+virus+isolation+to+determine+the+prevalence+of+avian+influenza+virus+infections+in+ducks+at+Minto+Flats+State+Game+Refuge%2C+Alaska%2C+during+August+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005.</a> Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).</li>
<li>Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+preservative+on+recoverable+RT-PCR+amplicon+length+from+influenza+A+virus+in+bird+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces.</a> Avian Dis. 51, 965-968 (2007).</li>
<li>Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sample+type%2C+temperature+and+RNAlater+%28TM%29+on+the+stability+of+avian+influenza+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA.</a> J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).</li>
<li>Kraus, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza+surveillance%3A+On+the+usability+of+FTA+cards+to+solve+biosafety+and+transport+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Wildfowl%22%5BJournal%5D)">Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues.</a> Wildfowl. , 215-223 (2009).</li>
<li>Smith, L. M., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting%2C+archiving+and+processing+DNA+from+wildlife+samples+using+FTA+databasing+paper%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecol%22%5BJournal%5D)">Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper.</a> BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).</li>
<li>Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription+of+an+RNA+genome+from+databasing+paper+%28FTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA).</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).</li>
<li>Rogers, C., Burgoyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+typing%3A+Storing+and+processing+of+stabilized+reference+bacteria+for+polymerase+chain+reaction+without+preparing+DNA+-+An+example+of+an+automatable+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure.</a> Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).</li>
<li>Fouchier, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+influenza+a+viruses+from+different+species+by+PCR+amplification+of+conserved+sequences+in+the+matrix+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene.</a> J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).</li>
<li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Res. 38, 46-51 (2009).</li>
<li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li>
<li>Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li>
<li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Pathol%22%5BJournal%5D)">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li>
</ol>

Odławianie, obchodzenie się i pobieranie próbek od ptaków odbywało się zgodnie z krajowym ustawodawstwem i zostało zatwierdzone przez Szwedzką Radę Rolnictwa oraz komisję etyki ds. zwierząt laboratoryjnych.

Opisany tutaj protokół stanowi pomocniczą metodę przesiewową w celu wykrycia AIV w próbkach kału lub próbkach o podobnym charakterze. Został on zaprojektowany w taki sposób, aby pobieranie próbek było szybkie i łatwe. Dzięki temu osoby z mniejszym doświadczeniem, takie jak myśliwi lub opiekunowie dzikich zwierząt, mogą brać udział w nadzorze nad AI. Nie jest wymagane stosowanie łańcucha chłodniczego, choć w miarę możliwości zaleca się zamrażanie próbek. Przechowywanie w temperaturze pokojowej przez kilka dni, na przykład podczas transportu do laboratorium, nie stanowiło problemu dla cząsteczek RNA na kartach FTA, pod warunkiem, że karty pozostawały suche. Inne niechłodzone systemy przechowywania, które są obecnie oceniane przez środowisko badawcze, takie jak alkohol15 czy guanidyna16, wymagają specjalnych procedur transportowych ze względu na ich niebezpieczny charakter. W przeciwieństwie do nich, metoda z wykorzystaniem kart FTA nie wymaga transportu materiałów niebezpiecznych. Innym interesującym pod tym względem medium do przechowywania jest RNAlater™, który również nie jest niebezpieczny17. Analiza próbek może być przeprowadzona w każdym standardowym laboratorium biologii molekularnej. Nie było wymagane żadne specjalistyczne wyposażenie poza sprzętem używanym do typowych reakcji PCR i sekwencjonowania kapilarnego. Wszystkie etapy można było przeprowadzić bez zachowania poziomu biosafety, ponieważ już w momencie pobierania próbek potencjalne czynniki patogenne zostały dezaktywowane dzięki działaniu przeciwbakteryjnemu i przeciwwirusowemu karty FTA.
W naszych badaniach z wykorzystaniem próbek od dzikich ptaków nie zaobserwowano zanieczyszczeń krzyżowych ani wynikających z nich wyników fałszywie dodatnich. Niemniej jednak, przy pracy z RNA i PCR zawsze zaleca się szczególną dbałość o czystość stanowisk pracy oraz stosowanie oddzielnych pomieszczeń do etapów przed- i po-PCR. Praca w dygestorium zmniejsza ryzyko kontaminacji aerozolowej w laboratorium. Do pipetowania należy używać końcówek z filtrem.
Z poprzedniego badania próbek pobranych jednocześnie od tych samych kaczek wiadomo, że sześć z 84 próbek dało wynik dodatni w tradycyjnej metodzie RealTime RT-PCR24, a wartości Ct z badania RealTime RT-PCR są znane. Dwie próbki dodatnie wykryte naszą metodą pochodzą od kaczek, które miały wartości Ct &lt;30 (co wskazuje na wysokie stężenie viralnego RNA). Pozostałe cztery próbki, które były dodatnie w tradycyjnym protokole, miały wartości Ct &gt;30 (niższe stężenie) i nie mogły zostać wykryte za pomocą naszego protokołu.
W naszym teście pozytywny wynik uzyskano jedynie dla próbek o stosunkowo wysokich mianach wirusa i prawdopodobnie to czułość metody była przyczyną niepowodzenia w wykryciu wszystkich próbek pozytywnych. Ponadto wielkość próby w obecnym badaniu była bardzo mała; metoda może zostać w pełni opracowana i oceniona, jeśli zostaną przeprowadzone bardziej kontrolowane i rygorystyczne eksperymenty. Jednakże, gdyby próbki te zostały pobrane z odległego obszaru, tradycyjna analiza nie byłaby w ogóle możliwa. Dodatkowo pierwsze wyniki te pochodzą z eksperymentów pilotażowych, które wymagają dalszej optymalizacji. Dwuletni okres przechowywania w zwykłej zamrażarce w temperaturze -20°C po pobraniu próbek prawdopodobnie wpłynął również na jakość wirusowego RNA. Ta możliwa degradacja RNA jest istotnym problemem w przypadku przechowywania inaktywowanych wirusów w temperaturze pokojowej. Próbki przechowywane w alternatywnych cieczach, o których wspomniano powyżej, ulegają znacznej degradacji, co wpływa na analizę dłuższych fragmentów genomu wirusa16. Choć nie zostały one przetestowane w naszym badaniu, karty FTA okazały się odpowiednie do zachowania nienaruszonych cząsteczek RNA w innych systemach RNA, które są bardzo podobne do wirusów grypy ptaków25, 26.

<table><tbody><tr><td>Plastikowy suchy wymaz z wiskozy</td><td>Copan, Italy</td><td>167KS01</td><td></td></tr><tr><td>Karta FTA</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td></td><td>kilka opcji</td></tr><tr><td>Mikropunch Harris 2mm z matą</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1154409</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa wolna od RNaz</td><td>Greiner Bio-One</td><td>652290</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Chusteczki precyzyjne Kim</td><td>Kimtech</td><td>75512</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do szybkiej ekstrakcji RNA</td><td>Ambion</td><td>AM9775</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji wirusowej MagMAX-96</td><td>Ambion</td><td>AM1836</td><td></td></tr><tr><td>System One-Step Access RT-PCR</td><td>Promega Corp.</td><td>A1250</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Agaroza MP</td><td>Roche Group</td><td>1388991001</td><td>agaroza wielozadaniowa</td></tr><tr><td>Bufor do ładowania 5x</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>dostarczany z drabiną DNA</td></tr><tr><td>Drabina DNA EZ load 100 bp</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8353</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Bromek etydyny 1%</td><td>Fluka</td><td>46067</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Probówki reakcyjne 1,5ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Zestaw do odzyskiwania DNA z żelu Zymoclean</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4001</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Chemia ABI big dye 3.1</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>lub odpowiednik</td></tr></tbody></table>

nadzór nad grypą ptaków z wykorzystaniem kart fta: rozwiązanie problemów związanych z metodami terenowymi, bezpieczeństwem biologicznym i transportem

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Wirusy grypy ptaków (AIVs) infekują wiele ssaków, w tym ludzi1. Wirusy te wykazują dużą różnorodność u swoich naturalnych gospodarzy, obejmując niemal wszystkie możliwe podtypy wirusowe2. Pandemie grypy u ludzi wywodzą się pierwotnie z AIVs3. W ostatnich latach zgłoszono wiele śmiertelnych przypadków u ludzi podczas epidemii H5N1. Niedawno populację ludzi ogarnął nowy szczep spokrewniony z AIV, wywołując „epidemię grypy świńskiej”4. Choć za rozprzestrzenianie się szczepów silnie patogennych zdaje się odpowiadać handel i transport realizowany przez ludzi5, dyspersję można przypisać częściowo również dzikim ptakom6, 7. Niemniej jednak rzeczywistym rezerwuarem wszystkich szczepów AIV są dzikie ptaki.
W odpowiedzi na tę sytuację oraz w obliczu dotkliwych strat komercyjnych w przemyśle drobiarskim, na całym świecie wdrożono rozległe programy nadzoru w celu gromadzenia informacji o ekologii AIV oraz instalacji systemów wczesnego ostrzegania pozwalających na wykrycie określonych szczepów wysokozjadliwych8-12. Tradycyjne metody wirusologiczne wymagają, aby wirusy pozostały nienaruszone i zostały namnożone przed analizą. Wiąże się to z koniecznością zachowania rygorystycznego łańcucha chłodniczego z użyciem zamrażarek niskotemperaturowych oraz stosowania surowych procedur bezpieczeństwa biologicznego podczas transportu. W związku z tym długoterminowy nadzór jest zazwyczaj ograniczony do kilku stacji terenowych znajdujących się w pobliżu dobrze wyposażonych laboratoriów. Pobieranie próbek z obszarów oddalonych jest niemożliwe, chyba że wdroży się logistycznie uciążliwe procedury. Problemy te zostały zidentyfikowane13, 14, a badano możliwość zastosowania alternatywnych strategii przechowywania i transportu (alkohole lub guanidyna)15-17. Niedawno Kraus et al.18 wprowadzili metodę pobierania, przechowywania i transportu próbek AIV opartą na specjalnym papierze filtracyjnym. Karty FTA19 konserwują RNA w formie suchej20 i dezaktywują patogeny w momencie kontaktu21. Badanie to wykazało, że karty FTA mogą być wykorzystywane do wykrywania RNA AIV za pomocą RT-PCR oraz że otrzymane cDNA można sekwencjonować w celu określenia genów wirusa.
W badaniu Kraus et al.18 wykorzystano izolat laboratoryjny AIV, a próbki przetwarzano indywidualnie. W rozszerzeniu przedstawionym w niniejszym opracowaniu bezpośrednio przetestowano próbki kału dzikich ptaków z pułapki na kaczki w Obserwatorium Ptaków w Ottenby (SE Szwecja), aby zilustrować przydatność tych metod w warunkach terenowych. Przedstawiono sposób odłowu kaczek oraz pobierania próbek za pomocą wymazów z kloaki. Obecny protokół obejmuje skalowanie przepływu pracy z przetwarzaniem pojedynczych probówek na projekt w formacie 96-dołkowym. Choć metoda z wykorzystaniem kart FTA jest mniej czuła niż metody tradycyjne, stanowi doskonałe uzupełnienie dużych systemów nadzoru. Umożliwia ona zbieranie i analizę próbek z dowolnego miejsca na świecie, bez konieczności zachowania łańcucha chłodniczego czy stosowania przepisów bezpieczeństwa dotyczących transportu odczynników niebezpiecznych, takich jak alkohol czy guanidyna.

Zwalidowano i rozszerzono metodę konserwacji, detekcji i sekwencjonowania RNA wirusów grypy ptasiej, wykorzystując naturalne próbki odchodów ptaków. Technika ta eliminuje konieczność zachowania łańcucha chłodniczego oraz obchodzenia się z zakaźnymi wirusami i może być zastosowana w wysokoprzepustowym układzie 96-dołkowym.

Nadzór nad grypą ptaków z wykorzystaniem kart FTA: rozwiązanie problemów związanych z metodami terenowymi, bezpieczeństwem biologicznym i transportem

Wirusy grypy ptasiej (AIV) zakażają wiele ssaków, w tym ludzi1. Wirusy te wykazują dużą różnorodność u swoich naturalnych gospodarzy, przenosząc niemal wszystkie możliwe wirusowe ...

Pandemie grypy u ludzi, w tym niedawna epidemia grypy świńskiej, wywodziły się pierwotnie z wirusa grypy ptasiej, A IV, który jest gatunkiem wirusa grypy A. Wdrożono rozległe programy nadzoru w celu gromadzenia informacji na temat ekologii A IV oraz wykrywania szczepów o wysokiej patogenności. W tym filmie zaprezentowano metodę izolacji i identyfikacji próbek A IV z dzikich ptaków.W pierwszej kolejności odłowiono kaczki. Zebrano ich odchody i nanieśli je na kartę FTA, która umożliwia przechowywanie viralnego RNA w stanie suchym. Z kart FTA pobrano próbki i wyekstrahowano materiał fekalny. Następnie wyekstrahowano RNA, a do jego oczyszczania wykorzystano kulki magnetyczne.Reakcję RT-PCR przeprowadza się w celu otrzymania cDNA, które następnie poddaje się sekwencjonowaniu. Uzyskane sekwencje są następnie porównywane ze znanymi sekwencjami a IV, aby zidentyfikować typ a IV obecny w próbkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak namnażanie wirusów zakaźnych, jest brak konieczności utrzymywania rygorystycznych warunków hodowli oraz łatwość pobierania próbek z obszarów oddalonych.Ponadto łatwiejsze jest wdrażanie przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu kart FDA. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny ekologii chorób, takie jak to, które szczepy grypy występują w danym miejscu. Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji w badaniach nad grypą ptaków.Metodę tę można zastosować również w innych systemach, np. w przypadku różnych chorób dzikich zwierząt wywołanych przez wirusy i inne mikroorganizmy. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie będą napotykać trudności, ponieważ chwytanie i pobieranie próbek od żywych kaczek lub innych ptaków wymaga praktyki, a praca laboratoryjna z RNA jest skomplikowana. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po raz pierwszy, gdy z powodzeniem pobraliśmy próbki i wyizolowaliśmy zwykłe DNA z odchodów zwierząt przechowywanych na filtrach Whatman FDA; pułapki na kaczki kręgośowate lub inne ptaki polegają na ich zwabieniu do klatki za pomocą kaczek domowych lub pokarmu.W tym etapie odłowione zostają kaczki z rodzaju onus. Umieść kaczki z pułapek w oddzielnych kartonowych pudełkach. Wyjmij kaczkę z pudełka, mocno przytrzymując jej skrzydła przy ciele.W większości przypadków na dnie pudełka będą znajdować się świeże, płynne odchody. Używając za każdym razem nowego jałowego tampona, należy zebrać odchody i nanieść je na kartę watman FTA, aż powierzchnia docelowa karty zostanie nasycona. Jeśli na dnie pudełka nie ma odchodów, należy przeprowadzić wymaz z kloaki.Najpierw należy położyć kaczkę na brzuchu, tak aby grzbiet był skierowany do góry, co umożliwi dostęp do kloaki. Kloaka to wystająca struktura znajdująca się pod brzuchem, blisko podstawy ogona. Doświadczona osoba może jednocześnie trzymać ptaka i pobierać próbkę, jeśli jest to konieczne.Druga osoba może pomagać w pobieraniu próbki, podczas gdy pierwsza osoba trzyma ptaka. Ostrożnie wprowadź sterylny plastikowy wymaz z rayonu na głębokość około jednego centymetra i wykonaj delikatny wymaz z okolicy kloaki. Wyjmij wymaz, a następnie przetocz go po powierzchni karty Whatman FTA.Suszyć karty FTA w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Każdą próbkę umieścić w papierowej kopercie. Następnie przechowywać koperty w temperaturze pokojowej w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub zamrozić je na dłuższy czas.Karty FTA mogą być przesyłane zwykłą pocztą, ponieważ patogeny ulegają inaktywacji. Pracując pod wyciągiem, należy wejść w kontakt z powierzchnią karty FTA. Procedurę izolacji viralnego RNA należy rozpocząć od wycięcia materiału z karty FTA, w tym kału, używając dziurkacza Harrisa o średnicy 2 mm; należy wyciąć trzy krążki i umieścić je wszystkie w dołku wolnej od RNaz płytki 96-dołkowej, zachowując odstęp między kolejnymi próbkami.Należy starannie oczyścić dziurkacz za pomocą alkoholu i chusteczki Kim precision. W celu przygotowania kontroli pozytywnej, należy nanieść szczep laboratoryjny na kartę FTA jako kontrolę negatywną.Wykrawaj krążki z pustej karty FTA. Umieść je w płytce w taki sam sposób jak poprzednio, pamiętając o pozostawieniu dodatkowego dołka dla kontroli PCR. W późniejszym etapie eksperymentu dodaj do dołka 70 µL roztworu do szybkiej ekstrakcji RNA.Następnie za pomocą zgrzewarki termicznej zgrzej płytkę, umieść ją na wytrząsarce i ustaw prędkość, upewniając się, że nie spowoduje to rozlania zawartości. Inkubuj płytkę w warunkach wytrząsania w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji wykorzystaj zestaw ambience Mag Max 96, aby wyizolować viralne RNA, dodając do każdej studni pustej płytki z zestawu 130 µL przygotowanego roztworu lizy i wiązania dołączonego do zestawu.Następnie przenieś 50 µL wyekstrahowanego materiału z karty FDA do każdego dołka. Umieść płytkę na wytrząsarce na jedną minutę. Dalej, dodaj 20 µL przygotowanej mieszaniny kulek z zestawu do każdej próbki i wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie wytrząsaj przez pięć minut.Podczas tej inkubacji cząsteczki RNA zwiążą się z kuleczkami magnetycznymi. Następnie, po całkowitym przezroczystym stanie roztworu, przenieś płytkę na magnetyczny stojak do płytek 96-dołkowych w celu wychwycenia kuleczek.Za pomocą pipety odessać i usunąć nadsącz. Następnie wyjąć płytkę ze stojaka magnetycznego. Przemyć kuleczki, dodając 150 µL przygotowanego roztworu płuczącego do każdej próbki, potrząsnąć przez jedną minutę, a następnie uchwycić kuleczki na stojaku magnetycznym.Gdy roztwór stanie się całkowicie przejrzysty, usunąć i odrzucić nadsącz. Powtórzyć to płukanie raz. Następnie wykonać dwa płukania przy użyciu roztworu dwa.Po ostatnim płukaniu za pomocą pipety odessać jak najwięcej roztworu, a następnie umieścić suchą płytkę na wytrząsarce na dwie minuty w temperaturze pokojowej, aby osuszyć kuleczki powietrzem. Po wyschnięciu kuleczek dodać 50 µL buforu do elucji z zestawu i wytrząsać przez cztery minuty, aby uwolnić RNA z kuleczek. Odzyskać kuleczki w taki sam sposób jak poprzednio.Nadosad zawiera obecnie wyizolowane RNA, które jest gotowe do dalszych zastosowań w celu generowania i amplifikacji cDNA genów wirusowych. Przeprowadź reakcję odwrotnej transkrypcji i PCR, wykorzystując system one step access R-T-P-C-R w reakcjach o objętości 25 µL, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym.Po zakończeniu reakcji PCR próbki można poddać przesiewowemu badaniu w kierunku obecności IV i oczyścić. Aby ustalić, czy próbki są dodatnie pod kątem IV, należy nanieść 2 µL produktu PCR na żel agarozowy o stężeniu 1%, barwiony 1% bromkiem etydium, i prowadzić elektroforezę przez jedną godzinę przy napięciu 120 V. Wyniki należy zwizualizować za pomocą systemu dokumentacji żeli, a następnie zidentyfikować próbki z fragmentami amplifikowanymi w oczekiwanym zakresie wielkości.W tym przypadku fragment docelowy ma długość 244 par zasad. Należy zatem szukać próbek z prążkami o wielkości od 200 par zasad do 300 par zasad, na przykład takich, które zostały obwiedzione czerwonym okręgiem. Następnie należy nałożyć pozostałą część reakcji PCR.Około 23 µL kandydatów naniesiono na żel agarozowy barwiony 2% bromkiem etydyny i poddano elektroforezie przez dwie godziny. Żel umieszczono na transiluminatorze UV. Następnie, za pomocą skalpela, wycięto prążki o prawidłowym rozmiarze i przeniesiono je do oddzielnych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 mL, korzystając z zestawu do odzyskiwania DNA.Oczyść DNA z fragmentów żelu w celu sekwencjonowania i identyfikacji. Przeprowadź sekwencjonowanie metodą Sangera fragmentów docelowych. Do sekwencjonowania genu macierzy A IV stosuje się starter przedni M 52 C.Po uzyskaniu wyników sekwencjonowania należy porównać sekwencje cDNA z bazami nukleotydowymi, takimi jak GenBank, wykorzystując lokalne lub internetowe narzędzia, np. program blast w National Center for Biotechnology Information, aby dopasować sekwencje fragmentów genów do istniejących wpisów. Dzięki temu można scharakteryzować konkretny szczep A IV i uzyskać cenne informacje na temat cech sekwencji.W grudniu 2007 roku w Obserwatorium Ptaków Autumn B pobrano próbki od 84 krzyżówek; od każdej kaczki pobrano próbkę na kartę FTA zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Po wysyłce karty FTA były przechowywane w zamrażarce w temperaturze -20 °C przez dwa lata. Tutaj przedstawiono zdjęcie żelu z produktami PCR z tych 84 próbek pochodzących z materiału naturalnego.Ze względu na obecność różnych zanieczyszczeń mikrobiologicznych w kałach można zaobserwować wiele niespecyficznych prążków. Fragment docelowy dla zastosowanej tutaj pary starterów ma długość 244 par zasad. Długie prążki o oczekiwanej wielkości zostały zakreślone na czerwono.Niebieskie kółka oznaczają nieswoisty amplikon lub artefakt w postaci dimeru starterów o rozmiarze poniżej 100 par zasad. Próbki wskazane czerwonymi strzałkami zostały wyizolowane i poddane sekwencjonowaniu. Zielona strzałka wskazuje kontrolę dodatnią.Potwierdzono, że wybrane próbki są dodatnie pod kątem IV, porównując ich sekwencje cDNA z bazą nukleotydową NCBI. Po opanowaniu techniki, proces ten – od załadowanej karty FDA do czystego matrycowego RNA – może zostać wykonany w ciągu dwóch godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia prac. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na czystość obszarów roboczych, stosowanie rękawiczek, rozdzielenie środowisk pracy przed i po reakcji PCR, używanie końcówek z filtrem oraz pracę pod wyciągiem bezpieczeństwa zgodnie z opisaną procedurą.Inne zastosowania w dalszych etapach, takie jak klonowanie fragmentów do wektorów, mogą posłużyć do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład czy jeden gospodarz jest zakażony wieloma szczepami grypy po opracowaniu metody. Procedura ta może utorować drogę badaczom z zakresu ekologii chorób do badania infekcji AI w odległych obszarach, gdzie pobieranie próbek AI nie było wcześniej możliwe. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak pobierać wymazy z kloaki w celu wykrycia grypy ptaków, izolować i oczyszczać cząsteczki RNA z kart FTA oraz określać, czy i jakim szczepem organizmy są zakażone.Należy pamiętać, że praca z dzikimi ptakami wiąże się z ryzykiem kontaktu z osobnikami zainfekowanymi grypą ptaków lub innymi chorobami odzwierzęcymi. Z tego powodu niezwykle ważne jest, aby podczas wykonywania tej procedury zawsze nosić odzież ochronną.

avian-influenza-surveillance-with-fta-cards-field-methods-biosafety

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Nadzór nad grypą ptaków za pomocą kart FTA: Rozwiązane zagadnienia dotyczące metod terenowych, bezpieczeństwa biologicznego i transportu

Niniejsze badanie opisuje diagnostykę grypy ptaków u dzikiego ptactwa z wykorzystaniem przenośnego systemu rRT-PCR. Metoda ta wykorzystuje liofilizowane odczynniki do badania dzikich ptaków w warunkach poza laboratoryjnymi, typowych dla scenariusza ogniska choroby. Zastosowanie narzędzi molekularnych zapewnia dokładne i czułe alternatywy dla szybkiej diagnostyki.

Szybka diagnostyka wirusa grypy ptaków u dzikich ptaków: wykorzystanie przenośnego urządzenia rRT-PCR i liofilizowanych odczynników w warunkach terenowych

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Film demonstruje test do ilościowego oznaczania wirusów grypy A i B. Test ten wykorzystuje namnażanie endonukleazy za pomocą starterów specyficznych dla grypy i wykrywanie celów za pomocą sond molekularnych.

Test molekularny do ilościowego oznaczania wirusów grypy A i B

Autorzy prezentują protokół zbierania chusteczek do nosa od świń w celu wykrycia i wyizolowania wirusa grypy A.

Chusteczki do nosa do wykrywania i izolacji wirusa grypy A od świń

Ponieważ patogeny o wysokich konsekwencjach mogą potencjalnie infekować podmioty poprzez cząsteczki unoszące się w powietrzu, aerobiologia jest coraz częściej stosowana w badaniach nad patogenezą i rozwoju medycznych środków zaradczych. Przedstawiamy szczegółową wizualną demonstrację procedur aerobiologicznych podczas wyzwania aerozolowego u naczelnych innych niż ludzie w środowisku bezpieczeństwa biologicznego zwierząt na poziomie maksymalnego 4 poziomu hermetyczności.

Środki ostrożności i procedury operacyjne w laboratorium (a)BSL-4: 3. Aerobiologia

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Opisujemy szybki, molekularny test na grypę A i B. Test grypy wykrywa każdy cel w ciągu 15 minut, stosując amplifikację izotermiczną za pomocą starterów specyficznych dla grypy, a następnie wykrywanie celu za pomocą molekularnych sond ostrzegawczych. Test na grypę A i B jest przyjazny dla użytkownika i wymaga minimalnego czasu na wykonanie.

Szybkie wykrywanie molekularne i różnicowanie wirusów grypy A i B

Pokazano metodę opartą na żywicy anionowymiennej, dostosowaną do pobierania próbek wirusów z bioaerozolu na bazie płynnych uderzeń. W połączeniu z detekcją molekularną, metoda ta pozwala na łatwe i czułe wykrywanie wirusów w bioaerozolach.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Szybko wdrażalne, niezależne od sieci laboratorium zostało zaprojektowane i zbudowane dla odległych, ograniczonych zasobami globalnych ustawień. Badane są cechy i krytyczne aspekty ulepszonych logistycznie, rozszerzalnych, wielofunkcyjnych modułów laboratoryjnych. Opracowywana i prezentowana jest lista kontrolna dotycząca podstawowego przebiegu pracy w laboratorium oraz protokół testu diagnostycznego na obecność wirusa układu oddechowego.

Zdalne zarządzanie laboratorium: diagnostyka wirusów układu oddechowego

Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące podawania IAV w ciągu nosa oraz dalszej analizy uszkodzeń płuc myszy i związanych z tym zmian transkrypcyjnych typów komórek płucnych.

Modelowanie dysplastycznej i funkcjonalnej naprawy płuc pęcherzyków płucnych po zakażeniu grypą

Poznaj metodę izolacji i identyfikacji wirusa ptasiej grypy z próbek kałowych dzikich ptaków przy użyciu kart FTA. Technika umożliwia bezpieczne przechowywanie RNA bez łańcucha chłodniczego i obsługi zakaźnych wirusów.

Nadzór nad ptasią grypą za pomocą kart FTA: rozwiązane metody terenowe, bezpieczeństwo biologiczne i problemy związane z transportem (Wideo) | JoVE Journal

Nadzór nad grypą ptaków z wykorzystaniem kart FTA: rozwiązanie problemów związanych z metodami terenowymi, bezpieczeństwem biologicznym i transportem

Przeglądaj więcej filmów