Name: Sekcja nerki dorosłego danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj technikę izolacji nerki dorosłego danio pręgowanego w badaniach nad komórkami macierzystymi. Metoda umożliwia analizę ekspresji genów i izolację populacji komórek nerkowych oraz krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.A.W. pragnie podziękować członkom laboratoriów badawczych Zon i Davidson za ich niezliczone wkłady w pomoc przy opracowywaniu strategii, które sukcesywnie kształtowały tę technikę sekcji u dorosłych danio pręgowanych w ciągu ostatniej dekady. Ponadto chcielibyśmy wyrazić wdzięczność pracownikom Notre Dame Center for Zebrafish Research za zapewnienie doskonałej, stałej opieki hodowlanej nad naszą kolonią danio pręgowanych. R.A.W. pozyskał fundusze na badania z grantu NIH-NIDDK nr DK083512 oraz hojne fundusze na rozpoczęcie działalności laboratoryjnej z University of Notre Dame.

1. Disekcja nerki dorosłego danio pręgowanego z nieutrwalonej próbki zwierzęcia
<ol>
	<li>Do sekcji wybierz dorosłego danio pręgowanego w wieku od 3 do 6 miesięcy.</li> 
	<li>Uśmierć rybę, umieszczając ją w naczyniu z 0,2% Tricaine pH 7,0 na około 4-5 minut, uważnie obserwując, aż skrzela przestaną się poruszać, a serce przestanie bić.</li>
	<li>Za pomocą łyżki wyjmij rybę z kąpieli w Tricaine wraz z niewielką ilością roztworu, odlej płyn i delikatnie połóż zwierzę na ręczniku papierowym.</li> 
	<li>Używając ostrych nożyczek sekcyjnych, odetnij głowę zwierzęcia, wykonując cięcie tuż za pokrywą skrzęgową (Rysunek 1, ścieżka A). Głowę wyrzuć do pojemnika na odpady biologiczne.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sekcyjnych otwórz ciało zwierzęcia, wykonując długie cięcie brzuszne, zaczynając od głowy i kończąc na ogonie u podstawy płetwy ogonowej (Rysunek 1, ścieżka B).</li>
	<li>Usuń narządy wewnętrzne zwierzęcia za pomocą pęsety sekcyjnej i umieść je w odpadach biologicznych. Należy uważać, aby nie dotknąć grzbietowej ściany ciała, ponieważ tam znajduje się nerka (Rysunek 2). W przypadku wyboru samicy należy usunąć rozwijające się jaja z jamy ciała, co najłatwiej zrobić za pomocą pęsety kątowej.</li>
	<li>Za pomocą igieł sekcyjnych przypnij ściany ciała do tacki sekcyjnej, ustawiając szpilki pod kątem umożliwiającym wizualizację nerki. Nerka będzie miała charakterystyczny kształt (głowa, tułów/siodło, ogon) i kolor, z przeplatającą się pigmentacją o czarnym odcieniu (Rysunek 2). Można również dostrzec aortę wypełnioną krwią obwodową, która biegnie wzdłuż linii środkowej struktury narządu.</li> 
	<li>Używając precyzyjnej pęsety, oddziel nerkę od grzbietowej ściany ciała, podnosząc nerkę jedną pęsetą podczas oddzielania narządu od leżących pod nim tkanek łącznych.</li> 
	<li>Delikatnie umieść nerkę w odpowiednim medium do dalszych badań na żywych komórkach, np. w probówce do mikrocentryfugi zawierającej 1x PBS do przygotowania do FACS.</li> 
</ol>
2. Przygotowanie i sekcja nerki dorosłego danio pręgowanego z utrwalonej próbki zwierzęcia
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 4% paraformaldehydu/1X PBST. Zagotować roztwór, aby rozpuścić PFA, następnie schłodzić mieszaninę do 4°C i dodać 0,1% dimetylosulfotlenku. Najlepsze efekty w utrwalaniu tkanek uzyskiwaliśmy stosując świeżo przygotowane roztwory PFA zamiast mrożonych alikwotów. Przygotować wystarczającą ilość roztworu, aby w pełni zanurzyć dorosłego danio pręgowanego podczas sekcji.</li>
	<li>Napełnić kuwetę sekcyjną wystarczającą ilością roztworu utrwalającego, aby zanurzyć dorosłego danio pręgowanego podczas sekcji. Kolejne kroki wykonujemy z kuwetą umieszczoną pod mikroskopem, który można ustawić w dygestorium, aby zminimalizować ekspozycję na zapachy środków utrwalających.</li>
	<li>Do sekcji wybrać dorosłego danio pręgowanego w wieku od 3 do 6 miesięcy.</li> 
	<li>Eutanazować rybę, umieszczając ją w naczyniu z 0,2% tricainem o pH 7,0 na około 5 minut, uważnie obserwując, czy skrzela i serce przestały bić.</li>
	<li>Używając łyżki, wyjąć rybę z kąpieli w tricainie wraz z niewielką ilością roztworu, odlać płyn i delikatnie położyć zwierzę na ręczniku papierowym.</li> 
	<li>Za pomocą ostrych nożyczek sekcyjnych odciąć głowę zwierzęcia, wykonując nacięcie tuż za pokrywą skrzelową (Rycina 1, ścieżka A). Głowę wyrzucić do pojemnika na odpady biologiczne, a zwierzę natychmiast umieścić w kuwecie sekcyjnej z PFA.</li>
	<li>Używając nożyczek sekcyjnych, otworzyć ciało zwierzęcia, wykonując długie nacięcie brzuszne, zaczynając od głowy i kończąc na ogonie u nasady płetwy ogonowej (Rycina 1, ścieżka B), utrzymując ciało częściowo zanurzone podczas procedury.</li> 
	<li>Usunąć narządy wewnętrzne zwierzęcia za pomocą pęsety sekcyjnej i umieścić je w odpadach biologicznych. Należy uważać, aby nie dotykać grzbietowej ściany ciała, ponieważ tam znajduje się nerka (Rycina 2).</li>
	<li>Użyć igieł sekcyjnych, aby rozsunąć i przypiąć ściany ciała, ustawiając igły pod kątem umożliwiającym wizualizację nerki. Nerka będzie miała charakterystyczny kształt (głowa, siodło, ogon) i kolor, z przeplatającą się pigmentacją o czarnym odcieniu (Rycina 2). Można również dostrzec aortę wypełnioną krwią obwodową, która biegnie wzdłuż linii środkowej struktury narządu.</li> 
	<li>Utrwalać próbkę przez noc, umieszczając kuwetę w temperaturze 4°C po zakończeniu rozmieszczenia pożądanych próbek.</li> 
	<li>Następnego dnia usunąć roztwór PFA z kuwety i zastąpić go 1x PBST.</li> 
	<li>Używając precyzyjnej pęsety, ostrożnie oddzielić nerkę od grzbietowej ściany ciała, używając jednej pęsety do uniesienia nerki podczas oddzielania narządu od leżących pod nim tkanek łącznych. Tkanka nerki będzie miękka i plastyczna dzięki obecności DMSO w roztworze utrwalającym, co umożliwi wycięcie całego narządu nerki w jednym kawałku.</li>
	<li>Użyć pipety transferowej z szerokim otworem, aby przenieść nerkę do probówki do mikrocentryfugi.</li> 
	<li>Nerkę można teraz poddać dalszej obróbce w celu przeprowadzenia badań histologicznych lub badań ekspresji genów in situ w preparatach całych, w zależności od celu badania.</li> 
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki: 
Kroki przedstawione schematycznie na rysunku 1 opisują procedurę sekcji. Nerka może zostać zidentyfikowana na podstawie jej charakterystycznego kształtu i ubarwienia oraz lokalizacji anatomicznej na grzbietowej ścianie jamy ciała zwierzęcia, co pokazano na rysunku 2. Po sekcji utrwalonego preparatu nerki można zastosować hybrydyzację in situ całych preparatów w celu zlokalizowania ekspresji badanego genu, jak pokazano na rysunku 3.
<img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig1.jpg" alt="Schemat ruchu ryby; wektory A i B wskazujące ruch, istotne dla badania biomechaniki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Procedura umożliwiająca bezpośredni dostęp do sekcji nerki dorosłego danio pręgowanego. (A) Uśpiona ryba danio pręgowany jest sekcjowana etapami (wskazanymi przez numery i strzałki), aby zapewnić badaczowi najłatwiejszy dostęp do całego narządu nerki. Zdjęcia jamy brzusznej przed (B) i po (C) usunięciu narządów brzusznych.
<img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig2.jpg" alt="Schemat struktury biologicznej i ilustracja z opisami przedstawiająca części anatomiczne: głowę, tułów i ogon." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2: Wizualizacja nerki danio pręgowanego w próbce niefiksowanej. Po usunięciu organów z jamy ciała nerka jawi się jako pojedynczy, spłaszczony organ przylegający do grzbietowej ściany ciała za pomocą tkanek łącznych (A); przedstawiono ją w formie schematu (B), aby ukazać jej kształt anatomiczny.
<img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig3.jpg" alt="Mikroskopia nerki embrionalnej, cadherin17, mafba, kanalik, PCT; analiza ekspresji genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3: Hybrydyzacje in situ całego preparatu wykonane na całym narządzie nerki dorosłego osobnika. (A) Transkrypty cadherin17 są wykrywane w kanaliku nefronów nerki dorosłego osobnika, powiększenie w (A’). (B) Transkrypty mafba są zlokalizowane w typach komórek proksymalnych nefronu w nerce dorosłego osobnika (porównać z całym kanalikiem w panelu A). (B’) Powiększony widok ekspresji mafba ujawnia, że transkrypty są specyficznie zlokalizowane w komórkach podocytów (P) filtra krwi (kłębuszka) oraz w kanalikach krętych bliższych (PCT).

<ol><li>Stocum, D. L., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+the+limits%3A+stem+cells+in+regeneration+science%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stretching the limits: stem cells in regeneration science.</a> Dev. Dyn. 237, 3648-3671 (2008).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Mione, M. C., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for cancer.</a> Dis. Model Mech. 3, 517-523 (2010).</li>
<li>Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Developmental biology of hematopoiesis.</a> Blood. 86, 2876-2891 (1995).</li>
<li>Davidson, A. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27definitive%27+%28and+%27primitive%27%29+guide+to+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The 'definitive' (and 'primitive') guide to zebrafish hematopoiesis.</a> Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Reimschuessel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fish+model+of+renal+regeneration+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">A fish model of renal regeneration and development.</a> ILAR J. 42, 285-291 (2001).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).</li>
<li>Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li>
<li>Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li>
<li>Weber, G. J., Choe, S. E., Dooley, K. A., Paffett-Lugassy, N. N., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant-specific+gene+programs+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mutant-specific gene programs in the zebrafish.</a> Blood. 106, 521-530 (2005).</li>
<li>Sumanas, S., Jorniak, T., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+vascular+endothelial-specific+genes+by+the+microarray+analysis+of+the+zebrafish+cloche+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants.</a> Blood. 106, 534-541 (2005).</li>
<li>Burns, C. E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J. L., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+fate+is+established+by+the+Notch-Runx+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway.</a> Genes Dev. 19, 2331-2342 (2005).</li>
<li>Little, M. H., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+such+a+thing+as+a+renal+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Is there such a thing as a renal stem cell.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).</li>
<li>Stachura, D. L., Reyes, J. R., Bartunek, P., Paw, B. H., Zon, L. I., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li>
<li>North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li>
<li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li>
<li>de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+expands+the+renal+progenitor+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Dorosłe komórki macierzyste są dynamicznymi i niezbędnymi komponentami, które utrzymują formę organizmu dorosłego1. Dorosłe komórki macierzyste mogą również służyć do przeciwdziałania uszkodzeniom, jakich organizm ulega w stanach chorobowych, a dysfunkcja lub utrata dorosłych komórek macierzystych może prowadzić do spadku funkcji narządów; przypisuje się im także rolę w napędzaniu procesów nowotworowych oraz przyczynianiu się do starzenia. Dorosłe komórki macierzyste wykazują właściwości komórkowe, które odróżniają je od zróżnicowanych typów komórek. Podczas podziału komórkowego dorosłe komórki macierzyste są zdolne do samoodnawiania oraz produkcji komórek progenitorowych, które z kolei mogą dawać początek odrębnym zróżnicowanym potomkom. Istnieje duże zainteresowanie zrozumieniem szlaków regulujących decyzje dotyczące losu komórki oraz potencjału dorosłych komórek macierzystych ze względu na ich istotną rolę w homeostazie tkankowej1. Na przykład wielu naukowców dąży obecnie do zidentyfikowania sygnałów, które utrzymują różne populacje dorosłych komórek macierzystych w ich niszy, czyli wyspecjalizowanym mikrośrodowisku, oraz do zbadania, w jaki sposób nisza ta jest oddziaływana przez czynniki humoralne.
Dorosłe hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są komórkami pluripotencjalnymi, które napędzają ciągłą odnowę komórek krwi u zwierząt8. Hematopoeza to dynamiczny proces nieustannie przebiegający w trakcie życia organizmu kręgowca, ponieważ dojrzałe, zróżnicowane typy komórek krwi są krótkotrwałe i w związku z tym muszą być regularnie uzupełniane. Podczas podziałów HSC zaspokajają to kluczowe zapotrzebowanie poprzez samoodnawianie oraz wytwarzanie serii prekursorów, z których powstają linie erytroidalna, megakariocytarna, limfoidalna i mieloidalna. Każdy z tych typów komórek krwi pełni unikalne funkcje w krwiobiegu, w tym zapewnianie wymiany gazowej w tkankach, uszczelnianie uszkodzeń naczyń krwionośnych poprzez tworzenie skrzepów lub mechanizmy obronne przeciwko naciekającym patogenom. Choć HSC są znane od wielu lat, wiele fascynujących pytań dotyczących tych niezwykłych komórek pozostaje bez odpowiedzi. Niedawne badania zidentyfikowały podklasy HSC o różnych właściwościach długoterminowego samoodnawiania oraz wyjaśniły składniki niszy i sygnały modulujące zachowanie HSC8. Danio pręgowany stał się obecnie jednym z fundamentów paradygmatów badań nad hematopoezą, dzięki cechom genetycznym i molekularnym tego modelu zwierzęcego8. Badania z wykorzystaniem danio pręgowanego doprowadziły do nowych spostrzeżeń na temat biologii HSC, które są konserwatywne u wyższych kręgowców, takich jak ssaki, co podkreśla biomedyczną istotność badań nad krwią ryb8.
Historycznie wiedza na temat HSC utorowała drogę do badań mających na celu ustalenie, czy inne organy ciała są regenerowane przez dorosłe komórki macierzyste. Obecnie uznaje się istnienie licznych populacji dorosłych komórek macierzystych, rozmieszczonych w różnych strukturach – od mózgu, przez jelita, aż po skórę i mięśnie szkieletowe. Dalsze wysiłki w dziedzinie komórek macierzystych dążą do zidentyfikowania mechanizmów, dzięki którym dorosłe komórki macierzyste, a nawet inne zróżnicowane typy komórek, mogą wykazywać zwiększoną potencjalność w różnych warunkach.
W odniesieniu do nerek, wśród nefrologów toczy się ożywiona dyskusja na temat tego, czy istnieją macierzyste komórki nerek16. Niezależne badania udokumentowały populacje komórek nerkowych u ssaków, które wykazują różny stopień potencjału regeneracyjnego, jednak spójne zrozumienie tych doniesień nie zostało jeszcze osiągnięte. Co ciekawe, istnieją silne dowody wspierające tezę, że wiele gatunków ryb posiada komórki zdolne do skutecznego napędzania regeneracji uszkodzonych nefronów, a także do tworzenia całkowicie nowych nefronów w wieku dorosłym9. Niedawne prace zidentyfikowały molekularne cechy charakterystyczne dla dorosłych komórek macierzystych nerek u danio-ostrobramka10,11 oraz wykazały potencjał do samoodnawiania tych tak zwanych komórek macierzystych/progenitorowych nerek (RPCs)11. Konieczne są dalsze badania, aby ustalić, czy analogiczne komórki nerkowe występują u ssaków. Niemniej jednak, kontynuowanie poszukiwań w zakresie mechanizmów komórkowych i molekularnych regulujących RPCs u ryb może dostarczyć wiedzy na temat tego, jak stymulować zdolności regeneracyjne w nerkach ssaków. Jest oczywiste, że wiele kwestii dotyczących RPCs pozostaje niezrozumiałych, a liczne narzędzia dostępne obecnie dla badaczy danio-ostrobramka mogą zostać wykorzystane do rozwiązania tych intrygujących problemów. 
W niniejszym protokole opisujemy metodę anatomicznej identyfikacji i preparowania nerki dorosłego danio przebrósławionego (zebrafish). Do preparowania nerki można zastosować alternatywne kroki, takie jak otwarcie jamy brzusznej za pomocą nacięcia brzusznego przy użyciu nożyc chirurgicznych; jednakże największą skuteczność w uzyskaniu dostępu do całej nerki odnotowaliśmy w przypadku rozpięcia ścian brzusznych szpilkami i usunięcia głowy. Obie metody preparowania mogą być stosowane przez badaczy krwi oraz nerek pragnących izolować i pracować z tymi typami komórek. Należy zauważyć, że opisana przez nas metoda izolacji i pracy z nerką dorosłego danio przebrósławionego nie jest ograniczona wyłącznie do naukowców zajmujących się biologią dorosłych komórek macierzystych, ponieważ preparowanie tego organu może ułatwić badania nad szerokim zakresem zagadnień, od fizjologii po procesy starzenia. Co więcej, metoda ta może być łączona z innymi technologiami, takimi jak transgeneza, w celu molekularnego znakowania, a następnie oczyszczania i badania poszczególnych subpopulacji komórek krwi lub nerek z osobników typu dzikiego lub mutantów genetycznych danio przebrósławionego11. W przyszłości tak szczegółowe procedury oczyszczania typów komórek macierzystych i progenitorowych będą kluczowe dla zdobycia wiedzy o regulacji ich zachowania, ponieważ testy funkcjonalne, takie jak transplantacja lub hodowla progenitorów, stanowią podstawę definiowania potencji i tożsamości tych komórek. Ostatnie postępy w metodach hodowli progenitorów hematopoetycznych otwierają wiele nowych kierunków badań i mogą zostać zaadaptowane do hodowli populacji nerkowych17. Genetyka chemiczna danio przebrósławionego odniosła sukces w identyfikacji szlaków modulujących HSC i progenitory nerkowe w różnych kontekstach18-20 i pozostanie użytecznym kierunkiem badań w połączeniu z wyżej wymienionymi technikami biologii komórki. Podsumowując, model danio przebrósławionego przyczynił się do wielu przełomowych odkryć w dziedzinie hematologii i nefrologii, a dalsze badania w tych obszarach obiecują dostarczenie kolejnych transformacyjnych spostrzeżeń w nadchodzących latach.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki do sekcji</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta do sekcji</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta kątowa do sekcji</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>Trykaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr></tbody></table>

sekcja nerek dorosłego danio pręgowanego

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Badacze pracujący w dynamicznie rozwijającej się dziedzinie biologii dorosłych komórek macierzystych dążą do zrozumienia sygnałów regulujących zachowanie i funkcje komórek macierzystych podczas normalnej homeostazy oraz w stanach chorobowych. Zrozumienie natury dorosłych komórek macierzystych ma szerokie implikacje dla przyszłości medycyny regeneracyjnej1. Na przykład lepsza wiedza na temat biologii dorosłych komórek macierzystych może ułatwić projektowanie strategii terapeutycznych, w których organy są stymulowane do samoleczenia, a nawet tworzenie metod hodowli organów in vitro, które można by przeszczepić ludziom1. Danio pręgowany stał się potężnym modelem zwierzęcym do badania biologii komórkowej kręgowców2. Rozwojowi embrionalnemu danio pręgowanego towarzyszyła obszerna dokumentacja i analiza3. Dopiero niedawno naukowcy zaczęli dokumentować anatomię osobników dorosłych oraz techniki dyssekcji chirurgicznej4, co wynika z postępującego dążenia środowiska badawczego do rozszerzenia zastosowań tego organizmu modelowego na badania nad osobnikami dorosłymi. Przykładowo, rośnie zainteresowanie wykorzystaniem danio pręgowanego do badania biologii populacji dorosłych komórek macierzystych oraz tworzenia zaawansowanych modeli chorób u osobników dorosłych, takich jak rak5. Historycznie izolacja nerki dorosłego danio pręgowanego była kluczowa dla badania hematopoezy, ponieważ nerka jest anatomicznym miejscem produkcji komórek krwi u ryb6,7. Nerka składa się z funkcjonalnych jednostek nefronów ułożonych w strukturach rozgałęzionych, otoczonych tkanką hematopoetyczną rozproszoną w przestrzeniach między nimi. Składnik hematopoetyczny składa się z hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCs) i ich potomstwa, które zamieszkują nerkę do czasu pełnego zróżnicowania8. Ponadto obecnie uznaje się, że w nerkach danio pręgowanego występuje również grupa nerkowych komórek macierzystych/progenitorowych (RPCs), które umożliwiają regenerację i wzrost nerki, co obserwowano u innych gatunków ryb9-11. W świetle tego odkrycia nerka danio pręgowanego jest organem, który stwarza dwie ekscytujące możliwości dla badań nad biologią dorosłych komórek macierzystych. Jest jasne, że wiele nierozwiązanych kwestii można by skutecznie zbadać przy użyciu tego systemu eksperymentalnego. Aby zachęcić do rozwoju tej dziedziny, korzystne jest udokumentowanie szczegółowych metod wizualizacji, a następnie izolacji nerki dorosłego danio pręgowanego. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje naszą procedurę dyssekcji nerki dorosłych zwierząt zarówno nieutrwalonych, jak i utrwalonych.
Dyssekcja organu nerki może być wykorzystana do izolacji i charakterystyki hematopoetycznych oraz nerkowych komórek macierzystych i ich potomstwa przy użyciu uznanych technik, takich jak histologia, fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS)11,12, profilowanie ekspresji13,14 oraz transplantacja11,15. 
Mamy nadzieję, że rozpowszechnienie tego protokołu dostarczy badaczom wiedzy niezbędnej do szerszego wykorzystania badań nad danio pręgowanym, które w ostateczności mogą zostać przełożone na zastosowania u ludzi.

Nerka danio pręgowanego jest siedliskiem zarówno nerkowych, jak i krwiotwórczych dorosłych komórek macierzystych i progenitorowych, co stanowi wyjątkową okazję do badania tych typów komórek oraz ich potomstwa w kręgowym organizmie modelowym. W niniejszej pracy prezentujemy szczegółową procedurę sekcji, która umożliwia badaczowi identyfikację i chirurgiczne usunięcie nerki dorosłego danio pręgowanego, co może być wykorzystane w takich zastosowaniach jak izolacja komórek, transplantacja oraz badania ekspresji populacji komórek nerkowych i/lub krwiotwórczych.

Sekcja nerek dorosłego danio pręgowanego

Badacze pracujący w dynamicznie rozwijającej się dziedzinie biologii dorosłych komórek macierzystych dążą do zrozumienia sygnałów regulujących zachowanie i funkcje komórek macierzystych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie i chirurgiczne usunięcie nerki dorosłego danio pręgowanego, która może zostać wykorzystana w takich zastosowaniach jak izolacja komórek, transplantacja i ekspresja oraz badania populacji komórek nerki i/lub krwi. W tym celu w pierwszej kolejności wybiera się dorosłego osobnika danio pręgowanego w wieku od trzech do sześciu miesięcy do sekcji. Następnie zwierzę uśmierca się w 0,2% tricainy, potwierdzając eutanazję w momencie, gdy skrzela przestają się poruszać, a serce przestaje bić.Trzecim krokiem procedury jest otwarcie jamy brzusznej za pomocą nożyczek sekcyjnych i usunięcie znajdujących się w niej narządów. Ostatnim etapem procedury jest usunięcie nerki z podścielających ją tkanek łącznych przy użyciu precyzyjnych pęset sekcyjnych. Docelowo analizie podlegają profile ekspresji genów podzbiorów komórek hematopoetycznych lub nerkowych oraz izolacja specyficznych populacji komórek metodą whole mount.W wyizolowanej tkance narządu i/lub komórkach można przeprowadzić hybrydyzację in situ, analizy immunohistochemiczne i/lub sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy sekcji są trudne do opanowania. Nerka danio pręgowanego jest delikatnym organem, który jest przymocowany do ściany ciała za pomocą gęstej tkanki łącznej.Zastosowania tej techniki mogą znaleźć odzwierciedlenie w terapii lub diagnostyce chorób nerek i krwi u ludzi, ponieważ procesy biologiczne są wysoce konserwatywne pomiędzy danio pręgowanym a ssakami wyższymi. W ostatnich latach opracowano liczne narzędzia genetyki molekularnej dla danio pręgowanego, co czyni go użytecznym modelem zwierzęcym. Wystarczy 0,2%trica, aby przenieść dorosłą rybkę danio w wieku od trzech do sześciu miesięcy do szalki.Następnie należy wybrać daninkę do sekcji i umieścić ją w naczyniu na około pięć minut, uważnie obserwując, aż skrzela przestaną się poruszać, a serce przestanie bić. Następnie za pomocą łyżki należy wyjąć rybę z kąpieli w tricainie wraz z niewielką ilością roztworu. Odlać roztwór i ostrożnie przenieść zwierzę na ręcznik papierowy, używając ostrych nożyczek sekcyjnych.Wykonaj cięcie tuż za skrzela, aby odciąć głowę zwierzęcia, a następnie wyrzuć głowę do pojemnika na odpady biologiczne. Następnie, zaczynając od strony głowy, użyj nożyczek sekcyjnych, aby wykonać długie cięcie brzuszne kończące się na ogonie w celu otwarcia ciała zwierzęcia. Teraz za pomocą pęsety sekcyjnej usuń organy wewnętrzne zwierzęcia i umieść je w odpadach biologicznych.Należy uważać, aby nie dotknąć pędzlem grzbietowej ściany ciała, ponieważ w tym miejscu znajduje się nerka. W przypadku wyboru ryby żeńskiej, należy wyjąć rozwijające się ikry z jamy ciała za pomocą pęsety kątowej lub zwykłej. Używając igieł sekcyjnych, należy przypiąć ściany ciała do tacki sekcyjnej.Ustaw piny pod takim kątem, aby nerka była widoczna. Nerka posiada charakterystyczny kształt z głową, trzonem lub siodłem oraz ogonem, a jej barwa jest charakterystyczna, z przeplatającą się pigmentacją o czarnym odcieniu. Użyj dwóch par precyzyjnych pęset, aby oddzielić nerkę od grzbietowej ściany ciała.Użyj jednej pęsety do uniesienia nerki i drugiej do przytrzymania leżącej pod nią tkanki łącznej. Wyjmując organ z jamy ciała danio pręgowanego, ostrożnie umieść nerkę w odpowiednim medium. W przypadku dalszych badań na żywych komórkach, np. w mikrosystemie, użyj probówki zawierającej 1× PBS. Do przygotowania próbek do mikroskopii konfokalnej napełnij kuwetę sekcyjną wystarczającą ilością świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego, aby całkowicie zanurzyć trzymianego w niej danio pręgowanego w wieku od trzech do sześciu miesięcy podczas sekcji.Następnie wlej do szalki odpowiednią ilość 0,02% trica o pH siedem. Aby zakryć danino pręgowanego, wybierz osobnika do sekcji i umieść go w szalce z trica w celu eutanazji. Odetnij i usuń głowę zwierzęcia w sposób opisany wcześniej, a następnie niezwłocznie umieść osobnika w kuwecie sekcyjnej zawierającej PFA.Po usunięciu, utrzymując ciało częściowo zanurzone w utrwalaczu podczas procedury, należy użyć nożyczek sekcyjnych, aby otworzyć ciało zwierzęcia za pomocą nacięcia brzusznego, tak jak wcześniej. Ponownie, uważając, aby nie dotknąć grzbietnej ściany ciała, należy usunąć organy wewnętrzne zwierzęcia za pomocą pęsety sekcyjnej. Organy należy umieścić w pojemniku na odpady biologiczne.Podobnie jak wcześniej, należy użyć igieł sekcyjnych, aby rozpiąć ściany ciała, ustawiając szpilki pod takim kątem, aby można było zwizualizować nerkę. Następnie próbkę utrwala się przez noc. Następnego dnia, po umieszczeniu kuwety w temperaturze 4 °C, należy usunąć z niej roztwór utrwalający i zastąpić go jednokrotnym roztworem PBST.Następnie, podobnie jak wcześniej, ostrożnie oddziel nerkę od grzbietowej ściany ciała, używając jednej pary pęsety do uniesienia całego organu w jednym kawałku podczas oddzielania go od leżących pod nim tkanek łącznych. Następnie za pomocą pipety transferowej o szerokim wylocie umieść nerkę w probówce do mikrocentryfugi w celu dalszej obróbki. Jak pokazano tutaj, po usunięciu organów z jamy ciała, nerka jawi się jako pojedynczy, spłaszczony organ, który jest przylegający do grzbietowej ściany ciała za pomocą tkanek łącznych.Na tej ilustracji nerka została przedstawiona w formie schematu, aby ukazać jej charakterystyczny kształt anatomiczny. Tutaj można zauważyć transkrypty kadin 17, wykryte za pomocą hybrydyzacji in situ w całej tkance nerki, w kłębuszkach nefronów dorosłej nerki, natomiast w prawym panelu przedstawiono powiększony widok barwienia kanalików. Na tej ilustracji, w lewym panelu, można zauważyć, że transkrypty M-A-F-B-A są zlokalizowane w typach komórek proksymalnych nefronów w dorosłej nerce.Powiększony widok ekspresji M-A-F-B-A przedstawiony po prawej stronie pokazuje, że transkrypty są swoiście zlokalizowane w podocytach kłębuszków nerkowych glejaków, co wskazują p i strzałka, oraz w krętych kanalikach bliższych, co wskazuje PCT i nawias. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ostrożnym usunięciu organów wewnętrznych dorosłej zebry, aby nie uszkodzić nerki przed jej chirurgiczną izolacją po zakończeniu tego etapu. Do oceny charakterystyki ultrastrukturalnej populacji komórek krwi i nerek lub do izolacji konkretnych populacji w celu transplantacji komórek lub pierwotnej hodowli komórkowej można zastosować inne metody, takie jak histologia lub fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS).

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sekcja nerki dorosłego danioła pręgowanego

W niniejszym artykule prezentujemy metodę przeprowadzania HCT u dorosłych danio pręgowanych.

Przeszczepianie całego szpiku nerkowego u dorosłych danio pręgowanych

Niniejszy protokół opisuje procedurę identyfikacji i wycinania narządów z dorosłego danio pręgowanego.

Disekcja organów dorosłej rybki zebrafish

Transplantacja komórek jest kluczową techniką w badaniu regeneracji tkanek oraz w opracowywaniu terapii chorób opartych na komórkach. Przedstawiamy tutaj technikę mikrochirurgiczną, która umożliwia transplantację genetycznie znakowanych komórek bezpośrednio do nerki dorosłych ryb zebrafish.

Transplantacja komórek bezpośrednio do nerki dorosłych danio-ostroskrzelnych

Ten film pokazuje sekcję i przygotowanie płaskiego mocowania nerki dorosłego danio pręgowanego. Przygotowane płaskie mocowanie można zobrazować pod mikroskopem w celu analizy próbki.

Przygotowanie płaskiego mocowania nerki: procedura preparowania i przygotowania płaskiego mocowania do analizy mikroskopowej nerki dorosłego danio pręgowanego

W tym filmie pokazujemy depigmentację nerki dorosłego danio pręgowanego i jej późniejsze przygotowanie do zabiegów barwienia. Po barwieniu dorosła nerka danio pręgowanego może być wykorzystana do badania regeneracji nerek, charakterystyki fenotypowej modeli chorób nerek i funkcjonalności nefronów.

Depigmentacja i wstępne barwienie nerki danio pręgowanego: technika przygotowania nerki dorosłego danio pręgowanego do barwienia

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami.  Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia rozwoju nerek. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania ekspresji genów u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju mesonephros.

In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros

Poznaj technikę izolacji nerki dorosłego danio pręgowanego w badaniach nad komórkami macierzystymi. Metoda umożliwia analizę ekspresji genów i izolację populacji komórek nerkowych oraz krwi.

Sekcja nerek dorosłego danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów