Name: Przygotowanie podciętego modelu padaczkogenezy pourazowej u gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj przygotowanie podciętego modelu padaczkogenezy pourazowej u szczurów z wykorzystaniem niestandardowego urządzenia chirurgicznego. Ta metoda zapewnia precyzyjne i powtarzalne uszkodzenia kory mózgowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu NIH/NINDS 4R00 NS 057940 oraz grantu SCBI 200-12 z funduszu badań nad urazami rdzenia kręgowego i mózgu (Spinal Cord and Brain Injury Research fund) Departamentu Zdrowia Stanu Indiana.

1. Wykonanie prostego urządzenia do operacji podcięcia
<ol>
<li>Stworzone przez nas urządzenie do podcinania składa się z trzech części (Ryc. 1): (1) płytki wspierającej wykonanej ze stali nierdzewnej lub tworzywa sztucznego, która umożliwia przymocowanie rurki prowadzącej oraz igły i spoczywa na oknie czaszkowym podczas operacji; (2) rurki prowadzącej, która utrzymuje igłę w pozycji i umożliwia jej obrót; oraz (3) igły, która jest zgięta pod kątem 90 stopni w odległości ok. 3 mm od czubka i może być przemieszczana poprzez obrót oraz wsuwanie.</li>
<li>Wytnij kawałek prostokątnej stali nierdzewnej lub przezroczystego tworzywa sztucznego (1) o grubości 1-1,5 mm i wymiarach 7~10 x 30 mm, aby przygotować płytkę wspierającą. Przygotuj igły do strzykawek o długości 1,5 cala i średnicy 22-gauge (firma BD, #305156) oraz 1,5 cala i średnicy 25-gauge (firma BD, #305127). Aby wykonać rurkę prowadzącą, odetnij plastikowy koniec oraz dolną końcówkę igły 2-gauge tak, aby jej całkowita długość wynosiła około 31-32 mm (2). Oszlifuj metalny koniec, aby był płaski i gładki. Końcowa długość tej rurki prowadzącej powinna być o około 5-6 mm krótsza niż igła 25-gauge.</li>
<li>Użyj kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować rurkę prowadzącą do płytki wspierającej, upewniając się, że igła jest prostopadła do krawędzi metalu.</li>
<li>Wsuń igłę 25-gauge do rurki prowadzącej i zgnij igłę pod kątem 90 stopni w odległości 2,5-3 mm od czubka (Ryc. 1).</li>
<li>Dostosuj pionowy zakres ruchu igły, przyklejając małą plastikową rurkę do górnego końca igły (Ryc. 1, ogranicznik igły). Końcowy zakres ruchu igły określa, jak głęboko igła może zostać wprowadzona do kory i powinien wynosić 1,6-1,8 mm dla szczurów P21 oraz 1,3-1,5 mm dla myszy P21. Długość ta musi zostać dostosowana do różnych gatunków i wieku zwierząt.</li>
<li>Przymocuj mały miedziany drut lub mały kawałek taśmy do górnego końca igły w tym samym kierunku, w którym skierowany jest zgięty czubek (Ryc. 1, wskaźnik igły). Drut lub taśma wskazują kąt obrotu igły podczas operacji podcinania (Ryc. 1).</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
<li>Wszystkie instrumenty chirurgiczne muszą zostać poddane autoklawowaniu, sterylizacji w sterylizatorze szklanym lub dezynfekcji 70% etanolem.</li>
<li>Stosujemy szczury Sprague/Dawley w 20–2 dniu po urodzeniu (P20-2) lub myszy CD1 w tym samym wieku. W zależności od konkretnego projektu mogą być wykorzystywane inne szczepy myszy lub szczurów.</li>
<li>Zanieś mysz pod narkozę poprzez dożylne wstrzyknięcie (i.p.) ketaminy w dawce 80 mg/kg i ksylazyny w dawce 8 mg/kg. Procedurę chirurgiczną rozpoczyna się po stwierdzeniu braku reakcji zwierzęcia na uszczypnięcie w ogon. W trakcie operacji, w razie potrzeby, można podać dawkę przypominającą stanowiącą jedną trzecią pierwotnej dawki koktajlu anestetycznego, aby przywrócić pierwotny stan znieczulenia.</li>
<li>Wytnij włosy na skórze głowy zwierzęcia za pomocą elektrycznego trymera. Na oczy zwierzęcia nałóż niewielką ilość maści okulistycznej, aby zapobiec ich wysychaniu podczas anestezji. Zdezynfekuj skórę głowy, stosując 10% roztwór powidonu z jodem, a następnie 70% etanol.</li> 
<li>Zamocuj zwierzę w aparacie stereotaksycznym, aby utrzymać głowę w stabilnej, stałej pozycji. Przez cały czas trwania operacji zwierzę powinno znajdować się na podgrzewanej macie w celu zapobiegania hipotermii.</li>
<li>Za pomocą skalpela wykonaj w linii środkowej nacięcie przednio-tylne na skórze głowy, rozciągając je od lambda do obszaru między oczami. Użyj kleszczyków hemostatycznych, aby odsunąć skórę i dostatecznie odsłonić lewą stronę czaszki.</li> 
<li>Wykonaj prostokątne nacięcie na lewej stronie czaszki, a następnie za pomocą skalpela zeskrob okostnę. Krok ten ograniczy krwawienie i ułatwi wiercenie w czaszce.</li>
</ol>
3. Wykonywanie podcięć
<ol>
<li>Nanieś niewielką ilość jałowej soli fizjologicznej na odsłonięty obszar czaszki, a następnie użyj kilku patyczków higienicznych, aby oczyścić krew i osuszyć ten obszar.</li>
<li>Pod mikroskopem chirurgicznym zacznij wiercić prostokątny rowek (~5 x 7 mm u szczurów, 4 x 5 mm u myszy) w centrum lewej strony czaszki (mniej więcej nad lewą korą sensoromotoryczną). Aplikacja kropli soli fizjologicznej na czaszkę ułatwia wiercenie i odprowadza ciepło. Po wywierceniu około 2/3 głębokości kości usuń nadmiar soli fizjologicznej i oczyść obszar wiercenia patyczkiem higienicznym. Powoli i ostrożnie wierć głębiej, aż środkowy fragment kości stanie się ruchomy przy delikatnym dotknięciu pęsetą.</li>
<li>Ostrożnie usuń środkowy fragment kości, wsuwając ostrą końcówkę pęsety na krawędź kości i powoli unosząc pęsetę, aby odsłonić lewą półkulę.</li>
<li>Pod mikroskopem chirurgicznym chwyć urządzenie do nacinania (undercut device), skieruj igłę w kierunku parasagitalnym, a płytkę wspierającą prostopadle do linii środkowej, lekko przechylając urządzenie w stronę kaudalną, aby zachować widoczność końcówki igły i docelowego obszaru kory. Skieruj końcówkę igły w obszar 1-2 mm bocznie od górnego szwu strzałkowego, w połowie okna czaszkowego, unikając bezpośredniego przebicia dużych naczyń.</li>
<li>Wprowadź igłę w kierunku poziomym przez oponę twardą i pod oponę miękką, tak aby oszczędzić naczynia krwionośne. Oprzyj podstawę urządzenia do nacinania o obie krawędzie okna czaszkowego, tak aby igła była ustawiona prostopadle do powierzchni kory (Rys. 1). Oparcie urządzenia ręcznie o obie krawędzie okna czaszkowego znacznie zredukuje lub wyeliminuje drżenie rąk podczas kolejnego etapu procedury. Unieś igłę pod oponę miękką, a następnie powoli opuszczaj ją, aby wykonać cięcie transkortykalne, aż igła nie będzie mogła wejść głębiej. Obróć o ~135° w kierunku przeciwnym do linii środkowej, aby stworzyć półkoliste podcięcie istoty białej/głębokiej warstwy VI. Następnie ponownie unieś igłę pod oponę miękką. Przechyl urządzenie do tyłu i wycofaj igłę.</li> 
<li>Opcjonalnie można powtórzyć powyższą procedurę (krok 2.5), ale bez obracania igły, aby wykonać dodatkowe cięcie transkortykalne przy bocznych krawędziach okna. Pozwoli to na uzyskanie bardziej pełnej izolacji kory.</li> 
<li>Umieść kawałek folii plastikowej (6 x 6 mm) na oknie czaszkowym w celu ochrony, a następnie zaszyj skórę głowy. Umieść zwierzę na podgrzewanej podkładce aż do całkowitego wybudzenia z anestezji.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki: 
W celu potwierdzenia powodzenia operacji podcięcia można przygotować koronalne skrawki kory. W skrawkach przygotowanych &gt;2 tygodnie po operacji, nacięcia transkortykalne i podcięcia są widoczne pod obiektywem mikroskopu o niskim powiększeniu (Rys. 2). Częściowo izolowana kora zazwyczaj staje się nieco cieńsza, a w większości skrawków korowych za pomocą rejestracji potencjałów polowych można wykryć aktywność epileptформową (Rys. 3).
Z kolei powstanie dużych ubytków w istocie białej lub w głębokich warstwach kory, znaczne ścieńczenie uszkodzonej kory lub błędne cięcie powyżej lub poniżej istoty białej sprawi, że mózg nie będzie nadawał się do dalszych eksperymentów.
<img src="/files/ftp_upload/2840/2840fig1.jpg" alt="Schemat zabiegu stereotaktycznego, konfiguracja aparatury z igłą mózgową do precyzyjnej iniekcji lub wykonania uszkodzenia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Budowa i zastosowanie urządzenia do wykonywania podcięć. Rurkę prowadzącą (2) przykleja się do płytki podporowej (1), wykonanej ze stali nierdzewnej lub przezroczystego tworzywa sztucznego. Igłę strzykawki (3) wprowadza się przez rurkę prowadzącą i zgina w odległości ok. 3 mm od końcówki. Na górnym końcu igły przykleja się ogranicznik wykonany z rurki plastikowej w taki sposób, aby zakres ruchu pionowego igły był ograniczony do ok. 1,2 mm w przypadku myszy P21 i do ok. 1,5 mm w przypadku szczurów. Pod uchwytem mocuje się odcinek cienkiego miedzianego drutu, który służy jako wskaźnik orientacji zgiętej igły. Należy pamiętać, aby urządzenie było nachylone i stykało się z obiema krawędziami okna czaszkowego, tak aby cięcie można było wykonać równolegle do powierzchni pialnej.
<img src="/files/ftp_upload/2840/2840fig2.jpg" alt="Proces krystalizacji, obraz mikroskopowy, przedstawiający wzorzec wzrostu kryształów i formowanie się struktury." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywny obraz przekroju z podcięciem. A. Obraz fluorescencyjny skrawka przygotowanego dwa tygodnie po wykonaniu podcięcia (undercut lesion) u szczura P48. Rana cięta została oznakowana fluorescencyjnym barwnikiem DiI. Białe strzałki po prawej stronie wskazują cięcie transkortykalne, a strzałki na dole wskazują podcięcie przebiegające przez granicę między warstwą IV a istotą białą. 
<img src="/files/ftp_upload/2840/2840fig3.jpg" alt="Rejestracja sygnałów neuronalnych, wykres elektrofizjologiczny, przedstawiający napięcie w czasie, aktywność synaptyczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Rejestracja potencjałów polowych z podciętego skrawka. Rejestracja potencjałów polowych z wyciętego fragmentu plastra mózgu wykazała aktywność epileptiformną, co sugeruje nadpobudliwość uszkodzonej tkanki korowej.

<ol><li>Hoffman, S. N., Salin, P. A., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+neocortical+epileptogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Chronic neocortical epileptogenesis in vitro.</a> J Neurophysiol. 71, 1762-1773 (1994).</li>
<li>Topolnik, L., Steriade, M., Timofeev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperexcitability+of+intact+neurons+underlies+acute+development+of+trauma-related+electrographic+seizures+in+cats+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hyperexcitability of intact neurons underlies acute development of trauma-related electrographic seizures in cats in vivo.</a> Eur J Neurosci. 18, 486-496 (2003).</li>
<li>Graber, K., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGraber%2C+K+%22Models+of+Seizures+and+Epilepsy%22">Models of Seizures and Epilepsy</a>. , Elsevier. 477-493 (2005).</li>
<li>Nita, D. A., Cisse, Y., Timofeev, I., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+propensity+to+seizures+after+chronic+cortical+deafferentation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Increased propensity to seizures after chronic cortical deafferentation in vivo.</a> J Neurophysiol. 95, 902-913 (2006).</li>
<li>Sharpless, S. K., Halpern, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrical+excitability+of+chronically+isolated+cortex+studied+by+means+of+permanently+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The electrical excitability of chronically isolated cortex studied by means of permanently implanted electrodes.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 244-255 (1962).</li>
<li>Echlin, F. A., Battista, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+Seizures+from+Chronic+Isolated+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epileptiform Seizures from Chronic Isolated Cortex.</a> Arch Neurol. 9, 154-170 (1963).</li>
<li>Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptogenic+neurons+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epileptogenic neurons and circuits.</a> Adv Neurol. 79, 665-684 (1999).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neuropathology+and+impact+of+perinatal+brain+damage.+II%3A+white+matter+lesions+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental neuropathology and impact of perinatal brain damage. II: white matter lesions of the neocortex.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56, 219-235 (1997).</li>
<li>Jin, X., Prince, D. A., Huguenard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitatory+synaptic+connectivity+in+layer+v+pyramidal+neurons+of+chronically+injured+epileptogenic+neocortex+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitatory synaptic connectivity in layer v pyramidal neurons of chronically injured epileptogenic neocortex in rats.</a> J Neurosci. 26, 4891-4900 (2006).</li>
<li>Li, H., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+in+chronically+injured%2C+epileptogenic+sensory-motor+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex.</a> J Neurophysiol. 88, 2-12 (2002).</li>
<li>Salin, P., Tseng, G. F., Hoffman, S., Parada, I., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+sprouting+in+layer+V+pyramidal+neurons+of+chronically+injured+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal sprouting in layer V pyramidal neurons of chronically injured cerebral cortex.</a> J Neurosci. 15, 8234-8245 (1995).</li>
<li>Avramescu, S., Nita, D. A., Timofeev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+post-traumatic+epileptogenesis+is+associated+with+loss+of+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Neocortical post-traumatic epileptogenesis is associated with loss of GABAergic neurons.</a> J Neurotrauma. 26, 799-812 (2009).</li>
<li>Avramescu, S., Timofeev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+strength+modulation+after+cortical+trauma%3A+a+role+in+epileptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic strength modulation after cortical trauma: a role in epileptogenesis.</a> J Neurosci. 28, 6760-6772 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Model podcięcia (undercut) jest wysoce wydajnym systemem do badania potraumatycznej epileptogenezy. Typowy zabieg trwa zaledwie około 20–30 minut, a wywołaną lub spontaniczną aktywność epileptyformną można rejestrować w skrawkach mózgu u większości zwierząt dwa tygodnie po operacji1-2. Co ważniejsze, model ten odwzorowuje aspekty zmian następujących po urazowym uszkodzeniu mózgu, takich jak krwawienie, stan zapalny, obrzęk, aksotomia i śmierć neuronów7. Aktywność epileptyformna została zaobserwowana...

<table><tbody><tr><td>Zestaw mikrosilnika Foredom</td><td>sprzęt</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Igła do strzykawki 1,5 cala, rozmiar 22G</td><td>materiał</td><td>BD Biosciences</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Igła do strzykawki 1,5 cala, rozmiar 25G</td><td>materiał</td><td>BD Biosciences</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>materiał</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>14450</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie modelu podcięcia w badaniu epileptogenezy potraumatycznej u gryzoni

Preparing Undercut Model of Posttraumatic Epileptogenesis in Rodents

Częściowa izolacja kory („undercut”) jest modelem zwierzęcym potraumatycznej epileptogenezy. Procedura chirurgiczna polega na przecięciu kory czuciowo-ruchowej oraz znajdującej się pod nią istoty białej (undercut), tak aby określony obszar kory mózgowej został w znacznym stopniu odizolowany od sąsiednich obszarów kory i regionów podkorowych1-3. Po okresie utajenia trwającym dwa lub więcej tygodni od operacji, w skrawkach mózgu gryzoni można zarejestrować wyładowania epileptформne1, natomiast u innych gatunków, takich jak koty i małpy, można obserwować napady elektryczne lub behawioralne in vivo4-6. Ten dobrze ugruntowany model zwierzęcy jest wydajny w tworzeniu i naśladuje kilka istotnych cech urazowego uszkodzenia mózgu. Jednakże wykonanie precyzyjnych uszkodzeń kory w małym mózgu gryzoni metodą „z wolnej ręki” jest technicznie trudne. Opierając się na procedurze opracowanej pierwotnie w laboratorium dr. Davida Prince'a na Uniwersytecie Stanforda1, przedstawiamy tutaj udoskonaloną technikę przeprowadzania operacji w celu przygotowania tego modelu u myszy i szczurów. Demonstrujemy, jak wykonać proste urządzenie chirurgiczne i wykorzystać je do uzyskania lepszej kontroli nad głębokością i kątem cięcia, aby uzyskać bardziej precyzyjne i powtarzalne wyniki. Urządzenie jest łatwe do wykonania, a procedura jest szybka do opanowania. Stworzenie tego modelu zwierzęcego zapewnia wydajny system do badania mechanizmów potraumatycznej epileptogenezy.

Częściowo izolowana kora („podcięcie”) stanowi wydajny model zwierzęcy potraumatycznej epileptogenezy. W niniejszym materiale demonstrujemy sposób wykonania nowego urządzenia chirurgicznego oraz jego zastosowanie w celu tworzenia bardziej precyzyjnych i spójnych uszkodzeń niezbędnych do wygenerowania tego modelu.

Przygotowanie modelu podcięcia w badaniu epileptogenezy potraumatycznej u gryzoni

Częściowo izolowana kora („undercut”) stanowi model zwierzęcy potraumatycznej epileptogenezy. Procedura chirurgiczna polega na przecięciu...

Niniejsza procedura zademonstruje sposób przygotowania modelu podcięcia (undercut) w badaniach nad potraumatyczną epileptogenezą u szczurów. Pierwszym krokiem jest wykonanie prostego urządzenia, które zwiększa precyzję i powtarzalność zabiegu podcięcia. Następnie zwierzę jest przygotowywane do operacji, a na powierzchni czaszki wykonuje się okno czaszkowe, aby uzyskać dostęp do mózgu.Na koniec igłę urządzenia do wycinania wprowadza się w istotę białą kory mózgowiej i obraca, aby utworzyć w regionie docelowym wycięcie w kształcie wachlarza. Ostatecznie, za pomocą rejestracji potencjałów polowych w plastrach mózgu, można uzyskać wyniki wykazujące aktywność o charakterze epileptycznym. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykonania dokładniejszego i bardziej powtarzalnego przerwania połączeń nerwowych przy użyciu prostego, specjalnie wykonanego urządzenia chirurgicznego.Ten model zwierzęcy może być wykorzystany do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące epileptogenezy po urazie mózgu. Chociaż model ten jest często stosowany u szczurów, można go również zastosować u myszy. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ wykonanie tak precyzyjnej lekcji kory gryzoni metodą ręczną jest trudne.Urządzenie chirurgiczne składa się z trzech części: płytki wspierającej, rurki prowadzącej oraz igły zgiętej pod kątem 90 stopni w pobliżu końcówki. Aby przygotować urządzenie do podcinania w chirurgii szczurów w wieku od trzech do czterech tygodni, najpierw należy wyciąć fragment stali nierdzewnej lub przezroczystego tworzywa sztucznego o grubości od 1 do 1,5 mm i kształcie prostokąta o wymiarach od 7 do 10 na 30 mm. Aby wykonać płytkę wspierającą, należy użyć igieł strzykawkowych o rozmiarach 25 G i 22 G, a następnie zmierzyć długość igły 25 G.Następnie odetnij plastikowy koniec igły 22G i zmierz całkowitą długość oznaczenia igły, a następnie przetnij igłę 22G w takim miejscu, aby końcowa długość rurki prowadzącej była o około pięć do sześciu milimetrów krótsza niż igła strzykawki 25G. Przeszlifuj koniec, aby wyrównać i wygładzić go. Użyj kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować rurkę prowadzącą do płytki wsporczej, upewniając się, że igła jest prostopadła i równoległa do krawędzi płytki wsporczej.Wprowadź igłę strzykawki o rozmiarze 25 G do prowadnicy i zgnij igłę pod kątem 90 stopni w odległości od 2,5 do 3 mm od czubka. Na koniec przymocuj cienki miedziany drut lub mały kawałek taśmy do górnego końca igły w tym samym kierunku, w którym zgięto czubek.Drut lub taśma wskazują kąt obrotu igły podczas operacji podcięcia. Przed rozpoczęciem tej procedury należy skonsultować się z instytucjonalną komisją ds. opieki nad zwierzętami w celu uzyskania niezbędnej zgody na przeprowadzenie poniższych czynności. W pierwszej kolejności należy upewnić się, że wszystkie instrumenty chirurgiczne zostały wysterylizowane zatwierdzoną metodą oraz że do operacji dostępny jest sterylny obszar.Znieczul zwierzę zgodnie z zatwierdzonym protokołem, upewniając się, że zwierzę jest w pełni znieczulone poprzez wykonanie uciśnięcia ogona. Użyj trymera elektrycznego, aby ogolić skórę głowy zwierzęcia wokół obszaru, w którym wykonane zostanie cięcie. Następnie zdezynfekuj skórę głowy, używając 10% roztworu powidonu jodowego, a następnie 70% etanolu.Smarujemy oczy zwierzęcia maścią okulistyczną, aby zapobiec ich wysychaniu. Podczas zabiegu zwierzę należy zamocować w aparacie stereotaktycznym, aby utrzymać głowę w stałej, stabilnej pozycji. Zaleca się umieszczenie zwierzęcia na podkładce grzewczej w celu zapobiegania hipotermii.Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w linii środkowej od przodu do tyłu na skórze głowy, rozciągając się od punktu Lambda do miejsca między oczami. Następnie użyj kleszczyków hemostatycznych, aby odsunąć skórę i dostatecznie odsłonić lewą stronę czaszki. Używając skalpela, wykonaj prostokątne nacięcie na lewej stronie czaszki i zeskrob okostnę.Ten krok ograniczy krwawienie i ułatwi wiercenie w czaszce. Najpierw należy oczyścić czaszkę za pomocą sterylnej soli fizjologicznej i kilku patyczków higienicznych, aby usunąć krew i osuszyć obszar. Następnie należy nanieść kroplę sterylnej soli fizjologicznej na środek lewej strony czaszki.Następnie rozpocznij wiercenie, aby wykonać prostokątny otwór o wymiarach 4 na 5 mm w centrum lewej strony czaszki. Po wywierceniu około dwóch trzecich głębokości kości usuń nadmiar soli fizjologicznej i oczyść obszar wiercenia za pomocą patyczka higienicznego. Powoli i ostrożnie kontynuuj wiercenie w głąb, aż centralny fragment kości stanie się ruchomy po delikatnym dotknięciu pęsetą.Ostrożnie usuń centralny fragment kości, delikatnie chwytając go pęsetą i powoli podnosząc okno kostne w celu odsłonięcia lewej półkuli, jednocześnie trzymając urządzenie do podcinania. Skieruj igłę w kierunku parasagitalnym, a płytkę wspierającą prostopadle do linii środkowej. Nakieruj końcówkę igły od jednego do dwóch milimetrów bocznie od górnego szwu strzałkowego w środku okna czaszkowego, unikając dużych naczyń krwionośnych.Następnie wprowadź igłę w kierunku poziomym przez oponę twardą i pod pierścień. Aby oszczędzić naczynia krwionośne, oprzyj podstawę urządzenia do podcinania o obie krawędzie okna czaszkowego w taki sposób, aby igła była ustawiona prostopadle do powierzchni kory. Podnosząc igłę lekko do góry, upewnij się, że znajduje się ona pod pierścieniem.Następnie powoli opuść igłę, aby wykonać cięcie przezkorowe, aż do momentu, gdy igła nie będzie mogła penetrować tkanki głębiej. Następnie obróć igłę o 180 stopni w kierunku przeciwnym do linii środkowej, aby stworzyć półkoliste podcięcie głębokiej warstwy szóstej istoty białej. Na koniec ponownie unieś igłę, aż znajdzie się ona pod filarem.Następnie odchyl urządzenie do wycinania wstecz i wyjmij igłę. Na okno czaszki połóż kawałek folii plastikowej w celu ochrony. Następnie odepnij kleszczyki hemostatyczne, w razie potrzeby zwilż skórę głowy sterylną solą fizjologiczną i przywróć ją na miejsce.Zamknąć nacięcie za pomocą szwów. Następnie zwolnić zwierzę z aparatu stereotaktycznego i umieścić na podkładce grzewczej do czasu wybudzenia zwierzęcia z narkozy. Po powrocie zwierzęcia do klatki macierzystej należy zastosować leki przeciwbólowe zgodnie z odpowiednim protokołem IA IACUC.W tym przypadku, dwa tygodnie po zabiegu, przygotowano koronalne skrawki kory w celu oceny powodzenia operacji podcięcia. Nacięcia transkortykalne i podcięcia są widoczne przy użyciu obiektywu o niskim powiększeniu mikroskopu. Rejestracja potencjałów polowych wykazuje wywołaną aktywność elektryczną w częściowo odizolowanej korze.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje około 30 minut. Przed przystąpieniem do zabiegu należy pamiętać o wcześniejszym przećwiczeniu obsługi narzędzi chirurgicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat przygotowania nieprzeciętego modelu potraumatycznej epileptogenezy u gryzoni.

preparing-undercut-model-of-posttraumatic-epileptogenesis-in-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowywanie modelu podcinania epileptogenezy pourazowej u gryzoni

Ten film pokazuje elektroencefalograficzny (EEG) zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką. Szczur z elektrodami wszczepionymi w brzuszny hipokamp podłącza się do systemu rejestracji EEG i umieszcza w komorze z pleksi. Szczur może się swobodnie poruszać, podczas gdy aktywność mózgu jest rejestrowana w celu monitorowania występowania napadów.

Elektroencefalograficzny zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką

Źródło: Jang, S., et al, Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje indukcję ostrego napadu elektrowstrząsowego (ECS) w modelu szczurzym w celu zbadania neuroplastyczności wywołanej napadem. Naukowcy stosują stymulację elektryczną za pomocą elektrod z klipsem do ucha, wywołując nadpobudliwość neuronów i klonus. Model ten pomaga badać plastyczność synaptyczną,...

Wywoływanie ostrego napadu elektrowstrząsowego w modelu szczurzym

Tutaj demonstrujemy użycie bezprzewodowej technologii umożliwiającej elektroencefalogram (EEG) w modelach chorób ludzkich noworodków gryzoni. Dzięki telemetrii nie ma obciążających połączeń, co pozwala na naturalne zachowania.

Długotrwałe, ciągłe monitorowanie EEG w modelach chorób człowieka u małych gryzoni przy użyciu systemu nadajników bezprzewodowych Epoch

Ten film przedstawia procedury przygotowania, rejestracji i analizy źródeł wysokorozdzielczego EEG u szczurów poddanych sedacji ze szczególnym przedklinicznym modelem padaczki ogniskowej w warunkach nieinwazyjnych.

Obrazowanie źródła mózgu w przedklinicznych szczurzych modelach padaczki ogniskowej przy użyciu zapisów EEG o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje metodę chemicznego rozpalania pentylenotetrazolu i dostarcza mysi model padaczki. Protokół ten może być również wykorzystany do badania podatności na indukcję i patogenezę napadów padaczkowych po napadach padaczkowych u myszy.

Model rozpałki indukowany pentylenotetrazolem

Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.

Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich

Ten systematyczny protokół opisuje nowy zwierzęcy model padaczki pourazowej po powtarzającym się łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu. Pierwsza część szczegółowo opisuje etapy indukcji urazowego uszkodzenia mózgu przy użyciu zmodyfikowanego modelu spadku masy ciała. Druga część zawiera instrukcje dotyczące podejścia chirurgicznego dla jedno- i wielokanałowych systemów akwizycji danych elektroencefalograficznych.

Wywoływanie padaczki pourazowej w mysim modelu powtarzalnego rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

Ten raport opisuje metody generowania modelu padaczki skroniowej na podstawie elektrycznego rozpalenia transgenicznych myszy VGAT-Cre. Rozpalone myszy VGAT-Cre mogą być przydatne w określaniu, co powoduje padaczkę i w badaniach przesiewowych nowych terapii.

Przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy VGAT-Cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej

Zakażenie śródmózgowe wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) u myszy C57BL/6 powiela wiele wczesnych i przewlekłych objawów klinicznych wirusowego zapalenia mózgu i późniejszej padaczki u ludzi. W artykule opisano zakażenie wirusem, objawy i histopatologię modelu TMEV.

Model padaczki o etiologii zakaźnej z wykorzystaniem wirusa mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera

Ciało migdałowate odgrywa kluczową rolę w padaczce skroniowej, która wywodzi się z tej struktury i z niej się rozprzestrzenia. Ten artykuł zawiera szczegółowy opis wytwarzania głębokich elektrod mózgowych z funkcjami zarówno rejestrującymi, jak i stymulującymi. Wprowadza model padaczki przyśrodkowego płata skroniowego wywodzącej się z ciała migdałowatego.

Użycie elektrody bipolarnej do stworzenia mysiego modelu padaczki skroniowej poprzez elektryczne rozppalenie ciała migdałowatego

Poznaj przygotowanie podciętego modelu padaczkogenezy pourazowej u szczurów z wykorzystaniem niestandardowego urządzenia chirurgicznego. Ta metoda zapewnia precyzyjne i powtarzalne uszkodzenia kory mózgowej.

Przygotowanie modelu podcięcia w badaniu epileptogenezy potraumatycznej u gryzoni

Przeglądaj więcej filmów