Name: Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidalności oocytów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj mikroiniekcję i dojrzewanie oocytów myszy w celu oceny ploidalności. Ta metoda pozwala badać mechanizmy segregacji chromosomów w biologii rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została przeprowadzona w laboratorium Richarda M. Schultza. Autorzy chcieliby również podziękować Michaelowi Lampsonowi za opracowanie koncepcji testu zliczania centromerów oraz za udostępnienie jego mikroskopu konfokalnego. Teresa Chiang i Francesca Duncan pomogły w optymalizacji testu zliczania centromerów. Paula Stein jest wspierana przez grant HD022681 (przyznany RMS), a Karen Schindler przez grant HD055822.

1. Pobieranie oocytów mysich
<ol>
<li>Aby zmaksymalizować liczbę mieszków antralnych wyizolowanych z każdej myszy, wykonaj dojamieniowy wtrysk 5 IU gonadotropiny z surowicy ciężkiej klaczy (PMSG) u dojrzałych płciowo samic myszy (stosujemy 6-tygodniowe myszy CF-1 od Harlan).</li>
<li>Przygotuj medium do zbierania (MEM/PVP) (3 ml/mysz), dodając milrinon do stężenia 2,5 μM i ogrzej je do 37°C. Milrinon jest inhibitorem fosfodiesterazy, który podtrzymuje zatrzymanie mejozy po usunięciu oocytów z mieszków. Alternatywnie można zastosować 3-izobutyl-1-metylksantynę (IBMX) (0,2 mM) lub dibutyrylocykliczny adenozynomonofosforan (dbcAMP) (100 μg/ml). Przygotuj medium hodowlane, dodając glutaminę (1 mM) i milrinon (2,5 μM) do 1 ml CZB i pozostaw do wyrównania w inkubatorze przez co najmniej godzinę. Przygotuj mikrokrople każdego z mediów w szalce Petriego i przykryj je olejem mineralnym. Szalkę z CZB umieszcza się w inkubatorze, natomiast szalkę z MEM/PVP pozostawia na zewnątrz na podgrzewaczu do szkiełek. Rutynowo stosuje się również inne dostępne komercyjnie media do zbierania i hodowli (M2 i M16 od Specialty media lub Sigma).</li> 
<li>Około 48 h po stymulacji PMSG, utnij mysz za pomocą sedacji CO2 z następującym zwichnięciem stawów szyjnych, wypreparuj jajniki i umieść je na szkiełku zegarkowym zawierającym uprzednio ogrzane MEM/PVP + milrinon (MEM/PVP+M).</li>
<li>Używając strzykawki insulinowej 1 ml, unieruchom jajniki na szalce i uwolnij mieszki antralne, nakłuwając je kilkakrotnie złączonymi igłami o rozmiarze 27 G (lub igłami do szycia).</li> 
<li>Obserwując preparat pod mikroskopem sekcyjnym, zbierz kompleksy cumulus-oocyt za pomocą szklanej pipety sterowanej ustami. Pomocne jest zastosowanie mikroskopu o dużym kontraście. Alternatywnie medium zawierające tkankę i komórki można nanieść pipetą na pokrywkę plastikowej szalki Petriego. Zbieraj tylko duże mieszki antralne, a nie mniejsze mieszki przedantralne lub oocyty pozbawione komórek cumulus. Po zebraniu przenieś kompleksy do mikrokropli MEM/PVP+M znajdującej się na podgrzewaczu do szkiełek i pod warstwą oleju.</li>
<li>Używając małej pipety (o średnicy nieco większej niż średnica oocytu), pipetuj kompleksy w górę i w dół, aby oddzielić komórki cumulus. Przenieś oocyty pozbawione komórek cumulus większą pipetą do mikrokropli CZB + milrinon (CZB+M) i umieść w inkubatorze.</li>
<li>Pozostaw oocyty do regeneracji w inkubatorze przez co najmniej 1 h przed przystąpieniem do manipulacji.</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja oocytów
<ol>
<li>Wykonaj pipety do iniekcji poprzez wyciąganie kapilar z borokrzemowego szkła w mechanicznym wyciągarzu. Używamy wyciągarza mikropipet Flaming-Brown (Model P-97) z następującymi ustawieniami: P=500, Heat=300, Pull=150, Vel=100, Time=150.</li>
<li>Przygotuj platformę do mikroiniekcji, umieszczając kroplę 5 μl MEM/PVP+M jak najbliżej kropli 0,5 μl wybranego materiału do iniekcji (np. siRNA, cRNA, oligonukleotyd morpholino itp.) na szkiełku z jedną komorą, z której usunięto komorę z medium. Przykryj olej mineralny i umieść na stoliku mikroskopu (Rys. 1).</li>
<li>Umieść pipety do iniekcji i pipety trzymające w uchwytach i ustaw je w kropli MEM/PVP+M. Otwórz butle z azotem podłączone do pikoinkektora i stołu antywibracyjnego. Otwórz końcówkę pipety do iniekcji, delikatnie stukając nią o pipetę trzymającą, jednocześnie napełniając ją medium. Jeśli otwór będzie zbyt duży, medium będzie szybko przepływać w obie strony, a igła zniszczy komórkę. Pipety z otworem zbyt małym często łatwo się zatykają.</li>
<li>Przenieś oocyty (5-10) z inkubatora do kropli MEM/PVP+M na platformie. Przed rozpoczęciem iniekcji skonfiguruj pikoinkektor. W naszym pikoinkektorze (Model PLI-100 z Harvard Apparatus) stosujemy następujące parametry: PBal=2.5-3.5 psi, PInj=7.8 psi, PClear= 10-12 psi, time= 3s. Pozwala to na uzyskanie objętości iniekcji wynoszącej 5-10 pL.</li> 
<li>Naciskając przycisk CLEAR, przesuń igłę do iniekcji do kropli z materiałem i napełnij ją. Następnie wróć do kropli z medium.</li>
<li>Użyj pipety trzymającej do uchwycenia oocytu i ustaw igłę do iniekcji, oocyt oraz pipetę trzymającą wzdłuż osi x.</li> 
<li>Przy większym powiększeniu wprowadź pipetę do iniekcji do oocytu, uważając, aby nie uszkodzić jądra komórkowego. Po przebiciu błony plazmatycznej naciśnij INJECT. Po iniekcji wycofaj igłę. Zwolnij oocyt i powtórz procedurę. Po zaszczepieniu wszystkich oocytów przenieś je z powrotem do inkubatora. Przechowuj w CZB+M przez wymagany czas; czas ten zależy od celu eksperymentu (np. wyciszenie za pomocą siRNA i morpholino (do 24 h), nadekspresja (3-12 h)). Należy pamiętać, że inkubacja dłuższa niż 24 h upośledzi dojrzewanie meiotyczne.</li>
</ol>
3. Dojrzewanie oocytów
<ol>
<li>Po inkubacji przemyj oocyty kilkoma kroplami medium CZB (medium do dojrzewania), przenieś je do mikrokropli medium do dojrzewania pod warstwą oleju i umieść w inkubatorze.</li> 
<li>Pozostaw na 16 h w celu pełnego dojrzewania do metafazy mejozy II.</li>
</ol>
4. Analiza ploidalności
<ol>
<li>Przygotować CZB + monastrol (100 μM) i nalać 750 μl do dołka naczynia do hodowli organów, w którym w zewnętrznym pierścieniu znajduje się woda.</li>
<li>Przemyć jaja, przekładając je przez kilka kropel CZB + monastrol, a następnie przenieść je do naczynia do hodowli organów. Umieścić w inkubatorze na 1 h.</li>
<li>Utrwalić jaja, przenosząc je do szkiełka zegarkowego zawierającego 2% paraformaldehyd w PBS na 20 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść do innego szkiełka zegarkowego z roztworem blokującym. Naczynie to można przechowywać w temperaturze 4° C do czasu przetworzenia.</li>
<li>Przenieść do roztworu permeabilizującego (PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN3) w szkiełku zegarkowym na 15 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać kilkukrotnie dużymi objętościami roztworu blokującego (PBS + 0.3% BSA + 0.01 Tween-20 + 0.02% NaN3).</li>
<li>Pozostałą część procedury wykonuje się na pokrywie płytki 96-dołkowej w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem. Krople (˜25 μl) umieszcza się wewnątrz okrągłych wgłębień. Przenieść jaja do roztworu blokującego na 15 minut.</li> 
<li>Aby oznakować centromery, przenieść jaja do kropli roztworu blokującego zawierającego antyserum CREST w rozcieńczeniu 1:40. Inkubować przez co najmniej 1 h. Przemyć, przekładając przez 3 krople roztworu blokującego, inkubując po 15 minut w każdej.</li>
<li>Przenieść jaja do kropli roztworu blokującego zawierającego przeciwciała anty-human IgG sprzężone z Cy5 lub Alexa-fluor-594 (1:200) i inkubować przez 1 h. Powtórzyć etapy przemywania jak wyżej, z wyjątkiem ostatniego kroku, w którym do roztworu blokującego należy dodać Sytox Green (1:5 000) w celu wykrycia chromosomów. Zamontować w 5 μl Vectashield. Aby zapobiec zmiażdżeniu jaj, nanieść 4 małe punkty wazeliny w rogach miejsca, w którym znajdzie się szkiełko nakrywkowe. Nałożyć szkiełko nakrywkowe i uszczelnić lakierem do paznokci. Przechowywać w kasetce na preparaty w temperaturze 4° C do czasu analizy za pomocą mikroskopii konfokalnej.</li>
<li>Podczas obrazowania z użyciem obiektywu 100X, rejestrować obrazy w krokach 0.4 μm w płaszczyźnie Z i obrazować cały obszar wrzeciona metafazowego. Policzyć centromery przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J (NIH).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Rycina 2 przedstawia projekcję Z z diploidalnego oocytu. W metafazie MII diploidalne oocyty myszy zawierają 20 par chromosomów, a zatem posiadają 40 centromerów. Czasami chromosomy nie rozkładają się mimo zastosowania monastrolu. Sytuacja ta utrudnia wiarygodne policzenie centromerów, dlatego nie uwzględniamy takich oocytów w naszych analizach. Okazyjnie może być trudne określenie, czy immunoreaktywna w odniesieniu do CREST „plamka” to 1 czy 2 centromery. Stosowanie programów takich jak Image J jest przydatne, ponieważ pozwala na analizę każdego przekroju Z przy uważnym odnotowywaniu orientacji chromosomów, liczby przekrojów, w których wykryto „plamkę” oraz intensywności pikseli tych „plamek”. W zależności od położenia wrzeciona meiotycznego względem ciałka polarnego, regiony DNA mogą na siebie nachodzić; takich próbek nie należy włączać do analizy.
Niepoddane manipulacjom, owulowane in vivo oocyty od młodych myszy w wieku rozrodczym charakteryzują się niskim wskaźnikiem aneuploidii (˜1-2%). Jednakże, z przyczyn nieznanych, procedury mikroiniekcji i dojrzewania in vitro mogą zwiększyć ten wskaźnik do poziomu powyżej 10%. Dlatego krytyczne jest uwzględnienie oocytów kontrolnych poddanych iniekcji w każdym badaniu z wykorzystaniem mikroiniekcji.
<img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Układ do wstrzykiwania mikroiłkami w badaniach nad zarodkami, przedstawiający igłę, pipetę i materiał do wstrzykiwania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przygotowanie szalki do mikroiniekcji. Szkiełko komorowe z kroplami 5 μl MEM/PVP + M znajdującymi się bezpośrednio nad kroplami 0,5 μl roztworu do wstrzykiwania. Przykryto olejem mineralnym. W tym przykładzie znajdują się 3 krople dla 3 różnych roztworów do wstrzykiwania, a szkiełko spoczywa na stoliku mikroskopu. Po lewej stronie znajduje się igła do mikroiniekcji, a po prawej pipeta trzymająca. Należy zwrócić uwagę na odbicie uchwytów igieł.
<img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Mapa chromosomowa, obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, markery genetyczne, oznakowane chromosomy do analizy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wyniki ploidii. Projekcja Z euploidnej komórki jajowej w metafazie II. DNA jest zabarwione na zielono, a kinetochory na czerwono. Strzałki wskazują na dwa odrębne ramiona chromatyd, co wskazuje na nakładanie się kinetochorów (#17 i #18). Euploidne komórki jajowe myszy zawierają 20 par kinetochorów (łącznie 40 „punktów”). Komórka aneuploidna zawierałaby dowolną inną liczbę. Gdyby procedura ta została przeprowadzona na oocytach w metafazie MI, obecnych byłoby 40 par kinetochorów (łącznie 80 „punktów”).
<img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tabela stężeń chemicznych dla hodowli komórkowych; obejmuje sole Earle'a, pirogronian, gentamycynę, HEPES." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Skład pożywki do zbierania i mikroiniekcji (MEM/PVP + M). Wszystkie materiały są klasy do hodowli embrionalnej i pochodzą od firmy Sigma-Aldrich. Sterylizować przez filtry PVDF 0.22μm (stosujemy Milipore Stericups) i przechowywać w temperaturze 4°C.
<img src="/files/ftp_upload/2851/2851table2.jpg" alt="Tabela stężeń chemicznych do przygotowania pożywek do hodowli komórkowej; zawiera wartości NaCl, KCl i BSA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2. Skład pożywki CZB. Wszystkie materiały są klasy do hodowli embrionalnej i pochodzą z firmy Sigma-Aldrich. Sterylizować przez filtrację przez filtry PVDF 0,22μm (stosujemy Milipore Stericups) i przechowywać w temperaturze 4°C.

<ol><li>Hunt, P. A., Hassold, T. J. Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).</li>
<li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).</li>
<li>Schultz, M. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchultz%2C+MR+%22Oogenesis+and+the+control+of+meiotic+maturation%22">Oogenesis and the control of meiotic maturation</a>. , Cambridge University Press. New York. (1986).</li>
<li>Moore, G. P., Lintern-Moore, S. Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).</li>
<li>Hodges, C. A., Hunt, P. A. Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).</li>
<li>Schindler, K., Schultz, R. M. Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).</li>
<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. 20 (17), 1522-1522 (2010).</li>
<li>Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. Science. 286 (5441), 971-971 (1999).</li>
<li>Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).</li>
<li>Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).</li>
<li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).</li>
<li>Schuh, M., Ellenberg, J. Cell. 130 (4), 484-484 (2007).</li>
<li>Backs, J., Stein, P., Backs, T. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).</li>
<li>Schindler, K., Schultz, R. M. Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).</li>
<li>Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. Cell. 126 (1), 135-135 (2006).</li>
<li>Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Mikroiniekcja oocytów jest potężną metodą badania mechanizmów regulujących dojrzewanie meiotyczne 10,11, 12, 13. Metoda ta stanowi ekonomiczny sposób testowania hipotez przed dokonaniem dużych inwestycji w opracowanie transgenicznych i celowanych modeli mysich. Opanowanie technik pobierania oocytów i mikroiniekcji wymaga więcej czasu niż w przypadku typowych procedur biologii komórki. Konkretne trudności przy pobieraniu często obejmują kontrolowanie pipety ustnej, wyciąganie szklanych pipet o odpowiedniej średnicy do pobierania i usuwania komórek somatycznych oraz zwiększanie szybkości pobierania w celu zminimalizowania czasu przebywania oocytów poza inkubatorem. Zalecamy wielokrotne ćwiczenia przed przystąpieniem do eksperymentów. Przenoszenie oocytów między mikrokroplami przy zachowaniu tej samej liczby komórek to doskonały sposób na oswojenie się z tą metodą.
Śmierć komórek często występuje podczas nauki mikroiniekcji. Może to być spowodowane szeregiem przyczyn, w tym wstrzyknięciem zbyt dużej objętości materiału (np. otwór igły do iniekcji jest zbyt duży), uderzeniem igły w jądro komórkowe, przebiciem przeciwległej strony oocytu lub toksycznością wstrzykniętego materiału dla oocytu. Kluczem do opanowania tej techniki jest ćwiczenie iniekcji buforu do oocytów aż do momentu, gdy wskaźnik przeżywalności wyniesie co najmniej 50%. Jeśli oocyty nie dojrzewają, prawdopodobnie milrinon nie został wystarczająco rozcieńczony. Zalecamy płukanie oocytów w wielu dużych kroplach medium CZB bez milrinonu przed rozpoczęciem dojrzewania.
Analiza ploidalności po mikroiniekcji jest jednym z wielu testów służących do oceny dojrzewania meiotycznego. Inne rutynowe analizy stosowane w naszym laboratorium obejmują monitorowanie kinetyki postępu oocytów przez mejozę, immunofluorescencję w celu analizy formowania wrzeciona i ustawienia chromosomów oraz aktywację komórki jajowej lub zapłodnienie in vitro w celu oceny skuteków rozwojowych manipulacji oocytem 14,15, 16, 17.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela specyficznych odczynników:</td></tr><tr><td>Milrinon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Resuspendować w DMSO w stężeniu 2,5mM</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Stosować wyłącznie sterylny, filtrowany, sprawdzony na embrionach</td></tr><tr><td>Autoserum CREST</td><td>Immunovision</td><td>HCT-0100</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Invitrogen</td><td>57020</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antyludzkie Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11014</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>577773</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Resuspendować w DMSO w stężeniu 100mM</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela specyficznego sprzętu:</td></tr><tr><td>Końcówka ustna</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>Zegarek szklany</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-30</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td>1ml, 27G&lt;sup&gt;1/2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz boczny</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Dowolny standardowy model</td></tr><tr><td>Mikroskop do dissekcji</td><td></td><td></td><td>Dowolny standardowy model</td></tr><tr><td>Kuweta do slajdów</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177372</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0500</td><td>microcaps</td></tr><tr><td>Wytapiająca do pipet</td><td>Flaming-Brown micropipette puller</td><td></td><td> Model P-97</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Dowolny standardowy model </td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dowolny standardowy model </td></tr><tr><td>Pikoinkektor</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model PLI-100</td><td>Dowolny standardowy model</td></tr><tr><td>Butle CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Do inkubatora</td></tr><tr><td>Butla N2</td><td></td><td></td><td>Do stołu i injektora</td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td></td><td>Dowolny standardowy model </td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td>Dowolny standardowy model </td></tr><tr><td>Pipety trzymające</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Dowolny standardowy model </td></tr><tr><td>Narzędzia do dissekcji</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Dowolny standardowy model </td></tr><tr><td>Komora nawilżana</td><td></td><td></td><td>Używamy pojemników typu tupperware</td></tr><tr><td>Wieczko płytki 96-dołkowej</td><td>Nalge Nunc international</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Przedmioty szkiełka</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywki</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>Grubość zależy od konkretnych mikroskopów</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli organów z centralnym dołkiem</td><td>Fisher Scientific</td><td>353037</td><td>60 X 15mm</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Błędy w segregacji chromosomów prowadzą do powstania komórek aneuploidalnych. W komórkach somatycznych aneuploidia wiąże się z nowotworami, natomiast w gametach prowadzi do niepłodności, poronień lub wad rozwojowych, takich jak zespół Downa. Haploidalne gamety powstają w wyniku specyficznych dla danego gatunku programów rozwojowych sprzężonych z mejozą. Pierwszy podział meiotyczny (MI) jest unikalny dla mejozy, ponieważ chromatydy siostrzane pozostają połączone, podczas gdy segregowane są chromosomy homologiczne. Z przyczyn nie do końca wyjaśnionych ten podział redukcyjny jest podatny na błędy i częściej stanowi źródło aneuploidii niż błędy w mejozie II (MII) lub błędy w mejozie męskiej 1,2.
U ssaków oocyty zatrzymują się w profazie MI z dużym, nienaruszonym pęcherzykiem zarodkowym (GV; jądro) i wznawiają mejozę dopiero po otrzymaniu sygnałów owulacyjnych. Po wznowieniu mejozy oocyty kończą MI i przechodzą asymetryczny podział komórkowy, ponownie zatrzymując się w metafazie MII. Komórki jajowe nie ukończą MII do momentu zapłodnienia przez plemniki. Oocyty mogą również przechodzić dojrzewanie meiotyczne przy zastosowaniu uznanych warunków hodowli in vitro 3. Ponieważ generowanie transgenicznych myszy i mutantów z celowanym nokautem genów jest kosztowne i czasochłonne, manipulacja gametami żeńskimi in vitro stanowi bardziej ekonomiczną i oszczędzającą czas strategię.
W niniejszej pracy opisujemy metody izolacji oocytów myszy zatrzymanych w profazie oraz technikę mikroiniekcji. Do oocytu można wprowadzić dowolny wybrany materiał, jednak ze względu na to, że oocyty zdolne do przejścia mejozy są transkrypcyjnie nieaktywne 4,5, do badań nad ekspresją ektopową należy wstrzyknąć cRNA, a nie DNA. W celu oceny ploidii opisujemy warunki dojrzewania oocytów in vitro do etapu jajeczek MII. Historycznie do określania liczby chromosomów stosowano techniki rozprzestrzeniajania chromosomów 6. Metoda ta jest trudna technicznie i pozwala jedynie na identyfikację hiperploidii. Tutaj opisujemy metodę określania hypo- i hiperploidii z wykorzystaniem nienaruszonych jajeczek 7-8. Metoda ta wykorzystuje monastrol, inhibitor kinezyny-5, który powoduje zapadnięcie się wrzeciona dwubiegunowego w wrzeciono jednobiegunowe 9, rozdzielając tym samym chromosomy w taki sposób, że poszczególne kinetochory mogą być łatwo wykrywane i liczone przy użyciu autoimmunologicznego serum anty-CREST. Ponieważ metoda ta jest przeprowadzana na nienaruszonych jajeczkach, chromosomy nie ulegają utracie w wyniku błędów operatora.

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Błędy w segregacji chromosomów prowadzą do powstania komórek aneuploidalnych. W komórkach somatycznych aneuploidia wiąże się z nowotworami, natomiast w gametach aneuploidia prowadzi do ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena diploidii jaj w metafazie drugiego podziału mejozy. Po manipulacjach eksperymentalnych należy rozpocząć od pobrania w pełni wyrośniętych oocytów mysich od primowanych, osiągających dojrzałość płciową samic. Następnie należy mikroiniekować oocyty wybranymi materiałami w celu zaburzenia interesującego białka i dojrzeć oocyty in vitro do metafazy drugiej mejozy. Kolejnym krokiem jest stymulacja rozprzestrzeniania się chromosomów w jajeczku poprzez traktowanie mantro, co prowadzi do powstania wrzeciona monopolarnego.Ostatecznie wyniki te mogą obrazować ploidię komórki jajowej za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozrodu oraz segregacji chromosomów, takie jak zrozumienie molekularnych mechanizmów prowadzących do aneuploidii. Wizualna demonstracja tej metody jest krytyczna, ponieważ technika mikroiniekcji jest trudna do opanowania, gdyż wiele etapów jest ciężkich do przekazania w formie pisemnej. Wykonaj iniekcję doprzewnową u płciowo dojrzałych samic myszy, podając 5 IU gonadotropiny dla pęcherzyków jajowych pochodzenia konnej marej (PMSG), aby zmaksymalizować liczbę pęcherzyków antralnych izolowanych z każdej myszy.Około 48 godzin po stymulacji PMSG podgrzać trzy mililitry na mysz medium do zbioru do 37 °C i inkubować. Jeden mililitr medium hodowlanego przez co najmniej jedną godzinę. Przygotować mikrokrople każdego z mediów w szalce Petriego i przykryć je olejem mineralnym.Następnie umieść szalkę z podłożem hodowlanym w inkubatorze, a szalkę z podłożem do zbierania na podgrzewaczu do szkiełek. Uśmierć mysz, wypreparuj jajniki i umieść je w szkiełku zegarkowym zawierającym uprzednio ogrzane podłoże do zbierania.Używając jednofazowej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml, przymocuj jajniki do szalki i uwolnij pęcherzyki antralne, nakłuwając je kilkukrotnie złączonymi igłami o rozmiarze 27 G. Pod mikroskopem stereoskopowym zbierz kompleksy oocyt-cumulus za pomocą szklanej pipety sterowanej ustami. Pobieraj wyłącznie duże pęcherzyki antralne, pomijając mniejsze pęcherzyki przedantralne oraz oocyty pozbawione warstwy cumulus.Przenieś kompleksy do mikrokropli przygotowanego medium zbierającego za pomocą małej pipety, której średnica jest nieco większa od średnicy oocytu. Oddziel komórki cumulus od kompleksów. Przenieś odgolone oocyty za pomocą większej pipety do mikrokropli medium hodowlanego.Przed manipulacją pozwolić oocytom na regenerację przez co najmniej jedną godzinę w inkubatorze. Przygotować pipety do wstrzykiwania, wyciągając kapilary z borokrzemianowego szkła za pomocą wyciągarki mechanicznej. Zdjąć komorę z medium z preparatu szkiełka z jedną komorą.Aby stworzyć platformę do mikroiniekcji, nanieś kroplę 5 µL medium zbierającego jak najbliżej kropli 0,5 µL materiału do iniekcji oligonukleotydów SIR N-A-C-R-N-A lub morpholino; przykryj całość olejem mineralnym i umieść na stole mikroskopu. Umieść pipety do iniekcji i podtrzymujące w uchwytach, a następnie wprowadź je do kropli medium zbierającego. Otwórz butle z azotem podłączone do piko-injektora oraz stołu antywibracyjnego.Otwórz końcówkę pipety wstrzykującej, delikatnie uderzając nią o pipetę trzymającą podczas napełniania medium. Przenieś od pięciu do 10 miejsc z inkubatora do kropli medium zbierającego na platformie. Następnie ustaw parametry piko-wtryskiwacza na objętość wstrzyknięcia od pięciu do 10 piko-litrów, naciskając przycisk clear.Przesuń igłę iniekcyjną do kropli materiału i pobierz próbkę. Zwróć ją następnie do kropli medium. Użyj pipety podtrzymującej, aby uchwycić oocyt, a następnie ustaw igłę iniekcyjną, oocyt i pipetę podtrzymującą w jednej linii wzdłuż osi x.Przy większym powiększeniu wprowadź pipetę iniekcyjną do oocyty, uważając, aby nie uszkodzić jądra komórkowego. Po przebiciu błony plazmatycznej naciśnij przycisk „inject”, a następnie wycofaj igłę, zwolnij oocytę i powtórz procedurę. Po wstrzyknięciu substancji do wszystkich oocyt, przenieś je z powrotem do inkubatora, aby utrzymać je w medium hodowlanym przez wymagany czas, który zazwyczaj wynosi od 12 do 24 godzin.Następnie przemyć cyty kilkoma kroplami CZB i przenieść do mikrokropli CZB pod olej, a następnie inkubować przez 16 godzin do czasu pełnego dojrzewania do metafazy drugiej mejozy. Do dołka naczynia do hodowli organów, w którego zewnętrznym pierścieniu znajduje się woda, wlać 750 µL CZB zawierającego 100 µM Mastri. Teraz przemyć jaja kilkoma kroplami CZB z dodatkiem mastri, a następnie przenieść je do naczynia do hodowli organów i inkubować przez godzinę.Utrwal jaja w szkiełku zegarkowym zawierającym 2% paraformaldehyd w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś jaja do roztworu blokującego i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu przeprowadzenia permeabilizacji jaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj je kilkukrotnie dużymi objętościami roztworu blokującego.Pozostałą część procedury przeprowadź na pokrywce płytki 96-dołkowej, chroniąc ją przed światłem w komorze wilgotnościowej. W temperaturze pokojowej przenieś jaja do kropel 25 µL roztworu blokującego na 15 minut. Następnie, aby oznakować centromery, przenieś jaja do kropli roztworu blokującego zawierającego antyserum Crest w rozcieńczeniu 1:40 i inkubuj przez co najmniej jedną godzinę.Następnie przemyj próbkę trzykrotnie, używając po trzy krople roztworu blokującego i inkubując przez 15 minut po każdym razie. Przenieś jaja do kropli roztworu blokującego zawierającego przeciwciało koniugowane z fluoro four i inkubuj przez jedną godzinę. Przemyj dwukrotnie roztworem blokującym w celu wykrycia chromosomów.Inkubować w rozcieńczeniu 1:5 000 cytx green i roztworze blokującym, a następnie zamontować próbki w 5 µL Vector Shield. Nanieść cztery małe kropki wazeliny w miejscach przyszłych narożników szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec zmiażdżeniu jajeczek. Nałożyć szkiełko nakrywkowe i uszczelnić lakierem do paznokci; przechowywać w kasetce na preparaty w temperaturze 4 °C do czasu analizy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Podczas obrazowania z użyciem obiektywu 100x należy rejestrować kroki 0,4 µm w płaszczyźnie Z i obrazować cały obszar metafazy; zliczyć centromery przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ z NIH. Euploidalne jajeczka myszy zawierają 20 par kinetochorów, co daje łącznie 40 punktów w tej projekcji Z euploidalnej metafazy II. DNA jest zabarwione na zielono, a kinetochory na czerwono.Strzałki wskazują na dwa odrębne ramiona chromatyd, co wskazuje na nakładanie się w obrębie kinetochorów numer 17 i numer 18 po procedurze mikroiniekcji. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wpływ zaburzenia białka zainteresowania na dojrzewanie mitotyczne i potencjał rozwojowy, można zastosować inne metody, np. Western blotting, PCR w czasie rzeczywistym, oceny konfiguracji wrzeciona i ułożenia chromosomów oraz zapłodnienie in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak manipulować wszystkimi miejscami i oceniać PLO w metafazie II.

mouse-oocyte-microinjection-maturation-and-ploidy-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wstrzyknięcie mikroskopiczne oocytów mysich, dojrzewanie i ocena poliploidii

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Tutaj prezentujemy protokół do nieinwazyjnej oceny kompetencji rozwojowych oocytów przeprowadzanej podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego do etapu metafazy II. Metoda ta łączy obrazowanie poklatkowe z prędkością obrazu cząstek (PIV) i analizami sieci neuronowych.

Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Przedstawiamy zarys protokołu klinicznego do nieinwazyjnej oceny dojrzałości ludzkiego jaja za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego.

Ocena dojrzałości ludzkich komórek jajowych i jej zastosowanie kliniczne

Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.

Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Ten protokół opisuje procedury dotyczące in vitro dojrzewania oocytów mysich, in vitro zapłodnienia i późniejszej kultury embrionów do etapu blastocysty.

Dojrzewanie in vitro komórek jajowych myszy, zapłodnienie i hodowlą zarodków przedimplantacyjnych

Poznaj mikroiniekcję i dojrzewanie oocytów myszy w celu oceny ploidalności. Ta metoda pozwala badać mechanizmy segregacji chromosomów w biologii rozrodu.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Przeglądaj więcej filmów