Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Ogólnym celem tej procedury jest ocena diploidii jaj w metafazie drugiego podziału mejozy. Po manipulacjach eksperymentalnych należy rozpocząć od pobrania w pełni wyrośniętych oocytów mysich od primowanych, osiągających dojrzałość płciową samic. Następnie należy mikroiniekować oocyty wybranymi materiałami w celu zaburzenia interesującego białka i dojrzeć oocyty in vitro do metafazy drugiej mejozy. Kolejnym krokiem jest stymulacja rozprzestrzeniania się chromosomów w jajeczku poprzez traktowanie mantro, co prowadzi do powstania wrzeciona monopolarnego.

Ostatecznie wyniki te mogą obrazować ploidię komórki jajowej za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozrodu oraz segregacji chromosomów, takie jak zrozumienie molekularnych mechanizmów prowadzących do aneuploidii. Wizualna demonstracja tej metody jest krytyczna, ponieważ technika mikroiniekcji jest trudna do opanowania, gdyż wiele etapów jest ciężkich do przekazania w formie pisemnej. Wykonaj iniekcję doprzewnową u płciowo dojrzałych samic myszy, podając 5 IU gonadotropiny dla pęcherzyków jajowych pochodzenia konnej marej (PMSG), aby zmaksymalizować liczbę pęcherzyków antralnych izolowanych z każdej myszy.

Około 48 godzin po stymulacji PMSG podgrzać trzy mililitry na mysz medium do zbioru do 37 °C i inkubować. Jeden mililitr medium hodowlanego przez co najmniej jedną godzinę. Przygotować mikrokrople każdego z mediów w szalce Petriego i przykryć je olejem mineralnym.

Następnie umieść szalkę z podłożem hodowlanym w inkubatorze, a szalkę z podłożem do zbierania na podgrzewaczu do szkiełek. Uśmierć mysz, wypreparuj jajniki i umieść je w szkiełku zegarkowym zawierającym uprzednio ogrzane podłoże do zbierania.

Używając jednofazowej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml, przymocuj jajniki do szalki i uwolnij pęcherzyki antralne, nakłuwając je kilkukrotnie złączonymi igłami o rozmiarze 27 G. Pod mikroskopem stereoskopowym zbierz kompleksy oocyt-cumulus za pomocą szklanej pipety sterowanej ustami. Pobieraj wyłącznie duże pęcherzyki antralne, pomijając mniejsze pęcherzyki przedantralne oraz oocyty pozbawione warstwy cumulus.

Przenieś kompleksy do mikrokropli przygotowanego medium zbierającego za pomocą małej pipety, której średnica jest nieco większa od średnicy oocytu. Oddziel komórki cumulus od kompleksów. Przenieś odgolone oocyty za pomocą większej pipety do mikrokropli medium hodowlanego.

Przed manipulacją pozwolić oocytom na regenerację przez co najmniej jedną godzinę w inkubatorze. Przygotować pipety do wstrzykiwania, wyciągając kapilary z borokrzemianowego szkła za pomocą wyciągarki mechanicznej. Zdjąć komorę z medium z preparatu szkiełka z jedną komorą.

Aby stworzyć platformę do mikroiniekcji, nanieś kroplę 5 µL medium zbierającego jak najbliżej kropli 0,5 µL materiału do iniekcji oligonukleotydów SIR N-A-C-R-N-A lub morpholino; przykryj całość olejem mineralnym i umieść na stole mikroskopu. Umieść pipety do iniekcji i podtrzymujące w uchwytach, a następnie wprowadź je do kropli medium zbierającego. Otwórz butle z azotem podłączone do piko-injektora oraz stołu antywibracyjnego.

Otwórz końcówkę pipety wstrzykującej, delikatnie uderzając nią o pipetę trzymającą podczas napełniania medium. Przenieś od pięciu do 10 miejsc z inkubatora do kropli medium zbierającego na platformie. Następnie ustaw parametry piko-wtryskiwacza na objętość wstrzyknięcia od pięciu do 10 piko-litrów, naciskając przycisk clear.

Przesuń igłę iniekcyjną do kropli materiału i pobierz próbkę. Zwróć ją następnie do kropli medium. Użyj pipety podtrzymującej, aby uchwycić oocyt, a następnie ustaw igłę iniekcyjną, oocyt i pipetę podtrzymującą w jednej linii wzdłuż osi x.

Przy większym powiększeniu wprowadź pipetę iniekcyjną do oocyty, uważając, aby nie uszkodzić jądra komórkowego. Po przebiciu błony plazmatycznej naciśnij przycisk „inject”, a następnie wycofaj igłę, zwolnij oocytę i powtórz procedurę. Po wstrzyknięciu substancji do wszystkich oocyt, przenieś je z powrotem do inkubatora, aby utrzymać je w medium hodowlanym przez wymagany czas, który zazwyczaj wynosi od 12 do 24 godzin.

Następnie przemyć cyty kilkoma kroplami CZB i przenieść do mikrokropli CZB pod olej, a następnie inkubować przez 16 godzin do czasu pełnego dojrzewania do metafazy drugiej mejozy. Do dołka naczynia do hodowli organów, w którego zewnętrznym pierścieniu znajduje się woda, wlać 750 µL CZB zawierającego 100 µM Mastri. Teraz przemyć jaja kilkoma kroplami CZB z dodatkiem mastri, a następnie przenieść je do naczynia do hodowli organów i inkubować przez godzinę.

Utrwal jaja w szkiełku zegarkowym zawierającym 2% paraformaldehyd w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś jaja do roztworu blokującego i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu przeprowadzenia permeabilizacji jaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj je kilkukrotnie dużymi objętościami roztworu blokującego.

Pozostałą część procedury przeprowadź na pokrywce płytki 96-dołkowej, chroniąc ją przed światłem w komorze wilgotnościowej. W temperaturze pokojowej przenieś jaja do kropel 25 µL roztworu blokującego na 15 minut. Następnie, aby oznakować centromery, przenieś jaja do kropli roztworu blokującego zawierającego antyserum Crest w rozcieńczeniu 1:40 i inkubuj przez co najmniej jedną godzinę.

Następnie przemyj próbkę trzykrotnie, używając po trzy krople roztworu blokującego i inkubując przez 15 minut po każdym razie. Przenieś jaja do kropli roztworu blokującego zawierającego przeciwciało koniugowane z fluoro four i inkubuj przez jedną godzinę. Przemyj dwukrotnie roztworem blokującym w celu wykrycia chromosomów.

Inkubować w rozcieńczeniu 1:5 000 cytx green i roztworze blokującym, a następnie zamontować próbki w 5 µL Vector Shield. Nanieść cztery małe kropki wazeliny w miejscach przyszłych narożników szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec zmiażdżeniu jajeczek. Nałożyć szkiełko nakrywkowe i uszczelnić lakierem do paznokci; przechowywać w kasetce na preparaty w temperaturze 4 °C do czasu analizy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Podczas obrazowania z użyciem obiektywu 100x należy rejestrować kroki 0,4 µm w płaszczyźnie Z i obrazować cały obszar metafazy; zliczyć centromery przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ z NIH. Euploidalne jajeczka myszy zawierają 20 par kinetochorów, co daje łącznie 40 punktów w tej projekcji Z euploidalnej metafazy II. DNA jest zabarwione na zielono, a kinetochory na czerwono.

Strzałki wskazują na dwa odrębne ramiona chromatyd, co wskazuje na nakładanie się w obrębie kinetochorów numer 17 i numer 18 po procedurze mikroiniekcji. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wpływ zaburzenia białka zainteresowania na dojrzewanie mitotyczne i potencjał rozwojowy, można zastosować inne metody, np. Western blotting, PCR w czasie rzeczywistym, oceny konfiguracji wrzeciona i ułożenia chromosomów oraz zapłodnienie in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak manipulować wszystkimi miejscami i oceniać PLO w metafazie II.