Name: Aktywowane GABA jednokanałowe i toniczne prądy w wycinkach mózgu szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-17T14:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Poznaj technikę patch-clamp do rejestracji prądów jednokanałowych aktywowanych przez GABA w wycinkach hipokampu szczura. Ta metoda pozwala rozróżnić synaptyczne i pozasynaptyczne kanały GABAA oraz zbadać modulację pobudliwości neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była finansowana przez Szwedzką Radę Badawczą (Swedish Research Council), Uniwersytet w Uppsali oraz Fundację Fredrika i Ingrid Thurings. ZJ posiadał stypendia podoktorskie z EXODIAB oraz Svenska Sällskapet för Medicinsk Forskning. Dziękujemy Frankowi Lee za pomoc techniczną.

<ol><li>Pavlov, I., Savtchenko, L. P., Kullmann, D. M., Semyanov, A., Walker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outwardly+rectifying+tonically+active+GABAA+receptors+in+pyramidal+cells+modulate+neuronal+offset%2C+not+gain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Outwardly rectifying tonically active GABAA receptors in pyramidal cells modulate neuronal offset, not gain.</a> J Neurosci. 29, 15341-15350 (2009).</li>
<li>Chao, H. T., Chen, H., Samaco, R. C., Xue, M., Chahrour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+in+GABA+signalling+mediates+autism-like+stereotypies+and+Rett+syndrome+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dysfunction in GABA signalling mediates autism-like stereotypies and Rett syndrome phenotypes.</a> Nature. 468, 263-269 (2010).</li>
<li>Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+excessive+GABA-mediated+tonic+inhibition+promotes+functional+recovery+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke.</a> Nature. 468, 305-309 (2010).</li>
<li>Jin, Z., Jin, Y., Mendu, K. M., Degerman, E., Groop, L., Birnir, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+reduces+neuronal+excitability+by+turning+on+GABA%28A%29+channels+that+generate+tonic+current%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Insulin reduces neuronal excitability by turning on GABA(A) channels that generate tonic current.</a> Plos One. 6, e16188-e16188 (2011).</li>
<li>Nusser, Z., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+modulation+of+tonic+and+phasic+inhibitions+in+dentate+gyrus+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Selective modulation of tonic and phasic inhibitions in dentate gyrus granule cells.</a> J Neurophysiol. 87, 2624-2628 (2002).</li>
<li>Semyanov, A., Walker, M. C., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+uptake+regulates+cortical+excitability+via+cell+type-specific+tonic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA uptake regulates cortical excitability via cell type-specific tonic inhibition.</a> Nat Neurosci. 6, 484-490 (2003).</li>
<li>Birnir, B., Korpi, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+sub-cellular+location+and+intracellular+neuronal+proteins+on+properties+of+GABA%28A%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">The impact of sub-cellular location and intracellular neuronal proteins on properties of GABA(A) receptors.</a> Curr Pharm Des. 13, 3169-3177 (2007).</li>
<li>Olsen, R. W., Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Union+of+Pharmacology.+LXX.+Subtypes+of+gamma-aminobutyric+acid%28A%29+receptors%3A+classification+on+the+basis+of+subunit+composition%2C+pharmacology%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Update.+Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International Union of Pharmacology. LXX. Subtypes of gamma-aminobutyric acid(A) receptors: classification on the basis of subunit composition, pharmacology, and function.</a> Update. Pharmacol Rev. 60, 243-260 (2008).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22The+Single-Channel+Recording%22">The Single-Channel Recording</a>. , 2 ed., Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Zilberter, Y., Zilberter, T., Bregestovski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+in+vitro+and+the+in+vivo+reality%3A+the+role+of+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity in vitro and the in vivo reality: the role of energy homeostasis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31, 394-401 (2010).</li>
<li>Spruston, N., McBain, C. Structural and functional properties of hippocampal neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpruston%2C+N+%22The+Hippocampus+Book%22">The Hippocampus Book</a>. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'keefe, O. , Oxford University Press. Oxford. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Hippocampus+Book%22">The Hippocampus Book</a>. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'keefe, O. , Oxford University Press. Oxford. (2007).</li>
<li>Eghbali, M., Curmi, J. P., Birnir, B., Gage, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+GABA%28A%29+channel+conductance+increased+by+diazepam%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal GABA(A) channel conductance increased by diazepam.</a> Nature. 388, 71-75 (1997).</li>
<li>Lindquist, C. E., Birnir, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graded+response+to+GABA+by+native+extrasynaptic+GABA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Graded response to GABA by native extrasynaptic GABA receptors.</a> J Neurochem. 97, 1349-1356 (2006).</li>
<li>Birnir, B., Eghbali, M., Cox, G. B., Gage, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+concentration+sets+the+conductance+of+delayed+GABAA+channels+in+outside-out+patches+from+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">GABA concentration sets the conductance of delayed GABAA channels in outside-out patches from rat hippocampal neurons.</a> J Membr Biol. 181, 171-183 (2001).</li>
<li>Birnir, B., Eghbali, M., Everitt, A. B., Gage, P. W. B. icuculline <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pentobarbital+and+diazepam+modulate+spontaneous+GABA%28A%29+channels+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">pentobarbital and diazepam modulate spontaneous GABA(A) channels in rat hippocampal neurons.</a> Br J Pharmacol. 131, 695-704 (2000).</li>
<li>Birnir, B., Everitt, A. B., Gage, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+GABAA+channels+in+rat+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of GABAA channels in rat dentate gyrus.</a> J Membr Biol. 142, 93-102 (1994).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Prąd całej komórki reprezentuje sumę prądów generowanych przez aktywne kanały w komórce. Specyficzna farmakologia i przepuszczalność dla chlorków kanałów GABAA umożliwiają identyfikację prądów związanych z tymi kanałami. Przemijający charakter aktywacji kanałów synaptycznych oraz toniczna aktywacja kanałów pozasynaptycznych pozwalają na łatwe rozróżnienie między tymi dwiema populacjami kanałów GABAA wykazujących ekspresję w neuronie. Jednak tylko rejestracje pojedynczych kanałów pozwalają na badanie właściwości kinetycznych cząsteczek kanałów generujących prądy toniczne. W przeciwieństwie do kanałów synaptycznych, które aktywują się w czasie 100 μs, toniczne kanały GABAA aktywują się z opóźnieniem wynoszącym od kilku do kilkunastu minut od momentu aplikacji GABA 4,7,15,16,17,18. To opóźniona aktywacja kanałów sprawia, że wielu ich właściwości nie można badać za pomocą rejestracji prądów całej komórki. Na poziomie pojedynczego kanału różne subpopulacje kanałów GABAA można zidentyfikować na podstawie zmiennych właściwości funkcjonalnych i farmakologicznych. Zatem, wykorzystując możliwości różnych konfiguracji patch-clamp, możliwe jest szczegółowe badanie funkcji molekularnej i farmakologii kanałów aktywowanych przez GABA, które generują prądy toniczne i synaptyczne w neuronach.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;Dostępnych jest kilka systemów sprzętowych i programistycznych do techniki patch-clamp, które wszystkie działają w oparciu o te same podstawowe zasady. W naszym laboratorium do rejestracji i analizy eksperymentów wykorzystujemy wzmacniacze Axoclamp oraz oprogramowanie PClamp (Molecular Devices, USA). Inną popularną marką są wzmacniacze i oprogramowanie HEKA (HEKA Elektronik, Niemcy). &lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę wprowadzić tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;Mikrokuwarka: Narishige MF-830 (Japonia); wibrotom: np. Leica VT1200S (Niemcy) lub wibrotom Campden Instruments (Wielka Brytania); mikroskop: Nikon Eclipse E600FN; kąpiel wodna; mikromanipulatory: wykonane na zamówienie oraz mikromanipulatory Narishige (Japonia); wypalarka elektrod: DMZ-universal (Niemcy) lub Narishige PC-10 (Japonia). Szkło elektrodowe: GC150F-15 (Harvard Apparatus, Wielka Brytania).&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

prądy pojedynczego kanału i prądy toniczne aktywowane przez gaba w skrawkach mózgu szczura

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

Kanały GABAA występują we wszystkich neuronach i znajdują się zarówno w synapsach, jak i poza nimi, gdzie generują odpowiednio prądy fazowe i toniczne 4,5,6,7. Kanał GABAA jest pentamerycznym kanałem chlorkowym sterowanym przez GABA. Podjednostki kanału dzielą się na 8 rodzin (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π i ρ). Funkcjonalny kanał tworzą dwie podjednostki alfa, dwie beta oraz jedna podjednostka 3rd 8. Poprzez połączenie badań specyficznych dla podtypów cząsteczek pojedynczych kanałów aktywowanych przez GABA z badaniami obejmującymi wszystkie populacje kanałów GABAA w neuronie, możliwe staje się zrozumienie podstawowego mechanizmu inhibicji neuronalnej oraz sposobu, w jaki jest ona modulowana przez środki farmakologiczne.
Wykorzystujemy technikę patch-clamp 9,10 do badania właściwości funkcjonalnych kanałów GABAA w żywych neuronach w skrawkach hipokampa mózgu oraz do rejestracji prądów pojedynczego kanału i prądów całokomórkowych. Badamy ponadto, w jaki sposób na kanały wpływają różne stężenia GABA, inne leki oraz czynniki wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe. Szczegółowy opis teoretyczny i praktyczny metody patch-clamp znajduje się w publikacji The Single-Channel Recordings pod redakcją B. Sakmana i E. Nehera 10.

Wykorzystujemy technikę patch-clamp do pomiaru prądów pojedynczych kanałów aktywowanych przez GABA (kanały GABAA, receptory GABAA) oraz generowanych przez nie prądów synaptycznych i tonicznych w neuronach. Aktywacja kanałów zmniejsza pobudliwość neuronów w stanach zdrowia i choroby 1,2,3,4.

Prądy pojedynczego kanału i prądy toniczne aktywowane przez GABA w skrawkach mózgu szczura

Kanały $\text{GABA}_A$ występują we wszystkich neuronach i znajdują się zarówno w synapsach, jak i poza nimi, gdzie generują prądy fazowe oraz toniczne, ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest rejestracja prądów aktywowanych przez GABA generowanych przez pojedyncze cząsteczki, prądu pojedynczego kanału oraz przez specyficzne populacje kanałów zlokalizowanych w synapsach lub poza nimi. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie skrawków mózgu szczura z obszaru hipokampa oraz wykonanie pipet do techniki patch clamp. W drugim kroku pipeta zostaje przytwierdzona do błony neuronalnej.Po utworzeniu giga-uszczelnienia uzyskuje się konfigurację cell-attached patch clamp. Następnie należy zastosować ssanie w pipecie. W momencie przerwania membrany komórkowej zostaje ustanowiona konfiguracja whole-cell patch clamp.Uzyskano wyniki pozwalające na rozróżnienie między synaptycznymi a pozasynaptycznymi kanałami GABA$_A$. Główną zaletą techniki patch-clamp w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak EMIT, jest możliwość badania właściwości funkcjonalnych kanałów. Metoda patch-clamp może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki, takie jak czynniki determinujące pobudliwość neuronów oraz sposób jej modulacji i precyzyjnego dostrajania.Implikacje tej technologii rozciągają się na terapię i diagnostykę wielu chorób, ponieważ każda żywa komórka zależy od prawidłowo funkcjonujących kanałów jonowych w celu przetrwania oraz realizacji wyspecjalizowanych funkcji komórkowych. Procedurę zaprezentują giant, stażysta podoktorski w laboratorium, oraz young yin, student studiów doktoranckich w laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, uśmierć szczura szczepu Wistar w wieku od 16 do 22 dni po urodzeniu poprzez dekapitację i szybko usuń mózg za pomocą szpatułki. Przetnij mózg wzdłuż linii środkowej za pomocą skalpela chirurgicznego.Następnie należy umieścić każdą półkulę na papierze filtrującym Watman, stroną przeciętą skierowaną w stronę papieru. Na dysk do preparatu nanieś kroplę superglue, a następnie umieść na nim półkulę stroną przeciętą do dołu. Następnie włóż dysk z preparatem do komory tnącej wibratomu wypełnionej lodowatą wodą.A CSF. Ustaw grubość plastra na 400 micrometers i rozpocznij cięcie mózgu. Odcinaj około dwóch milimetrów tkanki mózgowej, aż dotrzesz do hipokampa.Następnie należy umieścić skrawki hipokampa w szklanej płytce Petri wypełnionej CSF. Płytkę kładzie się na czarnym tle, aby umożliwić łatwą wizualizację hipokampa. Kolejnym krokiem jest wyizolowanie hipokampa z otaczającej go tkanki za pomocą ostrego skalpela chirurgicznego.Należy uważać, aby po tym kroku nie przesuwać ani nie rozciągać tkanki. Inkubować skrawki oraz roztwór A CSF w temperaturze 37°C przez jedną godzinę, a następnie przechowywać je w temperaturze pokojowej do momentu zakończenia eksperymentów. Do wykonania pipet patch-clamp wykorzystuje się kapilary z borokrzemianowego szkła.Wytocz pipety do patch-clampu za pomocą automatycznego lub ręcznego wytaczarki, aby uzyskać oporność od 2 do 4 MΩ w przypadku rejestracji z całej komórki lub od 8 do 20 MΩ dla rejestracji pojedynczych kanałów. W przypadku rejestracji pojedynczych kanałów wypoleruj pipetę za pomocą szkła borokrzemianowego o tym samym składzie. Używając mikrokuźni, stop szkło borokrzemianowe na drucie platynowym, aby wygładzić końcówkę.Polerowanie pipet w ten sposób pozwala uzyskać pipety tworzące bardziej stabilne i bardziej odporne uszczelnienia w porównaniu do pipet polerowanych ciepłem nieizolowanego drutu lub za pomocą etapu polerowania w automatycznej wyciągarku. Sprzęt do patch clamp składa się z mikroskopu umieszczonego na stole antywibracyjnym i zamkniętego w klatce Faradaya, wzmacniacza, digitiyzera oraz komputera. Wspólnie urządzenia te są często określane jako zestaw (rig) do patch clamp.Następnie włóż pipetę do uchwytu i dokręć nakrętkę, aby ją przymocować. Jako oprogramowanie do patch clampu wykorzystano P clamp. Wzmacniacz OC clamp amplifier 200 B ustaw w trybie V clamp, wzmocnienie na 2, filtr na 2 kHz, a potencjał trzymania na 0 mV; aby wytworzyć nadciśnienie w pipecie, wdmuchnij powietrze do ustnika przymocowanego do rurki połączonej z uchwytem pipety.Następnie zamknij zawór pomiędzy ustnikiem a rurką. Upewnij się, że nie ma wycieków powietrza. W następnym kroku zanurz pipetę w roztworze kąpieli.Na ekranie komputera, na którym mierzone jest opory pipety, pojawi się impuls generowany przez ciąg impulsów o wartości pięciu miliwoltów oraz liczba określająca opór pipety. Mniejsze wartości oznaczają większe otwory końcówek pipet oraz większe pipety. Ustaw przesunięcie (offset) pipety na wzmacniaczu na zero.Użyj 10-krotnego powiększenia mikroskopu, aby zidentyfikować dany obszar, lub powiększenia 60-krotnego. Aby zidentyfikować neuron parametalny, który zostanie poddany technice patch-clamp w skrawkach hipokampa, należy odnaleźć jasne pasma, które odpowiadają odpowiednio komórkom ziarnistym zakrętu zębatego, obszarowi ciał komórek parametalnych CA1 oraz obszarowi ciał komórek parametalnych CA3. Ustaw ostrość pipety tak, aby widoczny był zarówno wybrany obszar lub komórka, jak i sama pipeta.Patrząc przez okulary mikroskopu, umieść pipetę nad środkiem badanego obszaru, korzystając z pokręteł grubego ustawienia manipulatora, i obniżaj ją, aż znajdzie się tuż nad tkanką, niemal jej dotykając. W tym momencie bardzo delikatnie opuść pipetę na środek komórki lub obszaru, korzystając z pokręteł precyzyjnego ustawienia manipulatora. Jednocześnie obserwuj ekran komputera, aby monitorować opór pipety.Kontynuuj opuszczanie pipety, aż opór pipety wzrośnie. Zwolnij nadciśnienie z pipety poprzez otwarcie zaworu. Stworzy to delikatne ssanie i automatycznie doprowadzi do powstania giga-uszczelnienia (giga seal).Jeśli nie utworzy się giga-uszczelnienie, należy przyłożyć podciśnienie do ustnika, w którym wcześniej zastosowano nadciśnienie. W ten sposób uzyskano tzw. konfigurację cell-attached patch clamp. Należy dostroić szybką i wolną kompensację pojemności, aby wyeliminować sygnał przejściowy pochodzący z pipety i uchwytu pipety.Na ekranie komputera pojawi się płaski zapis prądu. Im wyższa wartość GigE, tym lepszy stosunek sygnału do szumu w rejestracjach jednokanałowych, co pozwala na zapis prądów jednokanałowych w konfiguracji patch clamp cell-attached. Ustaw wzmocnienie na 500, a częstotliwość próbkowania danych na wartość nie większą niż 100 microseconds.Następnie zarejestruj prądy. Utrzymuj niską objętość roztworu w kąpieli, tak aby ledwo zakrywał on skrawek, w celu zminimalizowania szumów w pomiarach podczas rejestracji z całej komórki. Zmień potencjał pipety na -60 mV lub wartość zbliżoną do potencjału spoczynkowego błony.W konfiguracji z przyczepioną komórką, zastosuj ssanie do pipety poprzez rurkę podłączoną do uchwytu pipety. Jednocześnie obserwuj zmiany rezystancji i przejściowej pojemności na ekranie komputera. Kontynuuj do momentu przerwania błony komórkowej.W takiej sytuacji znajdujemy się w tzw. konfiguracji whole-cell lub trybie whole-cell. Należy odczekać od 5 do 10 minut, aby roztwór w pipecie wyrównał się z wnętrzem komórki. W międzyczasie należy monitorować wartość oporności szeregowej.Prąd jest przenoszony przez populacje otwartych kanałów w błonie komórkowej. Aby zademonstrować pojedyncze kanały aktywowane przez GABA, do roztworu w pipecie dodaje się GABA, ponieważ nie może on przekroczyć błony komórkowej. Przedstawiono tutaj prądy pojedynczych kanałów aktywowanych przez stężenie 20 nanomolar GABA w konfiguracji cell-attached patch w neuronie ziarnistym zakrętu zębatego.Patch poddano depolaryzacji o 40 mV. Maksymalna konduktancja kanału wyniosła 44 pS, a czas latencji aktywacji wynosił 2,63 minuty. Poniżej znajduje się przykład, jak rozróżnić prądy GABA-ergiczne, aktywowane synaptyczne i pozasynaptyczne na podstawie fazowego i tonicznego charakteru prądów.Prąd przepływający przez populacje kanałów rejestrowano w neuronach hipokampa szczura przy użyciu metody voltage clamp w konfiguracji whole-cell, aby zidentyfikować prądy toniczne i fazowe. 100 µM antagonisty receptorów gabaa SR 9 55 31 podano do neuronu zakrętu zębatego, jak pokazano w BA, oraz do neuronu parametalnego poddanego działaniu insuliny, jak pokazano w BB. SR 9 55 31 zablokował kanały pozasynaptyczne i wywołał przesunięcie prądu bazowego, co pozwoliło na ujawnienie prądu tonicznego.Po opanowaniu tej techniki, uzyskanie patcha z przytwierdzoną błoną komórkową, a następnie przerwanie jej w celu ustanowienia konfiguracji whole-cell, można przeprowadzić w ciągu dwóch minut. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać patch na innych tkankach, takich jak nienaruszone wysepki trzustkowe, lub na izolowanych komórkach, na przykład limfocytach lub komórkach w hodowli.

gaba-activated-single-channel-and-tonic-currents-in-rat-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aktywowane GABA kanały pojedyncze i prądy toniczne w plastrach mózgu szczura

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Ten film demonstruje zapis prądów całych komórek indukowanych przez kwas gamma-aminomasłowy, czyli GABA, w wycinku mózgu myszy w korze przedczołowej. Kontrolowane dostarczanie GABA otwiera kanały chlorkowe w neuronach postsynaptycznych, generując hamujące prądy postsynaptyczne lub IPSC. Te IPSC zwiększają się wraz z wyższymi stężeniami GABA, co odzwierciedla hamującą aktywność GABA na przekaźnictwo synaptyczne.

Rejestrowanie prądów całokomórkowych za pomocą GABA Puffing w wycinku mózgu myszy

Ten film demonstruje procedurę analizy połączeń synaptycznych między przyśrodkową korą przedczołową (mPFC) a neuronami ciała migdałowatego za pomocą ostrych wycinków mózgu ciała migdałowatego od myszy. Neurony mPFC u tych myszy wyrażają rodopsynę kanałową połączoną z białkiem fluorescencyjnym. Rodopsyny kanałowe ułatwiają napływ jonów i generowanie potencjału czynnościowego w neuronach mPFC po aktywacji światłem. W konsekwencji neurony mPFC uwalniają neuroprzekaźniki, które wiążą się z...

Wizualizacja i mapowanie ścieżek neuronalnych w wycinku mózgu ciała migdałowatego

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Mechanizmy molekularne, które koordynują powstawanie hamujących synaps GABA-ergicznych podczas ontogenezy, są w dużej mierze nieznane. Aby zbadać te procesy, opracowaliśmy system modelu kohodowli, który obejmuje embrionalne średnio kolczaste neurony GABA-ergiczne hodowane razem ze stabilnie transfekowanymi ludzkimi embrionalnymi komórkami nerkowymi 293 (HEK293) wyrażającymi funkcjonalne receptoryGABA A.

Hamujące tworzenie synaps w modelu kokultury obejmującym średnie neurony kolczaste GABA-ergiczne i komórki HEK293 stabilnie eksprymujące receptory GABAA

Oscylacje są podstawowymi właściwościami sieci i są modulowane przez choroby i leki. Badanie oscylacji wycinków mózgu pozwala na scharakteryzowanie izolowanych sieci w kontrolowanych warunkach. Zapewniono protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu do wywoływania oscylacji γ CA1.

Generowanie lokalnych oscylacji γ CA1 przez stymulację tężcową

Opisujemy technikę zaciągania się, za pomocą której odczynniki farmakologiczne mogą być podawane podczas rejestracji krostek na całe komórki, i podkreślamy różne aspekty cech, które są kluczowe dla jej sukcesu.

Prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie GABA w wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.

Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Poznaj technikę patch-clamp do rejestracji prądów jednokanałowych aktywowanych przez GABA w wycinkach hipokampu szczura. Ta metoda pozwala rozróżnić synaptyczne i pozasynaptyczne kanały GABAA oraz zbadać modulację pobudliwości neuronów.

Prądy pojedynczego kanału i prądy toniczne aktywowane przez GABA w skrawkach mózgu szczura

Przeglądaj więcej filmów