Procedura ligacji i punkcji kątnicy

Witam, nazywam się Miguel Toscano z laboratorium dr Deny w katedrze mikrobiologii i hematologii na Temple University. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak przygotować model zakażenia i nakłucia iCal u myszy szczepu C 57 Black Seas. Model ten wykorzystujemy w naszym laboratorium do symulacji ludzkiej sepsy.

W zasadzie model ten polega na nakłuciu jelita, co umożliwia przedostanie się materiału kałowego do jamy otrzewnej w celu wywołania sepsy polimikrobowej, generując tym samym nasiloną odpowiedź immunologiczną. W tym modelu wiele narządów i różnych typów komórek ulega nieodwracalnemu uszkodzeniu. Może to w konsekwencji doprowadzić do śmierci zwierzęcia.

Zacznijmy zatem. Znieczulenie myszy. Pierwszym krokiem jest znieczulenie zwierzęcia poprzez iniekcję doszprytnową.

Mieszanina ketaminy i ksylazyny w stosunku jeden do jednego. Aby uniknąć ugryzienia przez mysz oraz by jej nie zranić, należy chwycić zwierzę za ogon jedną ręką. Drugą ręką dociskamy mysz do podłoża.

Następnie chwytamy mysz za kark i kładziemy zwierzę na grzbiecie, aby odsłonić brzuch. Za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 29 G wstrzykujemy od 20 do 30 µL środka znieczulającego do jamy otrzewnej. Przygotowując mysz do procedury, chwytamy ją za grzbiet i goliemy brzuch, przytrzymując ogon i/lub nogę myszy.

Sprawdzamy, czy mysz nie wykazuje wrażliwości na ból, następnie odkażamy brzuch. W pierwszej kolejności przecieramy skórę roztworem Betadine, a następnie przemywamy ją wacikiem nasączonym alkoholem izopropylowym przez co najmniej jedną minutę. Wykonanie laparotomii: aby przeprowadzić laparotomię, podnosimy pęsetą skórę w połowie brzucha i wykonujemy niewielkie nacięcie o długości około jednego centymetra.

Następnie unieś krocze i wykonaj kolejne małe nacięcie, aby odsłonić jamę otrzewną. Używając zakrzywionej pincety, uchwyć błonę otrzewną. Zidentyfikuj i odsłoń kątnicę, przeciągając ją przez błonę otrzewną.

Umieść go na brzuchu. Teraz następuje moment podwiązania. Jest to istotny czynnik.

W celu ustalenia stopnia nasilenia modelu możemy modulować przebieg procedury. W zależności od zakresu ligacji u myszy rozwinie się sepsa o różnym stopniu ciężkości. Jeśli ligacja zostanie wykonana bliżej końca kątnicy, rozwinie się sepsa o łagodnym przebiegu; jeśli w połowie – sepsa o średnim nasileniu, a jeśli bliżej zastawki ileocekalnej – sepsa ciężka. Stopień nasilenia procedury zostanie odzwierciedlony przez odsetek śmiertelności.

Nigdy nie podwiązuj zastawki kątniczego. Teraz wykonaj podwiązanie za pomocą jedwabnej nici chirurgicznej, zawiązując podwójny węzeł dla zapewnienia szczelności, wykonując nakłucie. Przytrzymaj kątnicę i ostrożnie wykonaj nakłucie blisko miejsca podwiązania, a następnie kolejne nakłucie bliżej końca kątnicy. Błona kątnicy jest miękka i zostanie przebita bardzo łatwo.

Stosując igły o różnej grubości i wykonując jedno lub dwa nakłucia, możemy również modulować stopień nasilenia modelu. Przedstawiona tutaj metoda pojedynczego lub podwójnego nakłucia jest alternatywną techniką w stosunku do klasycznego nakłucia przechodzącego. Zaletą stosowania metody pojedynczego lub podwójnego nakłucia jest lepsza kontrola ilości wydzielanych kałów podczas ściskania jelita.

Przytrzymaj kątnicę oboma palcami i delikatnie ją wyciśnij, aby pobrać niewielką ilość kału. Po zamknięciu laparotomii unieś otrzewną i ostrożnie umieść kątnicę z powrotem w jamie otrzewnowej.

Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć przypadkowego nakłucia kątnicy. Zaleca się użycie większych pęset. Teraz należy zamknąć jamę otrzewną. Przy użyciu nici jedwabnej niezwykle ważne jest upewnienie się, że została ona bardzo dokładnie zamknięta.

Zaczynamy od jednej strony rany, gdzie zawiązujemy węzeł. Wykonujemy szew aż do drugiej strony, przechodząc jedwabiem pod pętlą poprzedniego wkłucia. Do zamknięcia skóry możemy użyć klipsów do ran Mitchell lub klipsów refleksyjnych, wykorzystując odpowiednie narzędzie do ich zaciśnięcia.

Załóż tyle klamer, ile jest konieczne, aby upewnić się, że rana jest zamknięta. Przeprowadź resuscytację myszy, wstrzykując podskórnie 1 ml podgrzanego wcześniej roztworu soli fizjologicznej. Wykorzystanie igły o rozmiarze 25 G w celu nawodnienia organizmu wywoła hiperdynamiczną fazę sepsy, kończąc procedurę.

Umieść mysz pod podczerwienioną lampą grzewczą lub alternatywnie na podgrzewanej macie, aż zwierzę wybudzi się z narkozy. Umieść jedzenie i wodę na dnie klatki oraz nadzoruj zwierzęta co osiem do 12 godzin, sprawdzając, czy nie pojawiają się objawy choroby. Wstrzyknij buprenorfinę podskórnie w celu zapewnienia przeciwbólowego działania pooperacyjnego.

Innym lekiem przeciwbólowym, którego można użyć, jest T.Tramadol. Objawami sepsy są gorączka, letarg, piloerekcja, biegunka, kulenie się oraz złe samopoczucie. Bardzo chore zwierzęta wykazują znaczny spadek temperatury ciała i niemal się nie ruszają, aby uniknąć cierpienia.

Na tym etapie zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji. W ten sposób wykonuje się podwiązywanie tętnicy i model punktowy. Mamy nadzieję, że ta demonstracja procedury była dla Państwa interesująca i okaże się bardzo przydatna w planowaniu badań na zwierzętach. Zalecamy wykorzystanie modeli treningowych w celu ustalenia odpowiedniego stopnia dotkliwości eksperymentów poprzez modyfikację długości podwiązania, grubości igły oraz liczby nakłuć.

W takim razie, do widzenia.