Name: Procedura nakłucia podwiązania kątnicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj procedurę nakłucia podwiązania kątnicy u myszy C57BL/6 do badania sepsy. Ta metoda pozwala symulować sepsę polimikrobną i analizować odpowiedź immunologiczną oraz uszkodzenia narządów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu przyznanego przez Departament Zdrowia Pensylwanii (Pennsylvania Department of Health). 
Dr Miguel Garcia Toscano podczas realizacji niniejszego badania był stypendystą podoktorskim na Uniwersytecie Temple, finansowanym przez Fundację Alfonso Martina Escudero (Alfonso Martin Escudero Foundation). 
Pragniemy podziękować Iliyi Yordanovowi oraz Kevinowi Kotredesowi za pomoc w przygotowaniu filmu.

1. Ligacja i punkcja kątnicy jako model sepsy u myszy w odniesieniu do sepsy u ludzi
W tej procedurze wykorzystano myszy C57BL/6 (w wieku 7-9 tygodni).
<ol>
 <li>Znieczul mysz, wstrzykując dootrzewnowo roztwór ketaminy (75mg/kg) i ksylazyny (15mg/kg) w stosunku 1:1. Jako punkt odniesienia, wstrzyknij 30 μl roztworu 1:1 myszy o masie 20 g. Alternatywnie myszy można znieczulić izofluranem drogą wziewną przy użyciu waporyzatora anestezjologicznego.</li>
 <li>Wygol brzuch myszy i zdezynfekuj obszar, nakładając najpierw roztwór betadyny, a następnie przecierając gazikiem nasączonym 70% alkoholem (numer 1 w poniższej sekwencji zdjęć). Jako alternatywny środek antyseptyczny można zastosować chlorheksydynę. Opcjonalnie: aby utrzymać obszar w czystości, można użyć jałowej chusty operacyjnej.</li>
 <li>W warunkach aseptycznych wykonaj laparotomię w linii środkowej o długości od 1 do 2 cm i odsłoń kątnicę wraz z przyległym jelitem (2 i 3).</li>
 <li>Kątnicę należy ciasno podwiązać nicią jedwabną 6.0 (6-0 PROLENE, 8680G; Ethicon) u jej podstawy poniżej zastawki kręto-kątniczej, a następnie przebić raz lub dwa razy igłą 19G (4 i 5) po tej samej stronie kątnicy. Należy pamiętać, że długość podwiązanej kątnicy, definiowana jako odległość od dystalnego końca kątnicy do punktu podwiązania, określa stopień ciężkości stanu. Odległość &gt;1cm powoduje sepsę wysokiego stopnia, natomiast odległość ≤1 cm powoduje sepsę średniego do niskiego stopnia. Należy również zauważyć, że zastosowanie metody perforacji kątnicy przedstawionej tutaj różni się od standardowej techniki nakłucia na wylot (wprowadzenia igły przez całą szerokość kątnicy). Obie metody niezawodnie prowadzą do takiego samego efektu sepsy. Jednakże jedną z wad techniki nakłucia na wylot jest to, że nie ułatwia ona kontrolowania ilości wydalanych kałków podczas ściskania kątnicy.</li>
 <li>Następnie kątnicę należy delikatnie ścisnąć, aby z miejsc perforacji wydostała się niewielka ilość kałków (6). Kątnicę wprowadza się z powrotem do jamy otrzewnej, a otrzewną zamyka się szwami jedwabnymi 6.0 (7).</li>
 <li>Skórę zamyka się klipsami Reflex 7mm (RS-9258, Roboz Surgical Instruments) lub klipsami do ran Michel (7 mm, RS-9270) (8).</li>
 <li>Przeprowadź resuscytację myszy, wstrzykując podskórnie 1 ml uprzednio ogrzanego 0,9% roztworu soli fizjologicznej za pomocą igły 25G. To działanie w zakresie płynoterapii wywoła hiperdynamiczną fazę sepsy. Ten krytyczny krok jest opisany szerzej w sekcji dyskusji.</li>
 <li>Opcjonalnie: wstrzyknij podskórnie buprenorfinę (0,05mg/kg masy ciała) lub tramadol (20mg/kg masy ciała) w celu zapewnienia przeciwbólowej opieki pooperacyjnej. Należy pamiętać, że opioidy te mogą hamować oddychanie i lokomocję, a efekty te mogą zostać błędnie zinterpretowane jako objawy sepsy.</li>
 <li>Zwierzęta umieszcza się tymczasowo na macie grzewczej lub alternatywnie natychmiast przenosi do klatki z dostępem do podczerwieni lampy grzewczej o mocy 150W aż do wybudzenia z narkozy. Czas wybudzania wynosi od 30 min do 1 godziny.</li>
 <li>Zapewnij swobodny dostęp do pokarmu i wody (hydrożelu) umieszczonych na dnie klatki.</li>
 <li>Mysz monitoruje się co 12 godzin pod kątem przeżywalności przez jeden do dwóch tygodni lub poddaje eutanazji w różnych punktach czasowych w celu analizy różnych parametrów.</li>
</ol>
W ramach kontroli projektu eksperymentalnego zwierzęta w grupie pozorowanej zostaną poddane technice laparotomii bez podwiązania i nakłucia. 
 Od sześciu do 12 godzin po zabiegu chirurgicznym u myszy wystąpi letarg oraz gorączka, piloerekcja, biegunka, kłębienie się i malaise; czyli wszystkie objawy sepsy. Myszy z bardzo ciężką sepsą przed śmiercią mogą niemal nie być w stanie się poruszać i wykazują gwałtowny spadek temperatury ciała. Na tym etapie myszy należy poddać eutanazji, aby uniknąć przedłużonego bólu i cierpienia.
<img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig0.jpg" alt="Proces gojenia ran u myszy, sekwencja procedury chirurgicznej, eksperyment z badań biomedycznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 0">
2. Najczęściej analizowane parametry
Aby ocenić wynik procedury, można analizować różne parametry w narządach, ekstraktach komórkowych lub płynach ustrojowych. Próbki mogą być pobierane w różnych odstępach czasu, od 3 godzin do jednego tygodnia po zabiegu chirurgicznym.
<ol>
 <li>Przeżywalność myszy.</li>
 <li>Cytokiny i chemokiny w surowicy, jamie otrzewnowej i ekstraktach z narządów.
 <ol>
 <li>Interleukina-6: Produkowana i uwalniana przez monocyty, komórki dendrytyczne, makrofagi, limfocyty B, limfocyty T, granulocyty, komórki tuczne i wiele innych typów komórek. Odgrywa ważną rolę w reakcji ostrej fazy i zapaleniu.</li>
 <li>Czynnik martwicy nowotworu-α: Plejotropowa cytokina, która odgrywa centralną rolę w zapaleniu i apoptozie. Produkowana przez monocyty, makrofagi, neutrofile, komórki dendrytyczne i fibroblasty.</li>
 <li>Interleukina-1β: Produkowana przez monocyty, komórki NK, komórki dendrytyczne, limfocyty B i limfocyty T. Indukuje gorączkę i syntezę białek ostrej fazy.</li>
 <li>Interleukina 10: Sprzyja wychwytowi fagocytarnemu i odpowiedziom Th2, ale hamuje prezentację antygenów i prozapalne odpowiedzi Th1.</li>
 <li>Interleukina 10: Sprzyja wychwytowi fagocytarnemu i odpowiedziom Th2, ale hamuje prezentację antygenów i prozapalne odpowiedzi Th1.</li>
 <li>Monocytowy białkowy czynnik chemotaktyczny-1 (znany również jako CCL2): Rekrutuje monocyty, limfocyty T pamięci i komórki dendrytyczne do miejsc uszkodzenia tkanek i infekcji.</li>
 <li>KC (CXCL1): Produkowany przez makrofagi i komórki śródbłonka. Mysi KC jest silnym atraktantem i aktywatorem neutrofili.</li>
 <li>RANTES: Chemoatraktant monocytów. Może przyciągać niestymulowane limfocyty T pamięci CD4+/CD45RO+ oraz stymulowane limfocyty T CD4+ i CD8+ o fenotypach naiwnych i pamięci.</li>
 <li>Interferon-γ: Wydzielany przez komórki Th1, cytotoksyczne limfocyty T, komórki dendrytyczne i komórki natural killer (NK). Zwiększa prezentację antygenów i aktywność lityczną w makrofagach oraz hamuje aktywność komórek Th2. Sprzyja adhezji i wiązaniu niezbędnemu do migracji leukocytów oraz zwiększa aktywność komórek NK.</li>
 <li>Białko grupy wysokiej mobilności B-1: W monocytach jest aktywatorem jądrowego czynnika kappa B poprzez wiązanie się z komórkowym receptorem dla końcowych produktów zaawansowanej glikacji (RAGE), aktywując uwalnianie mediatorów prozapalnych w późnej fazie sepsy.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Oznaczanie mieloperoksydazy w narządach jako miara infiltracji neutrofili. Mieloperoksydaza (MPO) to enzym peroksydazowy występujący najobficiej w granulocytach neutrofilnych. Jest to białko lizosomalne magazynowane w ziarnistościach azurofilnych neutrofila. MPO posiada pigment hemowy, który nadaje zielony kolor wydzielinom bogatym w neutrofile, takim jak ropa i niektóre formy śluzu.</li>
 <li>Obciążenie bakteryjne w narządach i krwiobiegu, mierzone jako liczba jednostek tworzących kolonie na mililitr.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Procedurę CLP przeprowadzono początkowo na myszach szczepu C57BL/6. Przebadaliśmy kilka parametrów w celu modulacji ciężkości sepsy poprzez zmianę długości podwiązania oraz grubości igły, co przedstawiono na Rysunkach 1 i 2. Spośród tych dwóch czynników długość podwiązania wydaje się być skuteczniejsza niż grubość igły w modulowaniu odsetka przeżywalności. Jak pokazano na Rysunku 1, zwiększenie długości podwiązania o ponad 1cm powoduje wzrost śmiertelności do 100% w porównaniu z myszami z podwiązaniem ≤1cm. Zwiększenie grubości igły również zmniejszyło odsetek przeżywalności ze 100% (przy użyciu igły 22G) do 55% (przy użyciu igły 19G) przy dwóch nakłuciach. Przebadaliśmy również wpływ CLP na myszy C57BL/6 i 129SvJ, aby ustalić, czy różne szczepy myszy wykazują podobną czy odmienną podatność na sepsę indukowaną CLP. Rysunek 3 pokazuje, że w tych samych warunkach myszy 129SvJ były bardziej podatne na infekcję niż myszy C57BL/6, co wskazuje zwiększony odsetek śmiertelności.
<img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig1.jpg" alt="Wykres przeżywalności w zależności od długości podwiązania, myszy C57BL/6, porównanie wielkości nakłucia, 19G, wiek 7-8 tygodni." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Wpływ długości podwiązania kątnicy na przeżywalność zwierząt. CLP wykonano u myszy C57BL/6, stosując dwie różne długości podwiązania kątnicy. Ten pojedynczy parametr drastycznie wpływa na przeżywalność zwierząt, ponieważ wszystkie zwierzęta w grupie z obszarem podwiązania dłuższym niż 1 cm padły w ciągu mniej niż 3 dni w porównaniu z grupą zwierząt, u których obszar podwiązania wynosił ok. 1 cm (n=8).
<img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig2.jpg" alt="Wykres analizy przeżywalności myszy; wpływ grubości igły, 19G vs 22G, w ciągu 10 dni, dwa nakłucia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Wpływ grubości igły na przeżywalność. Procedurę CLP przeprowadzono u myszy C57BL/6 przy użyciu dwóch różnych rozmiarów igieł: 19G i 22G. U myszy z przebiciem kątnicy za pomocą igły 19G odnotowano przeżywalność na poziomie 55-60%. W przeciwieństwie do nich, myszy z przebiciem kątnicy igłą 22G wykazały 100% przeżywalności, mimo że w ciągu pierwszych 3-4 dni występowały u nich typowe objawy stanu zapalnego, które ustąpiły po 4 dniach (n=8). 
<img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig3.jpg" alt="Wykres porównania przeżywalności szczepów myszy; wykres Kaplana-Meiera; C57BL/6 vs 129SvJ w ciągu 10 dni." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Porównanie podatności na sepsę u dwóch różnych szczepów myszy. Model CLP przeprowadzono na myszach szczepów 129SvJ i C57BL/6 w tych samych warunkach. Na koniec okresu oceny procent przeżywalności szczepu 129SvJ był o 25% niższy niż w przypadku szczepu C57BL/6, co wskazuje na wyższą podatność na stan zapalny wywołany zakażeniem polimikrobowym. (n=6).

<ol><li>Angus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+severe+sepsis+in+the+United+States%3A+analysis+of+incidence%2C+outcome%2C+and+associated+costs+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care.</a> Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).</li>
<li>Riedemann, N. C., Guo, R. F., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigma+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The enigma of sepsis.</a> J Clin Invest. 112, 460-467 (2003).</li>
<li>Eichacker, P. Q., Gerstenberger, E. P., Banks, S. M., Cui, X., Natanson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+of+acute+lung+injury+and+acute+respiratory+distress+syndrome+trials+testing+low+tidal+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome trials testing low tidal volumes.</a> Am J Respir Crit Care Med. 166, 1510-1514 (2002).</li>
<li>Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sepsis%3A+setting+the+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Animal models of sepsis: setting the stage.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).</li>
<li>Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sepsis+and+sepsis-induced+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury.</a> J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).</li>
<li>Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+susceptibility+during+murine+septic+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis.</a> J Surg Res. 102, 45-49 (2002).</li>
<li>De Maio, A., Torres, M. B., Reeves, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+influencing+the+response+to+injury%2C+inflammation%2C+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants influencing the response to injury, inflammation, and sepsis.</a> Shock. 23, 11-17 (2005).</li>
<li>Diodato, M. D., Knoferl, M. W., Schwacha, M. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+the+inflammatory+response+and+survival+following+haemorrhage+and+subsequent+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Gender differences in the inflammatory response and survival following haemorrhage and subsequent sepsis.</a> Cytokine. 14, 162-169 (2001).</li>
<li>Turnbull, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+age+on+mortality+and+antibiotic+efficacy+in+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Effects of age on mortality and antibiotic efficacy in cecal ligation and puncture.</a> Shock. 19, 310-313 (2003).</li>
<li>Miyaji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+pyruvate+decreases+sepsis-induced+acute+renal+failure+and+multiple+organ+damage+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice.</a> Kidney Int. 64, 1620-1631 (2003).</li>
<li>Torres, M. B., De Maio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exaggerated+inflammatory+response+after+CLP+correlates+with+a+negative+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">An exaggerated inflammatory response after CLP correlates with a negative outcome.</a> J Surg Res. 125, 88-93 (2005).</li>
<li>Doi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AP214%2C+an+analogue+of+alpha-melanocyte-stimulating+hormone%2C+ameliorates+sepsis-induced+acute+kidney+injury+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">AP214, an analogue of alpha-melanocyte-stimulating hormone, ameliorates sepsis-induced acute kidney injury and mortality.</a> Kidney Int. 73, 1266-1274 (2008).</li>
<li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+resuscitation+attenuates+early+cytokine+mRNA+expression+after+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma%22%5BJournal%5D)">Fluid resuscitation attenuates early cytokine mRNA expression after peritonitis.</a> J Trauma. 41, 622-627 (1996).</li>
<li>Zanotti-Cavazzoni, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+resuscitation+influences+cardiovascular+performance+and+mortality+in+a+murine+model+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis.</a> Intensive Care Med. 35, 748-754 (2009).</li>
<li>Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+and+buprenorphine+on+select+immunologic+factors+in+a+cecal+ligation+and+puncture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model.</a> Shock. 34, 250-260 (2010).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals, a protokół został zatwierdzony przez komisję ds. opieki i wykorzystania zwierząt na Uniwersytecie Temple.

W niniejszym materiale szczegółowo przedstawiamy sposób wykonania modelu CLP u myszy oraz modulowania stopnia ciężkości zmian.
W porównaniu do innych modeli zwierzęcych sepsy, CLP można przeprowadzić na dowolnej szczepie myszy, niezależnie od wieku i płci. Jest to stosunkowo prosta i niedroga procedura chirurgiczna. W tym modelu stopień ciężkości ma bezpośredni wpływ na odsetek przeżywalności. Długość podwiązania, grubość igły oraz liczba nakłuć to parametry, które można kontrolować w celu mod...

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Ketaset</td><td>0856-2013-01</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>AnaSed</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa 29G</td><td>Excel Scientific</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Szew jedwabny, 6-0 PROLENE</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8680G</td><td></td></tr><tr><td>Igły 19G i 25G</td><td>BD Biosciences</td><td>305186</td><td></td></tr><tr><td>Strzygarka</td><td>General Supply</td><td>General supply</td><td></td></tr><tr><td>Lampka grzewcza na podczerwień</td><td>General Supply</td><td>General supply</td><td></td></tr><tr><td>Klamry do ran Michela 7mm</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-9270</td><td></td></tr><tr><td>Maseczka z pętelkami za uszy</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-4181</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do sekcji</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Betadyny</td><td>VWR international</td><td>63410-992</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta chirurgiczna</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Wacik nasączony 70% alkoholem izopropylowym</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-031-350</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Bedford Laboratories</td><td>55390-100-10</td><td></td></tr><tr><td>Tramadol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42965</td><td></td></tr></tbody></table>

procedura ligacji i punkcji kątnicy

Cecal Ligation Puncture Procedure

Sepsę u ludzi charakteryzuje zestaw reakcji systemowych w odpowiedzi na intensywną i masową infekcję, której organizm gospodarza nie zdołał opanować lokalnie. Obecnie sepsa znajduje się wśród dziesięciu głównych przyczyn śmiertelności na oddziałach intensywnej terapii w USA 1. W przebiegu sepsy wyróżnia się dwie uznane fazy hemodynamiczne, które mogą na siebie nachodzić. Faza początkowa (hiperdynamiczna) definiowana jest jako masowa produkcja cytokin prozapalnych i reaktywnych form tlenu przez makrofagi i neutrofile, co wpływa na przepuszczalność naczyniową (prowadząc do hipotensji), funkcję serca oraz indukuje zmiany metaboliczne kulminujące w nekrozie tkanek i niewydolności narządowej. W konsekwencji najczęstszą przyczyną zgonów jest ostra niewydolność nerek. Druga faza (hypodynamiczna) to proces przeciwzapalny obejmujący zaburzenia prezentacji antygenów przez monocyty, zmniejszoną proliferację i funkcję limfocytów oraz zwiększoną apoptozę. Stan ten, znany jako immunosupresja lub depresja immunologiczna, gwałtownie zwiększa ryzyko zakażeń wewnątrzszpitalnych i ostatecznie prowadzi do śmierci. Mechanizmy tych procesów patofizjologicznych nie są dobrze scharakteryzowane. Ponieważ obie fazy sepsy mogą powodować nieodwracalne i nieodwracalne uszkodzenia, kluczowe jest określenie stanu immunologicznego i fizjologicznego pacjenta. Jest to główny powód, dla którego wiele leków terapeutycznych okazało się nieskutecznych. Ten sam lek podany na różnych etapach sepsy może działać terapeutycznie, być szkodliwy lub nie wywołać żadnego efektu 2,3. Aby zrozumieć sepsę na różnych poziomach, niezbędny jest odpowiedni i kompleksowy model zwierzęcy, który odtwarza kliniczny przebieg choroby. Ważne jest scharakteryzowanie mechanizmów patofizjologicznych występujących podczas sepsy oraz kontrolowanie warunków modelu w celu testowania potencjalnych czynników terapeutycznych.
W celu zbadania etiologii sepsy u ludzi badacze opracowali różne modele zwierzęce. Najpowszechniej stosowanym modelem klinicznym jest podwiązywanie i nakłuwanie kątnicy (CLP). Model CLP polega na perforacji kątnicy, co umożliwia przedostanie się treści kałowej do jamy otrzewnej, wywołując nasiloną odpowiedź immunologiczną indukowaną infekcją polimikrobiologiczną. Model ten spełnia klinicznie istotne warunki występujące u ludzi. Podobnie jak u ludzi, myszy poddane procedurze CLP z płynoterapią wykazują pierwszą (wczesną) fazę hiperdynamiczną, która z czasem przechodzi w drugą (późną) fazę hipodynamiczną. Ponadto profil cytokinowy jest podobny do tego obserwowanego w sepsie u ludzi, gdzie występuje zwiększona apoptoza limfocytów (przegląd w 4,5). Ze względu na liczne i nakładające się mechanizmy zaangażowane w sepsę, badacze potrzebują odpowiedniego modelu sepsy o kontrolowanym stopniu ciężkości, aby uzyskać spójne i powtarzalne wyniki.

Mysi model podwiązania i perforacji kątnicy jako wartościowe narzędzie do badania sepsy u ludzi.

Procedura ligacji i punkcji kątnicy

Sepsa u ludzi charakteryzuje się zestawem reakcji systemowych w odpowiedzi na intensywną i masywną infekcję, której nie udało się ograniczyć lokalnie przez...

Witam, nazywam się Miguel Toscano i pracuję w laboratorium dr Deny w Departamencie Mikrobiologii i Hematologii na Temple University. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak przygotować model zapalenia i perforacji indukowanego iCal u myszy szczepu C 57 Black 6. Model ten wykorzystujemy w naszym laboratorium do symulacji sepsy u ludzi.W zasadzie model ten polega na nakłuciu jelita, co umożliwia przedostanie się materiału kałowego do jamy otrzewnej w celu wywołania sepsy polimikrobowej, generując tym samym nasiloną odpowiedź immunologiczną. W tym modelu wiele organów i różnych typów komórek ulega nieodwracalnemu uszkodzeniu, co w konsekwencji może doprowadzić do śmierci zwierzęcia.Zacznijmy zatem. Znieczulenie myszy. Pierwszym krokiem jest znieczulenie zwierzęcia poprzez iniekcję doszpikową.Mieszanina ketaminy i ksylazyny w stosunku jeden do jednego. Aby uniknąć ugryzienia przez mysz i nie wyrządzić jej krzywdy, należy chwycić mysz jedną ręką za ogon. Drugą ręką dociskamy ją do podłoża.Następnie chwytamy mysz za kark i kładziemy zwierzę na grzbiecie, aby odsłonić brzuch. Za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 29 G wstrzykujemy 20 do 30 µl środka znieczulającego do jamy otrzewnej. Przygotowując mysz do zabiegu, chwytamy ją za kark i golimy brzuch, unieruchamiając ogon i/lub kończynę myszy.Sprawdzamy, czy mysz nie wykazuje wrażliwości na ból, następnie odkażamy brzuch. Najpierw przecieramy go roztworem Betadinu, a następnie przemywamy wacikiem nasączonym alkoholem izopropylowym przez co najmniej jedną minutę. Wykonanie laparotomii: aby przeprowadzić laparotomię, podnosimy pęsetą skórę w środkowej części brzucha i wykonujemy niewielkie nacięcie o długości około jednego centymetra.Następnie unieś krocze i wykonaj kolejne małe nacięcie, aby odsłonić jamę otrzewną. Używając zakrzywionej pęsety, przytrzymaj błonę otrzewną. Zidentyfikuj i odsłoń ślepe oko, przeciągając je przez błonę otrzewną.Umieść go nad brzuchem. Teraz następuje moment podwiązania. Jest to istotny czynnik.Aby określić ciężkość modelu, można modulować stopień inwazyjności procedury. Poprzez zmianę miejsca podwiązania myszy będą rozwijać łagodniejszą sepsę. Jeśli podwiązanie zostanie wykonane bliżej końca kątnicy, rozwinie się sepsa o umiarkowanym nasileniu; jeśli w połowie – sepsa o średnim stopniu ciężkości, a jeśli bliżej zastawki kInputValue – sepsa ciężka. Ciężkość procedury zostanie odzwierciedlona przez odsetek śmiertelności.Nigdy nie podwiązuj zastawki ileocekalnej. Teraz wykonaj podwiązanie za pomocą szwu jedwabnego z podwójnym węzłem, aby było szczelne. Trzymając ślepe oko, ostrożnie wykonaj nakłucie blisko miejsca podwiązania, a następnie kolejne nakłucie bliżej końca ślepego oka. Błona ślepego oka jest miękka i bardzo łatwo o jej perforację.Stosując igły o różnej grubości i wykonując jedną lub dwie perforacje, możemy również modulować stopień nasilenia modelu. Przedstawiona tutaj metoda pojedynczego lub podwójnego nakłucia jest alternatywną techniką w stosunku do klasycznego nakłucia przelotowego. Przewagą metody pojedynczego lub podwójnego nakłucia jest możliwość lepszej kontroli ilości wydalanych kałków podczas uciskania ślepego jelita.Przytrzymaj kątnicę dwoma palcami i delikatnie ją wyciśnij, aby pobrać niewielką ilość kału. Zamykając laparotomię, podnieś wówczas otrzewną i ostrożnie umieść kątnicę z powrotem w jamie otrzewnej.Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć przypadkowego nakłucia kątnicy. Zaleca się użycie większych pincet. Teraz należy zamknąć jamę otrzewną. Używając szwu jedwabnego, należy upewnić się, że jest ona bardzo szczelnie zamknięta.Zaczynamy od jednej strony rany, gdzie zawiązujemy węzeł. Wykonujemy szwy aż do przeciwległej krawędzi, przerowadzając jedwab pod pętlą poprzedniego nakłucia. Do zamknięcia skóry możemy użyć klamer chirurgicznych typu Mitchell lub klamer refleksyjnych, wykorzystując odpowiednie narzędzie do ich zaciśnięcia.Załóż tyle klamer, ile jest konieczne, aby upewnić się, że rana jest zamknięta. Przeprowadź resuscytację myszy, wstrzykując podskórnie 1 ml podgrzanego roztworu soli fizjologicznej. Dzięki zastosowaniu igły 25G ten zabieg nawadniania wywoła hiperdynamiczną fazę sepsy, kończąc procedurę.Umieść mysz pod lampą grzewczą na podczerwień lub alternatywnie na macie grzewczej, aż zwierzę wybudzi się z narkozy. Dostarcz pokarm i wodę na dno klatki i nadzoruj zwierzęta co 8 do 12 godzin, sprawdzając, czy nie wykazują objawów choroby. Podaj buprenorfinę podskórnie w celu zapewnienia przeciwbólowego działania pooperacyjnego.Innym środkiem przeciwbólowym, który można zastosować, jest T.Tramadol. Objawami sepsy są gorączka, letarg, piloerekcja, biegunka, kulenie się i złe samopoczucie. Bardzo chore zwierzęta wykazują znaczny spadek temperatury ciała i prawie się nie ruszają, aby uniknąć cierpienia.Na tym etapie zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji. W ten sposób wykonujemy ligację tętnicy udowej oraz model punktowy. Mamy nadzieję, że prezentacja tej procedury była dla Państwa interesująca i okaże się bardzo pomocna w przygotowaniach do badań na zwierzętach. Gorąco zalecamy wykorzystanie modeli szkoleniowych lub nieużywanych tkanek w celu ustalenia odpowiedniego stopnia dotkliwości eksperymentów poprzez modyfikację długości ligacji, grubości igły oraz liczby nakłuć.Z tym wszystkim, do widzenia.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Procedura ligacji i nakłucia okrętnicy

Opisujemy nową metodę chirurgiczną kaniulacji „pętli jelitowych” w jelicie krętym owiec. Po powrocie zwierząt do zdrowia po operacji oraz całkowitym usunięciu z organizmu antybiotyków i leków przeciwbólowych, za pomocą kaniul można wprowadzać wiele dawek terapeutycznych bezpośrednio do pętli.

Kaniulacja pętli jelitowych u przeżuwaczy

C-seal to biodegradowalny drenaż chroniący zespolenie jelita grubego wykonane zszywaczem. W tym filmie przedstawiono szczegóły dotyczące jego produkcji, implementacji i zastosowania.

C-seal: biofragmentowalny drenaż chroniący zszywany zespolenie jelita grubego przed przeciekiem

Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (Colon Ascendens Stent Peritonitis, CASP) jest wysoce ustandaryzowanym modelem polimikrobowej sepsy brzusznej u gryzoni. Niniejszy artykuł opisuje procedurę chirurgiczną CASP. Model CASP oraz jego warianty umożliwiają systematyczne badanie różnych zagadnień związanych z tematyką sepsy.

Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (CASP) – standaryzowany model polimikrobowej sepsy brzusznej

Eksperymentalna sepsa może być wywołana u myszy za pomocą metody podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP). Aktualne protokoły oceny autofagii in vivo w kontekście sepsy wywołanej CLP przedstawiono tutaj: Protokół pomiaru autofagii przy użyciu myszy (GFP)-LC3 oraz protokół pomiaru tworzenia autofagosomów za pomocą mikroskopii elektronowej.

Podwiązanie jelita ślepego i sepsa wywołana nakłuciem jako model do badania autofagii u myszy

Przedstawiamy zabieg chirurgiczny polegający na cewnikowaniu jelitowego pnia limfatycznego u nowonarodzonych świń w celu pobrania dużych ilości składników metabolizmu lipidów z odprowadzającej limfy.

Długotrwałe cewnikowanie pnia limfatycznego jelit i pobieranie limfy u nowonarodzonych świń

Ten protokół opisuje centralnie cewnikowany mysi model przedłużającej się choroby krytycznej. Łączymy metodę podwiązania jelita ślepego i nakłucia w celu wywołania sepsy z wykorzystaniem centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych, aby naśladować warunki kliniczne człowieka.

Zastosowanie centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych w mysim modelu choroby krytycznej

Dostęp składników odżywczych, metabolitów mikrobioty i leków do krążenia jest kontrolowany przez barierę jelitowo-krwionośną (GBB). Opisujemy bezpośrednią metodę pomiaru przepuszczalności GBB in vivo, na którą, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod pośrednich, praktycznie nie ma wpływu na funkcje wątroby i nerek.

Metoda in vivo do oceny bariery jelitowo-krwionośnej i metabolizmu wątrobowego produktów mikrobioty

Ten protokół opisuje techniki pomiaru wyników infekcji leżących u podstaw wtórnych zakażeń szpitalnych w stanie immunosupresyjnym, najpierw poprzez ustalenie podwiązania/nakłucia jelita ślepego, a następnie prowokację ich infekcją donosową, aby stworzyć klinicznie istotny model sepsy immunosupresyjnej.

Projektowanie podwiązania i nakłucia jelita ślepego oraz podwójnego modelu infekcji donosowej immunosupresji wywołanej sepsą

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Ten protokół przedstawia szczegóły operacyjne podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP) w mysim modelu sepsy. CLP jest jedną z najczęściej stosowanych technik tworzenia zwierzęcego modelu sepsy. W związku z tym do uzyskania wiarygodnych wyników badań wymagany jest ustandaryzowany protokół CLP.

Ocena wiarygodnego biomarkera w mysim modelu sepsy wywołanym podwiązaniem i nakłuciem jelita ślepego

Poznaj procedurę nakłucia podwiązania kątnicy u myszy C57BL/6 do badania sepsy. Ta metoda pozwala symulować sepsę polimikrobną i analizować odpowiedź immunologiczną oraz uszkodzenia narządów.

Procedura ligacji i punkcji kątnicy

Przeglądaj więcej filmów