Name: Mutageneza i analiza mutacji genetycznych w sekwencji receptora KISS1 bogatej w GC zidentyfikowanej u ludzi z zaburzeniami rozrodu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Poznaj mutagenezę ukierunkowaną receptora KISS1R i analizę jego degradacji w komórkach nerek ludzkich zarodków. Ta metoda pozwala badać wpływ mutacji genetycznych na funkcję receptora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana przez Reproductive Branch National Institute of Child Health and Human Development (NICHD – R21 HD059015) oraz przez Charles H. Hood Foundation Young Investigator Child Health Research Award (Boston, MA).

1. Mutageneza celowana sekwencji genu KISS1R o wysokiej zawartości GC
<ol>
<li>Matryca: pełna sekwencja cDNA ludzkiego receptora KISS1R z tagiem Myc przyłączonym do jego końca N. Sekwencja ta jest sklonowana do wektora ekspresyjnego pCS2+, który jest kompatybilny z liniami komórek ssaków wykorzystywanych następnie do transfekcji. Wektor ekspresyjny ten określany jest w niniejszym tekście jako pCS2.+MycKISS1R.</li>
<li>Projektowanie starterów: startery są projektowane tak, aby wprowadzić pożądane mutacje, zgodnie z instrukcjami zestawu Quikchange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene). Podsumowując:
<ul>
		<li>Oba primery (prosty i odwrotny) muszą zawierać pożądaną mutację i przyłączać się do tej samej sekwencji na przeciwległych niciach plazmidu (np. primery prosty i odwrotny są wobec siebie komplementarne) 
<img src="/files/ftp_upload/2897/step1.jpg" alt="Schemat mutagenicznej reakcji PCR; zmiana sekwencji DNA przy użyciu starterów; metoda edycji genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Krok 1"></li>
		<li>Startery powinny mieć od 25 do 45 zasad i kończyć się jedną lub wieloma zasadami C lub G. 
				<img src="/files/ftp_upload/2897/step2.jpg" alt="Schemat edycji genu KISS1R, primery mutagenne; sekwencje forward/reverse, długość primerów 31 bp." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Krok 2"> 
				<img src="/files/ftp_upload/2897/step3.jpg" alt="Miejsce mutacji KISS1R, schemat projektowania primera mutagennego dla insercji 13 pz, proces edycji genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Krok 3"></li>
		<li>Wprowadzone mutacje powinny znajdować się w środkowej części startera i być otoczone z obu stron sekwencją ok. 10–15 prawidłowych zasad.</li>
		<li>Temperatura topnienia (Tm) starterów powinna być równa lub wyższa niż 78°C. Do oszacowania Tm należy użyć następujących wzorów:
 <ul>
				<li>Przy wprowadzaniu mutacji: Tm = 81,5 + 0,41(%GC) – 675/N – % niedopasowań (N to długość primera w zasadach)</li>
				<li>W przypadku wprowadzania insercji lub delecji: Tm = 81,5 + 0,41(%GC) – 675/N (N nie obejmuje zasad, które są wstawiane lub usuwane)</li>
				<li>Należy użyć starterów odsolonych (dalsze oczyszczanie nie jest konieczne). 
					<img src="/files/ftp_upload/2897/step4.jpg" alt="Wzór na temperaturę topnienia startera, obliczanie Tm, schemat PCR, %GC, długość startera, wpływ niedopasowań." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Krok 4"></li>
 </ul>
 </li>
 </ul>
 </li>
 <li>Optymalne warunki amplifikacji obejmują dodatek roztworu PCRx Enhancer (Invitrogen) oraz DMSO. Należy przetestować co najmniej dwa stężenia DMSO, np. 4% i 8%. Warunki PCR przedstawiono w Tabeli I oraz na Rysunku 1, a wyniki reprezentatywnej amplifikacji PCR pCS2+MycKISS1R pokazano na Rysunku 2.</li>
 <li>Usuń matrycowe DNA z produktów amplifikacji poprzez trawienie zmetylowanego DNA enzymem DpnI przez 1h 30min w temperaturze 37°Cwymieszać w probówce do wirówki 17.5μl produktu PCR za pomocą 2μl z 10x NEBuffer 4 oraz 0.5μl DpnI (10U; New England Biolabs).</li>
 <li>Transformacja produktu PCR traktowanego enzymem DpnI: mieszanie 2μl DNA poddanego działaniu DpnI za pomocą 45μl komórek ultrakompetentnych XL10-Gold E. coli (Stratagene) do schłodzonej wcześniej probówki do hodowli komórek o pojemności 15 ml. Dodać 2μl β-merkaptoetanolu i postępuj zgodnie z instrukcjami firmy Stratagene. Wysiej 100-400μl przetransformowanych bakterii na płytkach z agarem LB zawierających 100μg/ml ampicylinę i inkubować w 37°C.</li>
 <li>Przeprowadź miniprep 2 do 4 pojedynczych kolonii w celu izolacji DNA plazmidowego. Potwierdź pomyślne wprowadzenie pożądanych mutacji poprzez sekwencjonowanie i analizę wyizolowanego DNA.</li>
</ol>
2. Przejściowa transfekcja MycKISS1R do komórek HEK-293
<ol>
<li>Poniższe eksperymenty są przeprowadzane na ludzkich komórkach nerkowych embrionalnych (HEK-293) hodowanych w inkubatorze z CO2 (5% CO2) w temperaturze 37°C w medium DMEM uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
<li>Komórki HEK-293 wysiewamy w zagęszczeniu 2,5x105 komórek/ml w płytkach 6-dołkowych i pozostawiamy do wzrostu przez noc w temperaturze 37°C przed transfekcją. UWAGA: (i) dla każdego warunku doświadczalnego należy użyć trzech powtórzeń w oddzielnych dołkach; (ii) optymalna konfluencja komórek w momencie transfekcji wynosi 30%-50%.</li>
<li>Komórki HEK-293 transfekujemy przy użyciu odczynnika do transfekcji GenePorter (Genlantis), zgodnie z instrukcją producenta: połowę DMEM bezsurowiczego mieszamy z 0,5μg pCS2+ MycKISS1R oraz 0,5μg wektora kontrolnego (pustego), tak aby uzyskać łącznie 1μg DNA na dołek. Drugą połowę mieszamy z 10μl odczynnika do transfekcji na każdy 1μg transfekowanego DNA. UWAGA: Optymalne stężenie plazmidowego DNA może być zmienne.</li>
</ol>
3. Traktowanie i lizy komórek
<ol>
<li>24h po transfekcji zastąpić pożywkę komórkową 1ml DMEM zawierającego 2,5% FBS (aby obniżyć metabolizm komórek). UWAGA: To obniżenie poziomu surowicy może ułatwić i/lub wzmocnić detekcję wyników.</li>
<li>Dodać inhibitor lizosomów (10μg/studnią leupeptyny) bezpośrednio do każdej studni jednej pełnej płytki 6-dołkowej. Inkubować w 37°C przez 6 lub 16 h (lub inne pożądane czasy).</li>
<li>Dodać świeżo przygotowany inhibitor proteasomów (10μM/studnią MG132) bezpośrednio do wszystkich studni dwóch pełnych płytek 6-dołkowych. Inkubować w 37°C przez 2, 4, 6 lub 16h (lub pożądane czasy). Dodać nośnik do wszystkich studni czwartej płytki 6-dołkowej (punkt czasowy 0) i inkubować w 37°C przez 16h.</li>
<li>Po zakończeniu inkubacji przenieść płytki na lód i przeprowadzić całą procedurę lizy na lodzie, aby zapobiec degradacji białek:
<ul>
			<li>Aby zwiększyć wydajność białka, połączyć próbki powtórzone z płytek 6-dołkowych w jednej probówce wirówkowej</li> 
			<li>Odssać pożywkę i wypłukać komórki raz 1ml lodowatego soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS)</li>
			<li>Dodać do każdej studni 10μl lodowatego buforu do lizy (20mM HEPES, pH 7,4, 1% NP-40, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0,25% dejksycholan sodu) zawierającego inhibitory proteaz (1x koktajl zawierający 10mM AEBSF-HCl, 80μM aprotininy, 5mM bestatyny, 1,5mM E-64, 0,5M EDTA, 2mM leupeptyny i 1mM pepstatyny A, plus 2mM PMSF)</li>
 	<li>Zebrać komórki za pomocą skrobaka komórkowego i przenieść lizaty komórkowe do probówek wirówkowych</li>
			<li>Przeciągnąć komórki ˜10 razy przez igłę 20G. UWAGA: Nie poddawać sonikacji próbek przeznaczonych do detekcji białek błonowych metodą western blot. Sonikacja prowadzi do agregacji białek błonowych, które nie będą migrować prawidłowo podczas elektroforezy</li>
			<li>Inkubować lizaty komórkowe przez 1h w 4°C na platformie kołyszącej</li>
			<li>Wirować lizaty komórkowe w 4°C przez 10 min przy 10 0 x rpm i przenieść nadnadczenia do nowych probówek. UWAGA: Nie naruszać osadów podczas tego etapu</li>
			<li>Wyznaczyć stężenie białka w 10μl nadnadcieczy metodą BCA (Pierce)</li>
			<li>Rozcieńczyć lizaty do 1mg/ml buforem do lizy zawierającym inhibitory proteaz.</li>
</ul>
</li>
</ol>
4. Immunoprecypitacja i detekcja MycKISS1R metodą Western blot
<ol>
<li>Przeprowadź następujące etapy immunoprecypitacji w lodzie (lub w 4°C):
<ul>
		<li>Odpowiednią ilość przeciwciała anty-myc sprzężonego z agarozą (2,5μg/próbkę) przemyj dwukrotnie lodowatym PBS i dodaj do 400μg białka z lizatu.</li>
		<li>Immunoprecypitat MycKISS1R z lizatów inkubuj przez noc w 4°C na platformie kołyszącej przy łagodnym mieszaniu.</li>
		<li>Osadź kuleczki agarozy poprzez krótkie wirowanie w 4°C (do 10 0 x rpm).</li> 
		<li>Odsaj i usuń nadsączyny (nie naruszając pelletu).</li>
		<li>Przemyj kuleczki raz lodowatym buforem do lizy i dwukrotnie lodowatym PBS. Przed wirowaniem delikatnie odwracaj probówki.</li>
		<li>Resuspenduj kuleczki zawierające związane z przeciwciałem MycKISS1R w 2x buforze do ładowania próbek zawierającym 10% β-merkaptoetanolu.</li>
 </ul>
 </li>
<li>Western blot kompleksów immunologicznych MycKISS1R:
<ul> 
<li>Podgrzewaj próbki przez 30 min w 37°C. UWAGA: Nie gotuj próbek przeznaczonych do detekcji białek błonowych metodą western blot. Podobnie jak sonikacja, gotowanie prowadzi do agregacji tych białek.</li>
<li>Przenieś probówki natychmiast do lodu na 5 min.</li>
<li>Rozdziel białka metodą SDS-PAGE w żelu gradientowym 4-15%.</li> 
<li>Przenieś białka na membranę Immobilon-FL PVDF (do detekcji w podczerwieni) przy 25V przez 30 min w buforze do transferu (48mM Tris base, 39mM glicyny, 1,2mM SDS, 20% metanolu, pH 9,2), używając aparatu do transferu półsuchego Bio-Rad.</li>
<li>Przemywaj membrany przez 5 min w temperaturze pokojowej roztworem Tris-Buffered Saline (TBS) i blokuj przez 1h w temperaturze pokojowej przy użyciu Licor Odyssey blocking na platformie kołyszącej (alternatywnie można użyć 5% mleka w TBS w celu zablokowania wiązań niespecyficznych).</li>
<li>Inkubuj membrany przez noc w 4°C z króliczym przeciwciałem anty-myc (1:50) w roztworze blokującym zawierającym 0,1% Tween-20.</li> 
<li>Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj membrany 3 razy po 5 min każdorazowo za pomocą TBS zawierającego 0,1% Tween-20 (TBST).</li>
<li>Inkubuj membrany przez 1h w temperaturze pokojowej z kozim przeciwciałem anty-rabbit IgG znakowanym Infra-RedDye ® 80CW (1:10 0) w buforze blokującym zawierającym 0,1% Tween-20 i 0,01% SDS.</li> 
<li>Usuń przeciwciało drugorzędowe, przemyj membrany 3 razy po 5 min każdorazowo za pomocą TBST oraz ostatni raz samym TBS (aby usunąć pozostały Tween-20).</li>
</ul>
</li>
<li>Obrazowanie i kwantyfikacja MycKISS1R przy użyciu skanera podczerwieni LI-COR Odyssey:
<ul> 
<li>Obrazowanie białka MycKISS1R na membranach zostanie wykonane za pomocą skanera podczerwieni LI-COR Odyssey. Na początek umieść membranę w lewym dolnym rogu skanera Odyssey, dopasowując ją do siatki. Przykryj matą gumową, wygładź pęcherzyki powietrza wałkiem i zamknij pokrywę.</li>
<li>Utwórz nowy plik projektu na komputerze. Nazwij plik, kliknij "done", a następnie wprowadź dane logowania skanera w polu "scan". Dostosuj rozmiar okna konsoli skanera do swojej membrany, a następnie wybierz rozdzielczość 169μm i średnią jakość obrazu.</li> 
<li>Wybierz ustawienia intensywności dla kanałów 70 (czerwony) i 80 (zielony) zgodnie z oczekiwaną siłą każdego sygnału. Służy to wyłącznie celom wizualizacji sygnału i nie wpłynie na kwantyfikację. Kliknij "start scan".</li>
<li>Nazwij i zapisz skan, a następnie kliknij "OK", aby otworzyć go w nowym oknie w celu kwantyfikacji. Monomery MycKISS1R powinny być widoczne przy około 43kD.</li>
<li>Za pomocą narzędzia "box" (na lewym pasku bocznym) narysuj ramkę wokół pierwszego prążka. Przesuń ramkę, aby upewnić się, że wszystkie prążki mieszczą się w polu, a następnie "skopiuj" i "wklej" ramkę nad wszystkie pozostałe prążki.</li>
<li>Zaznacz wszystkie ramki za pomocą "Ctrl+A", a następnie wybierz opcję odejmowania średniego tła (subtract median background). Kliknij "report" w górnym menu; pojawi się arkusz z wartościami kwantyfikacji. Reprezentatywne wyniki przedstawione tutaj są wyrażone jako wzrost krotny w stosunku do komórek niepoddanych działaniu czynnika (czas zero).</li></ul></li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
<ol>
	<li>Mutageneza celowana wysoce bogatej w pary GC sekwencji genu KISS1R: 
Tabela 1 przedstawia kombinację odczynników służącą do zwiększenia wydajności amplifikacji KISS1R. Kombinacja ta była z powodzeniem stosowana do wprowadzania kilku mutacji skierowanych przeciwko różnym regionom sekwencji cDNA KISS1R, a także do amplifikacji tego wysoce bogatego w pary GC genu. Rysunek 1 przedstawia warunki cyklizacji i amplifikacji dla mutagenezy KISS1R. Warunki te zostały zmodyfikowane na podstawie zestawu QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene). 
Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny wynik uzyskany przy zastosowaniu tego zoptymalizowanego protokołu. Dodatek 4% lub 8% DMSO w połączeniu z PCRx Enhancer znacząco poprawia wydajność amplifikacji plazmidu zawierającego bogate w pary GC cDNA KISS1R. W tym reprezentatywnym eksperymencie 4% DMSO zapewniło nieco lepsze warunki amplifikacji w porównaniu do 8% DMSO. Transformacja produktów amplifikacji traktowanych enzymem DpnI do ultrakompetentnych szczepów E. coli zazwyczaj daje od 10 do ponad 10 kolonii, a odsetek skutecznego wprowadzenia pożądanych mutacji wynosi 80-90%, co potwierdzono w drodze sekwencjonowania DNA.</li>
<li>Wykorzystanie konstruktów MycKISS1R do badania fizjologii receptora: 
 W tym reprezentatywnym eksperymencie dziki typ pCS2+MycKISS1R, amplifikowany zgodnie z opisanym tutaj zoptymalizowanym protokołem, jest wykorzystywany do badania degradacji receptora KISS1 in vivo w odpowiedniej linii komórkowej (HEK-293) przejściowo ekspresyjnej dla MycKISS1R. Po potraktowaniu transfektowanych komórek HEK-293 inhibitorami lizosomów (leupeptyna) lub proteasomów (MG132) zgodnie z protokołem opisanym w metodach, komórki są lizowane i przygotowywane do analizy western blot. Górny panel Rysunku 3 przedstawia skan monomerów MycKISS1R, natomiast dolny panel przedstawia kwantyfikację prążków pokazanych na panelu górnym. Kwantyfikacja prążków wskazuje, że ani 6h, ani 16h traktowania leupeptyną nie wpłynęło na poziomy białka MycKISS1R. Przeciwnie, traktowanie MG132 spowodowało zależny od czasu wzrost ilości białka MycKISS1R w tych komórkach, co kulminowało w 45-krotnym nagromadzeniu receptora po 16h inkubacji z MG132. Obserwacje te wskazują, że w przeciwieństwie do większości receptorów sprzężonych z białkiem G, KISS1R jest degradowany przez proteasom (a nie przez lizosom).</li>
</ol>

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>DMSO</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Odczynniki</td>
 <td>0</td>
 <td>4%</td>
 <td>8%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Woda</td>
 <td>35</td>
 <td>33</td>
 <td>31</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bufor 10x Pfu Ultra Taq</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mieszanka dNTP (10 mM)</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Starter sensowny (25 pmol/μl)</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Starter antysensowny (25 pmol/μl)</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór 10x PCRx Enhancer</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>0</td>
 <td>2</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>polimeraza Pfu Ultra Taq (2,5 U/μl)</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>plazmidowe DNA (20 ng/μl)</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 <td>1</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 1. Kombinacja odczynników z powodzeniem zastosowana do mutacji i amplifikacji bogatego w GC genu KISS1R
<img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig1.jpg" alt="Schemat cykli termicznych PCR; proces amplifikacji DNA; profil temperatura-czas; 18 cykli; denaturacja w 95°C, przyłączanie starterów w 5°C, elongacja w 68°C; inkubacja w 4°C." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Warunki cykli udanej mutagenezy i amplifikacji obszarów bogatych w GC KISS1R: Po 2-minutowej szybkiej aktywacji (hot start) przeprowadzono 18 cykli składających się z 30 s denaturacji w temperaturze 95°C; 1 min wygrzewania w temperaturze 55°C or przedłużenie o 6 min w temperaturze 68°CDodatkowe przedłużenie o 10 min w 68°C dodano na koniec ostatniego cyklu. Parametry te zostały zmodyfikowane względem oryginalnego protokołu mutagenezy zawartego w zestawie QuikChange II XL-Site-Directed Mutagenesis (Stratagene).
<img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig2.jpg" alt="Żel do elektroforezy DNA wykazujący rozdzielenie fragmentów przy zmiżnym stężeniu DMSO." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wizualizacja pCS2+Myc bogatego w GCKISS1R amplifikowano w obecności lub w braku DMSO: Pięć μl alikwoty pCS2+MycKISS1R Produkty amplifikowane w obecności 0, 4 lub 8% DMSO zostały naniesione na ten reprezentatywny 1% żel agarozowy barwiony bromkiem etydyny i wizualizowane w świetle UV. Prążki plazmidu o wielkości 6 kb są widoczne w obu ścieżkach z produktami PCR amplifikowanymi w obecności 4% i 8% DMSO, natomiast nie są widoczne w pierwszej ścieżce, w której naniesiono produkt PCR amplifikowany bez DMSO.
<img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig3.jpg" alt="Schemat Western blot stabilności białka MycKISS1R, IP przeciw-Myc, WB przeciw-Myc, MG132, leupeptyna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Wpływ leupeptyny lub MG132 na poziom białka MycKISS1R białko w komórkach HEK-293: komórki HEK-293 wykazujące ekspresję MycKISS1R poddano działaniu 100μg/ml leupeptyna lub 10μM MG132 w stężeniu 37°C przez wyznaczone czasy. MycKISS1R włączone 400μg lizatu komórkowego poddano immunoprecypitacji za pomocą 2.5μg przeciwciał anty-Myc sprzężonych z agarozą i analizowano metodą western blot. (A) Detekcja Myc za pomocą systemu LI-COR OdysseyKISS1R po inkubacji immunoblottów z króliczym przeciwciałem przeciwko znacznikowi Myc, a następnie inkubacji z przeciwciałem antykróliczym znakowanym IRDye 80CW; (B) Ilościowe oznaczenie MycKISS1R prążki przedstawione na (A) za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji LI-COR Odyssey. Wyniki przedstawiono jako krotność wzrostu w stosunku do komórek niepoddanych działaniu czynnika (czas 0).

<ol><li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li>
<li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li>
<li>Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kisspeptin+Directly+Stimulates+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Release+via+G+Protein-Coupled+Receptor+54%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).</li>
<li>Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GPR54-Activating+Mutation+in+a+Patient+with+Central+Precocious+Puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty.</a> N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).</li>
<li>Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+Phenotype+Analysis+in+Five+Patients+with+Isolated+Hypogonadotropic+Hypogonadism+due+to+a+L102P+Inactivating+Mutation+of+GPR54%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54.</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).</li>
<li>Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li>
<li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li>
<li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR54+regulates+ERK1%2F2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha%28q%2F11%29+and+beta-arrestin-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li>
<li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation%3A+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+Specific+Position+in+a+DNA+Sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.</a> J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Unusual+Origin+of+the+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Am%22%5BJournal%5D)">The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.</a> Sci Am. 262, 56-61 (1990).</li>
<li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li>
<li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design%2C+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li>
<li>Kong, K. C. Chapter 10. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKong%2C+KC+%22MSTA.+in+G+Protein-Coupled+Receptors%3A+Essential+Methods%22">MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods</a>. Poyner, D. R., Wheatly, M. , Wiley-Blackwell. 197-204 (2010).</li>
<li>Hall, R. A. Chapter 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+RA+%22G+protein-Coupled+Receptor-Protein+Interactions%22">G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions</a>. George, S. R., O'Dowd, B. F. , John Wiley & Sons, Inc. 170-171 (2005).</li>
<li>Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+Involvement+in+Agonist-Induced+Down-Regulation+of+Mu+and+Delta+Opioid+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors.</a> J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).</li>
<li>Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Mutageneza celowana jest wykorzystywana od ponad trzech dekad do badania funkcji białek poprzez wprowadzanie zmian nukleotydowych w sekwencji kodującej wybranych genów. Oryginalna technika została opisana w 1978 roku przez brytyjsko-kanadyjskiego chemika i laureata Nagrody Nobla, Michaela Smitha 10. Michael Smith dzielił Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii z 1993 roku z Karym Mullisem, amerykańskim biochemikiem, który wynalazł reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) 11. Oryginalna metoda opisana przez Mic...

<table><tbody><tr><td>10x roztwór PCRx Enhancer</td><td>Invitrogen</td><td>52391</td><td></td></tr><tr><td>Alternatywny detergent do polimerazy DNA PfuUltra High-fidelity</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>600385</td><td></td></tr><tr><td>Dpn-I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Ultrakompetentne komórki XL10-Gold &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Geneporter</td><td>Genlantis</td><td>T201007</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptyna</td><td>Calbiochem</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>47491</td><td></td></tr><tr><td>10xPBS</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz i PMSF</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Koniugat agarozowy przeciwko znacznikowi Myc (klon 4A6)</td><td>EMD Millipore</td><td>16-219</td><td></td></tr><tr><td>2x bufor do nakładania próbek</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Gotowy żel Criterion Tris-HCl, gradient 4-15%</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0028</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-FL PVDF</td><td>EMD Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący Odyssey</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>10xTBS</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało przeciwko myc</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2272</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało przeciwko króliczym IRDye 800CW</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>Podczerwony system obrazowania Odyssey</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz Halt (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78430</td><td></td></tr></tbody></table>

mutogeneza i analiza mutacji genetycznych w bogatej w gc sekwencji receptora kiss1 zidentyfikowanej u ludzi z zaburzeniami rozrodu

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Receptor kisspeptyny (KISS1R) jest receptorem sprzężonym z białkiem G, uznawanym za wyzwalacz dojrzewania płciowego oraz regulator kompetencji rozrodczych w wieku dorosłym 1,2,3. Mutacje inaktywujące w KISS1R zidentyfikowane u pacjentów zostały powiązane z idiopatycznym hipogonadotropowym hipogonadyzmem (IHH) 1,2 oraz dojrzewaniem przedwczesnym 4. Badania funkcjonalne tych mutantów są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw regulacji rozrodu przez ten receptor, a także czynników kształtujących przebieg choroby, która wynika z nieprawidłowego sygnalizowania i funkcji KISS1R. Jednakże sekwencja genu KISS1R, charakteryzująca się wysoką zawartością par GC, sprawia, że wprowadzanie mutacji lub amplifikacja genu kodującego ten receptor za pomocą metody PCR jest dość trudna.
W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wprowadzania wybranych mutacji do tej sekwencji o wysokiej zawartości GC, która została z sukcesem wykorzystana w naszym laboratorium do wygenerowania ponad tuzina mutantów KISS1R. Zoptymalizowaliśmy warunki reakcji PCR, aby ułatwić amplifikację szeregu mutantów KISS1R, obejmujących substytucje, delecje lub insercje w sekwencji KISS1R. Szczególnie pomocne w poprawie amplifikacji okazało się dodanie roztworu wzmacniającego PCR oraz niewielkiego procenta DMSO. Ta zoptymalizowana procedura może być użyteczna również w przypadku innych matryc bogatych w GC.
Wektor ekspresyjny kodujący KISS1R jest wykorzystywany do charakterystyki sygnalizacji i funkcji tego receptora w celu zrozumienia, w jaki sposób mutacje mogą zmieniać funkcję KISS1R i prowadzić do związanych z nimi fenotypów rozrodczych. Odpowiednio, potencjalne zastosowania mutantów KISS1R generowanych poprzez mutogenezę celowaną mogą być zilustrowane w wielu badaniach 1,4,5,6,7,8. Na przykład wykazano, że mutacja typu gain-of-function w KISS1R (Arg386Pro), związana z dojrzewaniem przedwczesnym, przedłuża responsywność receptora na stymulację ligandem 4, a także zmienia tempo degradacji KISS1R 9. Co ciekawe, nasze badania wskazują, że KISS1R jest degradowany przez proteasom, w przeciwieństwie do klasycznej degradacji lizosomalnej opisanej dla większości receptorów sprzężonych z białkiem G 9. W przedstawionym tutaj przykładzie degradacja KISS1R jest badana w ludzkich komórkach embrionalnej nerki (HEK-293) przejściowo ekspresujących KISS1R z tagiem Myc (MycKISS1R) i traktowanych inhibitorami proteasomu lub lizosomów. Lizaty komórkowe są immunoprecypitowane przy użyciu przeciwciała anty-myc sprzężonego z agarozą, a następnie analizowane metodą western blot. Detekcja i kwantyfikacja MycKISS1R na blotach jest wykonywana przy użyciu systemu LI-COR Odyssey Infrared System. To podejście może być użyteczne również w badaniu degradacji innych interesujących białek.

Mutacje w receptorze kisspeptyny (KISS1R) są powiązane z zaburzeniami rozrodczymi u pacjentów. W niniejszej pracy opisujemy sposób wprowadzania wybranych mutacji w bogatej w GC sekwencji KISS1R, a także wykorzystanie konstruktów KISS1R do charakterystyki ścieżki degradacji receptora za pomocą immunoprecypitacji i western blotu.

Mutogeneza i analiza mutacji genetycznych w bogatej w GC sekwencji receptora KISS1 zidentyfikowanej u ludzi z zaburzeniami rozrodu

Receptor kisspeptyny (KISS1R) jest receptorem sprzężonym z białkiem G, uznawanym za wyzwalacz dojrzewania płciowego oraz regulator sprawności rozrodczej w ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie szlaku degradacji receptora KISS1, a także wpływu mutacji genetycznych związanych z ludzkimi chorobami na funkcję receptora. Pierwszym krokiem jest wprowadzenie pożądanych mutacji do receptora KISS1 z tagiem MT za pomocą mutogenezy ukierunkowanej, a następnie transformacja do e coli i sekwencjonowanie w celu potwierdzenia wprowadzenia pożądanych mutacji. Kolejnym krokiem jest transfekcja receptora KISS1 do ludzkich komórek embrionalnej nerki w celu zbadania degradacji receptora KISS1 przy użyciu inhibitorów lizosomów i proteasomów.Następnie receptor KISS1 jest immunoprecypitowany z potraktowanych komórek przy użyciu przeciwciała anty-KISS1 sprzężonego z HRP. Ostatnim etapem procedury jest ilościowe oznaczenie immunoprecypitowanego receptora KISS1 za pomocą analizy western blot. W końcowym etapie można uzyskać wyniki ujawniające ścieżkę degradacji receptora.Alternatywnie można również określić wpływ mutacji genetycznych na zachowanie receptorów. Techniki, które prezentujemy dzisiaj, mogą pomóc naukowcom odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące receptorów sprzężonych z białkiem G, takie jak sposób regulacji funkcji receptorów, a takż

mutagenesis-analysis-genetic-mutations-gc-rich-kiss1-receptor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mutageneza i analiza mutacji genetycznych w bogatym w GC sekwencji receptora KISS1 zidentyfikowanej u ludzi z zaburzeniami rozrodczymi

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Przedstawiamy metodę testowania wariantów BRCA1 w teście opartym na hodowli tkankowej dla homologicznej naprawy pęknięć DNA, polegającą na usunięciu endogennego białka BRCA1 z komórki za pomocą RNAi i zastąpieniu go mutantem punktowym BRCA1 zawierającym zmianę kodującą.

Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Mutacje de novo w męskiej linii zarodkowej mogą przyczyniać się do niekorzystnych skutków zdrowotnych w kolejnych pokoleniach. W tym miejscu opisujemy protokół użycia transgenicznego modelu gryzoni do ilościowego określania mutacji w męskich komórkach rozrodczych wywołanych przez czynniki środowiskowe.

Test transgenicznych gryzoni do ilościowego określania częstości mutantów męskich komórek rozrodczych

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Osoby z mutacjami BRCA1 mają wyższe ryzyko zachorowania na raka, co gwarantuje dokładną ocenę funkcji wariantów BRCA1. W tym artykule opisaliśmy protokół oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytorów zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które umożliwiają ukierunkowaną konwersję C:G do T:A w żywych komórkach.

Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodologię badań przesiewowych in vivo CRISPR/Cas9 za pomocą ultrasonograficznych iniekcji embrionalnych lentiwirusów in utero w celu jednoczesnej oceny funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej myszy immunokompetentnych.

Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Poznaj mutagenezę ukierunkowaną receptora KISS1R i analizę jego degradacji w komórkach nerek ludzkich zarodków. Ta metoda pozwala badać wpływ mutacji genetycznych na funkcję receptora.

Mutageneza i analiza mutacji genetycznych w sekwencji receptora KISS1 bogatej w GC zidentyfikowanej u ludzi z zaburzeniami rozrodu (Wideo) | JoVE Journal

Mutogeneza i analiza mutacji genetycznych w bogatej w GC sekwencji receptora KISS1 zidentyfikowanej u ludzi z zaburzeniami rozrodu

Przeglądaj więcej filmów