Name: Indukcja i badanie hipoksji w hodowli komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj metody indukcji hipoksji w hodowli komórkowej przy użyciu chlorku kobaltu i analizy ekspresji HIF-1 alpha. Techniki western blot i bioluminescencji umożliwiają precyzyjną ocenę odpowiedzi komórkowej na niedotlenienie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Hipoksja indukowana roztworem CoCl2
Sześciowodny chlorek kobaltu(II) (CoCl2 • 6H2O, MW=237.9) jest chemicznym induktorem czynnika 1 indukowanego hipoksją.3 8. Produkt ten jest rozpuszczalny w wodzie (100 mg/ml), dając klarowny, czerwony roztwór. 
<ol>
<li>Przygotuj 25mM roztwór zapasowy w sterylnej wodzie dd (przygotować bezpośrednio przed użyciem)</li> 
<li>W celu indukowania hipoksji zastosuj CoCl2 w końcowym stężeniu 100μM w standardowej pożywce do hodowli komórkowych.</li>
<li>Dodaj pożywkę zawierającą CoCl2 do komórek i inkubuj hodowle przez 24hours w konwencjonalnym inkubatorze (37°C; 5% C02).</li>
</ol>
Powyższe stężenie sprawdza się w przypadku przetestowanych przez nas linii komórkowych, jednak każdą linię komórkową należy przetestować przy różnych stężeniach (w celu ustalenia krzywej zależności od dawki) oraz w różnych czasach inkubacji, aby ograniczyć toksyczność związaną z lekiem i zoptymalizować test.
2. Indukcja hipoksji w modułowej komorze inkubacyjnej
<ol>
<li>Przygotuj co najmniej dwie identyczne hodowle komórkowe (hodowle bliźniacze). Hodowle mogą znajdować się w kolbach, płytkach lub naczyniach hodowlanych. Aby otworzyć komorę, najpierw otwórz dwa białe plastikowe zaciski znajdujące się na rurkach przymocowanych do komory (rurkach służących do wtryskiwania/przepłukiwania gazu hipoksycznego), a następnie ostrożnie otwórz stalowy zacisk pierścieniowy.</li>
<li>Zwolnij zacisk. Teraz można zdjąć pokrywę i tace.</li>
<li>Umieść hodowlę komórkową w komorze hipoksycznej. W komorze należy również umieścić szalkę Petriego zawierającą sterylną wodę, aby zapewnić odpowiednie nawilżenie hodowli.</li>
<li>Umieść „bliźniaczą” hodowlę komórkową w warunkach normoksji jako kontrolę.</li>
<li>Upewnij się, że tace są zabezpieczone i nie przesuwają się, a następnie zamknij komorę pokrywą. Prawidłowo ustaw stalowy zacisk pierścieniowy, aby zapewnić szczelne zamknięcie komory, i zamknij go.</li>
<li>Aby stworzyć warunki hipoksji, podłącz przewody do „zbiornika hipoksji” zawierającego mieszaninę gazów z 1% O2. Jeśli do zbiornika podłączony jest przepływomierz, komora zostanie z nim połączona bezpośrednio (zbiornik gazu – przepływomierz – komora). My stosujemy przepływomierz wbudowany w regulator.</li>
<li>Ważne jest usunięcie większości, jeśli nie całego tlenu znajdującego się w komorze i w pożywkach; w tym celu przepłucz komorę, otwierając zbiornik gazu przy szybkości przepływu 20 liters per minutes przez 7-10 minutes; następnie szybko wyłącz dopływ gazu i całkowicie zamknij komorę, zamykając oba białe zaciski.</li>
<li>Umieść komorę w konwencjonalnym inkubatorze na żądany czas. W przypadku dużych hodowli odczekaj 1- 2 hours, aby pożywki w hodowlach odgazowały, a następnie powtórz przepłukiwanie. 
Powyższe kroki opierają się na zaleceniach producenta (Billups-Rothenberg, Inc). Upewnij się, że zbiornik z gazem jest przez cały czas odpowiednio zabezpieczony.</li> 
</ol>
Uwagi:
<ul>
<li>W celu usunięcia O2 zawartego w pożywce zaleca się ponowne przepłukanie komory gazem po upływie 1-3 godzin.</li>
<li>W przypadku czasu inkubacji dłuższego niż 48 godzin również zaleca się ponowne przepłukanie komory gazem.</li>
<li>Czujniki tlenu (elektrody/manometry), które umożliwiają pomiary O2 zawartego w komórkach/komorze, zapewnią dokładniejszy pomiar zawartości O2 wewnątrzkomórkowej/w komorze.</li>
<li>Kulturowanie komórek przez różne okresy czasu w celu stworzenia krzywej czasowej pomogłoby określić optymalny czas ekspresji HIF-1α w konkretnych komórkach.</li>
</ul>
3. Ocena hipoksji
<ol>
<li>Wykrywanie HIF-1 α metodą western blot.
<ol>
<li>Ponownie otwórz komorę zgodnie z opisem w sekcji 2.2 i natychmiast umieść hodowle w lodzie.</li>
<li>Zlizuj komórki poddane i niepoddane działaniu hipoksji za pomocą 5% roztworu SDS bezpośrednio w płytkach, następnie przenieś lizat komórkowy do probówek, poddaj sonikacji, odwirowuj szczątki komórkowe i zbierz nadsącz.</li>
<li>Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu BCA, przygotuj próbkę, dodając bufor do nakładania i podgrzewając w 95°C przez 5 min.</li>
<li>Przeprowadź elektroforezę białek na 8% żelu SDS-poliakrylamidowym i przenieś je na membrany nitrocelulozowe.</li> 
<li>Blokuj membranę w PBS zawierającym 5% odtłuszczonego mleka w proszku i 0,1% Tween 20 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w 4°C przez noc na wytrząsarce.</li>
<li>Przeprowadź immunoblotting przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym monoklonalnym przeciwko HIF-1α (1/600) w tym samym buforze w 4 °C.</li> 
<li>Przepłucz 3 razy w PBS zawierającym 0,1% Tween 20 w temperaturze pokojowej po 5 min za każdym razem i inkubuj z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP (1/2000) w PBS + 0,1% Tween 20 przez 45 min.</li>
<li>Przepłucz 3 razy w PBS zawierającym 0,1% Tween 20 w temperaturze pokojowej przez 5 min za każdym razem.</li>
<li>Użyj zestawu Pierce ECL oraz filmu rentgenowskiego, aby uwidocznić prążek białkowy.</li>
</ol>
</li>
<li>Element odpowiedzi na hipoksję (HRE). 
HIF-1α reguluje liczne geny (np. VEGF, EPO) poprzez wiązanie się z sekwencją zwaną elementem regulującym hipoksję (HRE). Wykorzystując HRE powiązany z genem markerowym, możliwe jest wykrycie aktywności HIF 9. Aby zastosować tę metodę, należy najpierw przeprowadzić transfekcję komórek plazmidem HRE-lucyferaza, stosując metodę transfekcji dostosowaną do używanych komórek. W naszym przypadku zastosowano Lipofectamine 2000. Komórki muszą zostać przetransfekowane co najmniej 4 godziny przed inkubacją w warunkach hipoksji i normoksji. Czas ten pozwala na wniknięcie DNA do komórek, dzięki czemu ten pierwszy etap nie jest zaburzony przez hipoksję. Sygnał lucyferazy jest wykrywany przy użyciu zestawu do analizy lucyferazy (Luciferase Assay Kit).
<ol>
<li>Inkubuj przetransfekowane HRE komórki w hipoksji w komorze modularnej lub użyj komórek przetransfekowanych HRE inkubowanych z CoCl2, uwzględniając kontrolę w normoksji.</li>
<li>Po pożądanym czasie inkubacji usuń z komórek pożywkę wzrostową.</li>
<li>Przepłucz komórki w PBS, a następnie usuń PBS.</li>
<li>Dodaj 400μl 1X odczynnika do lizy do naczynia hodowlanego i zeskrob przylegające komórki, a następnie przenieś je do probówki typu mikro.</li> 
<li>Odwirowuj szczątki krótką centryfugacją.</li>
<li>Wymieszaj 20μl nadsączu z lizatów komórkowych ze 100μl odczynnika do analizy lucyferazy i zmierz luminescencję za pomocą luminometru.</li>
</ol>
</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
W komórkach K562 (ludzka linia komórkowa białaczki) hodowanych przez 2 dni w warunkach niskiego stężenia tlenu, w porównaniu do normoksji, hipoksja indukuje wzrost poziomu białka HIF-1α, co zostało wykryte za pomocą techniki western blot (Rysunek 1). 
Przy użyciu zmodyfikowanych komórek 293 (linia komórkowa embrionalnej nerki) z konstruktem HRE-lucyferaza hodowanych w warunkach hipoksji, w komórkach hipoksycznych stwierdzono istotny wzrost aktywności HIF-1α (Rysunek 2).
<img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="Analiza Western blot; poziomy HIF-1α i β-aktyny; hipoksja vs normoksja; porównanie ekspresji białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wzrost poziomu HIF-1α w komórkach w warunkach hipoksji. Komórki K562 hodowano w warunkach normoksji oraz hipoksji (komora hipoksyczna) przez 48 h, a następnie analizowano za pomocą techniki Western blot z użyciem przeciwciała specyficznego dla HIF-1α. Jako kontrolę załadunku wykorzystano przeciwciało specyficzne dla aktyny. 
<img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="Wykres porównawczy luminescencji w warunkach normoksji i hipoksji; wykres słupkowy z wartościami RLU." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Aktywność HIF-1α. Modyfikowane komórki 293 HRE-lucyferaza były hodowane w warunkach hipoksji i normoksji przez 48 h, a następnie poddano je lizie w celu wykrycia sygnału lucyferazy przy użyciu zestawu do analizy lucyferazy i luminometru. Wyniki przedstawiono jako względne jednostki luminescencji (RLU).

<ol><li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li>
<li>van Laarhoven, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+in+relation+to+vasculature+and+proliferation+in+liver+metastases+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).</li>
<li>Hockel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+pO2+predicts+survival+in+advanced+cancer+of+the+uterine+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix.</a> Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+and+human+disease%3A+one+highly+involved+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">HIF-1 and human disease: one highly involved factor.</a> Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1%3A+master+regulator+of+O2+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.</a> Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).</li>
<li>Tatum, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%3A+importance+in+tumor+biology%2C+noninvasive+measurement+by+imaging%2C+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).</li>
<li>Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">HIF at a glance.</a> J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).</li>
<li>Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoCl2%2C+a+chemical+inducer+of+hypoxia-inducible+factor-1%2C+and+hypoxia+reduce+apoptotic+cell+death+in+hepatoma+cell+line+HepG2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2.</a> Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).</li>
<li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+%28FOXO3a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Proliferacja i żywotność komórek w warunkach hipoksji znacznie różnią się w zależności od typu komórek. Należy zatem dostosować liczbę komórek lub liczbę płytek hodowlanych na początku procesu, aby mieć pewność, że uzyska się odpowiednią ilość komórek/białek do przeprowadzonych eksperymentów.
Metoda z użyciem chlorku kobaltu charakteryzuje się tym, że jest niedroga i szybka. Produkt ten naśladuje hipoksję poprzez indukcję HIF-1/3α, lecz może również regulować inne geny; należy upewnić się, że produkt ten jest odpowiedni dla danego projektu, sprawdzając, jakie inne efekty może wywierać na funkcję i fenotyp konkretnych komórek niezależnie od efektu „naśladowania hipoksji”. Innym lekiem stosowanym do naśladowania hipoksji jest mezylan deferoksaminy (DFO, stosowany w końcowym stężeniu 100 μM). Stosowanie tych leków pozwala badaczowi na wielokrotne otwieranie płytki/szalki/kolby hodowlanej bez wpływu na „warunki hipoksyjne”.
Poziom tlenu zawarty w mieszaninie gazowej może się różnić w zależności od przeprowadzanych eksperymentów i rodzajów komórek, ponieważ wartości hipoksji różnią się w zależności od tkanek i typów komórkowych. W rzeczywistości niektóre komórki wykazują hipoksję przy 5% O2, inne potrzebują mniej niż 1% O2, aby wystąpił stan hipoksji. Do mieszaniny gazowej dodaje się 5% CO2 w celu stabilizacji pH kultur; pozostała część gazu to zazwyczaj azot.
Komory hipoksyjne mają tę zaletę, że nie wymagają stosowania leków, które mogłyby zmieniać zachowanie komórek niezależnie od napięcia tlenowego. Jednak nie wszystkie rodzaje eksperymentów można w nich przeprowadzić, ponieważ przy każdym otwarciu do komory przedostaje się tlen, co zmniejsza stopień hipoksji. Należy wziąć ten czynnik pod uwagę w planowaniu doświadczeń; hipoksja/reoxygenacja jest specyficznym stanem, który może wpływać na niektóre typy komórek. Alternatywą jest zastosowanie stacji roboczych do hipoksji (podłączonych do butli z gotowymi mieszankami gazów lub systemów mieszania gazów) bądź większych inkubatorów hipoksyjnych (komór do przetwarzania w warunkach hipoksji z komorą rękawicową), które umożliwiają wymianę mediów i manipulację komórkami w ciągłym środowisku hipoksyjnym. W ciągu ostatniej dekady na rynek wprowadzono różne komory hipoksyjne, które należy dobierać w zależności od zastosowań laboratoryjnych, realizowanych projektów, dostępnej przestrzeni, wymaganej wielkości oraz budżetu. Zawsze należy dbać o prawidłowe użytkowanie i stan techniczny komory, aby zagwarantować odpowiednie warunki hodowli. Generalnie, podczas korzystania z komory, poziom hipoksji można modulować poprzez wybór różnych mieszanek gazowych (np. 1%, 5% lub 10% tlenu).
W odniesieniu do detekcji HIF-1α należy pamiętać, że niektóre linie komórkowe nowotworowe wykazują ekspresję HIF-1α w warunkach normoksji. Dlatego kluczowe jest zastosowanie kontroli normoksji w celu określenia podstawowego poziomu HIF w tych liniach komórkowych. HIF-1α może być obecny w normoksji również w komórkach niezłośliwych po stymulacji komórkowej lub stresie. Może to wystąpić także w przypadku głodzenia komórek, dlatego należy upewnić się, że hodowle komórkowe są odpowiednio odżywiane i utrzymywane.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-HIF-1&amp;#945;</td><td>Invitrogen</td><td>458400</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek kobaltu (II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661-25G</td><td></td></tr><tr><td>Komora inkubatora</td><td>Billups-Rothenberg, Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid HRE-Luciferase</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 26731</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja i badanie hipoksji w hodowlach komórkowych

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hipoksja jest definiowana jako zmniejszenie lub brak tlenu w organach, tkankach lub komórkach. Spadek ciśnienia parcjalnego tlenu może wynikać z ograniczonej podaży tlenu (przyczyny obejmują niewystarczającą sieć naczyń krwionośnych, wadliwe naczynia krwionośne oraz anemię) lub ze zwiększonego zużycia tlenu w stosunku do jego podaży (wywołanego nagłym wzrostem tempa proliferacji komórek). Hipoksja może mieć charakter fizjologiczny lub patologiczny, jak ma to miejsce w przypadku nowotworów litych. 1-3, reumatoidalne zapalenie stawów, miażdżyca itd.&#x2026; Każda tkanka i każda komórka wykazują różną zdolność adaptacji do tych nowych warunków. Podczas hipoksji czynnik indukowany hipoksją alfa (HIF) ulega stabilizacji i reguluje ekspresję różnych genów, m.in. tych zaangażowanych w angiogenezę lub transport tlenu. 4Stabilizacja tego białka jest charakterystyczną cechą hipoksji, dlatego detekcja HIF jest rutynowo wykorzystywana do badania występowania hipoksji. 5-7. 
W niniejszym artykule proponujemy dwie proste metody indukowania hipoksji w hodowlach komórek ssaków oraz proste testy służące do oceny stanu hipoksji tych komórek.

W niniejszym materiale proponujemy proste metody indukcji hipoksji w hodowlach komórkowych oraz proste testy służące do oceny stanu hipoksyjnego hodowli.

Indukcja i badanie hipoksji w hodowlach komórkowych

Hipoksja jest definiowana jako zmniejszenie lub brak tlenu w narządach, tkankach lub komórkach. Ten spadek napięcia tlenowego może wynikać ze zmniejszonej podaży w...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie hipoksji w hodowli komórkowej. Osiąga się to poprzez hodowlę komórek w obecności chemicznego induktora indukowalnego czynnika hipoksji 1 lub poprzez hodowlę komórek w inkubatorze hipoksycznym bądź komorze wypełnionej specjalną mieszaniną gazów. Następnie hipoksję wykrywa się poprzez weryfikację poziomu ekspresji HIF 1 alpha w ekstraktach białkowych komórek lub poprzez pomiar jego aktywności z wykorzystaniem wektora ENC kodującego sekwencje wiążące hi one alpha.Ostatecznie, za pomocą techniki western blotting oraz detekcji luminescencyjnej, można uzyskać wyniki wykazujące wzrost poziomów ekspresji i aktywności HIF one alpha. Nazywam się Danny U. i jestem doktorantem w laboratorium Patrizii Indy. Dzisiaj zaprezentuję procedurę indukowania hipoksji za pomocą chlorku kobaltu.Zacznij od przygotowania 25 mM roztworu zapasowego chlorku kobaltu w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej. Dodaj roztwór do komórek i inkubuj w końcowym stężeniu 100 µM. Inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, aby wywołać hipoksję.Używając modułowej komory inkubacyjnej, przygotuj co najmniej dwie identyczne hodowle komórkowe. Zaleca się jednak wykonanie trzech powtórzeń dla każdego wariantu. Otwórz modułową komorę inkubacyjną, najpierw odpinając dwa białe plastikowe zaciski znajdujące się na rurkach przymocowanych do komory, a następnie zdejmij pokrywę i tacki.Umieść hodowlę komórkową w komorze hipoksycznej wraz z płytką Petriego zawierającą jałową wodę, aby zapewnić odpowiednie nawilżenie kultur. Drugą hodowlę komórkową umieść w warunkach normoksji jako kontrolę do indukcji hipoksji. Podłącz rurkę do zbiornika z mieszaniną gazów zawierającą 1% tlenu.Jeśli do zbiornika podłączony jest przepływomierz, komora zostanie z nim połączona bezpośrednio. W celu usunięcia całego tlenu obecnego w komorze oraz w medium stosujemy przepływomierz wbudowany w regulator. Przepłucz komorę, otwierając zbiornik z gazem przy szybkości przepływu 20 litrów na minutę przez okres od czterech do siedmiu minut.Następnie szybko wyłącz przepływ gazu i całkowicie zamknij komorę, zaciśkając oba białe zaciski. Przenieś komorę z powrotem do konwencjonalnego inkubatora na wymagany czas.W przypadku stosowania dużych kultur należy pozostawić podłoże i kultury w DGAs przez jedną do dwóch godzin, a następnie powtórzyć płukanie w celu oceny hipoksji. Wykorzystując detekcję HIF one alpha za pomocą western blot, należy ponownie otworzyć komorę zgodnie z wcześniejszą instrukcją i natychmiast umieścić kultury na lodzie. Komórki poddane działaniu hipoksji oraz komórki niepoddane działaniu hipoksji należy poddać lizie w 5% roztworze SDS.Następnie przenieść lizaty do probówek i poddać sonikacji w celu ekstrakcji białek, odwirować pozostałości komórkowe i zebrać nadsącz. Następnie zmierzyć stężenie białek za pomocą zestawu BCA. Potem przygotować próbkę do elektroforezy poprzez dodanie buforu do nakładania i inkubację w temperaturze 95 °C przez pięć minut.Rozdziel białka w 8% żelu poliakrylamidowym z SDS, a następnie przenieś je na membranę nitrocelulozową. Zablokuj membranę w buforze PBS zawierającym 5% beztłustego mleka w proszku i 0,1% Tween 20 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce. Inkubuj blok przez noc z primary monoclonal antibody przeciwko HIF-1α w tym samym buforze w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia. Membranę należy przemyć trzykrotnie przez pięć minut każdorazowo w roztworze PBS zawierającym 0,1% tween 20 w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować z wtórnym przeciwciałem sprzężonym z HRP w roztworze PBS z dodatkiem 0,1% tween 20 przez 45 minut. Przemyć trzykrotnie przez pięć minut każdorazowo w roztworze PBS zawierającym 0,1% tween 20 w temperaturze pokojowej.Następnie inkubuj membranę w roztworach do detekcji chemiluminescencyjnej i naświetlaj ją na filmie rentgenowskim, aby zmierzyć aktywność lucyferazy. Usuń pożywkę wzrostową z hodowli komórkowych. Przepłucz komórki w PBS.Następnie do szalki hodowlanej należy dodać 400 µL odczynnika do lizy w stężeniu 1x. Przyczepione komórki należy zebrać skrobakiem i przenieść do mikroprobówki. Pozostałości należy osadzić poprzez krótkie wirowanie.Wymieszaj 20 µL supernatantu lizatu komórkowego ze 100 µL odczynnika do analizy lucyferazy i zmierz luminescencję za pomocą luminometru. Komórki K 5 62 hodowano w warunkach normoksji lub hipoksji przez 48 godzin, a następnie analizowano metodą western blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla H one alpha. Do kontroli ładunku wykorzystano przeciwciało specyficzne dla beta actin.Wyniki wykazują wzrost poziomu HIF-1α w komórkach w warunkach hipoksji. Komórki 293 zmodyfikowane reporterem HRE Lucyferaza były hodowane w warunkach hipoksji lub normoksji przez 48 godzin, a następnie poddano je analizie w celu wykrycia sygnału lucyferazy przy użyciu zestawu do testu lucyferazowego i luminometru. W komórkach w warunkach hipoksji stwierdzono również wzrost aktywności HIF-1α.Wyniki wyrażono jako względną luminescencję. Jednostki. Należy pamiętać, że praca z gazami wymagającymi precyzyjnego dozowania może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak prawidłowe przymocowanie butli z tlenem do ściany lub blatu, właściwe otwieranie i zamykanie butli z tlenem, a także kontrolowanie ciśnienia.

induction-and-testing-of-hypoxia-in-cell-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Indukcja i badanie hipoksji w hodowli komórkowej

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywności czynnika indukowanego hipoksją-1α jest stosowane do monitorowania rozwoju hipoksji guza wewnątrzczaszkowego w mysim modelu przerzutów raka piersi do mózgu.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne dynamiki niedotlenienia guza w przerzutach raka piersi do mózgu w modelu mysim

Tutaj opisujemy metodologię przeprowadzania ukierunkowanego badania przesiewowego "ubikwitom" siRNA w celu zidentyfikowania nowych regulatorów ubikwityny i podobnych do ubikwityny odpowiedzi komórkowej na niedotlenienie, w której pośredniczy HIF1A. Można to dostosować do dowolnej ścieżki biologicznej, gdzie dostępny jest solidny odczyt aktywności reporterowej.

Badania przesiewowe siRNA w celu identyfikacji ubikwityny i regulatorów systemów podobnych do ubikwityny szlaków biologicznych w hodowanych komórkach ssaków

Ten artykuł opisuje metodologię podawania krótkich okresów przerywanego niedotlenienia młodym myszom lub szczurom w dniach 1-8 po urodzeniu. Takie podejście skutecznie wywołuje silny "efekt primingu" na poziomie tkankowym na hodowanych nerwowych komórkach progenitorowych, które są zbierane w ciągu 30 minut od ekspozycji na hipoksję.

Dostarczanie in vivo ostrej przerywanej hipoksji u noworodków gryzoni do głównych kultur neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących ze strefy podkomorowej

Ten manuskrypt przedstawia unikalny model in vitro immunooczyszczanych ludzkich komórek cytopifoblastu kosmkowego hodowanych w warunkach hipoksji/reoksygenacji. Model ten jest odpowiedni do badania ochronnego wpływu obiecujących metod leczenia, takich jak melatonina, na powikłania ciąży związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i zmienioną funkcją łożyska.

Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją

Ten manuskrypt opisuje rozwój modelu zwierzęcego, który pozwala na bezpośrednie testowanie wpływu niedotlenienia guza na przerzuty i rozszyfrowywanie mechanizmów jego działania. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na mięsaku Ewinga, podobne podejście można zastosować do innych typów nowotworów.

In vivo (in vivo) Model do badania wpływu hipoksji na przerzuty nowotworu

Wprowadzamy nowatorski system komór hipoksyjnych do użytku z organizmami wodnymi, takimi jak zarodki żab i danio pręgowanych. Nasz system jest prosty, solidny, ekonomiczny i umożliwia indukcję i utrzymanie hipoksji in vivo i do 48 godzin. Przedstawiamy 2 powtarzalne metody monitorowania skuteczności hipoksji.

Indukcja niedotlenienia w żywych zarodkach żab i danio pręgowanego

Tutaj opisujemy protokół koimmunoprecypitacji do badania interakcji białko-białko między endogennymi białkami jądrowymi w warunkach niedotlenienia. Metoda ta jest odpowiednia do wykazania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a współregulatorami transkrypcji w warunkach niedotlenienia.

Test koimmunoprecypitacji z wykorzystaniem endogennych białek jądrowych z komórek hodowanych w warunkach niedotlenienia

Dystans przestrzenny jest kluczowym parametrem w ocenie uszkodzenia spowodowanego niedotlenieniem/reoksygenacją w modelu kokulturowym oddzielnych warstw komórek śródbłonka i kardiomiocytów, sugerując po raz pierwszy, że optymalizacja środowiska przestrzennego wspólnej hodowli jest konieczna, aby zapewnić korzystny model in vitro do testowania roli komórek śródbłonka w ochronie kardiomiocytów.

Opracowanie modelu kohodowli komórek w celu naśladowania niedokrwienia/reperfuzji serca in vitro

Wprowadzamy nowatorskie urządzenie do pomiaru wskaźników zużycia tlenu (OCR) w hodowlach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Urządzenie może mierzyć OCR przez wiele tygodni na RPE hodowanym na standardowych płytkach do hodowli komórkowych ze standardowymi pożywkami, podczas gdy płytki znajdują się w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.

Długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki

Tutaj opisujemy protokół in vitro modelujący niedotlenienie/uszkodzenia reoxygenacji w wysokometabolicznych komórkach nabłonka rurkowo-rurkowego. Model ten został zaprojektowany tak, aby wywołać uszkodzenia wywołane stresem metabolicznym, które można zmierzyć poprzez ekspresję markerów uszkodzenia kanałów bliższych oraz ocenę funkcji oddechowej mitochondriów.

Modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego

Poznaj metody indukcji hipoksji w hodowli komórkowej przy użyciu chlorku kobaltu i analizy ekspresji HIF-1 alpha. Techniki western blot i bioluminescencji umożliwiają precyzyjną ocenę odpowiedzi komórkowej na niedotlenienie.

Indukcja i badanie hipoksji w hodowlach komórkowych

Przeglądaj więcej filmów