Modelowanie neuronalnej sygnalizacji immunologicznej epizodycznej i przewlekłej migreny za pomocą rozprzestrzeniającej się depresji in vitro

Celem tego filmu jest zilustrowanie, w jaki sposób kultury warstw hipokampa mogą być wykorzystane do rozszyfrowania neuronalnej sygnalizacji immunologicznej, która moduluje podatność na rozprzestrzenianie się depresji, najbardziej prawdopodobną przyczynę aury migrenowej i być może migrenowego bólu głowy. Rozprzestrzenianie się depresji jest łatwo wywoływane w kulturach warstwowych hipokampa. Ponieważ hodowle są utrzymywane in vitro przez tygodnie, zachowanie poszczególnych typów komórek może być mierzone, naśladowane i modulowane przez dłuższy czas.

Jest to szczególnie ważne w przypadku badania neuronalnej sygnalizacji immunologicznej. Ponieważ dojrzałe wycinki mózgu hipokampa osiągają stan spoczynku immunologicznego, odpowiedzi immunologiczne na rozprzestrzenianie się depresji można ocenić bez potencjalnie mylących skutków znieczulenia przy użyciu nowoczesnych technik biologii molekularnej. Czułe wykrywanie cytokin sygnalizujących od zaledwie 50 komórek do około 90 000 komórek w wycinku może być odpowiednio określone.

Hodowle warstw mózgu w hipokampie idealnie nadają się do wykorzystania w opracowywaniu nowych neuronalnych terapii immunologicznych w celu złagodzenia migreny. Nazywam się Yian Berg, a to Aya Puss i Heidi Mitchell z laboratorium Richarda Craiga i Wydziału Neurologii w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Chicago. Dzisiaj zademonstrujemy zastosowanie hipokampa szczura,, kultur i badanie niskiego poziomu sygnalizacji immunologicznej rozprzestrzeniającej się depresji.

Rozprzestrzeniająca się depresja to napadowe zdarzenie neuronalne, które jest wywoływane przez wybuch zwiększonej aktywności synaptycznej, po którym szybko następuje przejściowa utrata całej aktywności. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że sygnalizacja immunologiczna na niskim poziomie może wpływać na aktywność synaptyczną w mózgu, a w zamian na nią wpływać. Stawiamy hipotezę, że cytokiny modulują podatność na rozprzestrzenianie się depresji, a w efekcie aurę migrenową, a być może także migrenowy ból głowy.

Procedury, które tutaj opisujemy, mają na celu zminimalizowanie potencjalnie zakłócającej aktywacji komórek odpornościowych i zwiększenie naszej zdolności do wykrywania niskiego poziomu sygnalizacji immunologicznej. To pozwala nam wykryć najszerszy wachlarz neuronalnej sygnalizacji immunologicznej i jej interakcji z rozprzestrzeniającą się depresją. Aby rozpocząć tę procedurę, wykonaj elektrody uziemiające, przycinając szklane rurki do długości 4,5 milimetra.

Następnie krótko wypoleruj wycięte sekcje na obu końcach. Następnie doprowadź 100 mililitrów jednego molowego chlorku potasu do wrzenia, dodaj do niego 3,5 grama agaru i 0,5 grama EDTA. Mieszać mieszaninę w sposób ciągły, aby uzyskać klarowny żółty roztwór.

Załóż kawałek krótkiej, elastycznej rurki na każdą szklaną rurkę. Następnie wciągnij ciepły roztwór chlorku potasu agri do szklanej rurki i na niewielką odległość do elastycznej rurki. Zwolnij ssanie i pozwól, aby agar z chlorkiem potasu powoli kapał z otwartej końcówki szklanej probówki.

Gdy agar kapie, dotknij kawałka lodu końcówką otwartej szklanej probówki, co spowoduje, że agar zżeluje się na końcówce elektrody, a nie żeluje po cofnięciu się z powrotem do szklanej probówki. Gdy agar zostanie zgalaretowany, delikatnie wyjmij elastyczną rurkę, nie zmieniając pozycji agry. W szklanych probówkach umieść 0,5 mililitra jednego molowego chlorku potasu do każdej studzienki 1,5-mililitrowego stojaka na probówki wirówkowe.

Następnie umieść końcówkę każdej szklanej probówki z chlorkiem potasu w osobnych studzienkach, aby końcówki były wilgotne. Następnie przytrzymaj srebrny drut o długości 80 centymetrów i grubości 15 z hemostatem. Wyczyść każdą z czterech stron, zeskrobując drut przez szmerglową deskę przytwierdzoną do blatu.

Następnie pokrój drut na długości czterech centymetrów. Umieść je w fiolce scyntylacyjnej wypełnionej wybielaczem na 20 do 30 minut. W celu nałożenia mocnej powłoki srebrno-chlorkowej na oczyszczoną srebrną powierzchnię, zegnij drut na pół i włóż go do szklanej rurki wypełnionej agarem z chlorkiem potasu, pozostawiając odsłonięte około czterech do sześciu milimetrów.

Następnie pokryj szklaną końcówkę rurki zawierającą srebrny drut i niewielką część drutu mazią, wodoodpornym i elastycznym klejem, aby zapobiec wysychaniu agaru z chlorkiem potasu, powtórz dla wszystkich elektrod i pozostaw klej do wyschnięcia na noc. Po pobraniu należy przechowywać elektrody w fiolkach scyntylacyjnych z pięcioma mililitrami jednego molowego chlorku potasu i 25 miligramami EDTA. Około pięciu do sześciu elektrod na fiolkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wykonaj elektrody rejestrujące z rurkami ze szkła krzemianowego bo z żarnikami. Następnie wykonaj elektrodę stymulującą, przecinając około 20-centymetrową długość meridu platynowego pokrytego teflonem. Następnie zegnij długość na pół, zwiąż luźne końce w luźny kwadratowy węzeł, pozostawiając około dwóch centymetrów od węzła do końców drutu.

Zabezpiecz węzeł w uchwycie wiertła elektrycznego do puszek umieszczonego na stole, trzymając drugi koniec drutu hemostatem. Na krótko włącz i wyłącz wiertło, aż drut zostanie mocno skręcony. Aby przymocować skręcone druty z meridium platyny do przewodów ołowianych, najpierw przyklej drut skręcony z meridium platyny do blatu stołu i upuść kałużę stężonego kwasu solnego na jeden wolny koniec skręconego drutu.

Następnie umieść odizolowany koniec na przewodzie ołowianym przylegającym do skręconego końca drutu i podgrzej lutownicę z cienką końcówką, a następnie, aż dwa druty zostaną mocno przymocowane. Wsuń krótki odcinek rurki termokurczliwej na odsłonięte połączenie przewodu i obkurcz go za pomocą ognia cieplnego. Wypoleruj końcówkę pipety o długości 15 centymetrów i poprowadź skręcony drut z meridianem platynowym w dół pipety.

Użyj wodoodpornej żywicy epoksydowej, aby uszczelnić oba końce elektrody. Na koniec podłącz wtyki bananowe do końców przewodów w celu podłączenia do izolatora bodźca pod obserwacją stereoskopową. Umieść końcówkę elektrody w PBS i poszukaj pęcherzyków wytwarzanych przez elektrolit pochodzących tylko z odciętego końca końcówek elektrod, jeśli jakiekolwiek pęcherzyki pochodzą z boków skręconych drutów.

Przetnij elektrodę poprzecznie za pomocą żyletki o pojedynczej krawędzi, aby przywrócić nienaruszoną izolację na długich osiach przewodów. Podczas rozwiązywania problemów w celu rozwiązania nieprawidłowych efektów bodźców, spróbuj zrobić świeżo odciętą końcówkę elektrody. Kolejnym ważnym krokiem jest przygotowanie naczyń do nagrywania, które składają się z wkładki do hodowli plastrów i 35-milimetrowej czaszy hodowlanej, która znajduje się na dwóch szklanych prętach o wymiarach 1,0 x 12 milimetrów oddalonych od siebie o około 1,0 centymetra.

Szklane pręty mocuje się do podstawy naczynia poprzez podgrzanie szklanych rurek, a następnie wciśnięcie ich w podstawę za pomocą kleszczy. W przypadku warunków nagrywania statycznego dodaj 1,5 mililitra nośnika do naczynia. Następnie namocz kawałek sterylnej bawełny o szerokości 10 milimetrów i długości od trzech do czterech centymetrów.

W 1,0 mililitra podłoża złóż bawełnę na pół wzdłuż długiej osi i umieść ją wzdłuż wewnętrznej ścianki na wkładce. Dzięki sterylnym kleszczom mokra bawełna pomaga utrzymać wilgotność naczynia. Trzy ściśliwe kawałki rurki o długości czterech milimetrów są równomiernie rozmieszczone wokół wkładki.

Przykryj naczynie szczelnie folią z polichlorku winylu, aby umożliwić wymianę gazową. Następnie przetnij jego środkową pionową ścianę żyletką z pojedynczą krawędzią, aby usunąć nadmiar polichlorku winylu. Film wywołuje około trzech potencjałów polowych z impulsami 100 mikrosekund przy 0,2 herca, zaczynając od prądu o natężeniu około jednego do pięciu mikroamperów, który jest wystarczający do wywołania odpowiedzi.

Przesuwaj elektrodę rejestrującą stopniowo wzdłuż długiej osi neuronu parametalowego, aż potencjał pola osiągnie maksimum. Następnie zwiększ prąd za pomocą elektrody rejestrującej w tej pozycji i zwróć uwagę na maksymalną odpowiedź prądową około 10 do 20 mikroamperów. Na koniec użyj połowy maksymalnej intensywności bodźca do eksperymentów, aby określić próg rozprzestrzeniania się depresji wywołanej przez trans synaptycznie.

Zmień paradygmat stymulacji, aby ręcznie wywoływać pojedyncze impulsy po 100 mikrosekund na impuls przy 10 hercach. Stopniowo zwiększaj intensywność prądu na wybuch bodźca, aż do wyzwolenia rozprzestrzeniającej się depresji. Zgłaszanie progu rozprzestrzeniania się depresji w lumach powoduje rozprzestrzenianie się depresji co dziewięć minut przez godzinę.

Rejestruj około trzech obszarów szybkich zmian potencjału i wolnych zmian potencjału za pomocą oddzielnych cyfrowych systemów przetwarzania sygnałów. Po ostatnim rozprzestrzeniającym się zagłębieniu przywrócić wkładkę hodowlaną do normalnych warunków inkubacji i oznaczyć pokrywę naczynia hodowlanego. Aby zwrócić uwagę na kulturę, która doświadczyła rozprzestrzeniania się depresji, zmieniaj pożywkę co trzy do czterech dni, aż do zbiorów kultury.

Rozpocznij tę procedurę od rozcieńczenia selektyny ISO do 20 mikrogramów na mililitr w pożywce wzrostowej. Następnie inkubuj kultury plastrów w normalnych warunkach inkubacji, cztery do 10 godzin przed obrazowaniem, włącz kamerę mikroskopu, kontrolę temperatury światła UV i gazy co najmniej godzinę przed obrazowaniem. Następnie skonfiguruj oprogramowanie metamorficzne do obrazowania, a następnie umieść wkładkę w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym z dwoma jednomilimetrowymi szklanymi prętami na dnie.

Następnie zamontuj trzy dwumilimetrowe kawałki gumowej rurki między ściankami wkładu a naczyniem hodowlanym. Aby jeszcze bardziej ustabilizować wkładkę, należy umieścić wewnątrz wkładu kawałek bawełny o szerokości 10 milimetrów nasączony dodatkowym mililitrem nośnika. Aby utrzymać wilgotne środowisko, przykryj szczelnie górną część naczynia hodowlanego folią z polichlorku winylu.

Aby zapobiec utracie płynu, upewnij się, że ognisko obrazowania znajduje się na warstwie trzech ogniw parametalicznych CA. Zwróć uwagę na orientację plasterków, wykonując zdjęcia fazowe z prędkością pięciu x 10 x i 20 x w oknie precyzyjnej ostrości, ustaw zakres prądu na osiem i dokładność na jedno kliknięcie, znajdź ostrość, aby zapewnić ostry obraz w oknie poklatkowym akwizycji. Wybierz przedział czasu na jedną minutę i czas trwania na sześć godzin, aby dokładnie uchwycić ruchy mikrogleju.

Obrazowanie powinno odbywać się nie rzadziej niż raz na minutę pod koniec filmu. Sprawdź, czy komórki nie są uszkodzone za pomocą badań przesiewowych CY talk pod kątem eksperymentów PCR. Zanurz wkładki kultur plastrowych w dwóch do trzech mililitrach RNA później i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do trzech dni do czasu dalszego przetwarzania.

Aby zebrać, usuń obcą tkankę za pomocą szklanego noża, włóż plastry do pojedynczych RNA. Wolne od DNA 1,5-mililitrowe probówki wirówkowe zawierające 0,5 mililitra sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Za pomocą pędzla z cienką końcówką obracaj próbki, 10 000 obr./min przez jedną minutę w stereotypowy sposób, tak aby wszystkie plastry przylegały do tej samej strony swoich tubek.

Usunąć supernatant PBS i ponownie zawiesić próbkę w 500 mikrolitrach triolu. Przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub trzymaj na lodzie do czasu ekstrakcji RNA Zmiany ekspresji białek spowodowane knockdownem SI RNA można z czułością ocenić poprzez wzmocnienie tradycyjnego barwienia immunologicznego DAB poprzez intensyfikację srebra, a następnie kwantyfikację metryki gęstości. Pokazany jest tutaj paradygmat zapisu elektrofizjologicznego kultury kromkowej, w którym mikroelektroda rejestrująca jest umieszczana w warstwie neuronu parametalicznego CA, a bipolarna elektroda stymulująca jest umieszczana w zakręcie zębatym.

Oto przykład wywołanych potencjałów pola CA trzech przez stymulację zakrętu zębatego, który służy do ustalenia odpowiedzi półmaksymalnej, tutaj pokazuje odpowiedzi potencjału trzech pól CA na pozostałe 10 herców, które były stopniowo zwiększane w intensywności, aby ostatecznie wywołać rozprzestrzeniającą się depresję. W prawym dolnym rogu. Pokazana tutaj jest przykładowa życiodajna komórka odpornościowa.

Obrazowanie to pokazuje po raz pierwszy, że część mikrogleju przemieszcza się na duże odległości w optymalnym wzorcu wyszukiwania, jak pokazano na czerwono, znanym jako loty opłatowe, które są odwrotnie proporcjonalne do aktywności synaptycznej. Preemyfikacja CDNA umożliwia wykrycie IFN gamma w kulturach warstwowych hipokampa. Początkowo tomografia komputerowa dla genu referencyjnego RPL 13 A wynosiła 20,5, a gamma IFN była niewykrywalna po lewej stronie.

Jednak po wzmocnieniu Preem wskazanym po prawej, gamma IFN została łatwo wykryta na poziomie 29,0. Z RPL 13 A rejestrującym się na poziomie 14,1, co wskazuje na 12-krotny wzrost wzmocnienia sygnału, immunohistochemiczne potwierdzenie wydajności jest pokazane tutaj. Zróżnicowane nasilenie srebra w barwieniu immunologicznym peroksydazy, diaminy, benzyny służy do ilościowego określenia znacznego zmniejszenia produkcji cyklofiliny B w kulturach plastrów hipokampa traktowanych siRNA.

Techniki przedstawione w tym filmie można wykonywać przez kilka dni. Pragniemy podkreślić, że nasze kultury warstw hipokampa są bardzo zbliżone do ich odpowiedników in vivo i są idealne do badania sygnalizacji immunologicznej i rozprzestrzeniania depresji. Jednak ważne jest, aby utrzymać spokojne środowisko immunologiczne pod kontrolą i w warunkach pozorowanych.

Aby zminimalizować zakłócającą aktywację immunologiczną, kultury muszą być utrzymywane w sterylnych warunkach. Nie powinny być narażone na nadmierne zakłócenia chemiczne, mechaniczne lub termiczne. Ponieważ fizjologiczna sygnalizacja cytokin zachodzi na poziomie femtomolowym, należy zastosować bardzo czułe i powtarzalne techniki pomiarowe.

Wykorzystujemy technologię PCRA oraz czułe techniki proteomiczne. Wreszcie, cytokiny są zarówno plejotropowe, jak i zbędne. Odpowiednio. Cele cytokin multipleksowych mierzone w czasie są przydatne do badania, w jaki sposób sygnalizacja immunologiczna moduluje podatność na skręcenie, depresję, a co za tym idzie, migrenę.