Name: Modelowanie neuronalnej sygnalizacji immunologicznej epizodycznej i przewlekłej migreny za pomocą rozprzestrzeniającej się depresji in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 13 s
Description: Poznaj metodę badania sygnalizacji immunologicznej w układzie nerwowym z wykorzystaniem hodowli wycinków hipokampu szczura. Technika ta pozwala modelować rozprzestrzeniającą się depresję i analizować jej związek z migreną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS-19108), National Institute of Child Health and Disease (PO1-HD09402), Migraine Research Foundation i White Foundation. Pani Marcia P. Kraig pomagała w przygotowaniu i utrzymaniu systemów hodowli.

Kilka punktów jest warto podkreślić dla pomyślnego badania sygnałowania związanego z odpornością w przekrojach mózgu. Po pierwsze, bodźce inicjujące muszą synchronicznie depolaryzować wystarczającą objętość szarej substancji mózgu, aby rozpocząć SD. Oznacza to, że wymagana jest konfiguracja interfejsu (tj. tylko płyn ekspozycji poniżej i gazowy wymiana na powierzchni wkładu kultury przekroju) 1,2. Po drugie, ostre przekroje mózgu utrzymują SD, ale trauma z ich przygotowania, jak również stosowanie 95% tlenowej aerowany roztwór Ringera powoduje zmiany prozapalne i zachowanie epileptyczne odpowiednio, co może zmienić funkcję obwodu neuronowego i homeostazę odpornościową.3 Po trzecie, podczas gdy kultury przekrojów hipokampu przezwyciężają te ostre ograniczenia przekrojów, ważne jest, aby pamiętać, że kultury przekrojów powinny być utrzymywane przez odpowiednie okresy przed użyciem (tj. więcej niż 10 dni in vitro) aby mikroglea i astrocyty stały się spoczynkowe.3-5 Wreszcie, SD powinno być indukowane przy użyciu sterylnych i aseptycznych technik. Techniki opisane poniżej są zaprojektowane, aby spełnić to zapotrzebowanie.
1. Depresja rozprzestrzeniająca się w kulturach przekrojów
<ol>
 <li>Przygotowanie i utrzymanie kultury.
 <ol>
 <li>Kultury przekrojów są przygotowywane i utrzymywane w pożywce opartej na surowicy koniowej lub w pożywce bez surowicy (SFM)6,7 jak opisano wcześniej8 z niewielkimi modyfikacjami pożywki. Parametry inkubacji to 36°C, 5% CO2, 95% wilgotność-równowaga powietrza.
 <ol>
 <li>Znalazłem, że kultury mogą być przełączone na SFM po 18 dniach in vitro i utrzymywane do co najmniej 35 dni in vitro poprzez zastosowanie naszej wcześniej zdefiniowanej SFM, która zawiera dodatkowe wapń i magnez.</li>
 <li>Dodatkowo, antybiotyki i przeciwgrzybicy są dodawane, aby zapobiec zakażeniom związanym z wielokrotnymi epizodami rejestracji.</li>
 <li>Ta długoterminowa (lub rejestrująca) formuła pożywki zawiera (na 100 ml): pożywka Neurobosal, 97 ml; Gem-21, 2,0 ml; Glutamax (200 mM), 0,5 ml; Gentamycin (10 mg/mL), 10 μL; D-glukoza (45%), 680 μL; kwas askorbinowy (0,5 M), 100 μL; Fungizone, (250 mg/mL), 400 μL; NaCl (5,0 M), 820 μL, Mg2Cl2 (1,0 M), 80 μL; CaCl2 (1,0 M), 160-240 μL. </li>
 <li>Kultury są używane do SD od 21-35 dni in vitro.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Weryfikacja żywotności.3,6,7
 <ol>
 <li>Kultury są przesiewane na obecność wskaźników śmierci neuronów piramidalnych przed użyciem.
 <ol>
 <li>W 18 dniu in vitro wkłady są inkubowane przez 20 min w pożywce (w normalnych warunkach inkubacji) zawierającej 5 μM Sytox Green, marker, który staje się fluorescencyjny, gdy wiąże się z DNA (tj. penetrując do martwych komórek).</li>
 <li>Wkłady są następnie przeniesione z powrotem do poprzedniej pożywki i badane metodą mikroskopu fluorescencyjnego (504 ekscytacja i 523 emisja) pod kątem wskaźników uszkodzenia warstwy neuronów piramidalnych CA3 lub CA1.
 <ol>
 <li>Przekrojów z więcej niż 20 komórek lub z ustaloną poziomem fluorescencji większym niż 250 IU wykluczono z dalszego użycia.</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wytwarzanie materiałów.
 <ol>
 <li>Elektrody gruntowe są wykonywane z rur szklanych (2,0 mm OD / 1,16 mm ID) przeciętych na długość 4,5 mm i krótko polerowanych ogniskowo na obu końcach.
 <ol>
 <li>Wykonujemy około 20 elektrod na raz, które mogą trwać ponad rok.</li>
 <li>Zaparzamy 100 ml 1M KCl do wrzenia i dodajemy z mieszaniem 3,5 g agaru i 0,5 g EDTA (etionodiaminatetraoctowa kwas disodowy dihydrat) aby uzyskać klarowny żółty roztwór.</li>
 <li>Używamy krótkiego odcinka elastycznego wężyka zamocowanego na każdej szklanej rurze, aby wciągnąć ciepły roztwór KCl/agar do rurek szklanych, a także na krótki odcinek do elastycznego wężyka.
 <ol>
 <li>Zwolnić ssanie i pozwolić, aby KCl/agar powoli kapał z otwartego końca rury szklanej; następnie przytrzymaj otwarty koniec rury szklanej o kawałku lodu.</li>
 <li>Ostatnia operacja spowoduje, że agar żeluje na końcu elektrody i nie żeluje po cofnięciu się z powrotem do rury szklanej.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Gdy agar żeluje w zimnej wodzie, elastyczny wężyk można usunąć bez zmiany pozycji agaru umieszczonego w rurach szklanych. </li>
 <li>Umieść 0,5 ml 1 M KCl do każdej komórki rurkowego stolika do wirówek o pojemności 1,5 ml. Następnie umieść jeden koniec każdej wypełnionej KCl/agar rury szklanej w pojedynczych komórkach. </li>
 <li>

<ol><li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18 (9), 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25 (15), 3952-3961 (2005).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-%CE%B1lpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha.</a> J Neurosci. 28 (47), 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18 (4), 319-331 (1996).</li>
<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Mitchell, H. M., White, D. M., Domowicz, M. S., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+pre-conditioning+neuroprotection+depends+on+TNF-%CE%B1lpha+and+is+enhanced+by+blockade+of+interleukin-11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem+DOI%22%5BJournal%5D)">Cold pre-conditioning neuroprotection depends on TNF-αlpha and is enhanced by blockade of interleukin-11.</a> J Neurochem DOI. , (2010).</li>
<li>Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+study+of+neuroprotection+from+cold-preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17 (1), 26-43 (1997).</li>
<li>Grinberg, Y. Y., Milton, J. G., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+depression+sends+microglia+on+L%C3%A9vy+flights%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spreading depression sends microglia on Lévy flights.</a> PLoS ONE. 6 (4), (2011).</li>
<li>Koroleva, V. I., Oitzl, M. S., Bures, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+of+synaptically+elicited+cortical+spreading+depression%3A+drug-induced+changes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Threshold of synaptically elicited cortical spreading depression: drug-induced changes in rats.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 60 (1), 55-64 (1985).</li>
<li>Gubern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+housekeeping+genes+for+quantitative+real-time+PCR+in+in-vivo+and+in-vitro+models+of+cerebral+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR in in-vivo and in-vitro models of cerebral ischaemia.</a> BMC Mol Biol. 10, 57-57 (2009).</li>
<li>Tian, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantification+of+ADAMTS+expression+in+an+animal+model+of+cerebral+ischemia+using+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anaesthesiol+Scand%22%5BJournal%5D)">The quantification of ADAMTS expression in an animal model of cerebral ischemia using real-time PCR.</a> Acta Anaesthesiol Scand. 51 (2), 158-164 (2007).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (9), e45-e45 (2001).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Pusic, A. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+gene+micro+array+profiling+demonstrates+%22T-cell-like%22+activation+after+recurrent+spreading+depression+-+implications+for+migraine+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+abst%22%5BJournal%5D)">Inflammatory gene micro array profiling demonstrates "T-cell-like" activation after recurrent spreading depression - implications for migraine pathogenesis.</a> Soc Neurosci abst. , (2010).</li>
<li>Quinn, B., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiated+silver+intensification+procedure+for+the+peroxidase-diaminobenzidine+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A differentiated silver intensification procedure for the peroxidase-diaminobenzidine reaction.</a> J Histochem Cytochem. 44 (1), 71-74 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369 (1), 93-108 (1996).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

SD to napadowe zaburzenie mózgu, którego cechy są wysoce konserwatywne u wszystkich gatunków i regionów mózgu zbadanych do tej pory. SD jest powszechnie badane w korze nowej. Jednak złożoność obwodów neuronalnych tej struktury (w porównaniu z hipokampem), a także niezdolność do utrzymania kory nowej przy życiu in vitro ze spoczynkowymi funkcjami immunologicznymi przez dłuższy czas, sprawiają, że jest ona mniej przydatna jako preparat in vitro do definiowania długoterminowych konsekwencji podatności na SD. W przeciwieństwie do tego, hipokamp jest nie tylko strukturą mózgu, która jest najbardziej wrażliwa na SD, jest to również struktura architektoniczna o bardziej uproszczonej strukturze i funkcji obwodu nerwowego, która dobrze nadaje się do zdefiniowania środków neuroimmunologicznych, za pomocą których aktywność neuronalna może modulować podatność na SD.

modelowanie neuronalnej sygnalizacji immunologicznej epizodycznej i przewlekłej migreny za pomocą rozprzestrzeniającej się depresji in vitro

Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro

Migrena i jej przemiana w przewlekłą migrenę to obciążenia zdrowotne, które wymagają poprawy metod leczenia. Staramy się określić, w jaki sposób neuronalna sygnalizacja immunologiczna moduluje podatność na migrenę, modelowaną in vitro przy użyciu rozprzestrzeniającej się depresji (SD), jako sposób na opracowanie nowych celów terapeutycznych dla epizodycznej i przewlekłej migreny. SD jest prawdopodobną przyczyną aury migrenowej i bólu migrenowego. Jest to napadowa utrata funkcji neuronalnych wywołana początkowo zwiększoną aktywnością neuronalną, która powoli rozprzestrzenia się w podatnych obszarach mózgu. Normalne funkcjonowanie mózgu jest niezwykle wrażliwe na zbieżną sygnalizację immunologiczną niskiego poziomu i opiera się na niej. Tak więc neuronalna sygnalizacja immunologiczna prawdopodobnie wpływa na aktywność elektryczną SD, a tym samym na migrenę. Badania percepcji bólu SD u całych zwierząt są najeżone trudnościami, ale całe zwierzęta są dobrze przystosowane do badania aspektów biologii systemowej migreny, ponieważ SD aktywuje trójdzielne szlaki nocyceptywne. Jednak same badania na całych zwierzętach nie mogą być wykorzystane do rozszyfrowania mechanizmów obwodów komórkowych i nerwowych SD. Zamiast tego konieczne są preparaty in vitro, w których można kontrolować warunki środowiskowe. W tym miejscu ważne jest, aby zdać sobie sprawę z ograniczeń ostrych plastrów i wyraźnych zalet kultur plastrów hipokampa. Ostre wycinki mózgu nie mogą ujawnić subtelnych zmian w sygnalizacji immunologicznej, ponieważ samo przygotowanie wycinków wyzwala: zmiany prozapalne, które trwają kilka dni, zachowanie padaczkowe spowodowane wysokim poziomem ciśnienia tlenu potrzebnego do ożywienia wycinków i nieodwracalne uszkodzenie komórek w beztlenowych środkach plasterków. 
Natomiast badamy sygnalizację immunologiczną w dojrzałych kulturach wycinków hipokampa, ponieważ kultury te są ściśle równoległe do swoich odpowiedników in vivo z dojrzałą funkcją trisynaptyczną; wykazują poziomy astrocytów w stanie spoczynku, mikrogleju i cytokin; a SD jest łatwo indukowane w preparacie nieznieczulonym. Co więcej, plastry są długotrwałe, a SD może być indukowane przez kolejne dni bez urazów, co czyni ten preparat jedynym jak dotąd środkiem zdolnym do modelowania neuroimmunologicznych konsekwencji przewlekłej SD, a tym samym być może przewlekłej migreny. Używamy technik elektrofizjologicznych i nieinwazyjnego obrazowania do pomiaru funkcji komórek neuronalnych i obwodów zbieżnych z SD. Zmienne ekspresji genów odporności neuronalnej są mierzone za pomocą badań przesiewowych qPCR, matryc qPCR i, co ważne, stosowania preamplifikacji cDNA do wykrywania celów o bardzo niskim poziomie, takich jak interferon gamma, przy użyciu próbkowania całych, regionalnych lub specyficznych komórek (za pomocą mikroskopii laserowej). Sygnalizacja kaskadowa cytokin jest dalej oceniana za pomocą multipleksowanych celów związanych z fosfoproteinami z ekspresją genów i zmianami fosfoproteinowymi potwierdzonymi za pomocą barwienia immunologicznego specyficznego dla komórki. Strategie farmakologiczne i siRNA są stosowane do naśladowania i modulowania sygnalizacji immunologicznej SD.

Migrena i jej przemiana w przewlekłą migrenę to ogromne obciążenie zdrowotne, które wymaga poprawy metod leczenia. Staramy się określić, w jaki sposób neuronalna sygnalizacja immunologiczna moduluje podatność na migrenę, modelując in vitro przy użyciu rozprzestrzeniającej się depresji w kulturach warstw hipokampa, jako sposób na opracowanie nowych celów terapeutycznych.

Modelowanie neuronalnej sygnalizacji immunologicznej epizodycznej i przewlekłej migreny za pomocą rozprzestrzeniającej się depresji in vitro

Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options.  We seek to define how neural immune ...

Celem tego filmu jest zilustrowanie, w jaki sposób kultury warstw hipokampa mogą być wykorzystane do rozszyfrowania neuronalnej sygnalizacji immunologicznej, która moduluje podatność na rozprzestrzenianie się depresji, najbardziej prawdopodobną przyczynę aury migrenowej i być może migrenowego bólu głowy. Rozprzestrzenianie się depresji jest łatwo wywoływane w kulturach warstwowych hipokampa. Ponieważ hodowle są utrzymywane in vitro przez tygodnie, zachowanie poszczególnych typów komórek może być mierzone, naśladowane i modulowane przez dłuższy czas.Jest to szczególnie ważne w przypadku badania neuronalnej sygnalizacji immunologicznej. Ponieważ dojrzałe wycinki mózgu hipokampa osiągają stan spoczynku immunologicznego, odpowiedzi immunologiczne na rozprzestrzenianie się depresji można ocenić bez potencjalnie mylących skutków znieczulenia przy użyciu nowoczesnych technik biologii molekularnej. Czułe wykrywanie cytokin sygnalizujących od zaledwie 50 komórek do około 90 000 komórek w wycinku może być odpowiednio określone.Hodowle warstw mózgu w hipokampie idealnie nadają się do wykorzystania w opracowywaniu nowych neuronalnych terapii immunologicznych w celu złagodzenia migreny. Nazywam się Yian Berg, a to Aya Puss i Heidi Mitchell z laboratorium Richarda Craiga i Wydziału Neurologii w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Chicago. Dzisiaj zademonstrujemy zastosowanie hipokampa szczura,, kultur i badanie niskiego poziomu sygnalizacji immunologicznej rozprzestrzeniającej się depresji.Rozprzestrzeniająca się depresja to napadowe zdarzenie neuronalne, które jest wywoływane przez wybuch zwiększonej aktywności synaptycznej, po którym szybko następuje przejściowa utrata całej aktywności. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że sygnalizacja immunologiczna na niskim poziomie może wpływać na aktywność synaptyczną w mózgu, a w zamian na nią wpływać. Stawiamy hipotezę, że cytokiny modulują podatność na rozprzestrzenianie się depresji, a w efekcie aurę migrenową, a być może także migrenowy ból głowy.Procedury, które tutaj opisujemy, mają na celu zminimalizowanie potencjalnie zakłócającej aktywacji komórek odpornościowych i zwiększenie naszej zdolności do wykrywania niskiego poziomu sygnalizacji immunologicznej. To pozwala nam wykryć najszerszy wachlarz neuronalnej sygnalizacji immunologicznej i jej interakcji z rozprzestrzeniającą się depresją. Aby rozpocząć tę procedurę, wykonaj elektrody uziemiające, przycinając szklane rurki do długości 4,5 milimetra.Następnie krótko wypoleruj wycięte sekcje na obu końcach. Następnie doprowadź 100 mililitrów jednego molowego chlorku potasu do wrzenia, dodaj do niego 3,5 grama agaru i 0,5 grama EDTA. Mieszać mieszaninę w sposób ciągły, aby uzyskać klarowny żółty roztwór.Załóż kawałek krótkiej, elastycznej rurki na każdą szklaną rurkę. Następnie wciągnij ciepły roztwór chlorku potasu agri do szklanej rurki i na niewielką odległość do elastycznej rurki. Zwolnij ssanie i pozwól, aby agar z chlorkiem potasu powoli kapał z otwartej końcówki szklanej probówki.Gdy agar kapie, dotknij kawałka lodu końcówką otwartej szklanej probówki, co spowoduje, że agar zżeluje się na końcówce elektrody, a nie żeluje po cofnięciu się z powrotem do szklanej probówki. Gdy agar zostanie zgalaretowany, delikatnie wyjmij elastyczną rurkę, nie zmieniając pozycji agry. W szklanych probówkach umieść 0,5 mililitra jednego molowego chlorku potasu do każdej studzienki 1,5-mililitrowego stojaka na probówki wirówkowe.Następnie umieść końcówkę każdej szklanej probówki z chlorkiem potasu w osobnych studzienkach, aby końcówki były wilgotne. Następnie przytrzymaj srebrny drut o długości 80 centymetrów i grubości 15 z hemostatem. Wyczyść każdą z czterech stron, zeskrobując drut przez szmerglową deskę przytwierdzoną do blatu.Następnie pokrój drut na długości czterech centymetrów. Umieść je w fiolce scyntylacyjnej wypełnionej wybielaczem na 20 do 30 minut. W celu nałożenia mocnej powłoki srebrno-chlorkowej na oczyszczoną srebrną powierzchnię, zegnij drut na pół i włóż go do szklanej rurki wypełnionej agarem z chlorkiem potasu, pozostawiając odsłonięte około czterech do sześciu milimetrów.Następnie pokryj szklaną końcówkę rurki zawierającą srebrny drut i niewielką część drutu mazią, wodoodpornym i elastycznym klejem, aby zapobiec wysychaniu agaru z chlorkiem potasu, powtórz dla wszystkich elektrod i pozostaw klej do wyschnięcia na noc. Po pobraniu należy przechowywać elektrody w fiolkach scyntylacyjnych z pięcioma mililitrami jednego molowego chlorku potasu i 25 miligramami EDTA. Około pięciu do sześciu elektrod na fiolkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wykonaj elektrody rejestrujące z rurkami ze szkła krzemianowego bo z żarnikami. Następnie wykonaj elektrodę stymulującą, przecinając około 20-centymetrową długość meridu platynowego pokrytego teflonem. Następnie zegnij długość na pół, zwiąż luźne końce w luźny kwadratowy węzeł, pozostawiając około dwóch centymetrów od węzła do końców drutu.Zabezpiecz węzeł w uchwycie wiertła elektrycznego do puszek umieszczonego na stole, trzymając drugi koniec drutu hemostatem. Na krótko włącz i wyłącz wiertło, aż drut zostanie mocno skręcony. Aby przymocować skręcone druty z meridium platyny do przewodów ołowianych, najpierw przyklej drut skręcony z meridium platyny do blatu stołu i upuść kałużę stężonego kwasu solnego na jeden wolny koniec skręconego drutu.Następnie umieść odizolowany koniec na przewodzie ołowianym przylegającym do skręconego końca drutu i podgrzej lutownicę z cienką końcówką, a następnie, aż dwa druty zostaną mocno przymocowane. Wsuń krótki odcinek rurki termokurczliwej na odsłonięte połączenie przewodu i obkurcz go za pomocą ognia cieplnego. Wypoleruj końcówkę pipety o długości 15 centymetrów i poprowadź skręcony drut z meridianem platynowym w dół pipety.Użyj wodoodpornej żywicy epoksydowej, aby uszczelnić oba końce elektrody. Na koniec podłącz wtyki bananowe do końców przewodów w celu podłączenia do izolatora bodźca pod obserwacją stereoskopową. Umieść końcówkę elektrody w PBS i poszukaj pęcherzyków wytwarzanych przez elektrolit pochodzących tylko z odciętego końca końcówek elektrod, jeśli jakiekolwiek pęcherzyki pochodzą z boków skręconych drutów.Przetnij elektrodę poprzecznie za pomocą żyletki o pojedynczej krawędzi, aby przywrócić nienaruszoną izolację na długich osiach przewodów. Podczas rozwiązywania problemów w celu rozwiązania nieprawidłowych efektów bodźców, spróbuj zrobić świeżo odciętą końcówkę elektrody. Kolejnym ważnym krokiem jest przygotowanie naczyń do nagrywania, które składają się z wkładki do hodowli plastrów i 35-milimetrowej czaszy hodowlanej, która znajduje się na dwóch szklanych prętach o wymiarach 1,0 x 12 milimetrów oddalonych od siebie o około 1,0 centymetra.Szklane pręty mocuje się do podstawy naczynia poprzez podgrzanie szklanych rurek, a następnie wciśnięcie ich w podstawę za pomocą kleszczy. W przypadku warunków nagrywania statycznego dodaj 1,5 mililitra nośnika do naczynia. Następnie namocz kawałek sterylnej bawełny o szerokości 10 milimetrów i długości od trzech do czterech centymetrów.W 1,0 mililitra podłoża złóż bawełnę na pół wzdłuż długiej osi i umieść ją wzdłuż wewnętrznej ścianki na wkładce. Dzięki sterylnym kleszczom mokra bawełna pomaga utrzymać wilgotność naczynia. Trzy ściśliwe kawałki rurki o długości czterech milimetrów są równomiernie rozmieszczone wokół wkładki.Przykryj naczynie szczelnie folią z polichlorku winylu, aby umożliwić wymianę gazową. Następnie przetnij jego środkową pionową ścianę żyletką z pojedynczą krawędzią, aby usunąć nadmiar polichlorku winylu. Film wywołuje około trzech potencjałów polowych z impulsami 100 mikrosekund przy 0,2 herca, zaczynając od prądu o natężeniu około jednego do pięciu mikroamperów, który jest wystarczający do wywołania odpowiedzi.Przesuwaj elektrodę rejestrującą stopniowo wzdłuż długiej osi neuronu parametalowego, aż potencjał pola osiągnie maksimum. Następnie zwiększ prąd za pomocą elektrody rejestrującej w tej pozycji i zwróć uwagę na maksymalną odpowiedź prądową około 10 do 20 mikroamperów. Na koniec użyj połowy maksymalnej intensywności bodźca do eksperymentów, aby określić próg rozprzestrzeniania się depresji wywołanej przez trans synaptycznie.Zmień paradygmat stymulacji, aby ręcznie wywoływać pojedyncze impulsy po 100 mikrosekund na impuls przy 10 hercach. Stopniowo zwiększaj intensywność prądu na wybuch bodźca, aż do wyzwolenia rozprzestrzeniającej się depresji. Zgłaszanie progu rozprzestrzeniania się depresji w lumach powoduje rozprzestrzenianie się depresji co dziewięć minut przez godzinę.Rejestruj około trzech obszarów szybkich zmian potencjału i wolnych zmian potencjału za pomocą oddzielnych cyfrowych systemów przetwarzania sygnałów. Po ostatnim rozprzestrzeniającym się zagłębieniu przywrócić wkładkę hodowlaną do normalnych warunków inkubacji i oznaczyć pokrywę naczynia hodowlanego. Aby zwrócić uwagę na kulturę, która doświadczyła rozprzestrzeniania się depresji, zmieniaj pożywkę co trzy do czterech dni, aż do zbiorów kultury.Rozpocznij tę procedurę od rozcieńczenia selektyny ISO do 20 mikrogramów na mililitr w pożywce wzrostowej. Następnie inkubuj kultury plastrów w normalnych warunkach inkubacji, cztery do 10 godzin przed obrazowaniem, włącz kamerę mikroskopu, kontrolę temperatury światła UV i gazy co najmniej godzinę przed obrazowaniem. Następnie skonfiguruj oprogramowanie metamorficzne do obrazowania, a następnie umieść wkładkę w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym z dwoma jednomilimetrowymi szklanymi prętami na dnie.Następnie zamontuj trzy dwumilimetrowe kawałki gumowej rurki między ściankami wkładu a naczyniem hodowlanym. Aby jeszcze bardziej ustabilizować wkładkę, należy umieścić wewnątrz wkładu kawałek bawełny o szerokości 10 milimetrów nasączony dodatkowym mililitrem nośnika. Aby utrzymać wilgotne środowisko, przykryj szczelnie górną część naczynia hodowlanego folią z polichlorku winylu.Aby zapobiec utracie płynu, upewnij się, że ognisko obrazowania znajduje się na warstwie trzech ogniw parametalicznych CA. Zwróć uwagę na orientację plasterków, wykonując zdjęcia fazowe z prędkością pięciu x 10 x i 20 x w oknie precyzyjnej ostrości, ustaw zakres prądu na osiem i dokładność na jedno kliknięcie, znajdź ostrość, aby zapewnić ostry obraz w oknie poklatkowym akwizycji. Wybierz przedział czasu na jedną minutę i czas trwania na sześć godzin, aby dokładnie uchwycić ruchy mikrogleju.Obrazowanie powinno odbywać się nie rzadziej niż raz na minutę pod koniec filmu. Sprawdź, czy komórki nie są uszkodzone za pomocą badań przesiewowych CY talk pod kątem eksperymentów PCR. Zanurz wkładki kultur plastrowych w dwóch do trzech mililitrach RNA później i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do trzech dni do czasu dalszego przetwarzania.Aby zebrać, usuń obcą tkankę za pomocą szklanego noża, włóż plastry do pojedynczych RNA. Wolne od DNA 1,5-mililitrowe probówki wirówkowe zawierające 0,5 mililitra sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Za pomocą pędzla z cienką końcówką obracaj próbki, 10 000 obr./min przez jedną minutę w stereotypowy sposób, tak aby wszystkie plastry przylegały do tej samej strony swoich tubek.Usunąć supernatant PBS i ponownie zawiesić próbkę w 500 mikrolitrach triolu. Przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub trzymaj na lodzie do czasu ekstrakcji RNA Zmiany ekspresji białek spowodowane knockdownem SI RNA można z czułością ocenić poprzez wzmocnienie tradycyjnego barwienia immunologicznego DAB poprzez intensyfikację srebra, a następnie kwantyfikację metryki gęstości. Pokazany jest tutaj paradygmat zapisu elektrofizjologicznego kultury kromkowej, w którym mikroelektroda rejestrująca jest umieszczana w warstwie neuronu parametalicznego CA, a bipolarna elektroda stymulująca jest umieszczana w zakręcie zębatym.Oto przykład wywołanych potencjałów pola CA trzech przez stymulację zakrętu zębatego, który służy do ustalenia odpowiedzi półmaksymalnej, tutaj pokazuje odpowiedzi potencjału trzech pól CA na pozostałe 10 herców, które były stopniowo zwiększane w intensywności, aby ostatecznie wywołać rozprzestrzeniającą się depresję. W prawym dolnym rogu. Pokazana tutaj jest przykładowa życiodajna komórka odpornościowa.Obrazowanie to pokazuje po raz pierwszy, że część mikrogleju przemieszcza się na duże odległości w optymalnym wzorcu wyszukiwania, jak pokazano na czerwono, znanym jako loty opłatowe, które są odwrotnie proporcjonalne do aktywności synaptycznej. Preemyfikacja CDNA umożliwia wykrycie IFN gamma w kulturach warstwowych hipokampa. Początkowo tomografia komputerowa dla genu referencyjnego RPL 13 A wynosiła 20,5, a gamma IFN była niewykrywalna po lewej stronie.Jednak po wzmocnieniu Preem wskazanym po prawej, gamma IFN została łatwo wykryta na poziomie 29,0. Z RPL 13 A rejestrującym się na poziomie 14,1, co wskazuje na 12-krotny wzrost wzmocnienia sygnału, immunohistochemiczne potwierdzenie wydajności jest pokazane tutaj. Zróżnicowane nasilenie srebra w barwieniu immunologicznym peroksydazy, diaminy, benzyny służy do ilościowego określenia znacznego zmniejszenia produkcji cyklofiliny B w kulturach plastrów hipokampa traktowanych siRNA.Techniki przedstawione w tym filmie można wykonywać przez kilka dni. Pragniemy podkreślić, że nasze kultury warstw hipokampa są bardzo zbliżone do ich odpowiedników in vivo i są idealne do badania sygnalizacji immunologicznej i rozprzestrzeniania depresji. Jednak ważne jest, aby utrzymać spokojne środowisko immunologiczne pod kontrolą i w warunkach pozorowanych.Aby zminimalizować zakłócającą aktywację immunologiczną, kultury muszą być utrzymywane w sterylnych warunkach. Nie powinny być narażone na nadmierne zakłócenia chemiczne, mechaniczne lub termiczne. Ponieważ fizjologiczna sygnalizacja cytokin zachodzi na poziomie femtomolowym, należy zastosować bardzo czułe i powtarzalne techniki pomiarowe.Wykorzystujemy technologię PCRA oraz czułe techniki proteomiczne. Wreszcie, cytokiny są zarówno plejotropowe, jak i zbędne. Odpowiednio. Cele cytokin multipleksowych mierzone w czasie są przydatne do badania, w jaki sposób sygnalizacja immunologiczna moduluje podatność na skręcenie, depresję, a co za tym idzie, migrenę.

modeling-neural-immune-signaling-episodic-chronic-migraine-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Modelowanie sygnalizacji nerwowo-odpornościowej epizodycznego i przewlekłego migrenowego bólu głowy z wykorzystaniem depresji rozprzestrzenionej in vitro

W tym badaniu, autorzy po raz pierwszy opisują nowatorską neuronawigację 3D-Immersive &amp; Interactive (3D-IIN) poprzez wpływ spontanicznego ataku migrenowego bólu głowy na układ μ-opioidowy mózgu pacjenta in vivo.

Neuronawigacja 3D in vivo przez mózg pacjenta podczas spontanicznego migrenowego bólu głowy

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Gryzonie nie są w stanie zgłaszać objawów migreny. W tym miejscu opisujemy możliwy do opanowania paradygmat testowy (testy jasne/ciemne i otwartego pola) w celu zmierzenia awersji do światła, jednego z najczęstszych i najbardziej uciążliwych objawów u pacjentów z migrenami.

Badanie zachowań podobnych do migreny przy użyciu awersji do światła u myszy

Najbardziej zauważalnym objawem migreny jest silny ból głowy, a przypuszcza się, że jest on spowodowany przez neurony czuciowe unerwiające opony mózgowe. W tym miejscu przedstawiamy metodę miejscowego nakładania substancji na oponę twardą w sposób minimalnie inwazyjny, przy jednoczesnym wykorzystaniu nadwrażliwości twarzy jako wyjścia.

Stymulacja opony twardej i okołooczodołowe testy von Freya u myszy jako przedkliniczny model bólu głowy

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Obecny protokół opisuje dwupunktowe wstrzykiwanie lizofosfatydylocholiny przez ramkę stereotaktyczną w celu wygenerowania stabilnego i powtarzalnego modelu demielinizacji u myszy.

Stabilnie ugruntowane dwupunktowe wstrzyknięcie modelu ogniskowej demielinizacji wywołanej lizofosfatydylocholiną u myszy

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Ten protokół demonstruje połączenie obrazowania i elektrofizjologii w celu niezawodnego wykrywania rozprzestrzeniających się depolaryzacji u dorosłych myszy po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu.

Połączenie obrazowania i elektrofizjologii w celu wizualizacji i rejestrowania rozprzestrzeniających się depolaryzacji u myszy

Ten protokół zapewnia metodę śledzenia automatycznego mrużenia oczu u gryzoni w czasie w sposób zgodny z blokowaniem czasu na pomiary neurofizjologiczne. Oczekuje się, że protokół ten będzie przydatny dla naukowców badających mechanizmy zaburzeń bólowych, takich jak migrena.

Zautomatyzowana metoda mrużenia oczu dla zachowania synchronizacji czasu i dynamiki mózgu w badaniach bólu myszy

Poznaj metodę badania sygnalizacji immunologicznej w układzie nerwowym z wykorzystaniem hodowli wycinków hipokampu szczura. Technika ta pozwala modelować rozprzestrzeniającą się depresję i analizować jej związek z migreną.

Modelowanie neuronalnej sygnalizacji immunologicznej epizodycznej i przewlekłej migreny za pomocą rozprzestrzeniającej się depresji in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Modelowanie neuronalnej sygnalizacji immunologicznej epizodycznej i przewlekłej migreny za pomocą rozprzestrzeniającej się depresji in vitro

Przeglądaj więcej filmów