Name: Wysokoprzepustowa metoda hybrydyzacji in situ do charakteryzowania wzorców ekspresji mRNA w dolnych drogach moczowo-płciowych myszy płodu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w dolnych drogach moczowo-płciowych myszy płodu. Technika umożliwia badanie lokalizacji przestrzennej i czasowej transkryptów o niskiej i wysokiej obfitości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr. Lan Yi z Cancer Institute of New Jersey za pomoc techniczną przy przygotowywaniu koszyczków tkankowych. Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health nr DK083425 oraz DK070219.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Stosując opisaną tutaj metodę, możliwe jest wykrycie mRNA we wszystkich głównych typach komórek i przedziałach tkankowych płodowych męskich i żeńskich układów moczowo-płciowych (LUT) myszy, w tym w poduszkach mezenchymalnych, urothelium, mięśniach gładkich, pąkach prostaty, przewodzie wytryskowym oraz w pochwie. Przekroje o grubości 50μm stosowane w tym protokole mają tę zaletę, że są wystarczająco grube, aby rozpoznać architekturę tkanki (np. naczynia krwionośne), a jednocześnie na tyle cienkie, aby uniknąć pułapkowania...

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-digoksigeninowe, fragmenty Fab</td><td>Grupa Roche</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Grupa Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże BM Purple AP, wytrącające się</td><td>Grupa Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowej, 24 dołki</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Digoksygenina 11-UTP</td><td>Grupa Roche</td><td>1277073910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Grupa Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr><td>Dwukrotna żyletka</td><td>Wilkinson Sword</td><td>Model klasyczny</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase – preparat do usuwania RNaz</td><td>Decon Laboratories</td><td>1102</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5786-1L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA z żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd, roztwór 25% w H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna, sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, roztwór 30% w H2O&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633-500</td><td></td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>Szybkowiążący klej błyskawiczny Loctite 404</td><td>Henkel Corp</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówki, 1,5 ml</td><td>Biologix Research Company</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Wkład do płytki hodowlanej Millicell</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Żywica do rozcierania molekularnego</td><td>G-Biosciences</td><td>786-138PR</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 4% roztwór w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy (PBS), bez Ca &amp;amp; Mg</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN1760420</td><td></td></tr><tr><td>Siatka poliestrowa, 33 mikrony, 12&quot;&amp;#157; x 24&quot;&amp;#157;</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMY-0033-D</td><td></td></tr><tr><td>roztwór proteinazy K, 20 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E195-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>roztwór Q</td><td>Qiagen</td><td>Dostarczono polimerazę DNA Taq</td><td></td></tr><tr><td>RNaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor RNazy</td><td>Grupa Roche</td><td>03335399001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>zestaw RNEASY mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNaza wolna od RNaz</td><td>Promega Corp.</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>agaroza niskotopliwa SeaPlaque</td><td>Lonza Inc.</td><td>50101</td><td></td></tr><tr><td>Surowica owcza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2263-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Stericup, 0,22 µm&amp;mu;m, polietersulfon, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu, ziarnisty</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227I-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S529-500</td><td></td></tr><tr><td>SSC, roztwór 20X</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S24022-4000.0</td><td></td></tr><tr><td>System do syntezy pierwszej nici SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza RNA T7</td><td>Grupa Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza DNA Taq</td><td>Qiagen</td><td>201203</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Wibromikrotom z zaawansowaną wanną do próbek</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000A</td><td></td></tr><tr><td>tRNA drożdży</td><td>Grupa Roche</td><td>109495</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mrna w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Rozwój dolnych dróg moczowo-płciowych (LUT) jest złożonym procesem. Złożoność ta przejawia się podczas formowania prostaty z płodowej cewki moczowej samca, co zależy od sygnałów androgenowych i oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych1,2. Zrozumienie mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za rozwój prostaty może ujawnić mechanizmy wzrostu, które zostają niewłaściwie reaktywowane w późniejszym życiu, prowadząc do chorób prostaty, takich jak łagodny przerost prostaty i rak prostaty.
Rozwijający się układ moczowo-płciowy (LUT) jest anatomicznie złożony. W momencie rozpoczęcia pączkowania prostaty w 16,5 dniu po zapłodnieniu (dpc) obecnych jest liczne typy komórek. Naczynia krwionośne, nerwy i mięśnie gładkie znajdują się w obrębie zrębu mezenchymalnego3. Zręb ten otacza wielowarstwowe nabłonek i daje początek płodowej prostacie poprzez paracrynne sygnały zależne od receptora androgenowego4. Tożsamość stromalnych genów reagujących na receptor androgenowy, niezbędnych do rozwoju prostaty, oraz mechanizm, w którym nabłonek przewodowy prostaty formuje się w odpowiedzi na te geny, nie są w pełni poznane. Zdolność do precyzyjnej identyfikacji typów komórek i lokalizacji ekspresji konkretnych czynników w ich obrębie jest niezbędna do dalszego zrozumienia rozwoju prostaty. Hybrydyzacja in situ (ISH) pozwala na lokalizację mRNA w obrębie tkanki. Zatem metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji wzorca i czasu ekspresji cząsteczek sygnałowych oraz ich receptorów, co pozwala na wyjaśnienie potencjalnych regulatorów rozwoju prostaty.
W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową technikę ISH służącą do identyfikacji wzorców ekspresji mRNA w płodowej cewce moczowej (LUT) myszy z wykorzystaniem przekrojów wykonanych mikrotomem wibracyjnym. Metoda ta oferuje szereg zalet w porównaniu z innymi protokołami ISH. Przeprowadzanie ISH na cienkich przekrojach przyklejonych do szkiełka jest technicznie trudne; krioprzekroje często charakteryzują się niską jakością strukturalną, natomiast zarówno krioprzekroje, jak i przekroje parafinowe często skutkują słabą rozdzielczością sygnału. Wykonywanie ISH na całych preparatach tkankowych może prowadzić do uwięzienia sondy. W przeciwieństwie do nich, nasza wysokoprzepustowa technika wykorzystuje grube przekroje, które ukazują szczegółową architekturę tkanki. Modyfikowane probówki do wirówek umożliwiają łatwą manipulację przekrojami podczas procedury ISH. Z pojedynczego LUT w 17,5dpc można przesiewowo zbadać maksymalnie 4 transkrypty mRNA, wykrywając do 24 transkrypty mRNA w jednym cyklu, co redukuje koszty i maksymalizuje wydajność. Metoda ta pozwala na identyczne przetwarzanie wielu grup badawczych jako jednej jednostki, co eliminuje wszelkie błędy systematyczne w interpretacji danych. Co najważniejsze dla badaczy prostaty, metoda ta umożliwia określenie lokalizacji przestrzennej i czasowej transkryptów mRNA o niskiej i wysokiej obfitości w płodowej cewce moczowej myszy, z której powstaje sieci przewodowa prostaty.

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Rozwój dolnych dróg moczowo-płciowych (LUT) jest złożonym procesem. Złożoność ta jest widoczna podczas formowania się prostaty z płodowego męskiego...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja wzorców ekspresji mRNA w rozwijających się tkankach dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych płodu myszy. Jest to osiągane poprzez syntezę sondy rybotropowej znakowanej digoksygenem z matrycy uzyskanej za pomocą PCR. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie grubych przekrojów z wykorzystaniem mikrotomu wibracyjnego.Trzecim krokiem jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ w przekrojach dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych umieszczonych w specjalnie dostosowanych koszyczkach. mRNA są wizualizowane poprzez detekcję immunohistochemiczną związanych sond rybo- przy użyciu osadzającego podłoża fosfatazy alkalicznej BM purple. Ostatecznie analiza mikroskopowa pozwala na wykazanie przestrzennej i czasowej lokalizacji transkryptów mRNA o niskiej i wysokiej liczebności w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych myszy płodowej.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak immunohistochemia, jest łatwość generowania sond ribo oraz możliwość ich zaprojektowania tak, aby rozpoznawały większość mRNA w całym genomie myszy. Choć metoda ta pozwala na wgląd w wzorce ekspresji mRNA podczas rozwoju układu moczowo-płciowego myszy płodowej, może ona zostać zastosowana również do innych układów narządowych, gatunków i etapów rozwoju. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ zatapianie tkanki w agarze może być trudne do opanowania, a niewielkie różnice w orientacji mogą prowadzić do niespójnych wyników. Przynajmniej jeden dzień przed przygotowaniem tkanki należy usunąć i wyrzucić membranę z płytki do hodowli komórkowej typu milli o średnicy 12 mm; pozostały pierścień będzie pełnił funkcję formy. Pierścienie należy moczyć przez noc w roztworze inhibitora RNA.W dniu wykonania protokołu przeprowadź sekcję dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych myszy, który został rehydratowany w seriach rozcieńczeń metanolu. Po przemyciu w roztworze PBS tween usuń około dwóch trzecich pęcherza moczowego, a pozostałą tkankę dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych przechowuj w roztworze PBS tween. Następnie umieść przygotowaną formę pierścieniową na szkiełku przedmiotowym i wypełnij ją 4% roztworem agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 62 °C, a następnie pozostaw do ostygnięcia na około dwie minuty.Następnie osusz tkankę dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych i zanurz ją w roztworze agarozowym. Za pomocą pęsety ustaw tkankę tak, aby była zawieszona w połowie odległości między górą a dołem pierścienia. Inkubuj formę w temperaturze czterech stopni Celsiusza, aż agaroza stwardnieje.Przed pokrojeniem tkanki należy przygotować dostosowane ostrze typu Wilkinson, płucząc je rozpuszczalnikami, a następnie wodą. Rozdzielone wzdłuż podwójne ostrze należy podzielić na dwa pojedyncze ostrza. Następnie ostrze Wilkinson należy zamocować w uchwycie ostrza mikrotomu.Aby to zrobić, należy najpierw przyciąć ostrze mikrotomu do długości ostrza Wilkinson. Następnie, używając kleju Lock Tite, przykleić ostrze mikrotomu do ostrza Wilkinson w odległości około trzech do czterech milimetrów od krawędzi tnącej. Teraz zamontować wzmocnione ostrze w wibracyjnym mikrotomie i ustawić kąt ostrza na 35 stopni.Przygotuj luksusową kąpiel dla preparatów, napełniając ją buforem PBS i otaczając ją kruszonym lodem. Przed zamontowaniem tkanki zatopionej w wkładce, wyjmij ją z pierścieniowej formy i osusz powierzchnię dna za pomocą chusteczki do blokowania. Następnie przyklej osuszoną powierzchnię do dysku montażowego, używając kleju Loctite.Włóż krążek do wibrotomu i ustaw grubość przekroju na 50 microns, prędkość na dwa, a amplitudę ostrza na cztery. Podczas wycinania przekrojów tkanki, użyj pęsety tępowej, aby przenieść każdy przekrój do 24-dołkowej płytki hodowlanej wypełnionej 0.5 mL lodowatego PBS tween. Po pocięciu, przed rozpoczęciem hybrydyzacji INI, usuń za pomocą nożyczek sprężynowych większość agaru z otoczenia każdego przekroju tkanki; przekroje można przechowywać do 48 hours w temperaturze 4 °C w PBS tween zawierającym 2 mM azydku sodu.W pierwszej kolejności należy przygotować niestandardowe koszyczki do próbek, odcinając dno probówki do mikrocentryfugi na poziomie 100 µL. Miejsce cięcia probówki należy podgrzewać w płomieniu, aż plastik zmięknie. Następnie miękkim plastikiem należy mocno docisnąć do kwadratu z siatki.Pozostaw do stwardnienia i odetnij nadmiar siatki. Wykończ koszyczki, przebijając podgrzaną igłą o rozmiarze 18 G dwa otwory w każdym wieczku probówki. Przygotuj tackę do przechowywania koszyczków z próbkami, wiercąc 24 równomiernie rozmieszczone otwory o średnicy 12 mm w wieczku płytki 24-dołkowej.Przed rozpoczęciem należy umieścić każdy otwór bezpośrednio nad dołkiem, a następnie rozpocząć wstępne podgrzewanie przykrytej komory do hybrydyzacji wypełnionej około 1,27 cm wody z kranu do temperatury 60,5 °C. Hybrydyzację in situ rozpocznij od dodania 2 mL PBS tween do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej. Przykryj płytkę przygotowaną pokrywą z zamocowanymi koszyczkami.Następnie przenieść skrawki tkanek do koszyczków w temperaturze pokojowej i inkubować je w 6% nadtlenku wodoru z PBS tween w inkubatorze kołyszącym, a następnie przeprowadzić serię płukań w PBS tween, inkubację z proteinazą K, ponowną fiksację oraz kolejne płukania. Aby zakończyć przygotowanie próbek, dodać dwa mililitry podgrzanego buforu do przedhybrydyzacji do każdej studzienki i inkubować płytkę w ogrzewanej komorze do hybrydyzacji przez co najmniej jedną godzinę. Rozpocząć hybrydyzację, dodając 0,5 mikrograma znakowanej sondy RIBA do każdej z nich.Następnie kontynuuj inkubację przez noc w ogrzewanej komorze do hybrydyzacji. Następnego dnia przemyj tkanki roztworem pierwszym, stopniowo przechodząc do roztworu drugiego, a następnie potraktuj je RNA. Przemyj tkanki w roztworze trzecim, a następnie w TBS tween oraz w buforze blokującym tkanki, podczas gdy tkanki inkubują się w buforze blokującym.Po okresie inkubacji rozpocznij co najmniej dwugodzinną inkubację przeciwciała anty-dig w buforze do absorpcji przeciwciał w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwiruj roztwór przeciwciał przy 10 000 RPM przez minutę. Aby usunąć substancje nierozpuszczalne, dodaj Senna do 2 ml buforu do roztworu przeciwciał.Następnie należy wyjąć tkankę z buforu blokującego i inkubować ją w przygotowanym roztworze przeciwciał. Trzeciego dnia procedury należy pozostawić próbki w komorze hybrydyzacyjnej przez noc w temperaturze 4 °C. Tkanki należy kilkukrotnie przemyć w TBST.Następnie, używając szklanej pipety Pasteura, ostrożnie przenieś tkanki do czystych probówek do mikrocentrifugowania. Przemyj tkanki przez 10 minut jednym mililitrem pustego NTM.Następnie należy zastąpić roztwór TMT zawierającym barwnik lava sole MBM purple. Probówki należy umieścić w ciemności, a w ciągu kolejnych kilku dni monitorować rozwój barwy i w razie potrzeby wymieniać roztwór. Po pełnym wykształceniu się barwy tkanki należy krótko przemyć TMT zawierającym lava sole, a następnie inkubować je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PBS zawierającym paraformaldehyd.Następnego dnia tkanki należy wybielić i wypłukać. Przekroje są teraz gotowe do obrazowania. Tkankę dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych zatopiono w agarze w taki sposób, aby linia środkowa cewki moczowej była równoległa do płaskiej powierzchni zatyczki aros.Taka orientacja pozwoliła na uzyskanie przekrojów strzałkowych. Koszyczki do próbek wykonane na specjalne zamówienie chroniły delikatne przekroje tkanek przed kurzem i cząstkami stałymi. Podczas wielodniowej procedury hybrydyzacji in C two.Zapobiegło to również utracie jakichkolwiek przekrojów. Ograniczenie barwienia tła podczas długich inkubacji, niezbędnych do wykrycia niskoekspresyjnych mRNA, jest trudnym zadaniem. Jednak dodanie azotku sodu i następująca po nim filtracja zdają się ograniczać barwienie tła.Ponadto nie zaobserwowano widocznych różnic w zabarwieniu tła, gdy próbki inkubowano w roztworze do wywoływania koloru przez dłuższy czas. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu sześciu dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, aby ustalić, czy wzorzec ekspresji mRNA koreluje ze wzorcem ekspresji białek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w rozwijającym się dolnym odcinku dróg rodnych myszy.

a-high-throughput-situ-hybridization-method-to-characterize-mrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda hybrydyzacji in situ o wysokiej wydajności do scharakteryzowania wzorców ekspresji mRNA w dolnym układzie moczowo-płciowym płodu mysiego

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Śmierć płodowa i okołoporodowa jest częstym zjawiskiem podczas badania zmian genetycznych wpływających na rozwój serca. Obrazowanie za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości poprawiło rozdzielczość 2-D i może dostarczyć doskonałych informacji na temat wczesnego rozwoju serca, stanowiąc idealną metodę wykrywania wpływu na strukturę i funkcję serca przed śmiercią.

Echokardiografia płodowa myszy

Ultra-wysokiej częstotliwości ultrasonografia to potężne narzędzie do obrazowania na żywo do badania nieprawidłowości w pracy serca u małych zwierząt. Jego nieinwazyjność pozwala na utrzymanie stanu fizjologicznego zarodków. W tym artykule pokazujemy zastosowanie ultrasonografii w trybie M do pomiaru częstości akcji serca zarodków przy E18,5 w macicy.

W macicy Pomiar tętna u myszy za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii w trybie m

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Myszy są powszechnie używane do badania biologii ciąży. W przypadku takich badań wymagane jest jednak przerwanie ciąży, co wyklucza badania podłużne i wymaga wykorzystania dużej liczby zwierząt. Dlatego opisujemy nieinwazyjną technikę ultrasonografii o wysokiej częstotliwości do wczesnego wykrywania i monitorowania zdarzeń poimplantacyjnych u ciężarnej myszy.

Nowatorskie zastosowanie trójwymiarowej ultrasonografii o wysokiej częstotliwości do charakteryzowania wczesnej ciąży u myszy

mikro-RNA (miRNA) to krótkie i wysoce homologiczne sekwencje RNA, służące jako posttranskrypcyjne regulatory informacyjnych RNA (mRNA). Obecne metody wykrywania miRNA różnią się czułością i swoistością. Opisujemy protokół, który łączy hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu jednoczesnego wykrywania cząsteczek miRNA i białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Poznaj wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w dolnych drogach moczowo-płciowych myszy płodu. Technika umożliwia badanie lokalizacji przestrzennej i czasowej transkryptów o niskiej i wysokiej obfitości.

Wysokoprzepustowa metoda hybrydyzacji in situ do charakteryzowania wzorców ekspresji mRNA w dolnych drogach moczowo-płciowych myszy płodu (Wideo) | JoVE Journal

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Przeglądaj więcej filmów