Wysokoprzepustowa metoda hybrydyzacji in situ do charakteryzowania wzorców ekspresji mRNA w dolnych drogach moczowo-płciowych myszy płodu
19 sierpnia 2011
Tutaj opisujemy efektywną metodę wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ (ISH) do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w rozwijających się wycinkach tkanki prostaty u myszy płodowych. Metodę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja wzorców ekspresji mRNA w rozwijających się tkankach dolnych dróg moczowo-płciowych myszy płodowej. Osiąga się to poprzez najpierw zsyntetyzowanie tlenu di w znakowanej sondzie rybo z matrycy wygenerowanej przez PCR. Drugim etapem procedury jest wygenerowanie grubych ciętych skrawków za pomocą wibracyjnego mikrotomu.
Trzecim krokiem jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ w dolnych odcinkach dróg moczowo-płciowych zawartych w dostosowanych do potrzeb koszy. MRNA są wizualizowane poprzez immunohistochemiczne wykrywanie związanych sond rybo-rybowych przy użyciu fioletowego substratu fosfatazy alkalicznej BM. Ostatecznie mikroskopia może pokazać przestrzenną i czasową lokalizację transkryptów mRNA o niskiej i wysokiej liczebności w dolnych drogach moczowo-płciowych płodu myszy.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia, jest to, że sondy rybo-owe są łatwe do wygenerowania i mogą być zdolne do rozpoznawania większości mRNA w całym genomie myszy. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w wzorce ekspresji mRNA podczas rozwoju moczu narządów płciowych u płodu myszy, można ją również zastosować do innych układów narządów, gatunków i etapów rozwoju. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ osadzanie tkanki w ślimaku może być trudne do nauczenia, a niewielkie różnice w orientacji mogą prowadzić do niespójnych wyników Co najmniej jeden dzień przed przygotowaniem tkanki usuń i wyrzuć membranę z płytki do hodowli milikomórek o średnicy 12 milimetrów, podczas gdy włóż pozostały pierścień będzie działał jako pleśń namocz pierścienie przez noc w roztworze inhibitora RNA.
W dniu sporządzenia protokołu należy przeprowadzić sekcję dolnych dróg moczowo-płciowych myszy, która została ponownie nawodniona stopniowanym metanolem. PBS tween wash usuwa około dwóch trzecich pęcherza moczowego i przechowuje pozostałą tkankę dolnych dróg moczowo-płciowych w PBS tween. Teraz umieść obrobioną formę pierścieniową na szklanym szkiełku mikroskopowym i napełnij ją 4% roztworem o niskiej temperaturze topnienia w temperaturze 62 stopni Celsjusza i pozostaw do ostygnięcia przez około dwie minuty.
Teraz zablokuj suchą tkankę dolnych dróg moczowo-płciowych i zanurz ją w powstałym roztworze. Użyj kleszczy, aby zorientować tkankę tak, aby była zawieszona w połowie odległości między górną a dolną częścią pierścienia. Pleśń inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż powstająca zastygnie.
Przed pokrojeniem tkanki przygotuj niestandardowe ostrze Wilkinsona, spłukując je rozpuszczalnikami, a następnie wodą. Podziel podwójne ostrze wzdłuż na dwa pojedyncze ostrza. Następnie podeprzyj ostrze Wilkinsona ostrzem mikrotonowym.
Aby to zrobić najpierw, przytnij ostrze mikrotonowe do długości ostrza Wilkinsona. Następnie za pomocą kleju Lock Tite przyklej mikrotonowe ostrze do ostrza Wilkinsona przesunięte od krawędzi tnącej o około trzy do czterech milimetrów. Teraz zamontuj wzmocnione ostrze w wibrującym mikrotomie i ustaw kąt ostrza na 35 stopni.
Przygotuj luksusową kąpiel z próbkami, napełniając wannę PBS i pakując wokół niej mokry lód. Przed zamontowaniem chusteczki osadzonej we wtyczce należy wyjąć ją z formy pierścieniowej i osuszyć dolną powierzchnię. Następnie przyklej wysuszoną powierzchnię do tarczy montażowej za pomocą kleju Loctite.
Włóż tarczę do wibratora i dostosuj grubość przekroju do 50 mikronów, prędkość do dwóch, a amplitudę ostrza do czterech. Podczas cięcia skrawków tkanek użyj kleszczy, aby przenieść każdą sekcję na 24-dołkową płytkę hodowlaną wypełnioną pół mililitrem lodowatego tweenu PBS. Po pokrojeniu usuń większość aros z okolic każdego odcinka tkanki za pomocą nożyczek sprężynowych przed rozpoczęciem hybrydyzacji INI, skrawki można przechowywać do 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza w pterekcie PBS zawierającym dwa milimolowe azydki sodu.
Najpierw wykonaj niestandardowe kosze na próbki, odcinając dno od rurki mikrowirówki na znaku 100 mikrolitrów. Podgrzej cięcie rurki w płomieniu, aż plastik będzie miękki. Następnie mocno dociśnij miękki plastik do kwadratu siatki.
Pozwól mu stwardnieć i przytnij nadmiar siatki. Uzupełnij kosze za pomocą podgrzanej igły o rozmiarze 18, aby przebić dwa otwory w każdej pokrywie tuby. Przygotuj tacę do przechowywania koszy na próbki, wiercąc 24 równomiernie rozmieszczone 12-milimetrowe otwory w pokrywie płytki 24-dołkowej.
Każdy otwór należy umieścić bezpośrednio nad studnią przed rozpoczęciem wstępnego podgrzewania zakrytej komory hybrydyzacyjnej wypełnionej pół cala wody z kranu do 60,5 stopni Celsjusza. Rozpocznij hybrydyzację in situ, dodając dwa mililitry PBS tween do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej. Przykryj ten talerz przygotowaną pokrywką załadowaną koszami.
Teraz przenieś skrawki tkanek do koszy w temperaturze pokojowej z kołysaniem, inkubuj skrawki w 6% nadtlenku wodoru z tweenem PBS, a następnie serię płukań z tweenem PBS, inkubację z proteinazą K, kolejne utrwalenie i więcej płukań. Aby zakończyć przygotowywanie próbek, dodaj dwa mililitry przedwojennego buforu przed hybrydyzacją do każdej studzienki i inkubuj płytkę w ogrzewanej komorze hybrydyzacyjnej przez co najmniej godzinę. Rozpocznij hybrydyzację, dodając 0,5 mikrograma znakowanej sondy RIBA do każdej.
Cóż, następnie kontynuuj inkubację przez noc w ogrzewanej komorze hybrydyzacyjnej. Następnego dnia umyj tkanki roztworem pierwszym, stopniowo zmieniając się w roztwór drugi, a następnie potraktuj RNA. Następnie przemyj roztwór trzeci, a następnie przepłucz w twenie TBS i buforze blokującym tkanki, podczas gdy tkanki inkubują w buforze blokującym tkanki.
Po okresie inkubacji rozpocząć co najmniej dwugodzinną inkubację przeciwciała anty dig w buforze absorpcyjnym przeciwciał w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odkręć roztwór przeciwciała z prędkością 10 000 obr./min przez minutę. Aby usunąć w rozpuszczonych roztworach, dodaj Sennę do dwóch mililitrów buforu roztworu przeciwciał.
Teraz wyjmij tkankę z buforu blokującego i inkubuj je w przygotowanym roztworze przeciwciała. Trzymaj je w komorze hybrydyzacyjnej na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w trzecim dniu zabiegu. Umyj chusteczki kilka razy w TBST za pomocą ole.
Następnie za pomocą szklanej pipety do makaronu. Ostrożnie przenieś tkanki do czystych mikroprobówek wirówkowych. Myj chusteczki przez 10 minut pustym jednym mililitrem NTM.
Następnie zastąp roztwór TMT zawierającym podeszwę lawy MBM fioletowy. Umieść probówki w ciemności i przez kilka następnych dni monitoruj rozwój koloru i zmieniaj roztwór w razie potrzeby. Po rozwinięciu pełnego koloru krótko umyj tkanki TMT zawierającym lawę, a następnie inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PBS zawierającym para formaldehyd.
Następnego dnia wybiel i umyj chusteczki. Sekcje są teraz gotowe do obrazowania. Tkanka dolnych dróg moczowo-płciowych została osadzona w agarze w taki sposób, że linia środkowa cewki moczowej była równoległa do płaskiej powierzchni czopa aros.
Ta orientacja dała przekroje strzałkowe. Wykonane na zamówienie kosze na próbki chroniły delikatne skrawki tkanek przed kurzem i cząstkami stałymi. Podczas wielodniowej procedury hybrydyzacji w C dwa.
Zapobiegły one również utracie jakichkolwiek sekcji. Trudno jest ograniczyć barwienie tła podczas długich inkubacji wymaganych do wykrycia mRNA o niskiej liczebności. Wydaje się jednak, że dodanie azydku sodu i późniejsza filtracja mają ograniczone zabarwienie tła.
Co więcej, nie było widocznych różnic w barwieniu tła, gdy próbki były inkubowane w roztworze do wywoływania koloru przez dłuższy czas. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu sześciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, w celu określenia, czy wzorzec ekspresji mRNA koreluje ze wzorcem ekspresji białek.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować wzorce ekspresji mRNA i rozwijającą się mysz obniżać drogi rodne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje wydajną wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w rozwijających się tkankach dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych płodu myszy. Metoda ta może zostać dostosowana do zastosowania w różnych tkankach myszy lub tkankach innych gatunków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Ekspresja genów
Wprowadzenie
- Hybrydyzacja in situ jest techniką stosowaną do wykrywania specyficznych sekwencji kwasów nukleinowych.
- Zrozumienie wzorców ekspresji mRNA jest kluczowe dla badania procesów rozwojowych.
- Dolny odcinek dróg moczowo-płciowych płodu myszy służy jako model do badania ekspresji genów podczas rozwoju.
- Metoda ta umożliwia wysokoprzepustową analizę lokalizacji mRNA.
Cel badania
- W celu wizualizacji ekspresji mRNA w tkance płodowej prostaty myszy.
- W celu opracowania metody, którą można dostosować do innych tkanek.
- W celu pogłębienia zrozumienia ekspresji genów podczas rozwoju płodowego.
Zastosowane metody
- Synteza znakowanej digoksygeną sondy ryboprobowej z matrycy otrzymanej metodą PCR.
- Przygotowanie grubych przekrojów z wykorzystaniem mikrotomu wibracyjnego.
- Przeprowadzenie hybrydyzacji in situ w specjalnie dostosowanych koszykach.
- Wizualizacja mRNA poprzez detekcję immunohistochemiczną z użyciem substratu BM purple.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja transkryptów mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy.
- Wykazanie przestrzennej i czasowej lokalizacji ekspresji mRNA.
- Zdolność do wykrywania transkryptów mRNA o niskiej i wysokiej liczbie kopii.
- Metoda może zostać dostosowana do innych tkanek i gatunków.
Wnioski
- Opracowana metoda ISH jest wydajna i elastyczna.
- Umożliwia ona uzyskanie wglądu w ekspresję genów podczas rozwoju płodowego.
- Technika ta może usprawnić dalsze badania w dziedzinie biologii rozwoju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowa hybrydyzacja in situ (ISH) umożliwia precyzyjne mapowanie przestrzenne i czasowe ekspresji mRNA w złożonych tkankach płodowych, wspierając wczesne odkrycia i walidację celów w modelach rozwojowych i chorobowych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad funkcją genów, pozwalając na multipleksową, bezstronną analizę w wielu grupach badawczych. Jej skalowalność i powtarzalność sprawiają, że jest ona cennym narzędziem w procesie selekcji projektów (triage) oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie wzorców ekspresji genów rozwojowych istotnych dla mechanizmów chorobowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez lokalizację mRNA w określonych typach komórek i obszarach tkanek.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie relacji przestrzennych między cząsteczkami sygnałowymi a architekturą tkanki.
- Zapewnia analizę multipleksową, pozwalającą na równoległe porównywanie wielu celów lub warunków.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane przekroje tkanek do dalszych analiz molekularnych lub fenotypowych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty przestrzenne w celu standaryzacji analizy.
- Umożliwia wysokoprzepustowe badanie do 24 transkrypty mRNA w jednym przebiegu, wspierając skalowalne procesy analityczne.
- Ogranicza błędy interpretacyjne dzięki identycznemu przetwarzaniu wielu grup w jednej partii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje ekspresję genów rozwojowych ze ścieżkami istotnymi dla przebiegu choroby w celu odkrycia translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki umożliwieniu profilowania molekularnego na różnych etapach.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez wyjaśnianie funkcji genów w odpowiednim kontekście tkankowym.
- Stanowi platformę możliwą do adaptacji w odniesieniu do innych układów narządowych i gatunków, co zwiększa potencjał oddziaływania translacyjnego.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ta metoda ISH integruje etapy od wczesnego odkrycia, przez identyfikację wiodących związków, aż po badania przedkliniczne, umożliwiając testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w modelach rozwojowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera mapowanie przestrzenne ekspresji genów w celu wyjaśnienia szlaków rozwojowych i mechanizmów biologicznych.
- Przesiewanie: Oferuje powtarzalną, multipleksową detekcję transkryptów mRNA w celu przygotowania testów i analizy porównawczej.
- Analityka: Zapewnia ilościowe i rozdzielone przestrzennie wyniki, które służą do porównywania warunków i ustalania priorytetów dla celów terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy ekspresję genów rozwojowych z modelami chorób w celu dopasowania biomarkerów i zapewnienia ciągłości badań przedklinicznych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Adaptowalny protokół umożliwia ponowne wykorzystanie w różnych tkankach, gatunkach i etapach rozwoju, maksymalizując wartość prac B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obróbkę tkanek i hybrydyzację w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie wiarygodnych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie kapitałem w ramach portfela.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów na etapie odkrywania.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie obróbki tkanek, ich sekcjonowania oraz technik hybrydyzacji molekularnej.
- Wymagany dostęp do mikrotomów wibrotomów, mikroskopii oraz infrastruktury do detekcji immunohistochemicznej.
- Wymagana standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania próbek i interpretacji danych.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych typów tkanek i etapów rozwoju poprzez optymalizację protokołu.
- Potencjał wystąpienia barwienia tła oraz zmienność orientacji wymagają biegłości technicznej i stosowania kontroli jakości.
