Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja wzorców ekspresji mRNA w rozwijających się tkankach dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych płodu myszy. Jest to osiągane poprzez syntezę sondy rybotropowej znakowanej digoksygenem z matrycy uzyskanej za pomocą PCR. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie grubych przekrojów z wykorzystaniem mikrotomu wibracyjnego.

Trzecim krokiem jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ w przekrojach dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych umieszczonych w specjalnie dostosowanych koszyczkach. mRNA są wizualizowane poprzez detekcję immunohistochemiczną związanych sond rybo- przy użyciu osadzającego podłoża fosfatazy alkalicznej BM purple. Ostatecznie analiza mikroskopowa pozwala na wykazanie przestrzennej i czasowej lokalizacji transkryptów mRNA o niskiej i wysokiej liczebności w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych myszy płodowej.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak immunohistochemia, jest łatwość generowania sond ribo oraz możliwość ich zaprojektowania tak, aby rozpoznawały większość mRNA w całym genomie myszy. Choć metoda ta pozwala na wgląd w wzorce ekspresji mRNA podczas rozwoju układu moczowo-płciowego myszy płodowej, może ona zostać zastosowana również do innych układów narządowych, gatunków i etapów rozwoju. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ zatapianie tkanki w agarze może być trudne do opanowania, a niewielkie różnice w orientacji mogą prowadzić do niespójnych wyników. Przynajmniej jeden dzień przed przygotowaniem tkanki należy usunąć i wyrzucić membranę z płytki do hodowli komórkowej typu milli o średnicy 12 mm; pozostały pierścień będzie pełnił funkcję formy. Pierścienie należy moczyć przez noc w roztworze inhibitora RNA.

W dniu wykonania protokołu przeprowadź sekcję dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych myszy, który został rehydratowany w seriach rozcieńczeń metanolu. Po przemyciu w roztworze PBS tween usuń około dwóch trzecich pęcherza moczowego, a pozostałą tkankę dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych przechowuj w roztworze PBS tween. Następnie umieść przygotowaną formę pierścieniową na szkiełku przedmiotowym i wypełnij ją 4% roztworem agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 62 °C, a następnie pozostaw do ostygnięcia na około dwie minuty.

Następnie osusz tkankę dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych i zanurz ją w roztworze agarozowym. Za pomocą pęsety ustaw tkankę tak, aby była zawieszona w połowie odległości między górą a dołem pierścienia. Inkubuj formę w temperaturze czterech stopni Celsiusza, aż agaroza stwardnieje.

Przed pokrojeniem tkanki należy przygotować dostosowane ostrze typu Wilkinson, płucząc je rozpuszczalnikami, a następnie wodą. Rozdzielone wzdłuż podwójne ostrze należy podzielić na dwa pojedyncze ostrza. Następnie ostrze Wilkinson należy zamocować w uchwycie ostrza mikrotomu.

Aby to zrobić, należy najpierw przyciąć ostrze mikrotomu do długości ostrza Wilkinson. Następnie, używając kleju Lock Tite, przykleić ostrze mikrotomu do ostrza Wilkinson w odległości około trzech do czterech milimetrów od krawędzi tnącej. Teraz zamontować wzmocnione ostrze w wibracyjnym mikrotomie i ustawić kąt ostrza na 35 stopni.

Przygotuj luksusową kąpiel dla preparatów, napełniając ją buforem PBS i otaczając ją kruszonym lodem. Przed zamontowaniem tkanki zatopionej w wkładce, wyjmij ją z pierścieniowej formy i osusz powierzchnię dna za pomocą chusteczki do blokowania. Następnie przyklej osuszoną powierzchnię do dysku montażowego, używając kleju Loctite.

Włóż krążek do wibrotomu i ustaw grubość przekroju na 50 microns, prędkość na dwa, a amplitudę ostrza na cztery. Podczas wycinania przekrojów tkanki, użyj pęsety tępowej, aby przenieść każdy przekrój do 24-dołkowej płytki hodowlanej wypełnionej 0.5 mL lodowatego PBS tween. Po pocięciu, przed rozpoczęciem hybrydyzacji INI, usuń za pomocą nożyczek sprężynowych większość agaru z otoczenia każdego przekroju tkanki; przekroje można przechowywać do 48 hours w temperaturze 4 °C w PBS tween zawierającym 2 mM azydku sodu.

W pierwszej kolejności należy przygotować niestandardowe koszyczki do próbek, odcinając dno probówki do mikrocentryfugi na poziomie 100 µL. Miejsce cięcia probówki należy podgrzewać w płomieniu, aż plastik zmięknie. Następnie miękkim plastikiem należy mocno docisnąć do kwadratu z siatki.

Pozostaw do stwardnienia i odetnij nadmiar siatki. Wykończ koszyczki, przebijając podgrzaną igłą o rozmiarze 18 G dwa otwory w każdym wieczku probówki. Przygotuj tackę do przechowywania koszyczków z próbkami, wiercąc 24 równomiernie rozmieszczone otwory o średnicy 12 mm w wieczku płytki 24-dołkowej.

Przed rozpoczęciem należy umieścić każdy otwór bezpośrednio nad dołkiem, a następnie rozpocząć wstępne podgrzewanie przykrytej komory do hybrydyzacji wypełnionej około 1,27 cm wody z kranu do temperatury 60,5 °C. Hybrydyzację in situ rozpocznij od dodania 2 mL PBS tween do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej. Przykryj płytkę przygotowaną pokrywą z zamocowanymi koszyczkami.

Następnie przenieść skrawki tkanek do koszyczków w temperaturze pokojowej i inkubować je w 6% nadtlenku wodoru z PBS tween w inkubatorze kołyszącym, a następnie przeprowadzić serię płukań w PBS tween, inkubację z proteinazą K, ponowną fiksację oraz kolejne płukania. Aby zakończyć przygotowanie próbek, dodać dwa mililitry podgrzanego buforu do przedhybrydyzacji do każdej studzienki i inkubować płytkę w ogrzewanej komorze do hybrydyzacji przez co najmniej jedną godzinę. Rozpocząć hybrydyzację, dodając 0,5 mikrograma znakowanej sondy RIBA do każdej z nich.

Następnie kontynuuj inkubację przez noc w ogrzewanej komorze do hybrydyzacji. Następnego dnia przemyj tkanki roztworem pierwszym, stopniowo przechodząc do roztworu drugiego, a następnie potraktuj je RNA. Przemyj tkanki w roztworze trzecim, a następnie w TBS tween oraz w buforze blokującym tkanki, podczas gdy tkanki inkubują się w buforze blokującym.

Po okresie inkubacji rozpocznij co najmniej dwugodzinną inkubację przeciwciała anty-dig w buforze do absorpcji przeciwciał w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwiruj roztwór przeciwciał przy 10 000 RPM przez minutę. Aby usunąć substancje nierozpuszczalne, dodaj Senna do 2 ml buforu do roztworu przeciwciał.

Następnie należy wyjąć tkankę z buforu blokującego i inkubować ją w przygotowanym roztworze przeciwciał. Trzeciego dnia procedury należy pozostawić próbki w komorze hybrydyzacyjnej przez noc w temperaturze 4 °C. Tkanki należy kilkukrotnie przemyć w TBST.

Następnie, używając szklanej pipety Pasteura, ostrożnie przenieś tkanki do czystych probówek do mikrocentrifugowania. Przemyj tkanki przez 10 minut jednym mililitrem pustego NTM.

Następnie należy zastąpić roztwór TMT zawierającym barwnik lava sole MBM purple. Probówki należy umieścić w ciemności, a w ciągu kolejnych kilku dni monitorować rozwój barwy i w razie potrzeby wymieniać roztwór. Po pełnym wykształceniu się barwy tkanki należy krótko przemyć TMT zawierającym lava sole, a następnie inkubować je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PBS zawierającym paraformaldehyd.

Następnego dnia tkanki należy wybielić i wypłukać. Przekroje są teraz gotowe do obrazowania. Tkankę dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych zatopiono w agarze w taki sposób, aby linia środkowa cewki moczowej była równoległa do płaskiej powierzchni zatyczki aros.

Taka orientacja pozwoliła na uzyskanie przekrojów strzałkowych. Koszyczki do próbek wykonane na specjalne zamówienie chroniły delikatne przekroje tkanek przed kurzem i cząstkami stałymi. Podczas wielodniowej procedury hybrydyzacji in C two.

Zapobiegło to również utracie jakichkolwiek przekrojów. Ograniczenie barwienia tła podczas długich inkubacji, niezbędnych do wykrycia niskoekspresyjnych mRNA, jest trudnym zadaniem. Jednak dodanie azotku sodu i następująca po nim filtracja zdają się ograniczać barwienie tła.

Ponadto nie zaobserwowano widocznych różnic w zabarwieniu tła, gdy próbki inkubowano w roztworze do wywoływania koloru przez dłuższy czas. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu sześciu dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, aby ustalić, czy wzorzec ekspresji mRNA koreluje ze wzorcem ekspresji białek.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w rozwijającym się dolnym odcinku dróg rodnych myszy.