Name: Wysokoprzepustowa metoda hybrydyzacji in situ do charakteryzowania wzorców ekspresji mRNA w dolnych drogach moczowo-płciowych myszy płodu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w dolnych drogach moczowo-płciowych myszy płodu. Technika umożliwia badanie lokalizacji przestrzennej i czasowej transkryptów o niskiej i wysokiej obfitości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować dr. Lan Yi z Cancer Institute of New Jersey za pomoc techniczną przy przygotowywaniu koszyczków tkankowych. Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health nr DK083425 oraz DK070219.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Stosując opisaną tutaj metodę, możliwe jest wykrycie mRNA we wszystkich głównych typach komórek i przedziałach tkankowych płodowych męskich i żeńskich układów moczowo-płciowych (LUT) myszy, w tym w poduszkach mezenchymalnych, urothelium, mięśniach gładkich, pąkach prostaty, przewodzie wytryskowym oraz w pochwie. Przekroje o grubości 50μm stosowane w tym protokole mają tę zaletę, że są wystarczająco grube, aby rozpoznać architekturę tkanki (np. naczynia krwionośne), a jednocześnie na tyle cienkie, aby uniknąć pułapkowania...

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-digoksigeninowe, fragmenty Fab</td><td>Grupa Roche</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Grupa Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże BM Purple AP, wytrącające się</td><td>Grupa Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowej, 24 dołki</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Digoksygenina 11-UTP</td><td>Grupa Roche</td><td>1277073910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Grupa Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr><td>Dwukrotna żyletka</td><td>Wilkinson Sword</td><td>Model klasyczny</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase – preparat do usuwania RNaz</td><td>Decon Laboratories</td><td>1102</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5786-1L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA z żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd, roztwór 25% w H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna, sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, roztwór 30% w H2O&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633-500</td><td></td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>Szybkowiążący klej błyskawiczny Loctite 404</td><td>Henkel Corp</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówki, 1,5 ml</td><td>Biologix Research Company</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Wkład do płytki hodowlanej Millicell</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Żywica do rozcierania molekularnego</td><td>G-Biosciences</td><td>786-138PR</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 4% roztwór w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy (PBS), bez Ca &amp;amp; Mg</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN1760420</td><td></td></tr><tr><td>Siatka poliestrowa, 33 mikrony, 12&quot;&amp;#157; x 24&quot;&amp;#157;</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMY-0033-D</td><td></td></tr><tr><td>roztwór proteinazy K, 20 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E195-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>roztwór Q</td><td>Qiagen</td><td>Dostarczono polimerazę DNA Taq</td><td></td></tr><tr><td>RNaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor RNazy</td><td>Grupa Roche</td><td>03335399001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>zestaw RNEASY mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNaza wolna od RNaz</td><td>Promega Corp.</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>agaroza niskotopliwa SeaPlaque</td><td>Lonza Inc.</td><td>50101</td><td></td></tr><tr><td>Surowica owcza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2263-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Stericup, 0,22 µm&amp;mu;m, polietersulfon, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu, ziarnisty</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227I-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S529-500</td><td></td></tr><tr><td>SSC, roztwór 20X</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S24022-4000.0</td><td></td></tr><tr><td>System do syntezy pierwszej nici SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza RNA T7</td><td>Grupa Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza DNA Taq</td><td>Qiagen</td><td>201203</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Wibromikrotom z zaawansowaną wanną do próbek</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000A</td><td></td></tr><tr><td>tRNA drożdży</td><td>Grupa Roche</td><td>109495</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mrna w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Rozwój dolnych dróg moczowo-płciowych (LUT) jest złożonym procesem. Złożoność ta przejawia się podczas formowania prostaty z płodowej cewki moczowej samca, co zależy od sygnałów androgenowych i oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych1,2. Zrozumienie mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za rozwój prostaty może ujawnić mechanizmy wzrostu, które zostają niewłaściwie reaktywowane w późniejszym życiu, prowadząc do chorób prostaty, takich jak łagodny przerost prostaty i rak prostaty.
Rozwijający się układ moczowo-płciowy (LUT) jest anatomicznie złożony. W momencie rozpoczęcia pączkowania prostaty w 16,5 dniu po zapłodnieniu (dpc) obecnych jest liczne typy komórek. Naczynia krwionośne, nerwy i mięśnie gładkie znajdują się w obrębie zrębu mezenchymalnego3. Zręb ten otacza wielowarstwowe nabłonek i daje początek płodowej prostacie poprzez paracrynne sygnały zależne od receptora androgenowego4. Tożsamość stromalnych genów reagujących na receptor androgenowy, niezbędnych do rozwoju prostaty, oraz mechanizm, w którym nabłonek przewodowy prostaty formuje się w odpowiedzi na te geny, nie są w pełni poznane. Zdolność do precyzyjnej identyfikacji typów komórek i lokalizacji ekspresji konkretnych czynników w ich obrębie jest niezbędna do dalszego zrozumienia rozwoju prostaty. Hybrydyzacja in situ (ISH) pozwala na lokalizację mRNA w obrębie tkanki. Zatem metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji wzorca i czasu ekspresji cząsteczek sygnałowych oraz ich receptorów, co pozwala na wyjaśnienie potencjalnych regulatorów rozwoju prostaty.
W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową technikę ISH służącą do identyfikacji wzorców ekspresji mRNA w płodowej cewce moczowej (LUT) myszy z wykorzystaniem przekrojów wykonanych mikrotomem wibracyjnym. Metoda ta oferuje szereg zalet w porównaniu z innymi protokołami ISH. Przeprowadzanie ISH na cienkich przekrojach przyklejonych do szkiełka jest technicznie trudne; krioprzekroje często charakteryzują się niską jakością strukturalną, natomiast zarówno krioprzekroje, jak i przekroje parafinowe często skutkują słabą rozdzielczością sygnału. Wykonywanie ISH na całych preparatach tkankowych może prowadzić do uwięzienia sondy. W przeciwieństwie do nich, nasza wysokoprzepustowa technika wykorzystuje grube przekroje, które ukazują szczegółową architekturę tkanki. Modyfikowane probówki do wirówek umożliwiają łatwą manipulację przekrojami podczas procedury ISH. Z pojedynczego LUT w 17,5dpc można przesiewowo zbadać maksymalnie 4 transkrypty mRNA, wykrywając do 24 transkrypty mRNA w jednym cyklu, co redukuje koszty i maksymalizuje wydajność. Metoda ta pozwala na identyczne przetwarzanie wielu grup badawczych jako jednej jednostki, co eliminuje wszelkie błędy systematyczne w interpretacji danych. Co najważniejsze dla badaczy prostaty, metoda ta umożliwia określenie lokalizacji przestrzennej i czasowej transkryptów mRNA o niskiej i wysokiej obfitości w płodowej cewce moczowej myszy, z której powstaje sieci przewodowa prostaty.

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Rozwój dolnych dróg moczowo-płciowych (LUT) jest złożonym procesem. Złożoność ta jest widoczna podczas formowania się prostaty z płodowego męskiego...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja wzorców ekspresji mRNA w rozwijających się tkankach dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych płodu myszy. Jest to osiągane poprzez syntezę sondy rybotropowej znakowanej digoksygenem z matrycy uzyskanej za pomocą PCR. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie grubych przekrojów z wykorzystaniem mikrotomu wibracyjnego.Trzecim krokiem jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ w przekrojach dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych umieszczonych w specjalnie dostosowanych koszyczkach. mRNA są wizualizowane poprzez detekcję immunohistochemiczną związanych sond rybo- przy użyciu osadzającego podłoża fosfatazy alkalicznej BM purple. Ostatecznie analiza mikroskopowa pozwala na wykazanie przestrzennej i czasowej lokalizacji transkryptów mRNA o niskiej i wysokiej liczebności w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych myszy płodowej.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak immunohistochemia, jest łatwość generowania sond ribo oraz możliwość ich zaprojektowania tak, aby rozpoznawały większość mRNA w całym genomie myszy. Choć metoda ta pozwala na wgląd w wzorce ekspresji mRNA podczas rozwoju układu moczowo-płciowego myszy pł

a-high-throughput-situ-hybridization-method-to-characterize-mrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda hybrydyzacji in situ o wysokiej wydajności do scharakteryzowania wzorców ekspresji mRNA w dolnym układzie moczowo-płciowym płodu mysiego

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Śmierć płodowa i okołoporodowa jest częstym zjawiskiem podczas badania zmian genetycznych wpływających na rozwój serca. Obrazowanie za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości poprawiło rozdzielczość 2-D i może dostarczyć doskonałych informacji na temat wczesnego rozwoju serca, stanowiąc idealną metodę wykrywania wpływu na strukturę i funkcję serca przed śmiercią.

Echokardiografia płodowa myszy

Ultra-wysokiej częstotliwości ultrasonografia to potężne narzędzie do obrazowania na żywo do badania nieprawidłowości w pracy serca u małych zwierząt. Jego nieinwazyjność pozwala na utrzymanie stanu fizjologicznego zarodków. W tym artykule pokazujemy zastosowanie ultrasonografii w trybie M do pomiaru częstości akcji serca zarodków przy E18,5 w macicy.

W macicy Pomiar tętna u myszy za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii w trybie m

Myszy są powszechnie używane do badania biologii ciąży. W przypadku takich badań wymagane jest jednak przerwanie ciąży, co wyklucza badania podłużne i wymaga wykorzystania dużej liczby zwierząt. Dlatego opisujemy nieinwazyjną technikę ultrasonografii o wysokiej częstotliwości do wczesnego wykrywania i monitorowania zdarzeń poimplantacyjnych u ciężarnej myszy.

Nowatorskie zastosowanie trójwymiarowej ultrasonografii o wysokiej częstotliwości do charakteryzowania wczesnej ciąży u myszy

mikro-RNA (miRNA) to krótkie i wysoce homologiczne sekwencje RNA, służące jako posttranskrypcyjne regulatory informacyjnych RNA (mRNA). Obecne metody wykrywania miRNA różnią się czułością i swoistością. Opisujemy protokół, który łączy hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu jednoczesnego wykrywania cząsteczek miRNA i białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Poznaj wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w dolnych drogach moczowo-płciowych myszy płodu. Technika umożliwia badanie lokalizacji przestrzennej i czasowej transkryptów o niskiej i wysokiej obfitości.

Wysokoprzepustowa metoda hybrydyzacji in situ do charakteryzowania wzorców ekspresji mRNA w dolnych drogach moczowo-płciowych myszy płodu (Wideo) | JoVE Journal

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Przeglądaj więcej filmów