System In Vitro do badania uśpienia nowotworów i przejścia w wzrost przerzutny

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest obserwacja w czasie rzeczywistym i w sposób wysokoprzepustowy wpływu potencjalnych czynników na uśpienie komórek nowotworowych lub ich wybudzanie ze stanu uśpienia, z wykorzystaniem poniższego testu in vitro do modelowania uśpienia nowotworu lub przejścia w wzrost przerzutowy. Osiąga się to poprzez uprzednie hodowanie uśpionych i/lub przerzutowych komórek nowotworowych w trójwymiarowym systemie hodowli w ekstrakcie błony podstawnej (BME), dostosowanym do formatu płytki 96-dołkowej. Podczas hodowli w systemie 3D komórki przerzutowe wchodzą w przejściową fazę uśpienia lub spoczynku.

W przeciwieństwie do nich, komórki nowotworowe pozostające w stanie uśpienia in vivo wchodzą w przedłużony stan spoczynku. W systemie hodowli 3D komórki przerzutowe mogą być następnie traktowane potencjalnymi środkami terapeutycznymi, aby zapobiec ich przejściu ze stanu spoczynku do proliferacji. Z kolei uśpione komórki nowotworowe mogą być traktowane potencjalnymi środkami, które mogą indukować ich przejście ze stanu spoczynku do proliferacji.

Zachowanie proliferacyjne komórek uśpionych i przerzutowych w wyniku leczenia zostanie ocenione poprzez dodanie zestawu do analizy proliferacji komórek CellTiter-96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay w wybranych punktach czasowych, a następnie analizę za pomocą czytnika płytek ELISA. Wyniki wykażą wpływ leczenia na proliferację komórek uśpionych lub przerzutowych nowotworu w oparciu o test proliferacji komórek w systemie 3D. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutnictwa, takie jak to, jakie czynniki i mechanizmy komórkowe utrzymują rozprzestrzenione komórki nowotworowe w stanie uśpienia oraz jakie czynniki i mechanizmy komórkowe indukują przejście ze stanu uśpienia nowotworu do przerzutów klinicznych.

W dniu poprzedzającym wykonanie testu proliferacji, inkubuj BME z redukowanym poziomem czynników wzrostu w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie, w dniu wykonania testu, wybierz do eksperymentu hodowlę komórek guza uśpionego lub przerzutowego. Następnie umieść płytkę 96-dołkową na tacy z lodem wewnątrz komory laminarnej.

Następnie za pomocą dozownika ze strzykawką pokryj każdą studzienkę płytki 50 µL rozmrożonego, schłodzonego na lodzie BME. Upewnij się, że w studzienkach nie powstały pęcherzyki powietrza. Umieść płytkę 96-dołkową pokrytą BME w inkubatorze z nawilżaniem, w atmosferze 5% carbon dioxide w temperaturze 37 °C na 30 minut. W tym czasie, podczas inkubacji płytki pokrytej BME, umieść butelkę z trypsyną w temperaturze 37 °C w celu jej ogrzania.

Odsaj PBS z komórek nowotworowych. Przepłucz płytki hodowlane 10 mililitrami PBS. Następnie odessaj PBS i dodaj do płytek hodowlanych dwa mililitry uprzednio podgrzanej trypsyny.

Inkubuj płytki przez pięć minut. Dodaj pięć mililitrów DMEM high glucose, uzupełnionego o 10%FCS i antybiotyki, do 15 mililitrowej probówki stożkowej. W tym czasie.

Po inkubacji przenieść odseparowane komórki do probówki 15 ml i policzyć komórki. Następnie odwirować całkowitą liczbę komórek przeznaczonych do hodowli w wirówce do kultur tkankowych przez pięć minut przy 1500 G w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać osad.

Pozostaw niewielką ilość pożywki, ponieważ w większości przypadków osad nie jest widoczny. Następnie lekko uderz w dno probówki, aby upewnić się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek. Następnie resuspenduj osad w 100 µL pożywki do testu na każde 2 × 10³ komórek.

Wielokrotnie potryturuj komórki za pomocą pipety 5 ml, aby zapewnić utrzymanie zawiesiny pojedynczych komórek. Przenieś 100 µL zawiesiny komórkowej na każdą studzienkę 96-dołkowej płytki pokrytej BME jako płytkę kontrolną do odejmowania tła. Do kilku studzienek 96-dołkowej płytki pokrytej BME dodaj dodatkowo 100 µL pożywki testowej na studzienkę. Następnie inkubuj płytki, odsysaj starą pożywkę i wymieniaj ją na nową pożywkę testową co cztery dni.

Aby ocenić proliferację komórek, do każdego dołka analizowanej płytki 96-dołkowej w wybranym punkcie czasowym eksperymentu należy dodać 20 µL wodnego roztworu Cell Titer 96 One z zestawu do analizy proliferacji komórek. Płytki należy inkubować przez dwie godziny. Następnie, używając czytnika płytek ELISA, należy zmierzyć absorbancję dołków eksperymentalnych oraz tła przy długości fali 490 nm w ramach przygotowania do immunofluorescencji.

Barwienie cząsteczek sygnałowych komórek i komórek nowotworowych. Rozmrozić BME w lodówce o temperaturze 4°C przez noc w dniu poprzedzającym wykonanie barwienia. W dniu barwienia umieścić ośmiokomorowy system szkiełek na tacy z lodem wewnątrz komory laminarno-wyciągowej. Następnie, używając pipety 200 µL, pokryć każdą komorę systemu szkiełek 50 µL lodowatego BME.

Upewnij się, że BME jest rozprowadzone równomiernie i że w dołkach nie powstały pęcherzyki powietrza. Inkubuj powlekane szkiełka przez 20 minut. Wybierz linię komórkową guza uśpionego lub przerzutowego.

Zbierz komórki przy użyciu trypsyny zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie połącz całkowitą liczbę komórek przeznaczonych do hodowli w probówce stożkowej o pojemności 15 ml. Teraz odwiruj komórki, ostrożnie ponownie odessij supernatant, pozostawiając niewielką ilość pożywki.

Aby rozbić osad, uderz w dno stożkowej probówki o pojemności 15 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Resuspender osad w 400 µl medium analitycznego na każde 5×10³ komórek. Kilkukrotnie potryturuj komórki pipetą o pojemności 5 ml, aby upewnić się, że zachowano zawiesinę pojedynczych komórek, a następnie nanieś 400 µL roztworu komórkowego do każdej z ośmiu komór powlekanych BME.

Następnie inkubuj system z szkiełek przedmiotowych, odessij stare medium i wymieniaj medium do analizy co cztery dni w wybranych punktach czasowych eksperymentu. Odessij górną warstwę medium, dodaj 200 µL fiksaty z dodatkiem tritonu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie odessij fiksaty z dodatkiem tritonu, dodaj 200 µL samej fiksaty i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne 25 minut.

Ponownie odessaj utrwalacz, a następnie dodaj 400 µL PBS do każdej studni. Inkubuj płytkę przez kolejne 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessaj PBS i dodaj 400 µL PBS zawierającego 0,05% Tween 20 i inkubuj przez kolejne 10 minut.

Również w temperaturze pokojowej. Teraz zablokuj utrwalone komórki, dodając 200 µL roztworu blokującego. Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę; po inkubacji odessij roztwór blokujący i do każdej próbki dodaj 200 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym.

Następnie inkubujemy preparaty na szkiełkach z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia odsysamy przeciwciało, a następnie trzykrotnie płuczemy dołki, dodając 400 µL PBS na 15 minut i odsysając roztwór po każdym cyklu. Po odsaniu PBS z ostatniego płukania, dodajemy 200 µL przeciwciała wtórnego sprzężonego z rod domine red.

Następnie przykryć system szkiełek z ośmioma komorami folią aluminiową i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie przemyć dołki roztworem PBS, analogicznie jak wcześniej, a po trzecim przemyciu zamontować szkiełka w medium montażowym beta shield z dodatkiem dpi.

Na koniec pozostaw preparaty do wyschnięcia na 40 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Przedstawiono tutaj przykład analizy proliferacji uśpionych komórek guza D 2.0 R oraz metastatycznych komórek D two A one w hodowli 3D. Komórki D 2.0 R pozostają w stanie uśpienia przez cały 14-dniowy okres hodowli eksperymentalnej, podczas gdy silnie metastatyczne komórki D two A one pozostają uśpione jedynie przez cztery do sześciu dni hodowli, po czym zaczynają proliferować w początkowej fazie uśpienia.

Wiele komórek pozostaje pojedynczych w hodowli 3D, co pokazano tutaj na reprezentatywnym zdjęciu hodowli z czwartego dnia, podczas gdy inne nieproliferujące komórki tworzą struktury wielokomórkowe. Przejście komórek D dwa A jeden ze stanu uśpienia do stanu proliferacyjnego w hodowli 3D przedstawiono na tym zdjęciu hodowli z 12. dnia. Wiąże się ono z gwałtownymi zmianami w morfologii komórek widocznymi na tej rycinie.

Przykładem czynnika zapobiegającego przejściu komórek D two A one ze stanu uśpienia do stanu proliferacyjnego jest traktowanie komórek D two A one specyficznym inhibitorem kinazy lekkiego łańcucha miozyny. Pozwala to utrzymać komórki D two A one w stanie uśpienia, jak przedstawiono na tej rycinie. Podczas przejścia ze stanu uśpienia (dni 1–4) do proliferacji następuje znaczący wzrost fosforylacji lekkiego łańcucha miozyny w komórkach D two A one (kolor czerwony), a następnie reorganizacja filamentów F-aktyny w postaci włókien stresowych aktyny (kolor zielony).

Dzień siódmy. Jednak zablokowanie aktywności kinazy lekkich łańcuchów miozyny w komórkach D2A1 za pomocą SHRA lub leku ML7 utrzymuje komórki D2A1 w stanie uśpienia i prowadzi do zahamowania fosforylacji lekkich łańcuchów miozyny, polimeryzacji aktyny oraz organizacji włókien stresowych, co widać tutaj. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować model in vitro do badania uśpienia nowotworu oraz przejścia w wzrost przerzutniczy.