Name: Wytwarzanie biosensorów elektrochemiczno-DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Poznaj wytwarzanie biosensorów elektrochemiczno-DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek w złożonych matrycach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu (OPP1015402) przyznanego przez Fundację Billa i Melindy Gatesów w ramach inicjatywy Grand Challenges Explorations Initiative oraz przez NIH za pośrednictwem grantów GM062958-01 i 2R01EB002046. Praca ta została w części wykonana pod egidą Departamentu Energii USA przez Lawrence Livermore National Laboratory na mocy kontraktu DE-AC52-07NA27344.

1. Przygotowanie do badania
<ol>
	<li>Należy zakupić odpowiednią, chemicznie zmodyfikowaną sondę DNA z firmy zajmującej się syntezą oligosutratów na zamówienie, takiej jak Biosearch Technologies (Novato, CA) lub Midland Certified (Midland, TX). Sonda jest modyfikowana podczas syntezy poprzez dodanie grupy C6 thiol na końcu 3’ oraz redoks-aktywnego błękitu metylenowego na końcu 5’.</li>
	<li>Sondę DNA należy rozpuścić w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym o pH 7.4 do stężenia 20 μM, a następnie zweryfikować stężenie, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru. Ze względu na obecność grupy błękitu metylenowego w sondzie DNA roztwór powinien mieć widoczny niebieski odcień.</li>
	<li>Należy świeżo przygotować 1 mL 10 mM roztworu tris(2-karboksyetylo)fosfiny TCEP w destylowanej wodzie dejonizowanej (DI-water). Z naszego doświadczenia wynika, że roztwory TCEP pozostają stabilne przez jeden tydzień przy przechowywaniu w ciemności w temperaturze 4°C.</li> 
	<li>Aby zredukować ewentualne wiązania disiarczkowe obecne w roztworze sondy DNA, należy połączyć 1 μL roztworu zapasu sondy DNA z 2 μL roztworu TCEP i delikatnie wymieszać za pomocą pipety. Mieszaninę należy inkubować przez jedną godzinę w ciemnym, schłodzonym pojemniku. Początkowo niebieski roztwór powinien stać się bezbarwny, ponieważ TCEP odwracalnie redukuje błękit metylenowy. Jeśli roztwór nie stanie się bezbarwny, należy powtórzyć procedurę, używając świeżego roztworu TCEP lub ewentualnie w temperaturze pokojowej.</li> 
	<li>Po godzinie zredukowany roztwór sondy DNA należy rozcieńczyć 1 mL buforu; pozwoli to uzyskać stężenie 20nM. W dalszej kolejności zestaw elektrod z dysków złotych będzie inkubowany w 20 μL porcjach tego rozcieńczonego roztworu sondy.</li>
	<li>Należy świeżo przygotować co najmniej 2 mL 2mM merkaptoheksanolu w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym.</li> 
</ol>
2. Przygotowanie czujnika
<ol>
	<li>Połącz proszek tlenku glinu o ziarnistości 0,05 mikrona z wodą na drobnoziarnistej ściereczce polerskiej. Wypoleruj zestaw złotych elektrod dyskowych (CH Instruments, Austin, TX), mocno dociskając złotą powierzchnię do wilgotnej ściereczki i wykonując ruchy w kształcie ósemki przez około trzy minuty dla każdej elektrody.</li>
	<li>Opłucz wypolerowane elektrody wodą DI i zanurz je w probówkach Eppendorf wypełnionych tą samą wodą. Poddaj je sonikacji przez pięć minut, aby usunąć pozostałości proszku tlenku glinu.</li>> 
	<li>Umieść elektrody w 0,5 M roztworze kwasu siarkowego, podłącz je do potencjostatu wraz z platynową elektrodą pomocniczą i srebrowo-chlorkową elektrodą odniesienia, a następnie wykonaj serię woltamperogramów w celu utlenienia, redukcji i elektrochemicznego oczyszczenia ich powierzchni. Następnie przeprowadź drugie oczyszczanie elektrochemiczne w roztworze 0,01 M KCl w 0,1 M kwasie siarkowym. Szczegółowe informacje na temat tych procedur czyszczenia znajdują się w naszej publikacji w Nature Protocols1 oraz w uzupełnieniu do tego filmu.</li>
	<li>Ustaw zestaw probówek Eppendorf o pojemności 2 mL w statywie i napełnij każdą z nich 200 μL roztworu sond DNA. Stężenie sond DNA w tym roztworze określi gęstość upakowania sond DNA na powierzchni sensora. Wydajność sensora jest silnie zależna od gęstości sond, a optymalna gęstość różni się w zależności od architektury sensora. Zatem stężenie sond stosowane na tym etapie powinno zostać zoptymalizowane dla każdego nowego typu sensora2. W przypadku architektur sond, które zbadaliśmy do tej pory, stężenia sond DNA stosowane na tym etapie mieszczą się w zakresie od 15 nM do 2 μm, przy czym typową wartością jest 20 nM.</li> 
	<li>Opłucz złote elektrody dyskowe wodą DI, a następnie zanurz je na jedną godzinę w odpowiednim roztworze sond DNA w probówce Eppendorf. Na tym etapie sondy DNA przyłączą się do powierzchni złotej elektrody poprzez utworzenie samoorganizującej się monowarstwy tiol-złoto.</li> 
	<li>Opłucz elektrody wodą DI, zanurz je w 2 mM merkaptoheksanolu w probówce Eppendorf i przechowuj w ciemnym miejscu przez 3 godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej, aby zapewnić całkowite utworzenie samoorganizującej się monowarstwy. Ten krok wprowadza merkaptoheksanol jako element mieszanej monowarstwy w celu zapewnienia stabilności całej struktury. Aby zapobiec odparowaniu, można zamknąć probówkę Eppendorf z elektrodą za pomocą parafilmu. W razie potrzeby sensory mogą być przechowywane w tym roztworze przez kilka dni.</li>
	<li>Przed użyciem sensora opłucz go wodą DI, a następnie namocz w buforze przez co najmniej dziesięć minut. Sensory przeznaczone do detekcji przeciwciał muszą przed użyciem zostać również zanurzone w 10 nM roztworze odpowiedniej nici rozpoznawczej, a następnie bardzo szybko opłukane buforem.</li>
</ol>
3. Testowanie czujnika, detekcja DNA
<ol>
	<li>W niniejszym protokole 17-nukleotydowa nić sondy jest przytwierdzona do złotej elektrody. Na jej końcu 3’ znajduje się reporter redoks w postaci błękitu metylenowego (Rysunek 1). Gdy cząsteczka sondy hybrydyzuje z nicią przechwytującą, prąd płynący przez obwód czujnika maleje.</li> 
	<li>Przepłucz nowy czujnik wodą DI i zanurz go w próbce ślepej pozbawionej celu, aby zarejestrować generowany sygnał tła. Podłącz czujnik do przewodu elektrody roboczej potencjostatu. Umieść platynową elektrodę pomocniczą oraz srebrową elektrodę odniesienia (Ag/AgCl) w roztworze.</li> 
	<li>Wykonaj pomiar w prądzie kwadratowym w zakresie od 0 do -0,6 V z amplitudą 25 mV i krokiem 1mV. Optymalna częstotliwość prądu kwadratowego zależy od szczegółów architektury sondy2,3; dla stosowanych przez nas architektur sond optymalne wartości zazwyczaj mieszczą się w zakresie od 60 do 600 Hz. Powinien pojawić się zaokrąglony pik przy około -0,35 V, co odpowiada potencjałowi redoks błękitu metylenowego (potencjał piku może nieznacznie przesuwać się w zależności od dokładnego pH roztworu testowego). Wysokość od prądu linii bazowej do tego piku jest proporcjonalna do wydajności przeniesienia elektronów między błękitem metylenowym a złotą elektrodą (Rysunek 2). Zapisz ten pomiar tła.</li>
	<li>Przenieś elektrody do roztworu zawierającego docelową cząsteczkę DNA, wyrównaj (od 5 do 120 min w zależności od wielkości, struktury i stężenia celu 4,5) i zarejestruj drugi woltamperogram w prądzie kwadratowym. Wysokość piku przy -0,35 V zmieni się w stosunku do początkowego pomiaru tła. Wartość tej zmiany jest powiązana ze stężeniem analitytu i stanowi główny wynik pomiarowy tego czujnika (Rysunek 3).</li> 
	<li>Pomiar względnej zmiany sygnału, czyli procentowego spadku lub wzrostu sygnału względem piku tła, jest często bardziej powtarzalny niż pomiar bezwzględnej zmiany prądu, ponieważ koryguje on różnice w powierzchni elektrody. Aby to obliczyć, różnicę między prądem piku a prądem piku tła dzieli się przez prąd piku tła.</li>
</ol>
4. Regeneracja sensora
<ol>
	<li>Po zakończeniu pomiarów umieść czujnik w pojemniku z wodą DI na 30 s lub opłucz go stałym strumieniem wody DI przez 30 s. Powtórz tę czynność jeszcze dwa razy, używając świeżej wody dejonizowanej. Uwaga: niektóre anality są odporne na tę metodę; w takich przypadkach należy zastosować intensywne płukanie w 6 M chlorku guanidyny lub 70% etanolu.</li>
	<li>Włóż czujnik z powrotem do roztworu, w którym będą wykonywane pomiary. W ciągu minuty wysokość piku powinna powrócić do wartości pierwotnej. Warto zauważyć, że czujniki te często wykazują nieco większą zmianę sygnału podczas pierwszego cyklu testowego i regeneracyjnego, a w kolejnych cyklach dają wyniki wysoce spójne6.</li>
</ol>
5. Testowanie sensora, detekcja przeciwciał
<ol>
	<li>W niniejszym protokole sonda DNA modyfikowana błękitem metylenowym i tiolem, wykorzystywana w tych czujnikach, służy jako nić „kotwicząca”7. Jest ona przytwierdzona bezpośrednio do elektrody złotej. Następnie dochodzi do hybrydyzacji z drugą, „rozpoznawczą” nicią DNA, która została kowalencyjnie sprzężona z odpowiednim antygenem (Rysunek 4). Pozytywne doświadczenia w syntezie niezbędnych chimer DNA-antygen uzyskaliśmy korzystając z usług komercyjnych firm syntezujących, takich jak Biosearch Technologies i Panagene. Etap hybrydyzacji przeprowadza się poprzez przeniesienie gotowego czujnika do probówki Eppendorf zawierającej 10 nM odpowiedniej rozpoznawczej nici DNA w PBS na 1 godzinę.</li> 
	<li>Umieść czujnik w odpowiednim roztworze blankowym. Podłącz go do przewodu elektrody roboczej potencjostatu, a do roztworu wprowadź platynową elektrodę pomocniczą oraz srebrowo-chlorkową elektrodę odniesienia.</li>
	<li>Wykonaj woltamperometrię z falą kwadratową zgodnie z powyższym opisem. Dla zastosowanej tutaj architektury sondy optymalna częstotliwość fali kwadratowej wynosi 60 Hz. Powinien pojawić się zaokrąglony piki w okolicach -0,35 V. Zapisz ten pomiar tła.</li>
	<li>Przenieś elektrody do roztworu zawierającego analizowany związek, inkubuj przez 5 do 60 min, a następnie zarejestruj drugi woltamperogram z falą kwadratową. Jeśli przeciwciało docelowe jest obecne, piki przy -0,35 V ulegnie zmniejszeniu. Wielkość tej zmiany jest związana z koncentracją przeciwciał.</li>
</ol>
6. Testowanie czujnika, detekcja małych cząsteczek
<ol>
	<li>W tym przypadku cząsteczką sondy na powierzchni sensora jest aptamer – cząsteczka DNA lub RNA wyselekcjonowana in vitro w celu wiązania specyficznego analitycznego związku cząsteczkowego, która zmienia swoją strukturę (zwija się) po związaniu z docelowym analitem8,9 (Rycina 5). Tutaj wykorzystujemy DNA-aptamer wiążący kokainę, opracowany przez laboratorium Stojanovica10,1.</li> 
	<li>Przepłucz nowy sensor wodą dejonizowaną (DI-water) i zanurz go w próbce ślepej, pozbawionej celu, aby zarejestrować generowany sygnał tła. Podłącz sensor do przewodu elektrody roboczej potencjostatu. Umieść w roztworze platynową elektrodę pomocniczą oraz srebrno-chlorkową elektrodę odniesienia.</li> 
	<li>Wykonaj woltamperometrię z falą prostokątną zgodnie z powyższym opisem. Dla zastosowanej tutaj konkretnej architektury sondy optymalna częstotliwość fali prostokątnej wynosi 20Hz (choć 60 Hz również jest skuteczne). Powinien pojawić się zaokrąglony pik w okolicach -0,35 V. Zapisz ten pomiar tła.</li> 
	<li>Przenieś elektrody do roztworu zawierającego docelowy analyt, inkubuj przez ok. 5 min, a następnie zarejestruj drugi woltamperogram z falą prostokątną. Wysokość piku przy -0,35 V ulegnie zmianie. Wielkość tej zmiany jest powiązana z stężeniem docelowego analitu. Jeśli nie masz dostępu do próbki kokainy, jako substytut można zastosować prokainę, której użycie nie jest regulowane.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki: 
W przypadku detekcji DNA przy zastosowaniu pierwszej architektury, sygnał powinien spaść o co najmniej 60% po osiągnięciu stanu równowagi przy 20 nM celu. 
Po trzech krótkich płukaniach wodą dejonizowaną sygnał powinien powrócić do wartości bardzo zbliżonej (w granicach 0,1-5%) do wartości pierwotnej. Sensory detekcyjne przeciwciał powinny wykazać spadek sygnału od 40 do 80%. Sensory oparte na aptamerach do detekcji kokainy wykazują wzrost sygnału do 20% w zależności od częstotliwości i stopnia pokrycia powierzchni, przy których pracują. W przypadku sensora kokainy najkorzystniejsze jest niskie pokrycie powierzchni3.
<img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Schemat elektrochemicznego sensora DNA; detekcja sekwencji poprzez transfer elektronów na elektrodzie Au." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wykrywanie DNA za pomocą elektrochemicznego biosensora DNA.
<img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Wykres woltamperometrii z impulsem kwadratowym, potencjał względem natężenia prądu, analiza danych elektrochemicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zrzut ekranu przedstawiający sygnał generowany przez biosensor E-DNA podczas woltamperometrii z falą prostokątną. 
<img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Wykres woltamperometrii impulsowej kwadratowej, potencjał względem natężenia prądu, analiza elektrochemiczna, wyniki SWV." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Zrzut ekranu przedstawiający sygnały generowane przez biosensor E-DNA podczas woltamperometrii z impulsem kwadratowym, przed i po hybrydyzacją z analitym.
<img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Schemat procesu elektrochemicznego czujnika DNA z elektrodą Au, detekcją celu i przeniesieniem elektronów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4. Wykrywanie przeciwciał za pomocą biosensora rusztowianowego.
<img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="hybrydyzacja DNA; schemat dodawania celu molekularnego na elektrodzie Au; przeniesienie elektronu (eT)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5. Wykrywanie kokainy lub prokainy za pomocą elektrochemicznego biosensora aptamerowego. 
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dostosowany oligonukleotyd</td>
			<td>Sekwencja</td>
			<td>Komentarze </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liniowa sonda DNA (LP17)</td>
			<td>5′-HS−(CH2)6−TGGATCGGCGTTATT−(CH2)7−NH−MB-3′</td>
			<td>Oczyszczony metodą HPLC, dostępny w wersji z mostkami S-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Docelowe DNA analityczne </td>
			<td>AATAAAACGCCGATCCA</td>
			<td>Niemodyfikowany </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nić rozpoznawcza</td>
			<td>5'-Antygen-TEG- CAGTGGCGTTATTCTTGTTACTG-3'</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kotwica rusztowania </td>
			<td>5'-HS-(CH2)6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH2)7-MB</td>
			<td>oczyszczone metodą HPLC, dostępny w wersji z mostkami S-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aptamer do kokainy A4</td>
			<td>5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3'</td>
			<td>Oczyszczony metodą HPLC, dostępny w wersji z mostkiem S-S</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Sekwencje sond i docelowego DNA.

<ol><li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+electrode-immobilized%2C+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li>
<li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li>
<li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Probe+Length%2C+Probe+Geometry%2C+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li>
<li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-Based+Electrochemical+Biosensors%3A+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li>
<li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-Specific%2C+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood%2C+Soil%2C+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless%2C+Reusable+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li>
<li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein%3FSmall+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li>
<li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electronic%2C+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid%2C+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li>
<li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Prada, P. de, Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li>
<li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Reusable%2C+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li>
<li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Specificity%2C+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li>
<li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li>
<li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless%2C+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li>
<li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li>
<li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous%2C+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic%2C+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li>
</ol>

Brak informacji do ujawnienia.

Ważną uwagą jest to, że żaden z opisanych powyżej eksperymentów nie będzie przebiegał prawidłowo, jeśli elektrody nie zostaną odpowiednio oczyszczone. Poniżej znajduje się przewodnik po naszej procedurze czyszczenia elektrochemicznego. Podczas pracy z potencjostatami firmy CH Instruments wykonujemy te kroki czyszczenia, korzystając z zestawu trzech programów makro.
Faza Zero (czyszczenie elektrochemiczne O) 
Zanurz elektrody w 0,5M H2SO4 i podłącz je do elektrod roboczych potencjostatu. Podłącz i zanurz również elektrodę odniesienia Ag/AgCl oraz platynową elektrodę pomocniczą. Rozpocznij od etapu utleniania (2 V przez 5 s), a następnie etapu redukcji (0,35 V przez 10 s).
Faza pierwsza (E-clean 1) 
Rozpocząć skanowanie utleniania i redukcji w tych samych warunkach kwasowych (0.5M H2SO4) w zakresie od 0.35 do 1.5 V (20 skanowań przy prędkości przesunięcia 4 V/s i odstępie próbkowania 0.01 V, a następnie cztery skanowania przy prędkości przesunięcia 0.1 V/s i odstępie próbkowania 0.01 V).
Faza druga (E-clean 2) 
Przeprowadź kolejną serię skanów utleniania i redukcji elektrochemicznej w warunkach kwasowych (0.01 M KCl/0.1 MH2SO4) obejmujących cztery różne zakresy potencjałów (wszystkie wykonane dla 10 segmentów przy prędkości skanowania 0.1 V s 1 i odstępie próbkowania 0.01 V): (i) zakres potencjałów od 0.2 do 0.75 V; (ii) zakres potencjałów od 0.2 do 1.0 V; (iii) zakres potencjałów od 0.2 do 1.25 V; (iv) zakres potencjałów od 0.2 do 1.5 V.
Do przeprowadzenia tych eksperymentów można wykorzystać wiele rodzajów elektrod złotych. Oprócz elektrod dyskowych ze złota, takich jak te zastosowane w niniejszej pracy, pomyślne wyniki osiągnięto również przy użyciu mikrofabrykowanych powierzchni złota, drutu złota oraz złota na płytkach drukowanych.
Oprócz sensorów opisanych w niniejszej pracy, opisano wiele innych architektur elektrochemicznych biosensorów DNA. Obejmują one sensory z architekturą w postaci pseudowęzła12, potrójnej nici13, kanapki14, super-kanapki15 lub tripleksu16.
Przewidujemy, że w przyszłości sensory te znajdą zastosowanie w diagnostyce medycznej w punkcie opieki (point-of-care). Zostały one z sukcesem zintegrowane z kilkoma urządzeniami mikroprzepływowymi17,18 i oferują wiele zalet w porównaniu do optycznych systemów detekcji analitów. W szczególności sensory te mogą funkcjonować w próbkach mętnych, optycznie gęstych i wykazujących silną autofluorescencję.

<table><tbody><tr><td>Złote elektrody dyskowe</td><td>CH Instruments, Inc.</td><td>CHI101</td><td>Możliwość ponownego użycia</td></tr><tr><td>Syntetyczne DNA sondy</td><td>Biosearch Technologies</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczne DNA docelowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Merkaptoheksanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>725226-1G</td><td>Przechowywać w chłodnym, ciemnym miejscu</td></tr><tr><td>Elektroda platynowa</td><td>BASi</td><td>MW-1032</td><td>Możliwość ponownego użycia</td></tr><tr><td>Referencja Ag/AgCl</td><td>BASi</td><td>MF-2052</td><td>Możliwość ponownego użycia</td></tr><tr><td>Ściereczka do polerowania</td><td>Buehler</td><td>40-7212</td><td></td></tr><tr><td>Pasta polerska tlenkowa</td><td>Buehler</td><td>40-6325-016</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowo-solny, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>CH Instruments 605A</td><td>CH Instruments, Inc.</td><td>605A</td><td>Można użyć dowolnego potencjostatu</td></tr><tr><td>Surowica z noworodka cielęcia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4637-500ML</td><td>Przechowywać w zamrażarce</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Można użyć dowolnego spektrofotometru UV-Vis</td></tr><tr><td>Mieszanka do PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8862</td><td>Przechowywać w zamrażarce</td></tr><tr><td>Kokaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5776</td><td>Wymagana licencja DEA</td></tr><tr><td>Prokaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9879</td><td>Substytut kokainy</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Flag</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów dna do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

W obecnej praktyce medycznej lekarze przesyłają próbki do laboratorium centralnego w celu wykonania badań, przez co muszą czekać godziny lub dni na otrzymanie wyników. Wielu pacjentów odniosłoby większą korzyść z szybkich testów wykonywanych przy łóżku chorego. W tym celu nasze oraz inne laboratoria opracowały wszechstronną, bezodczynnikową platformę biosensorową, która umożliwia ilościową, bezodczynnikową, elektrochemiczną detekcję kwasów nukleinowych (DNA, RNA), białek (w tym przeciwciał) oraz małocząsteczkowych analitów bezpośrednio w nieprzetworzonych próbkach klinicznych i środowiskowych. W tym filmie prezentujemy przygotowanie i zastosowanie kilku biosensorów z tej klasy „E-DNA”. W szczególności wytwarzamy i demonstrujemy sensory do detekcji docelowej sekwencji DNA w mieszaninie do reakcji łańcuchowej polimerazy, przeciwciała specyficznego dla HIV oraz narkotyku, jakim jest kokaina. Procedura przygotowania wymaga jedynie trzech godzin pracy manualnej, po których następuje inkubacja przez noc, a ich zastosowanie zajmuje zaledwie kilka minut.

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

W obecnej praktyce medycznej lekarze przesyłają próbki do laboratorium centralnego w celu przeprowadzenia badań, przez co muszą czekać godziny lub dni na otrzymanie wyników. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie i zastosowanie elektrochemicznych biosensorów DNA. Jest to realizowane poprzez uprzedną redukcję sondy DNA, a następnie oczyszczenie elektrod złotych, na których budowane są sensory. Kolejnym krokiem procedury jest naniesienie na elektrody złote zawierającej sondę DNA samoporządkującej się monowarstwy tioli na złocie.Następnie powierzchnię elektrody złotej wypełnia się mercaptoetanolem. Aby zapewnić utworzenie kompletnej, prawidłowo sformowanej monowarstwy, ostatnim etapem procedury jest zastosowanie czujników i próbek, takich jak bufor, mocz, surowica lub krew. W rezultacie można uzyskać wyniki wskazujące stężenia analitu poprzez zmiany prądu szczytowego w woltamperometrii z falą kwadratową lub prądem zmiennym.Technika ta ma szerokie zastosowanie w diagnostyce molekularnej, ponieważ czujniki te mogą wykrywać wiele różnych biomarkerów i cząsteczek leków bezpośrednio w moczu lub surowicy. Procedurę zaprezentuje pan Aaron Rowe, doktorant w mojej grupie badawczej. Wspierać go będą dwaj współpracownicy z ramienia staży podoktorskich, dr Ryan White oraz dr Andrew Bonham.Aby rozpocząć, należy zakupić odpowiednią sondę DNA od firmy zajmującej się syntezą oligonukleotydów na zamówienie; sonda ta jest modyfikowana podczas syntezy poprzez dodanie sześciowęglowego tiolu na końcu 5' oraz aktywną redoks błękitu metylenowego na końcu 3'. Rozpuścić sondę DNA, aby uzyskać roztwór o widocznym niebieskim zabarwieniu wynikającym z obecności grupy błękitu metylenowego. Zweryfikować stężenie, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru, a następnie zredukować wszelkie wiązania dwusiarczkowe, które mogą występować w roztworze sondy DNA. Połączyć 1 µL roztworu zapasowego sondy DNA z 2 µL świeżo przygotowanego roztworu TEP.Ostrożnie wymieszaj otrzymany roztwór za pomocą pipety. Inkubuj mieszaninę przez jedną godzinę w ciemnym pojemniku w lodówce. Podczas inkubacji niebieski roztwór powinien stać się klarowny, ponieważ TEP odwracalnie redukuje błękit metylenowy.Następnie rozcieńcz roztwór zredukowanej sondy DNA buforem PBS do pożądanego stężenia, które zazwyczaj mieści się w przedziale od 25 do 1000. Przygotowanie sensora do pomiaru anomolarnego rozpoczyna się od połączenia proszku Illumina o ziarnistości 0,05 mikrona z wodą na drobnoziarnistej ściereczce polerskiej. Użyj tej ściereczki do wypolerowania zestawu złotych elektrod dyskowych, mocno dociskając złotą powierzchnię do mokrej tkaniny i poruszając nimi w kształcie ósemki przez około trzy minuty na każdą elektrodę.Po płukaniu opłucz wypolerowane elektrody wodą dejonizowaną. Zanurz je w probówkach EOR wypełnionych wodą dejonizowaną. Następnie poddaj elektrody działaniu myjki ultradźwiękowej przez pięć minut, aby usunąć wszelkie pozostałości proszku Illumina.Po sonikacji umieść elektrody w 0,5 molarnym roztworze kwasu siarkowego. Następnie umieść w roztworze platynową elektrodę pomocniczą oraz srebrowo-chlorkową elektrodę odniesienia i podłącz je do potencjostatu. Przeprowadź następnie serię woltamperometrii cyklicznej, aby elektrochemicznie oczyścić powierzchnie elektrod.Szczegóły tych procedur zawarto w pisemnym uzupełnieniu do tego filmu oraz w artykule z serii Nature Protocols opublikowanym wcześniej przez tę grupę. Następnie należy przeprowadzić drugie czyszczenie elektrochemiczne w roztworze KCl w kwasie siarkowym zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Następnie należy ustawić w statywie zestaw probówek Eppendorf o pojemności 2 ml i napełnić każdą z nich 200 µL roztworu DNA sondy.Stężenie sondy, DNA w tym roztworze, określi gęstość upakowania sondy DNA na powierzchni sensora i powinno zostać zoptymalizowane dla każdego nowego typu sensora. Przepłucz złote elektrody tarczowe wodą dejonizowaną. Następnie zanurz je w odpowiednim roztworze sondy DNA w probówce typu Eppendorf na jedną godzinę.Na tym etapie DNA sondy przyłączy się do powierzchni złotej elektrody poprzez utworzenie samozorganizowanej monowarstwy tioli na złocie. Po ponownym przepłukaniu elektrod wodą dejonizowaną, zanurzyć je w roztworze mercaptoetanolu o stężeniu 2 mM w probówce typu Eppendorf. Pozwala to na wypełnienie wolnych przestrzeni na powierzchni, zapewniając powstanie kompletnej i stabilnej samozorganizowanej monowarstwy.Aby zapobiec parowaniu, uszczelnij elektrody w probówce einor za pomocą parafiny. Przechowuj zanurzone elektrody w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej od trzech godzin do całej nocy, aby zapewnić całkowite utworzenie monowarstwy samoorganizującej się. Aby przygotować czujnik do użycia po inkubacji, opłucz go wodą dejonizowaną, a następnie namocz w buforze przez co najmniej 10 minut.Detekcja DNA za pomocą sensorów jest zaprezentowana z wykorzystaniem 17-nukleotydowej nici sondy przymocowanej do złotej elektrody poprzez grupę tiolową na jej końcu 5', sonda zawiera reporter redox w postaci błękitu metylenowego na swoim końcu 3'. Gdy cząsteczka sondy hybrydyzuje z nicią wychwytującą, prąd elektrochemiczny generowany przez sensor spada. Aby rozpocząć, przepłucz nowy sensor wodą dejonizowaną i zanurz go w próbce ślepej.W celu zarejestrowania sygnału tła należy przeprowadzić pomiar falą kwadratową w zakresie od 0 do -0,6 V, z amplitudą 25 mV i krokiem napięcia 1 mV. Optymalna częstotliwość fali kwadratowej zależy od szczegółów konstrukcji sondy. Zaokrąglony pik powinien pojawić się przy około -0,25 V, co odpowiada potencjałowi redoks błękitu metylenowego.Wysokość prądu od linii bazowej do tego piku jest proporcjonalna do wydajności przeniesienia elektronów między błękitem metylenowym a elektrodą złotą. Zapisz ten pomiar tła. Następnie przenieś elektrody do roztworu zawierającego docelową cząsteczkę DNA i poczekaj, aż osiągną stan równowagi.Alternatywnie, docelowe DNA można dodać do roztworu, w którym zanurzone są sensory. Należy zarejestrować drugi woltamperogram w trybie fali kwadratowej. Wysokość piku przy wartości -0,25 V ulegnie zmianie w stosunku do początkowego pomiaru tła.Wielkość tej zmiany jest związana z stężeniem analitytu. Stanowi ona główny wynik pomiarowy czujnika. Po przeprowadzeniu pomiaru oblicz względną zmianę sygnału.Ten procent jest często bardziej powtarzalny niż pomiar bezwzględnej zmiany prądu, ponieważ koryguje on różnice w powierzchni między poszczególnymi elektrodami. Po zakończeniu procedury czujnik można zregenerować zgodnie z opisem w towarzyszącej procedurze pisemnej dotyczącej detekcji przeciwciał. W czujnikach zmodyfikowane metylenowym błękitem i tiolem DNA służy jako nić kotwicząca i jest przyłączone bezpośrednio do elektrody złotej.Następnie przeprowadza się hybrydyzację z drugą rozpoznawczą nicią DNA, która została kowalencyjnie sprzężona z odpowiednim antygenem. Kolejnym krokiem jest inkubacja ze specyficznym przeciwciałem docelowym. Etap hybrydyzacji wykonuje się poprzez przeniesienie gotowego sensora do probówki typu Eppendorf zawierającej 100 nM odpowiedniego elementu rozpoznającego.Inkubuj czujnik w PBS z nicią DNA przez jedną godzinę. Następnie zanurz go w buforze PBS, aby usunąć niezhybrydyzowane sondy przed przeniesieniem do roztworu ślepej próby. Następnie umieść czujnik w odpowiednim roztworze ślepej próby oraz wprowadź do roztworu platynową elektrodę pomocniczą i srebrowo-chlorkową elektrodę odniesienia.Podłącz elektrody do potencjostatu. Wykonaj woltamperometrię z falą prostokątną zgodnie z wcześniejszym opisem; optymalna częstotliwość fali prostokątnej dla konkretnej architektury sondy użytej w tym przykładzie wynosi 60 hertz. W okolicach wartości -0,25 V powinien pojawić się zaokrąglony pik.Zapisz ten pomiar tła. Po inkubacji trwającej od 5 do 60 minut przenieś elektrody do roztworu zawierającego analizowany analit i zarejestruj drugi woltamperogram w trybie fali kwadratowej. Jeśli przeciwciało docelowe jest obecne, pik przy wartości -0,25 V ulegnie zmniejszeniu.Wielkość tej zmiany jest związana ze stężeniem przeciwciał. Aby zademonstrować detekcję małych cząsteczek, jako DNA sondy na powierzchni sensora zastosowano aptamer. Aptamer to cząsteczka DNA lub RNA, która została wyselekcjonowana in vitro w celu wiązania specyficznego analitycznego związku molekularnego.Aptamery często można modyfikować w celu zmiany ich struktury. W wyniku takiego wiązania aptamer zastosowany w niniejszym badaniu zmienia swoją konformację po związaniu się z lekiem, jakim jest kokaina.Aby rozpocząć, należy przepłukać nowy czujnik wodą dejonizowaną i zanurzyć go w próbce ślepej, pozbawionej analitu, w celu zarejestrowania generowanego sygnału tła. Następnie należy umieścić w roztworze platynową elektrodę pomocniczą oraz srebrno-chlorkową elektrodę odniesienia. Elektrody należy podłączyć do przewodów potencjostatu, a następnie przeprowadzić pomiar metodą woltamperometrii z falą kwadratową lub prądem zmiennym.Jak opisano wcześniej, optymalna częstotliwość fali prostokątnej dla zastosowanej tutaj architektury sondy wynosi 60 hertz. Ponownie powinien pojawić się zaokrąglony pik w okolicach minus 0,25 wolta, który należy zapisać jako pomiar tła. Następnie należy przenieść elektrody do roztworu zawierającego analizowany związek.Po 32. inkubacji zarejestruj drugi woltamperogram z wykorzystaniem fali kwadratowej lub prądu przemiennego. Wysokość piku przy napięciu -0,25 V ulegnie zmianie. Wielkość tej zmiany jest powiązana ze stężeniem badanego anality.W przypadku zastosowania elektrochemicznych biosensorów DNA do wykrywania DNA przy użyciu opisanej tutaj architektury sondy, sygnał powinien zmaleć o co najmniej 60%. Po trzykrotnym krótkim płukaniu w wodzie dejonizowanej i osiągnięciu równowagi z 200 nanomolarnym celem, sygnał powinien powrócić do wartości w przedziale od 0,1 do 5% wartości pierwotnej. Podobnie, gdy opisane tutaj sensory są wykorzystywane do wykrywania przeciwciał, sygnał powinien zmaleć o 40 do 80% po związaniu przeciwciała. Z kolei sensory oparte na aptamerach do wykrywania kokainy wykazują wzrost sygnału do 200% po związaniu małych cząsteczek.Wielkość tej zmiany zależy od częstotliwości odpytywania elektrochemicznego oraz stopnia pokrycia powierzchni sensorów. W przypadku sensora do kokainy najkorzystniejsze jest stosunkowo niskie pokrycie powierzchni. Po opanowaniu techniki, wytwarzanie i stosowanie tych sensorów można przeprowadzić w ciągu jednego dnia.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że parametry takie jak częstotliwość fali kwadratowej lub gęstość sond na powierzchni elektrody mają ogromny wpływ na działanie czujnika. Po obejrzeniu tego filmu dowiesz się, jak przygotować elektrochemiczne biosensory DNA, biosensory aptamerowe oraz biosensory rusztowaniowe, a także jak wykorzystać je do szerokiego zakresu podstawowych pomiarów. Jedynym istotnym zagrożeniem w tym protokole jest stosowanie kwasu siarkowego, który jest substancją żrącą, dlatego obowiązkowe jest stosowanie ochrony oczu i rękawic.

fabrication-electrochemical-dna-biosensors-for-reagentless-detection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Produkcja elektrochemicznych biosensorów DNA do bezreagentowego wykrywania kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Opisujemy protokół produkcji i pomiaru urządzeń dla biosensorów wysokiej częstotliwości opartych na nanorurkach węglowych. Technika wykrywania wysokiej częstotliwości łagodzi podstawowy efekt ekranowania jonowego (Debye) i umożliwia pracę biosensora z nanorurkami w roztworach o wysokiej sile jonowej, w których zawodzą konwencjonalne bioczujniki elektroniczne. Nasza technologia stanowi unikalną platformę dla elektronicznych bioczujników przyłóżkowych (POC) działających w warunkach fizjologicznie...

Wytwarzanie nanoelektronicznego biosensora wysokiej częstotliwości z nanorurek węglowych do wykrywania w roztworach o wysokiej sile jonowej

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Synteza asymetrycznych gatunków ferrocenu jest wyzwaniem przy użyciu technik rozwiązań.  Niniejszy raport koncentruje się na metodach przeprowadzonych w celu wytworzenia biokoniugatu ferrocen-biotyna przy użyciu łatwych i czystych reakcji przeprowadzanych w drodze syntezy w fazie stałej.  Wykazano, że włączenie ugrupowania tiolanowego nadaje zdolność do unieruchamiania na powierzchniach złota.

Metodologia syntezy asymetrycznych układów biosprzężonych pochodzących z ferrocenu za pomocą metodologii opartej na żywicy w fazie stałej

Opisujemy kluczowe etapy biodetekcji za pomocą tranzystorów polowych z polikrzemu nanoprzewodowego, w tym przygotowanie urządzenia oraz immobilizację i potwierdzenie sondy molekularnej DNA na powierzchni nanodrutu, a także warunki do wykrywania DNA.

Przygotowanie tranzystora polowego z nanodrutu krzemowego do zastosowań chemicznych i biosensorycznych

Kwasy nukleinowe są powszechnymi analitami do oceny systemów biologicznych; jednak stronniczość wynikająca z manipulacji enzymatycznych może budzić niepokój. W tym miejscu opisano metodę bezznacznikowego wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą polianiliny. Ta czuła, ekonomiczna technologia czujników może rozróżniać różnice między pojedynczymi nukleotydami między cząsteczkami.

Czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Przedstawiono protokół rozwoju elektrochemicznego biosensora DNA, składającego się z stabilizowanej kwasem polimlekowym, modyfikowanej nanocząstkami złota, sitodrukowanej elektrody węglowej do wykrywania Vibrio parahaemolyticus.

Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Metoda wytwarzania cienkich elektrod międzypalcowych (szczelina i szerokość: 20 μm) na końcu igły podskórnej (średnica: 720 μm) jest demonstrowana przy użyciu powłoki natryskowej i elastycznej folii fotomaski w procesie fotolitografii.

Wytwarzanie cienkich elektrod na końcówce igły podskórnej przy użyciu powłoki Photoresist Spray Coating i elastycznej fotomaski do zastosowań biomedycznych

Przedstawiono protokół selekcji in vitro i charakterystyki aptamerów DNA wiążących estry kwasu ftalowego specyficznych dla grupy. Uwzględniono również zastosowanie wybranego aptameru w elektrochemicznym czujniku aptasensorycznym.

Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Poznaj wytwarzanie biosensorów elektrochemiczno-DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek w złożonych matrycach biologicznych.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów