Name: Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry do badania fizjologii melanocytów, progresji czerniaka i zachowania komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia ocenę przedkliniczną leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Wistar Institute Animal Facility, Microscopy Facility, Histotechnology Facility oraz Research Supply Center. Badanie to zostało sfinansowane częściowo z grantów National Institutes of Health CA 076674, CA 098101, CA 025874 oraz CA 10815.

1. Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry:
<ol>
 <li>Przygotowanie warstwy abezylowej: W probówce o pojemności 50 ml, w warunkach chłodzenia na lodzie, wymieszać następujące odczynniki: 0,59 ml 10X EMEM, 50 μl 200 mM L-glutaminy, 0,6 ml FBS, 120 μl 7,5% wodorowęglanu sodu i 4,6 ml kolagenu bydlęcego typu I. Do każdego insertu w taczkach do hodowli tkankowej należy dodać 1 ml mieszaniny. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, aż żel stężeje. Kolor mieszaniny powinien być od słomkowo-żółtego do różowego.</li>
 <li>Poddać ludzkie fibroblasty z kolb hodowlanych trypsynizacji przy użyciu 0,25% trypsyny/EDTA, a następnie dodać DMEM zawierający 10% FBS w celu neutralizacji. Zebrać komórki poprzez wirowanie i resuspendować 0,45 x 106 komórki w 1,5 ml DMEM z 10% FBS. W przypadku dermalnych komórek macierzystych należy zebrać 6600 sfer dermalnych (podczas wzrostu w medium dla komórek macierzystych, dermalne komórki macierzyste tworzą sfery w sposób analogiczny do neurosfer), opukując kolbę w celu odłączenia sfer, a następnie przeprowadzając wirowanie.</li>
 <li>Przygotowanie warstwy komórkowej: W probówce o pojemności 50 mL, w warunkach chłodzenia w lodzie, wymieszać następujące składniki: 1,65 mL 10X EMEM, 150 μl 200 mM L-glutaminy, 1,85 ml FBS, 350 μl 7,5% wodorowęglanu sodu, 14 ml kolagenu bydlęcego typu I oraz 1,5 ml zawiesiny fibroblastów z kroku 2 (alternatywnie należy użyć kombinacji 0,45 x 106 fibroblasty oraz 6600 sfer dermalnych w 1,5 ml pożywki do rekonstrukcji skóry I (dla rekonstruktów dermalnych komórek macierzystych), wymieszać dokładnie. Do każdego insertu pokrytego warstwą acellularną dodać 3 ml mieszaniny. Inkubować przez 45 min w temperaturze 37 °C w 5% CO22 inkubator do hodowli tkankowych. Kolor mieszaniny powinien zmieniać się od słomkowożółtego do różowego. Po zestaleniu się żelu dodać DMEM zawierający 10% FBS (2 ml do wnętrza i 10 ml na zewnątrz insertu w każdym dołku tacek do rekonstrukcji skóry). Inkubować przez 4 dni, upewniając się, że żel uległ kontrakcji.</li>
 <li>Odssać medium z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu. W celu wypłukania standardowej surowicy dodać medium piorące (HBSS z 1% dializowanym FBS) w ilości 2 ml do wnętrza oraz 10 ml na zewnątrz wkładu. Inkubować przez 1 godzinę w 37 °C.</li>
 <li>Przygotowanie pożywki do rekonstrukcji skóry:
 <ol>
 <li>W przypadku rekonstruktów normalnych melanocytów i dermalnych komórek macierzystych: aby przygotować pożywkę podstawową (500 ml), należy zmieszać następujące odczynniki: 490 ml bezzbiłkowej pożywki dla keratynocytów, 1,8 ml ekstraktu z przysadki bydlęcej, 10 ml dializowanej płodowej surowicy bydlęcej, 500 μl z 10 μg/mL SCF, 562.5 μl z 4 μg/mL bFGF i 500 μl z 264 μg/mL ET-3. Pożywka I: Dodaj 10 μl EGF z 100 μg/mL do 100 ml pożywki zasadowej. Pożywka II: Dodać 2 μl EGF do 100 mL pożywki podstawowej. Pożywka III: Dodać 720 μl CaCl₂2 od 1 M do 300 ml pożywki podstawowej.</li>
 <li>Do rekonstrukcji skóry z czerniakiem: Aby przygotować Medium I (100 ml), zmieszać następujące odczynniki: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM's), 2 ml L-glutaminy o stężeniu 200 mM, 200 μl hydrokortyzonu 269 μg/mL, 200 μl obiektyw 500X, 200 μl 0,05 M O-fosforyloetanoloaminy, 200 μl adeniny o stężeniu 90 mM, 200 μl progesteron w stężeniu 2 nM, 240 μl CaCl22 o stężeniu 1 M, 200 μl trijodotyronina w stężeniu 10 nM oraz 100 μl surowicy z noworodków cieląt oczyszczonej Chelexem (rozpuścić 3 g Chelex 100 w 100 ml surowicy, mieszać przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C, wysterylizować przez filtr). Aby przygotować Medium II (100 ml), zmieszać następujące odczynniki: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM's), 2 ml L-glutaminy o stężeniu 200 mM, 200 μl hydrokortyzonu 269 μg/mL, 200 μl obiektywy 500X, 200 μl 0,05 M O-fosforyloetanolaminy, 200 μl adeninę o stężeniu 90 mM, 200 μl progesteron w stężeniu 2 nM, 240 μl 1 M CaCl2, 200 μl trijodotyronina w stężeniu 10 nM i 100 μl surowica z noworodka cielęcia. Aby przygotować Medium III (300 ml), należy zmieszać następujące odczynniki: 142,5 ml DMEM, 142,5 ml F12 (HAM's) oraz 6 ml L-glutaminy o stężeniu 200 mM, 600 μl hydrokortyzonu 269 μg/mL, 600 μl obiektywy 500X, 600 μl 0,05 M O-fosforyloetanoloaminy, 600 μl adeniny o stężeniu 90 mM, 600 μl progesteron w stężeniu 2 nM, 720 μl CaCl22 o stężeniu 1 M, 600 μl Trijodotyronina w stężeniu 10 nM oraz 6 ml surowicy z noworodka cielęcia.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Potraktuj ludzkie keratynocyty z kolb hodowlanych 0,05% trypsyną/EDTA, zneutralizuj trypsynę za pomocą inhibitora trypsyny z soi (250 mg/L w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem), odwiruj, a następnie resuspenduj pellet komórkowy do stężenia 4,17 x 106 komórek/ml w medium do rekonstrukcji skóry I.</li>
 <li>Poddać trypsynizacji ludzkie melanocyty lub komórki czerniaka z kolb hodowlanych przy użyciu 0,05% trypsyny/EDTA, zneutralizować trypsynę za pomocą inhibitora trypsyny z soi, odwirować, a następnie zawiesić osad komórkowy w stężeniu 0,83 x 106 komórek/ml w medium do rekonstrukcji skóry I.</li>
 <li>Usuń medium piorące z wnętrza i z zewnętrznej strony każdego insertu.</li>
 <li>Dodać pożywkę do rekonstrukcji skóry I (1,5 ml do wnętrza i 10 ml na zewnątrz każdego insertu).</li>
 <li>Pobierz 600 μl suspensja komórkowa keratynocytów i 600 μl zawiesina komórkowa melanocytów lub komórek czerniaka, wymieszać dokładnie. Rozdzielić 200 μl mieszaninę zawiesiny komórkowej kropla po kropli do wnętrza każdego wkładu. Do rekonstrukcji komórek macierzystych skóry należy użyć 100 μl wyłącznie zawiesiny keratynocytów. Inkubować przez 2 dni w 37 °C.</li>
 <li>Odssać pożywkę do rekonstrukcji skóry I z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu. Dodać pożywkę do rekonstrukcji skóry II (2 ml do wnętrza i 10 ml na zewnątrz). Inkubować przez kolejne 2 dni w 37 °C.</li>
 <li>Odssać podłoże do rekonstrukcji skóry II (skin reconstruct medium II) z wnętrza i z zewnętrznej strony każdego insertu, a następnie dodać 7,5 ml podłoża do rekonstrukcji skóry III (skin reconstruct medium III) wyłącznie na stronę zewnętrzną. Od tego momentu powierzchnia rekonstruktów zostaje wystawiona na działanie powietrza. Wymieniać podłoże III co drugi dzień aż do 18. dnia.</li>
 <li>Pobranie zrekonstruowanej skóry w 18. dniu:
 <ol>
 <li>Odssać pożywkę z wnętrza i z zewnątrz insertów.</li>
 <li>Za pomocą pęsety wyjmij wkłady z tacki.</li>
 <li>Wytnij rekonstrukcję (łącznie z filtrem poliwęglanowym), prowadząc ostrzem skalpela po okręgu blisko krawędzi.</li>
 <li>Przetnij rekonstrukt oraz filtr na pół na twardej powierzchni.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>W przypadku skrawków parafinowych: połowę rekonstruktu należy umieścić w kasecie histologicznej pomiędzy dwoma czarnymi papierami do biopsji TBS, a następnie zanurzyć całą kasetę w 10% formalinie na ponad 4 godziny. Następnie kasetę należy umieścić w 70% etanolu i przechowywać w 4 °C do momentu rozpoczęcia procesu rekonstrukcji do zatapiania w parafinie.</li>
 <li>W przypadku skrawków mrożonych:
 <ol>
 <li>Umieść drugą połowę rekonstruktu w 50% sacharozie w temperaturze 4 °C przez 1–2 godziny, następnie zmienić stężenie sacharozy na 2M i przechowywać w 4 °C przez kolejne 1-2 godziny.</li>
 <li>Nalej medium do mrożenia OCT (optimal cutting temperature) do jednorazowej formy podstawowej tak, aby wypełniło ono około 50% objętości formy. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza w medium OCT.</li>
 <li>Chwyć krawędź rekonstruktu pęsetą i wyjmij go z sacharozy. Połóż go na ręcznikach Kimwipes, aż wchłoną one sacharozę.</li>
 <li>Przenieś rekonstrukcję do formy podstawowej na wierzch OCT, używając pęsety i szpatułki. Przykryj górną część rekonstrukcji kolejną warstwą OCT, aż forma podstawowa zostanie całkowicie wypełniona. Upewnij się, że w OCT nie ma pęcherzyków powietrza, które utrudniłyby cięcie.</li>
 <li>Umieść formę podstawową równomiernie na kruszonym suchym lodzie i poczekaj do całkowitego zamrożenia OCT.</li>
 <li>Owiń formę bazową folią aluminiową i przechowuj w temperaturze -70 °C do momentu przygotowania do cięcia w kriostacie.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przeszczep rekonstrukcyjny skóry u myszy:
 <ol>
 <li>Przygotować probówkę typu Falcon o pojemności 50 ml z 5 ml pożywki DMEM (do zamrażania i rozmrażania skóry mysiej).</li>
 <li>Należy użyć samicy bezwłosej myszy outbred SCID w wieku około 6 tygodni.</li>
 <li>Myszy poddaje się znieczuleniu izofluranem (system EZ anesthesia): znieczulenie wstępne przeprowadza się w komorze indukcyjnej z użyciem 4% izofluranu (przed przeniesieniem myszy na stół operacyjny), a następnie utrzymuje znieczulenie za pomocą maski nosowej podczas procedury (izofluran: 1,5–2%). W celu zapobiegania hipotermii stosuje się ogrzewanie za pomocą podkładki grzewczej, a aby uniknąć uszkodzeń gałek ocznych podczas znieczulenia, aplikuje się sterylny lubrykant oftalmiczny.</li>
 <li>Wlać 600 ml wody do zlewki i pozostawić na płycie grzejnej, aby utrzymać temperaturę wody w zakresie 40 - 60 °C.</li>
 <li>Oczyścić skórę myszy za pomocą nalewki z benzoesanu i gazików nasączonych alkoholem.</li>
 <li>Zaznacz linię na grzbiecie myszy, aby zachować tę samą pozycję podczas późniejszego szycia.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek Iris i pęsety wyciąć na górnej części grzbietu myszy okrągły obszar rany o średnicy około 1,2 cm. Obszar rany przykryć sterylnymi gazykami. Wycięty okrągły fragment skóry mysiej umieścić w 5 ml DMEM, a następnie pozostawić w pojemniku z ciekłym azotem do całkowitego zamrożenia. Probówkę rozmrozić w gorącej wodzie na płytce grzejnej aż do całkowitego rozmarznięcia. Procedurę powtórzyć 3 razy.</li>
 <li>Oddziel rekonstrukt skóry z insertu transwell za pomocą skalpela i bardzo ostrożnie usuń membranę, a następnie przenieś rekonstrukt skóry (warstwą naskórka do góry) na łoże rany.</li>
 <li>Umieść skórę mysi (warstwą naskórka do góry) na powierzchni rekonstruktu skóry.</li>
 <li>Wykonaj pierwszy szew w miejscu wcześniej zaznaczonego markera, drugi na dole, a następnie dwa kolejne szwy po bokach, aby utrwalić skórę myszy.</li>
 <li>Oczyścić skórę myszy po przeszczepie. Zdjąć stożek nosowy i pozostawić mysz na podgrzewanym podkładzie do momentu odzyskania przytomności i zdolności do poruszania się.</li>
 <li>Przenieś mysz do nowej klatki.</li>
 <li>Analgezja pooperacyjna: meloksykam (1 mg/kg) podawany podskórnie bezpośrednio po zabiegu, 24 godziny oraz 48 godzin po zabiegu.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Reprezentatywne wyniki:
Rekonstrukty skóry z prawidłowymi melanocytami i dermalnymi komórkami macierzystymi 
Rekonstrukty skóry są hodowane w specjalnej płytce 6-dołkowej z wkładkami. Kompartment dermalny jest hodowany w pożywce DMEM z 10% FBS przez pierwsze cztery dni (Rys. 1A). Pożywka do rekonstruktów skóry I jest stosowana podczas wysiewania keratynocytów z melanocytami lub komórkami czerniaka (Rys. 1B). W 9. dniu naskórek zostaje wystawiony na działanie powietrza, co umożliwia różnicowanie keratynocytów (Rys. 1C). W 18. dniu naskórek rekonstruktów skóry składa się z warstwowych warstw keratynocytów. Niedróżnicowana warstwa podstawna i kolejno różnicujące się warstwy są zorientowane pionowo (Rys. 1D). Barwienie przekroju rekonstruktów markerem melanocytarnym S100 wykazuje, że melanocyty są rozmieszczone w warstwie podstawnej naskórka i komunikują się z wieloma keratynocytami poprzez wypustki dendrytyczne (Rys. 1E). Kompartment dermalny zawiera fibroblasty zatopione w macierzy kolagenu typu I. Zdeponowany kolagen IV wskazuje na błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej (Rys. 1F). Gdy dermalne komórki macierzyste (oznaczone lentiwirusem GFP) są zatopione wraz z fibroblastami w macierzy kolagenu I, migrują one do naskórka i różnicują się w melanocyty (1), (Rys. 2). W naskórku rozwija się wiele warstw keratynocytów.
Rekonstrukcje skóry z guzami czerniaka 
Badania kliniczno-patologiczne wskazują, że czerniaki postępują w sposób etapowy: powszechne nabyte znamiona, znamiona dysplastyczne, czerniaki w fazie wzrostu radialnego (RGP), czerniaki w fazie wzrostu pionowego (VGP) oraz czerniaki przerzutowe (7). Różne stadia linii komórkowych czerniaka są morfologicznie do siebie podobne w hodowli 2-D (Ryc. 3A-D), jednak po włączeniu ich do rekonstrukcji skóry zachowanie komórek odzwierciedla ich charakterystykę in vivo. Lokalizacja i tempo wzrostu prawidłowych melanocytów są ściśle kontrolowane w rekonstrukcjach skóry (Ryc. 3E). Pierwotne czerniaki RGP WM35 proliferują głównie w naskórku (Ryc. 3F), podczas gdy czerniaki VGP WM793 rosną inwazyjnie w głąb skóry właściwej (Ryc. 3G). Czerniaki przerzutowe 1205Lu agresywnie naciekają głęboko do skóry właściwej (Ryc. 3H).
<img alt="Schematy inżynierii tkankowej: A-C układ z próbkami tkanek. D-F wyniki analizy mikroskopowej." src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Rekonstrukcje skóry z normalnymi melanocytami. Wygląd makroskopowy rekonstrukcji skóry przedstawiono na panelach A-C. A. Fibroblasty zmieszane z kolagenem są hodowane w DMEM zawierającym 10% FBS i tworzą komponent skórny. B. Keratynocyty i melanocyty są wysiewane na wierzch skóry właściwej i rosną w medium do rekonstrukcji skóry. C. Naskórek zostaje wystawiony na działanie powietrza w 9. dniu. D. Rekonstrukcja skóry barwiona H&amp;E wykazuje naskórek składający się z pionowo zorientowanej warstwy podstawnej oraz następujących po niej zróżnicowanych warstw komórek wielowarstwowych. Skóra właściwa zawiera fibroblasty osadzone w macierzy kolagenu typu I. E. Melanocyty S100-dodatnie (czarne strzałki) są rozmieszczone wzdłuż błony podstawnej i komunikują się z wieloma keratynocytami. F. Barwienie na kolagen IV wskazuje błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Wszystkie barwienia w panelach D-F zostały wykonane na przekrojach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.
<img alt="Etapy wzrostu komórek w ciągu dni, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, barwienie HMB45 wskazane strzałkami." src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Dermalne komórki macierzyste w rekonstruktach skóry migrują do naskórka i różnicują się w melanocyty. W 5. dniu po wysianiu keratynocytów pojedyncze komórki GFP-dodatnie (zielone) zaczynają migrować poza sfery. Naskórek nadal składa się z jednej warstwy. W 8. dniu kilka komórek dociera do granicy naskórka i skóry właściwej. Do 10. dnia komórki GFP-dodatnie są ściśle ułożone w pozycji błony podstawnej. Zmigrowane do naskórka komórki GFP-dodatnie wykazują ekspresję markera melanocytarnego HMB45 (czerwony, wskazany białymi strzałkami). Jądra komórkowe są barwione DAPI (niebieski). Naskórek rozwija się w wiele warstw. Błonę podstawną zaznaczono białymi liniami przerywanymi.
<img alt="Morfologia hodowli komórkowych i preparaty histologiczne; obrazy mikroskopowe struktur komórkowych i próbek tkanek." src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Rekonstrukcje skóry na różnych etapach czerniaka: A-D. Normalne melanocyty i komórki czerniaka hodowane w kulturach 2D. A. Melanocyty z napletka. B. Komórki RGP WM35. C. Komórki VGP WM793. D. Komórki przerzutowego czerniaka 1205Lu. E. Normalne melanocyty znajdują się w błonie podstawnej. F. Komórki czerniaka RGP WM35 rosną w postaci skupisk komórek w naskórku. G. Komórki czerniaka VGP WM793 naciekają do skóry właściwej poprzez błonę podstawną. H. Komórki przerzutowego czerniaka 1205Lu agresywnie naciekają głęboko do skóry właściwej.
 
Rozwiązywanie problemów
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Problem</td>
 <td>Rozwiązywanie problemów</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mieszanina kolagenu nie twardnieje</td>
 <td>Kolor mieszaniny kolagenu powinien być słomkowo-żółty do różowego; w przeciwnym razie pH jest niewłaściwe i kolagen może nie żelować. Jeśli kolor jest jaskrawożółty, należy dodać więcej wodorowęglanu sodu, dodając go kropla po kropli.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kolagen przedwcześnie wytrąca się w mieszaninie</td>
 <td>Wszystkie komponenty należy przechowywać w lodzie do momentu umieszczenia mieszaniny kolagenu na wkładce</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Skurczony kolagen nie jest jednorodny (jedna strona jest grubsza od drugiej)</td>
 <td>Należy skalibrować półkę inkubatora</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epidermis tworzy mniej niż trzy warstwy keratynocytów</td>
 <td>Należy użyć nieróżnicowanych keratynocytów z niskich pasaży</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

<ol><li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).</li>
<li>Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3D+cell+culture+system+for+investigating+cell+interactions+with+electrospun+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).</li>
<li>Kremer, M., Lang, E., Berger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypical+engineering+of+differentiated+composite-skin+equivalents+of+human+keratinocytes+in+a+collagen-GAG+matrix+%28INTEGRA+Artificial+Skin%29+in+a+perfusion+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system.</a> Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).</li>
<li>Escámez, M. J., Garcí, M., Larcher, F., Meana, A., Muñoz, E., Jorcano, J. L., Del Río, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).</li>
<li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).</li>
<li>Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs%3A+biological+significance+of+bFGF%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF.</a> Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).</li>
<li>Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+BRAF+mutation+and+p53+inactivation+during+transformation+of+a+subpopulation+of+primary+human+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes.</a> Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).</li>
<li>Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLX4032%2C+a+potent+inhibitor+of+the+B-Raf+V600E+oncogene%2C+selectively+inhibits+V600E-positive+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).</li>
<li>Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+selective+inhibitor+of+oncogenic+B-Raf+kinase+with+potent+antimelanoma+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisano proces tworzenia trójwymiarowych (3D) rekonstruktów skóry z wykorzystaniem prawidłowych ludzkich melanocytów, dermalnych komórek macierzystych oraz komórek czerniaka. W hodowlach monowarstwowych komórki melanocytarne wykazują podobną morfologię (spłaszczoną, wrzecionowatą lub bardziej dendrytyczną), niezależnie od ich pochodzenia czy stadium klinicznego. W przeciwieństwie do tego, rekonstrukty skóry 3D odwzorowują właściwości komórek czerniaka charakterystyczne dla poszczególnych stadiów. Prawidłowe ludzkie melanocyty występują jako pojedyncze komórki w błonach podstawnych pomiędzy warstwą naskórka a skórą właściwą. Pierwotne komórki czerniaka RGP rosną w formie małych skupisk wzdłuż błony podstawnej, podczas gdy bardziej agresywne komórki czerniaka VGP tworzą duże skupiska przebijające się przez błonę podstawną do skóry właściwej. Komórki czerniaka przerzutowego rosną we wszystkich kierunkach i naciekają głęboko do skóry właściwej jako pojedyncze komórki lub skupiska. W tym modelu można przeprowadzić analizy ilościowe, mierząc głębokość nacieku oraz stopień proliferacji. Oprócz charakteryzacji prawidłowych i nowotworowych komórek melanocytarnych, przy użyciu tego modelu możemy bezpośrednio indukować różnicowanie dermalnych komórek macierzystych w dojrzałe melanocyty, które migrują do warstwy podstawnej naskórka i nawiązują bona fide komunikację z keratynocytami poprzez upregulację E-kadheryny (6).
Dzięki zastosowaniu wektorów wirusowych jesteśmy w stanie aktywować lub inaktywować funkcję genów, co pozwala na lepsze zrozumienie dynamiki i znaczenia funkcjonalnego genów eksprymowanych przez poszczególne typy komórek w rekonstruktach skóry. Stanowi to obiecujący i wydajny model do badania nie tylko mechanizmów transformacji melanocytów, ale również progresji czerniaka (8). Długoterminowa obserwacja fenotypów komórkowych stała się możliwa dzięki przeszczepianiu rekonstruktów skóry zwierzętom z niedoborem odporności. Taka chimera skóry ludzkiej i myszy jest doskonałym narzędziem badawczym do analizy melanomogenezy oraz przerzutowania czerniaka.
Rekonstrukcje skóry mogą być również użyteczną platformą do oceny leków. Wiele leków, które eliminują komórki nowotworowe w warunkach hodowli 2D, często wykazuje niewielki efekt w zastosowaniach eksperymentalnych i klinicznych. Podobnie jak w guzie in vivo, komórki czerniaka w hodowlach 3D są często oporne na leki, na które reagują komórki w hodowlach 2D, co sugeruje, że mikrośrodowisko moduluje szlaki sygnalizacyjne w czerniaku. W celu skutecznego odkrywania leków model 3D rekonstrukcji skóry stanowi idealne narzędzie przedkliniczne do przewidywania działania związków in vivo (9,10). 
Podsumowując, modele rekonstrukcji skóry stanowią pomost między badaniami in vitro a in vivo. Pozwolą one na lepsze zrozumienie tego, które geny biorą udział w transformacji oraz w jaki sposób komórki macierzyste przyczyniają się do tego procesu.

<table><tbody><tr><td>10x EMEM</td><td>BioWhittaker</td><td>12-684F</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyclone</td><td>SH-30071.02</td><td></td></tr><tr><td>Kwasowo ekstrahowany kolagen z bydlęcych ścięgien</td><td>Organogeneza</td><td>200/50</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych 6-dołkowe z wkładkami</td><td>Organogeneza</td><td>9285</td><td></td></tr><tr><td>Bezwiernikowe pożywka dla keratynocytów (Keratinocyte Serum Free Medium)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>Dializowana surowica z płodu cielęcego</td><td>Hyclone</td><td>SH-30079.03</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany czynnik wzrostu komórek macierzystych człowieka </td><td>Fitzgerald Industries</td><td>RDI-307-255X</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy FGF </td><td>Fitzgerald Industries</td><td>30R-AF015</td><td></td></tr><tr><td>Endotelina-3, ludzka</td><td>American Peptide</td><td>88-5-10</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>JRH biosciences</td><td>56430-10L</td><td></td></tr><tr><td>F12 (HAM&amp;rsquo;s)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11765-54</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0888</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, transferyna, etanolamina, selen (ITES)</td><td>BioWhittaker</td><td>17839Z</td><td></td></tr><tr><td>O-fosforyloetanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9795</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td></td></tr><tr><td>Trijodotyronina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-5516</td><td></td></tr><tr><td>Surowica z noworodków cieląt</td><td>Hyclone</td><td>SH3011802</td><td></td></tr><tr><td>10% buforowana formalina </td><td>Surgipath</td><td>00600</td><td></td></tr><tr><td>optymalne medium do mrożenia w temperaturze cięcia (OCT) </td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Wielokasetowe </td><td>Surgipath</td><td>02293-BX</td><td></td></tr><tr><td>dokumentacja z biopsji TBS </td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>BP-B</td><td></td></tr><tr><td>artykuły dotyczące biopsji TBS </td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>BP-B</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe formy podstawowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-182-501C</td><td></td></tr><tr><td>Nalewka z benzoesanem złożonym</td><td>Professional Disposables, Inc,</td><td>S42450</td><td></td></tr><tr><td>gaziki nasączone alkoholem</td><td>apteka CVS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pleciona jedwabna nić chirurgiczna, czarna, 5-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>682G</td><td></td></tr><tr><td>Gazy chirurgiczne (sterylne)</td><td>apteka CVS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS5070</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki irydologiczne</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS5913</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele chirurgiczne</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2976</td><td></td></tr><tr><td>znieczulenie EZ</td><td>Euthanex Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mysz SCID hairless outbred</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Większość badań in vitro w eksperymentalnej biologii skóry przeprowadzono w dwuwymiarowych (2D) monokulturach, podczas gdy narastające dowody sugerują, że komórki zachowują się inaczej, gdy są hodowane w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej i oddziałują z innymi komórkami (1-5). Modele mysie były szeroko wykorzystywane do badania morfogenezy tkanek in vivo. Jednak skóra myszy i człowieka wykazuje istotne różnice w architekturze komórkowej i fizjologii, co utrudnia ekstrapolację wyników badań na myszach na ludzi. Ponieważ melanocyty w skórze myszy są zlokalizowane głównie w mieszkach włosowych, posiadają one odmienne właściwości biologiczne niż melanocyty ludzkie, które znajdują się przede wszystkim w warstwie podstawnej naskórka. Niedawny rozwój modeli rekonstrukcji ludzkiej skóry 3D umożliwił badanie oddziaływań komórka-macierz oraz komórka-komórka pomiędzy różnymi typami komórek. Rekonstrukcje składają się z „ skóry właściwej” z fibroblastami osadzonymi w macierzy kolagenu I, „naskórka”, który składa się ze stratyfikowanych, zróżnicowanych keratynocytów oraz funkcjonalnej błony podstawnej, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Kolagen zapewnia rusztowanie, dostarczanie składników odżywczych oraz potencjał do oddziaływań międzykomórkowych. Modele skóry 3D zawierające komórki melanocytarne odtwarzają naturalne cechy homeostazy melanocytów i progresji czerniaka w ludzkiej skórze. Podobnie jak in vivo, melanocyty w zrekonstruowanej skórze są zlokalizowane przy błonie podstawnej, przeplatając się z keratynocytami warstwy podstawnej. Komórki czerniaka wykazują te same cechy odzwierciedlające pierwotne stadium nowotworu (RGP, VGP i komórki czerniaka przerzutowego) in vivo. Niedawno w ludzkiej skórze właściwej zidentyfikowano dermalne komórki macierzyste (6). Te wielopotencjalne komórki macierzyste mogą migrować do naskórka i różnicować się w melanocyty.

W niniejszym raporcie opisujemy trójwymiarowy model rekonstrukcji skóry, który naśladuje architekturę i skład ludzkiej skóry. Wykorzystując model rekonstrukcji skóry, badano fizjologię melanocytów, progresję czerniaka oraz losy dermalnych komórek macierzystych. Model ten jest również przydatny jako narzędzie przedkliniczne do oceny leków.

Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Większość badań in vitro w eksperymentalnej biologii skóry przeprowadzano w dwuwymiarowych (2D) monokulturach, podczas gdy narastające dowody sugerują, że komórki...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie trójwymiarowej rekonstrukcji ludzkiej skóry do badań nad biologią melanocytów, czerniaka oraz macierzystych komórek skóry. Osiąga się to najpierw poprzez pokrycie wkładki tacek do hodowli tkankowej zneutralizowanym kolagenem bydlęcym. Drugim krokiem jest utworzenie komórki dermalnej z fibroblastów i kolagenu.Następnie przygotowuje się przedział naskórkowy z keratynocytów zmieszanych z melanocytami lub komórkami czerniaka. Ostatnim etapem procedury jest pobranie zrekonstruowanej skóry w 18. dniu oraz przeszczepienie jej myszy. Ostatecznie analizy immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne przeszczepu wykazują architekturę prawidłowej skóry zawierającej melanocyty, migrację i różnicowanie prawidłowych komórek macierzystych oraz fenotypy czerniaka specyficzne dla danego stadium.Model rekonstrukcji skóry opracowaliśmy 20 lat temu, ponieważ na wczesnym etapie naszych badań odkryliśmy, że prawidłowe melanocyty lub komórki czerniaka hodowane na szalce zachowują się zupełnie inaczej niż komórki w kontekście tkankowym. Model rekonstrukcji skóry jest zatem dla nas idealnym narzędziem do obserwacji sposobu, w jaki komórki przemieszczają się z jednego przedziału skóry do dowolnego innego miejsca. Wcześniej przygotowaną bezkomórkową warstwę mieszaniny kolagenowej schłodzono na lodzie, a następnie do każdego insertu sześciodołkowej płytki dodano 1 mL słomkowożółtego roztworu.Tackę do hodowli tkankowej w dołkach inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby żel mógł stężeć. W tym czasie, podczas tężenia żelu, kolor roztworu powinien zmienić się z żółtego na różowy. Trypsynizować ludzkie fibroblasty w kolbie hodowlanej za pomocą 0,25% trypsyny z EDTA przez pięć minut. Dodać DMEM zawierający 10% FBS, aby zneutralizować proces trypsynizacji.Oddzielone komórki zebrać poprzez wirowanie przez pięć minut przy 200 G w temperaturze pokojowej, a następnie resuspender komórki do stężenia 4,5 × 10⁵ komórek w 1,5 ml DMEM uzupełnionego o 10% FBS. Następnie napełnić probówkę o pojemności 50 ml wcześniej przygotowaną mieszaniną kolagenu warstwy komórkowej i umieścić probówkę w lodzie.Do probówki dodać 1,5 ml zawiesiny fibroblastów i dokładnie wymieszać. Do każdego insertu pokrytego warstwą acellularną dodać trzy ml słomkowożółtego roztworu warstwy komórkowej. Następnie inkubować taczkę do hodowli tkankowej przez 45 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowej z 5% carbon dioxide.Kolor roztworu warstwy komórkowej powinien również zmienić się z żółtego na różowy. Po zastygnięciu żelu w warstwie górnej, należy dodać dwa mililitry DMEM zawierającego 10% FBS do wnętrza wkładki w płytce do hodowli tkankowej oraz 10 mililitrów na zewnątrz wkładki. Płytki do hodowli tkankowej należy inkubować przez cztery dni.W czwartym dniu inkubacji, po sprawdzeniu, czy żel uległ skurczeniu, odessać pożywkę z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu. Dodać 2 mL pożywki do płukania do wnętrza oraz 10 mL na zewnątrz wkładów, aby wypłukać surowicę. Następnie inkubować tacki przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w celu regeneracji naskórka.Najpierw poddaj ludzkie keratynocyty trypsynizacji. Następnie, po pięciu minutach, użyj inhibitora trypsyny z soi w celu neutralizacji trypsyny po odwirowaniu ododerwanych komórek z prędkością 200 G przez pięć minut. Ponownie zawiesź osad komórkowy w skórze w stężeniu 4,17 × 10⁶ komórek/ml.Odtwórz pożywkę po zebraniu keratynocytów. Inkubuj ludzkie melanocyty z trypsyną w temperaturze 4°C przez jedną do dwóch minut. Następnie zneutralizuj trypsynę za pomocą inhibitora trypsyny z soi.Następnie, po odwirowaniu komórek w tych samych warunkach co wcześniej, resuspender osad melanocytów do stężenia 8,3 × 10⁵ komórek/ml w medium skin. Należy również przygotować medium one. W dalszej kolejności usunąć medium piorące z wnętrza i z zewnątrz każdego insertu w tacy do hodowli tkankowej z przygotowaną warstwą dermalną.Wymień medium płuczące, dodając 1,5 mililitra medium do rekonstrukcji skóry do wnętrza oraz 10 mililitrów na zewnątrz każdego insertu. Następnie wymieszaj 600 mikrolitrów zawiesiny keratynocytów z 600 mikrolitrami zawiesiny melanocytów. Odmień 200 mikrolitrów zmieszanej zawiesiny komórek.Kropla po kropli do wnętrza każdego wkładu. Inkubować tackę do hodowli tkankowej przez dwa dni w temperaturze 37 °C. Po inkubacji komórek aspirować podłoże do rekonstrukcji skóry 1 zarówno z wnętrza, jak i z zewnątrz każdego wkładu, a następnie dodać 2 mL podłoża do rekonstrukcji skóry 2 do wnętrza oraz 10 mL do zewnętrznej części wkładu.Następnie inkubować rekonstrukcje przez kolejne dwa dni w temperaturze 37 °C. Po drugiej dwudniowej inkubacji odessać pożywkę do rekonstrukcji skóry 2 z wnętrza i z zewnętrznej strony każdego insertu. Następnie dodać 7,5 ml pożywki do rekonstrukcji skóry 3 wyłącznie na zewnętrzną stronę insertów.Umieścić rekonstrukty z powrotem w inkubatorze i wymienić pożywkę. Wymieniać pożywkę do rekonstrukcji co drugi dzień aż do 18. dnia. W 18. dniu inkubacji odessać pożywkę z wnętrza i z zewnętrznej strony wkładów w tacy do hodowli tkankowej z załadowanymi rekonstruktami skóry.Za pomocą pęsety wyjmij wkłady z tacki. Wytnij konstrukt wraz z filtrem poliwęglanowym, prowadząc ostrzem skalpela wzdłuż krawędzi po okręgu. Następnie umieść konstrukt na filtrze na twardej powierzchni i przekrój go na pół ostrzem skalpela.Umieść połowę rekonstruktu na czarnym papierze do biopsji TBS, a następnie włóż papier do kasety histologicznej. Namocz całą kasetę w 10% formalinie przez ponad cztery godziny. Następnie umieść kasetę w 70% etanolu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsius until będziesz gotowy do przetworzenia rekonstruktu w celu zatopienia w parafinie.Umieścić drugą połowę rekonstruktu w 50% sacharozie w temperaturze 4 °C przez jedną do dwóch godzin. Następnie zmienić stężenie sacharozy na 2 M i przechowywać w temperaturze 4 °C przez kolejne jedną do dwóch godzin. Wypełnić formę do tkanek do połowy medium OCT (optimal cutting temperature freezing media).Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Chwycić krawędź rekonstruktu pęsetą i wyjąć go z sacharozy. Położyć go na chusteczkach Kim wipes do czasu wchłonięcia sacharozy.Za pomocą pęsety i szpatułki przenieś rekonstrukt do łódzki na wierzch OCT. Przykryj górę rekonstruktu kolejną porcją OCT, aż łódzka zostanie całkowicie wypełniona. Ponownie unikaj powstawania pęcherzyków powietrza.Umieść formę równomiernie na kruszonym suchym lodzie, aby OCT mógł całkowicie zamarznąć. Następnie owiń formę podstawową i folię, a następnie przechowuj w temperaturze -70 °C aż do momentu krioostatycznego cięcia. Aby przygotować się do przeszczepienia zrekonstruowanej skóry na mysz, napełnij pojemnik ciekłym azotem i dodaj 5 mL DMEM do probówki o pojemności 50 mL.Napełnij zlewkę 600 mililitrami wody z kranu i postaw ją na płycie grzewczej w celu ogrzania. Następnie wybierz samicę myszy outbred rasy skid hairless w wieku około sześciu tygodni. Po znieczuleniu myszy izofluranem.W celu utrzymania znieczulenia przez cały czas trwania procedury należy zastosować maskę nosową. Należy nałożyć sterylny lubrykant do oczu oraz zapewnić ogrzewanie, aby zapobiec hipotermii. Następnie skórę myszy należy oczyścić za pomocą tinduktury benzoesanowej i gazików nasączonych alkoholem.Zaznaczyć linię na grzbiecie myszy, aby zachować tę samą pozycję do późniejszego szycia. Za pomocą nożyczek irydowych i pęsety wyciąć okrągłe łoże rany na grzbiecie myszy, a następnie przykryć łoże rany sterylnymi gązkami gazowymi. Okrągły fragment skóry myszy umieścić w 50 mililitrowej probówce z DMEM.Zanurz probówkę w pojemniku z ciekłym azotem, aż wszystkie pożywki i tkanka całkowicie zamarzną. Następnie rozmroź probówkę w zlewce z gorącą wodą do całkowitego odtajania. Powtórz tę procedurę zamrażania i rozmrażania trzy razy.Używając skalpela, oddziel rekonstrukt skóry od wkładki. Bardzo ostrożnie usuń membranę, a następnie przenieś rekonstrukt skóry na wierzch łoża rany myszy. Następnie ułóż skórę myszy na wierzchu rekonstruktu skóry.Należy upewnić się, że pierwszy szew znajduje się nad wcześniej oznaczonym markerem, a drugi pod nim. Następnie należy użyć dwóch kolejnych szwów po bokach zrekonstruowanej skóry, aby unieruchomić skórę myszy. Po przeszczepieniu skórę myszy należy oczyścić, a następnie umieścić mysz w nowej klatce.W 18. dniu naskórek rekonstruktu skóry składa się z warstw keratynocytów ułożonych warstwowo; niediferencjowana warstwa podstawna oraz kolejno różnicujące się warstwy są zorientowane pionowo. Wykonano barwienie przekroju rekonstruktów z użyciem markera melanocytowego.S 100, wskazane czarnymi strzałkami, pokazuje, że melanocyty są ułożone w warstwie podstawnej naskórka i komunikują się z wieloma keratynocytami poprzez wypustki dendrytyczne. Przedział skórny zawiera fibroblasty osadzone w macierzy kolagenu typu jeden; osadzony kolagen cztery wskazuje błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Następne ryciny ilustrują sposób powstawania wielu warstw keratynocytów w naskórku.Kiedy dermalne komórki macierzyste znakowane lentiwirusem GFP są osadzone wraz z fibroblastami w matrycy z kolagenu typu I, migrują one do naskórka i w piątym dniu różnicują się w melanocyty. Po wysianiu keratynocytów pojedyncze komórki zaczynają migrować na zewnątrz sfer.Należy zauważyć, że naskórek nadal składa się z jednej warstwy. W ósmym dniu kilka komórek dociera do granicy między naskórkiem a skórą właściwą.Do 10. dnia komórki GFP-dodatnie są ściśle ułożone w pozycji błony podstawnej, co widać tutaj. Zmigrowane komórki GFP-dodatnie w naskórku wykazują ekspresję markera melanocytarnego HMB 45. W przypadku włączenia linii komórkowych czerniaka na różnych etapach rozwoju do rekonstruktów skóry, zachowanie komórek odzwierciedla ich charakterystykę in vivo.Na tej rycinie przedstawiono prawidłowe melanocyty oraz komórki czerniaka hodowane w kulturach 2D. Lokalizacja i tempo wzrostu prawidłowych melanocytów są ściśle kontrolowane w rekonstrukcjach skóry, jak pokazano tutaj; w fazie wzrostu radialnego pierwotne czerniaki proliferują głównie w naskórku, podczas gdy czerniaki w fazie wzrostu pionowego wrastają inwazyjnie w skórę właściwą, co widać na tej rycinie. Na koniec, tutaj zaprezentowano sposób, w jaki czerniaki przerzutowe agresywnie naciekają głębokie warstwy skóry właściwej.Nasze badania nad prawidłową skórą stanowią podstawę do lepszego zrozumienia rozwoju i progresji czerniaka.

the-three-dimensional-human-skin-reconstruct-model-tool-to-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Model trójwymiarowym odtworzenia skóry ludzkiej: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Karcynogeneza to proces obejmujący interakcje między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem nowotworu. Aby przeanalizować zdarzenia molekularne, należy wyizolować różne populacje komórek na różnych etapach rozwoju raka. Korzystając z mysiego modelu raka podstawnokomórkowego, opisujemy protokół analizy komórek podczas kancerogenezy.

Analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Celem tego protokołu jest opisanie generacji i analizy objętościowej unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry przy użyciu dostępnych i prostych technik dla długoterminowej hodowli. W miarę możliwości opisano uzasadnienie kroków, aby umożliwić badaczom dostosowanie ich do ich potrzeb badawczych.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Obecny protokół opisuje, jak przeszczepić ludzką skórę nieotyłym myszom z cukrzycą (NOD)-scid z receptorem łańcucha gamma interleukiny-2 (NSG). W raporcie zawarto szczegółowy opis przygotowania skóry ludzkiej do przeszczepu, przygotowania myszy do przeszczepu, przeszczepu skóry ludzkiej o podzielonej grubości oraz procedury rekonwalescencji po przeszczepie.

Model skóry ksenoprzeszczepu do manipulowania ludzkimi odpowiedziami immunologicznymi in vivo

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Opisano płaski oraz trójwymiarowy druk z użyciem przewodzących tuszy metalicznych. Nasze podejście otwiera nowe możliwości wytwarzania drukowanych urządzeń elektronicznych, optoelektronicznych i biomedycznych o nietypowych układach w skali mikro.

Planarny i trójwymiarowy druk atramentów przewodzących

Poznaj trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry do badania fizjologii melanocytów, progresji czerniaka i zachowania komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia ocenę przedkliniczną leków.

Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Przeglądaj więcej filmów