Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie rekonstrukcji 3D ludzkiej skóry do badań nad melanocytami, czerniakiem i biologią komórek macierzystych skóry. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie wkładki tacek do hodowli tkankowych zneutralizowanym kolagenem bydlęcym. Drugim krokiem jest wytworzenie komórkowego przedziału skórnego z fibroblastów i kolagenu.

Następnie wykonaj przedział naskórka z keratynocytów zmieszanych z melanocytami lub komórkami czerniaka. Ostatnim etapem zabiegu jest pobranie rekonstrukcji skóry w 18 dniu i przeszczepienie rekonstrukcji skóry myszy. Ostatecznie analizy immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne przeszczepu pokazują architekturę normalnej skóry zawierającej melanocyty, migrację i różnicowanie prawidłowych komórek macierzystych oraz fenotypy czerniaka specyficzne dla danego stadium.

Opracowaliśmy model rekonstrukcji skóry 20 lat temu, ponieważ na początku naszych badań odkryliśmy, że normalne melanocyty lub komórki czerniaka, które są hodowane na szalce, zachowują się bardzo inaczej niż komórki, które znajdują się w kontekście tkankowym. Tak więc model rekonstrukcji skóry jest dla nas idealny, aby zobaczyć, jak komórki przemieszczają się z jednego przedziału w skórze do dowolnego innego miejsca. Wcześniej przygotowaną warstwę bezkomórkową mieszaninę kolagenu na lodzie, a następnie dodać jeden mililitr słomkowo-żółtego roztworu do każdej wkładki sześciu.

Dobrze, taca do hodowli tkankowej, inkubować tacę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby żel mógł się zestalić. W tym czasie roztwór powinien zmienić kolor z żółtego na różowy, podczas gdy żel zestala oczy trypsyny, ludzki włókno z ich kolby hodowlanej z 0,25% tripyny EDTA po pięciu minutach. Dodaj DMEM zawierający 10% FBS, aby zneutralizować proces izacji.

Zebrać oderwane komórki przez wirowanie przez pięć minut w temperaturze 200 G w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zawiesić komórki w ilości 4,5 razy 10 do piątej komórki na 1,5 mililitra. DMEM uzupełniony o 10% FBS. Następnie napełnij 50-mililitrową tubkę wcześniej przygotowaną mieszanką kolagenu warstwy komórkowej i umieść probówkę na lodzie.

Dodaj 1,5 mililitra zawiesiny fibroblastów do probówki i wymieszaj.Cóż. Dodaj trzy mililitry słomkowo-żółtego roztworu warstwy komórkowej do każdej wkładki pokrytej warstwą bezkomórkową. Następnie inkubować tacę do hodowli tkankowej przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w okresie inkubacji.

Kolor roztworu warstwy komórkowej powinien również zmienić się z żółtego na różowy. Po zestaleniu się wierzchniej warstwy żelu dodaj dwa mililitry DMEM zawierające 10% FBS do wnętrza wkładki w tacy do hodowli tkankowej i 10 mililitrów na zewnątrz wkładki. Inkubować tace do hodowli tkankowych przez cztery dni.

Sprawdzając czwartego dnia, czy żel kurczy się w czwartym dniu inkubacji, zassać pożywkę zarówno od wewnątrz, jak i na zewnątrz każdej wkładki. Dodaj dwa mililitry środka myjącego do środka i 10 mililitrów na zewnątrz wkładek, aby zmyć zwykłe serum. Następnie inkubuj tace przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu wytworzenia naskórka.

Pierwszą trypsyną są ludzkie keratynocyty. Następnie po pięciu minutach użyj inhibitora trypsyny sojowej, aby zneutralizować trypsynę po odwirowaniu oderwanych komórek w temperaturze 200 G przez pięć minut. Reus zawiesił osad komórkowy w ilości 4,17 razy 10 do sześciu komórek na mililitr w skórze.

Zrekonstruuj podłoże po zebraniu keratynocytów. Trypsyna zamraża ludzkie melanocyty przez jedną do dwóch minut. Ponownie zneutralizuj trypsynę za pomocą inhibitora trypsyny sojowej.

Następnie, po odwirowaniu komórek w tych samych warunkach, co poprzednio, ponownie zawieś osad melanocytów w ilości 8,3 razy 10 do piątej komórki na mililitr w skórze. Zrekonstruuj również średnią. Następnie należy usunąć pożywkę myjącą zarówno z wewnątrz, jak i z zewnątrz każdej wkładki tacki do hodowli tkankowej przygotowanej przez warstwę skóry.

Zastąp medium myjące, dodając 1,5 mililitra skóry, zrekonstruuj podłoże, jedno do wewnątrz i 10 mililitrów na zewnątrz każdej wkładki. Następnie wymieszaj 600 mikrolitrów zawiesiny komórek keratynocytów z 600 mikrolitrami zawiesiny melanocytów. Dozować 200 mikrolitrów zawiesiny z mieszanymi komórkami.

Kropla po kropli do wnętrza każdej wkładki. Inkubować tackę do hodowli tkankowej przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji komórek odessać skórę, zrekonstruować pożywkę jeden zarówno od wewnątrz, jak i na zewnątrz każdej wkładki, a następnie dodać dwa mililitry skóry, zrekonstruować podłoże, dwa do wewnątrz i 10 mililitrów na zewnątrz wkładki.

Następnie inkubuj rekonstrukcje przez kolejne dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po drugiej dwudniowej inkubacji odessać skórę, zrekonstruować podłoże drugie od wewnątrz i na zewnątrz każdej wkładki. Teraz dodaj 7,5 mililitra skóry, zrekonstruuj podłoże trzy tylko na zewnątrz wkładek.

Umieść rekonstrukcje z powrotem w inkubatorze i zmień skórę. Rekonstruuj podłoże trzy co drugi dzień do 18 dnia. W 18 dniu inkubacji należy odessać pożywkę od wewnątrz i z zewnątrz wkładek zrekonstruowanej przez skórę tacki do hodowli tkankowej.

Wyjmij wkładki z tacki za pomocą kleszczyków. Wytnij konstrukcję, w tym filtr poliwęglanowy, rysując okrąg blisko krawędzi za pomocą ostrza skalpela. Następnie umieść rekonstrukcję w filtrze na twardej powierzchni i przetnij je na pół ostrzem.

Umieść połowę rekonstrukcji na czarnym bibule do biopsji TBS, a następnie umieść papier w kasecie histologicznej. Namocz całą kasetę w 10% formalinie na ponad cztery godziny. Następnie umieść kasetę w 70% etanolu i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będziesz gotowy do przetworzenia rekonstrukcji do zatapiania parafiny.

Umieść drugą połowę rekonstrukcji w 50% sacharozie w temperaturze czterech stopni Celsjusza na jedną do dwóch godzin. Następnie zmień sacharozę na dwie trzonowe, a następnie przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejną godzinę do dwóch godzin. Napełnij formę bazową do połowy optymalną temperaturą cięcia, środkiem do zamrażania lub OCT.

Unikaj pęcherzyków. Chwyć krawędź rekonstrukcji kleszczami i usuń rekonstrukcję z sacharozy. Umieść go na chusteczkach Kim, aż sacharoza zostanie wchłonięta.

Za pomocą kleszczy i szpatułki przenieś rekonstrukcję do łodzi na szczycie OCT. Przykryj górną część rekonstrukcji większą ilością OCT, aż łódź będzie całkowicie pełna. Ponownie, unikanie bąbelków.

Umieść łódź równomiernie na pokruszonym suchym lodzie, aby OCT całkowicie zamarło. Następnie owiń podstawę formy i folię i przechowuj w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza, aż będziesz gotowy do przecięcia kriostatem. Aby przygotować się do przeszczepienia rekonstrukcji skóry na myszy, napełnij pojemnik ciekłym azotem i dodaj pięć mililitrów DMEM do 50-mililitrowej probówki.

Napełnij zlewkę 600 mililitrami wody z kranu i umieść zlewkę na płycie grzejnej, aby się rozgrzała. Następnie wybierz samicę bezwłosej myszy niekrewniaczej w wieku około sześciu tygodni. Po znieczuleniu myszy izofluorem.

Użyj stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie przez cały zabieg. Zastosuj sterylny smar okulistyczny i zapewnij wsparcie cieplne, aby zapobiec hipotermii. Następnie oczyść skórę myszy za pomocą złożonej nalewki benzoesowej i wacików nasączonych alkoholem.

Zaznacz linię na górze pleców myszy, aby zachować tę samą pozycję do późniejszego zszycia. Wytnij okrągłe łożysko rany na grzbiecie myszy za pomocą nożyczek do tęczówki i kleszczy, a następnie przykryj łożysko rany sterylnymi gąbkami z gazy. Umieść okrągłą skórę myszy w 50-mililitrowej tubce DMEM.

Zanurz probówkę w pojemniku z ciekłym azotem, aż wszystkie podłoża i tkanki zostaną całkowicie zamrożone. Następnie rozmrozić rurkę w zlewce z gorącą wodą, aż do całkowitego rozmrożenia. Powtórz to, trzykrotnie zamroź i rozmroź procedurę.

Użyj ostrza chirurgicznego, aby odłączyć rekonstrukcję skóry od wkładki. Usuń membranę bardzo ostrożnie, a następnie przenieś rekonstrukcję skóry na wierzch łożyska rany myszy. Teraz umieść skórę myszy na wierzchu rekonstrukcji skóry.

Upewnij się, że pierwszy szew znajduje się na górze wcześniej oznaczonego markera, a drugi na dole. Następnie użyj dwóch dodatkowych szwów po bokach skóry, zrekonstruuj, aby utrwalić skórę myszy. Po szczepieniu oczyść skórę myszy, a następnie umieść mysz w nowej klatce.

W dniu 18. Naskórek rekonstrukcji skóry składa się z warstwowych warstw keratynocytów, niezróżnicowana warstwa podstawna i kolejno zróżnicowane warstwy są zorientowane pionowo. Barwienie przekroju rekonstrukcji markerem melanocytowym.

S 100, jak wskazują czarne strzałki, pokazuje, że melanocyty są ustawione w warstwie podstawnej naskórka i komunikują się z wieloma keratynocytami poprzez przedłużenia dendrytów. Przedział skórny zawiera fibroblasty osadzone w matrycy kolagenu typu pierwszego, zdeponowany kolagen cztery wskazuje na błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Poniższe rysunki ilustrują, w jaki sposób powstaje wiele warstw keratynocytów w naskórku.

Gdy skórne komórki macierzyste znakowane wektorem lentiwirusowym GFP są osadzone w fibroblastach. W macierzy kolagenu typu pierwszego migrują do naskórka i różnicują się w melanocyty w piątym dniu. Po wysianiu keratynocytów pojedyncze komórki zaczynają migrować ze sfer.

Należy pamiętać, że naskórek nadal składa się z jednej warstwy. W ósmym dniu. Kilka komórek dociera do granicy naskórka i skóry właściwej.

Do dnia 10 komórek GFP dodatnich jest ściśle wyrównanych w pozycji błony podstawnej, jak widać tutaj. Migrowane komórki GFP dodatnie w naskórku wyrażają marker melanocytowy HMB 45. Kiedy różne stadia linii komórkowych czerniaka są włączane do rekonstrukcji skóry, zachowanie komórek odzwierciedla ich cechy in vivo.

Tutaj na tym rysunku można zobaczyć normalne melanocyty i komórki czerniaka wyhodowane w kulturach 2D. Lokalizacja i tempo wzrostu normalnych melanocytów są ściśle kontrolowane w rekonstrukcjach skóry, jak widać tutaj, radialna faza wzrostu, czerniaki pierwotne namnażają się głównie w naskórku, podczas gdy czerniaki w fazie wzrostu pionowego rosną inwazyjnie do skóry właściwej, jak widać na tym rysunku. Wreszcie, sposób, w jaki przerzutowe czerniaki agresywnie wnikają głęboko w skórę właściwą, można zobaczyć tutaj.

Nasze badania nad skórą normalną stanowią podstawę do lepszego poznania rozwoju i progresji czerniaka.