Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie trójwymiarowej rekonstrukcji ludzkiej skóry do badań nad biologią melanocytów, czerniaka oraz macierzystych komórek skóry. Osiąga się to poprzez najpierw pokrycie wkładki tacek do hodowli tkankowej zneutralizowaną kolagenem bydlęcym. Drugim krokiem jest utworzenie komórkowej warstwy skóry właściwej z fibroblastów i kolagenu.

Następnie należy przygotować przedział naskórkowy z keratynocytów zmieszanych z melanocytami lub komórkami czerniaka. Ostatnim etapem procedury jest pobranie zrekonstruowanej skóry w 18. dniu oraz przeszczepienie jej myszy. W końcowym etapie analizy immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne przeszczepu ukazują architekturę prawidłowej skóry zawierającej melanocyty, migrację i różnicowanie prawidłowych komórek macierzystych oraz fenotypy czerniaka charakterystyczne dla poszczególnych stadiów.

Model rekonstrukcji skóry opracowaliśmy 20 lat temu, ponieważ na wczesnym etapie naszych badań odkryliśmy, że prawidłowe melanocyty lub komórki czerniaka hodowane w szalce zachowują się zupełnie inaczej niż komórki w kontekście tkankowym. Model rekonstrukcji skóry jest zatem dla nas idealnym rozwiązaniem, aby zaobserwować, w jaki sposób komórki przemieszczają się z jednego przedziału skóry do dowolnego innego miejsca. Wcześniej przygotowaną bezkomórkową warstwę mieszaniny kolagenu schłodzono na lodzie, a następnie do każdego insertu w sześciostanowiskowej płytce dodano 1 ml słomkowożółtego roztworu.

Tackę do hodowli tkankowej inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby żel mógł stężeć. W tym czasie, podczas krzepnięcia żelu, kolor roztworu powinien zmienić się z żółtego na różowy. Następnie zneutralizować ludzkie fibroblasty z kolby hodowlanej za pomocą 0,25% trypsyny EDTA; po pięciu minutach dodać DMEM zawierający 10% FBS, aby przerwać proces trypsynizacji.

Odwiruj oddzielone komórki przez pięć minut przy 200 G w temperaturze pokojowej, a następnie resuspenduj komórki w stężeniu 4,5 × 10⁵ komórek na 1,5 ml DMEM uzupełnionego o 10% FBS. Następnie napełnij probówkę o pojemności 50 ml wcześniej przygotowaną mieszaniną kolagenu i warstwy komórkowej i umieść probówkę na lodzie.

Do probówki dodać 1,5 ml zawiesiny fibroblastów i dokładnie wymieszać. Do każdego insertu pokrytego warstwą acelularną dodać trzy ml słomkowożółtego roztworu warstwy komórkowej. Następnie inkubować kasetkę do hodowli tkankowej przez 45 minut w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkankowej z 5% CO2.

Kolor roztworu warstwy komórkowej powinien również zmienić się z żółtego na różowy. Po zestaleniu żelu górnej warstwy, dodaj dwa mililitry DMEM zawierającego 10% FBS do wnętrza wkładki w płytce hodowlanej oraz 10 mililitrów na zewnątrz wkładki. Inkubuj płytki hodowlane przez cztery dni.

W czwartym dniu inkubacji, w celu sprawdzenia, czy żel uległ skurczeniu, odessaj pożywkę z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu. Do wnętrza wkładów dodaj 2 ml medium piorącego, a na zewnątrz 10 ml, aby wypłukać surowicę. Następnie inkubuj tacki przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w celu generacji naskórka.

W pierwszej kolejności poddaj ludzkie keratynocyty trypsynizacji. Następnie, po pięciu minutach, odwiruj oddzielone komórki przy 200 G przez pięć minut i użyj inhibitora trypsyny z soi, aby zneutralizować trypsynę. Ponownie zawieś osad komórkowy w podłożu do skóry w stężeniu 4,17 × 10⁶ komórek na ml.

Przygotuj pożywkę rekonstrukcyjną po zebraniu keratynocytów. Inkubuj ludzkie melanocyty z trypsyną w temperaturze lodu przez jedną do dwóch minut. Następnie ponownie zneutralizuj trypsynę za pomocą inhibitora trypsyny z soi.

Następnie, po odwirowaniu komórek w tych samych warunkach co wcześniej, resuspenduj osad melanocytów do stężenia 8,3 × 10⁵ komórek/ml w medium skin. Odtwórz również medium one. Następnie usuń medium piorące z wnętrza i z zewnątrz każdego insertu w tacy do hodowli tkankowej z przygotowaną warstwą dermalną.

Wymień medium płuczące, dodając 1,5 mililitra medium do rekonstrukcji skóry do wnętrza oraz 10 mililitrów na zewnątrz każdego insertu. Następnie zmieszaj 600 mikrolitrów zawiesiny keratynocytów z 600 mikrolitrami zawiesiny melanocytów. Odmierz 200 mikrolitrów zmieszanej zawiesiny komórkowej.

Kropla po kropli do wnętrza każdego wkładu. Inkubować taczkę do hodowli tkankowej przez dwa dni w temperaturze 37 °C. Po inkubacji komórek odessać medium do rekonstrukcji skóry 1 zarówno z wnętrza, jak i z zewnątrz każdego wkładu, a następnie dodać 2 mL medium do rekonstrukcji skóry 2 do wnętrza oraz 10 mL do zewnętrznej części wkładu.

Następnie inkubować rekonstrukcje przez kolejne dwa dni w temperaturze 37°C. Po drugiej dwudniowej inkubacji odessać pożywkę do rekonstrukcji skóry nr 2 z wnętrza i z zewnętrznej strony każdego insertu. Teraz dodać 7,5 ml pożywki do rekonstrukcji skóry nr 3 wyłącznie na zewnętrzną stronę insertów.

Umieścić rekonstrukcje z powrotem w inkubatorze i wymienić skórę. Wymieniać pożywkę do rekonstrukcji numer trzy co drugi dzień aż do 18. dnia. W 18. dniu inkubacji odessać pożywkę z wnętrza i z zewnątrz insertów z tkanem kultury tkankowej z załadowaną rekonstrukcją skóry.

Wyjąć wkłady z tacki za pomocą pęsety. Wyciąć konstrukt wraz z filtrem poliwęglanowym, wykreślając skalpelem okrąg blisko krawędzi. Następnie położyć konstrukt w filtrze na twardej powierzchni i przeciąć je na pół ostrzem skalpela.

Umieść jedną połowę rekonstruktu na czarnym papierze do biopsji TBS, a następnie włóż papier do kasety histologicznej. Namocz całą kasetę w 10% formalinie przez ponad cztery godziny. Następnie umieść kasetę w 70% etanolu i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsiusa do momentu rozpoczęcia procesu zatapiania rekonstruktu w parafinie.

Umieścić drugą połowę rekonstruktu w 50% sacharozy w temperaturze 4 °C na jedną do dwóch godzin. Następnie wymienić sacharozę na 2 M i przechowywać w temperaturze 4 °C przez kolejne jedną do dwóch godzin. Wypełnić formę podstawową do połowy medium do mrożenia OCT (optimal cutting temperature).

Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Chwyć krawędź rekonstrukcji pęsetą i wyjmij ją z sacharozy. Połóż ją na chusteczkach Kim wipes, aż sacharoza zostanie wchłonięta.

Za pomocą pęsety i szpatułki przenieś rekonstrukt do łóreczki na wierzch OCT. Przykryj górę rekonstruktu kolejną warstwą OCT, aż łóreczka zostanie całkowicie wypełniona. Ponownie unikaj powstawania pęcherzyków powietrza.

Umieść łódkę równomiernie na kruszonym suchym lodzie, aby OCT mógł całkowicie zamarznąć. Następnie owiń formę podstawy oraz folię i przechowuj w temperaturze -70 °C do momentu przygotowania do cięcia w kriostacie. Aby przygotować się do przeszczepienia zrekonstruowanej skóry myszy, napełnij pojemnik ciekłym azotem i dodaj 5 mL DMEM do probówki o pojemności 50 mL.

Napełnij zlewkę 600 mililitrami wody z kranu i postaw ją na płycie grzewczej w celu podgrzania. Następnie wybierz samicę myszy szczepu skid hairless outbred w wieku około sześciu tygodni. Po znieczuleniu myszy izofluranem.

Aby utrzymać znieczulenie przez cały czas trwania procedury, należy zastosować stożek nosowy. Nałożyć sterylną maść nawilżającą do oczu oraz zapewnić ogrzewanie, aby zapobiec hipotermii. Następnie oczyścić skórę myszy za pomocą nalewki z benzoesanem i gazików nasączonych alkoholem.

Zaznaczyć linię na grzbiecie myszy, aby zachować tę samą pozycję do późniejszego szycia. Za pomocą nożyczek irydowych i pęsety wyciąć okrągły obszar rany na grzbiecie myszy, a następnie przykryć go sterylnymi gązkami gazowymi. Okrągły fragment skóry myszy umieścić w probówce o pojemności 50 milliliter z DMEM.

Zanurz probówkę w pojemniku z ciekłym azotem, aż wszystkie media i tkanka zostaną całkowicie zamrożone. Następnie rozmroź probówkę w zlewce z gorącą wodą do pełnego odtajania. Powtórz tę procedurę zamrażania i rozmrażania trzykrotnie.

Użyj skalpela, aby oddzielić rekonstrukt skóry od wkładki. Bardzo ostrożnie usuń błonę, a następnie przenieś rekonstrukt skóry na łożysko rany myszy. Następnie nałóż skórę myszy na wierzch rekonstruktu skóry.

Upewnij się, że pierwszy szew znajduje się nad wcześniej zaznaczonym znacznikiem, a drugi pod nim. Następnie użyj dwóch kolejnych szwów po bokach zrekonstruowanej skóry, aby przymocować skórę myszy. Oczyść skórę myszy po przeszczepieniu, a następnie umieść mysz w nowej klatce.

W 18. dniu naskórek zrekonstruowanej skóry składa się z warstw keratynocytów, w których warstwa podstawna z komórkami niezróżnicowanymi oraz następujące po niej warstwy zróżnicowane są zorientowane pionowo. Wykonano barwienie przekroju rekonstrukcji z zastosowaniem markeru melanocytowego.

S 100, wskazane czarnymi strzałkami, pokazuje, że melanocyty są rozmieszczone w warstwie podstawnej naskórka i komunikują się z wieloma keratynocytami poprzez wypustki dendrytyczne. Przedział skórny zawiera fibroblasty zatopione w macierzy z kolagenu typu jeden; zdeponowany kolagen czwarty wskazuje na błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Poniższe ryciny ilustrują, w jaki sposób powstają wielowarstwowe keratynocyty w naskórku.

Gdy dermalne komórki macierzyste znakowane lentiwirusowym wektorem GFP zostają osadzone wraz z fibroblastami w matrycy z kolagenu typu I, migrują one do naskórka i w piątym dniu różnicują się w melanocyty. Po wysianiu keratynocytów, pojedyncze komórki zaczynają migrować na zewnątrz sfer.

Należy zauważyć, że naskórek nadal składa się z pojedynczej warstwy. W ósmym dniu kilka komórek dociera do granicy między naskórkiem a skórą właściwą.

Do 10. dnia komórki GFP-dodatnie są ściśle ułożone w obrębie błony podstawnej, co widać tutaj. Zmigrowane do naskórka komórki GFP-dodatnie wykazują ekspresję markera melanocytarnego HMB 45. Kiedy linie komórkowe czerniaka na różnych etapach rozwoju są włączane do rekonstruktów skóry, zachowanie komórek odzwierciedla ich charakterystykę in vivo.

Na tej rycinie przedstawiono prawidłowe melanocyty oraz komórki czerniaka hodowane w kulturach 2D. Lokalizacja i tempo wzrostu prawidłowych melanocytów są ściśle kontrolowane w rekonstrukcjach skóry, jak pokazano tutaj; w fazie wzrostu radialnego pierwotne czerniaki proliferują głównie w naskórku, podczas gdy czerniaki w fazie wzrostu pionowego rosną inwazyjnie w głąb skóry właściwej, co widać na tej rycinie. Na koniec, tutaj zaprezentowano sposób, w jaki czerniaki przerzutowe agresywnie naciekają głębokie warstwy skóry właściwej.

Nasze badania nad prawidłową skórą stanowią podstawę dla lepszego zrozumienia powstawania i progresji czerniaka.