Name: Biochemiczny pomiar niedotlenienia noworodków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Poznaj metodę biochemicznego pomiaru niedotlenienia noworodków z wykorzystaniem HPLC i GC/MS do analizy hipoksantyny, ksantyny i kwasu moczowego. Technika ta wspiera wczesną diagnostykę i leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana przez National Institutes of Health w ramach grantu R01 NR011209-03

<ol><li>Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapartum+hypoxia%3A+the+association+between+neurological+assessment+of+damage+and+abnormal+excretion+of+ATP+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites.</a> J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).</li>
<li>Shalak, L., Perlman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic-ischemic+brain+injury+in+the+term+infant-current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts.</a> Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).</li>
<li>Webster, W. S., Abela, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hypoxia+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">The effect of hypoxia in development.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).</li>
<li>Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+xanthine+dehydrogenase+to+oxidase+in+ischemic+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues.</a> J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).</li>
<li>Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+action+of+xanthine+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inorg+Biochem%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase.</a> J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).</li>
<li>Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+human+xanthine+oxidoreductase%3A+the+enzyme+is+grossly+deficient+in+molybdenum+and+substantially+deficient+in+iron-sulphur+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres.</a> Biochem J. 388, 501-508 (2005).</li>
<li>Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allantoin+in+human+plasma%2C+serum%2C+and+nasal-lining+fluids+as+a+biomarker+of+oxidative+stress%3A+avoiding+artifacts+and+establishing+real+in+vivo+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).</li>
<li>Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+and+allantoin+levels+in+Down+syndrome%3A+antioxidant+and+oxidative+stress+mechanisms%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?</a> Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).</li>
<li>Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+thiobarbituric+acid-reacting+substances+as+potential+biomarkers+of+intrauterine+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pediatr+Adolesc+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia.</a> Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).</li>
<li>Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+hydroperoxide+and+advanced+oxidation+protein+products+in+preterm+hypoxic+babies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies.</a> Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).</li>
<li>Berne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+nucleotides+in+hypoxia%3A+possible+role+in+regulation+of+coronary+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow.</a> Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).</li>
<li>Harkness, R. A., Lund, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+hypoxanthine%2C+xanthine%2C+uridine+and+inosine%3A+high+concentrations+of+the+ATP+metabolite%2C+hypoxanthine%2C+after+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia.</a> J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).</li>
<li>Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+markers+of+neonatal+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Health%22%5BJournal%5D)">Biochemical markers of neonatal hypoxia.</a> Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).</li>
<li>Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+methyl+malondialdehyde+as+an+internal+standard+for+malondialdehyde+detection%3A+validation+by+isotope-dilution+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry.</a> Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).</li>
<li>Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methyl+malondialdehyde+as+internal+standard+for+malondialdehyde+detection+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis.</a> Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-ethoxyacrolein+contamination+increases+malondialdehyde+inhibition+of+milk+xanthine+oxidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity.</a> Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+total+malondialdehyde+assessment+in+biological+matrices+by+gas+chromatography-mass+spectrometry%3A+what+is+needed+for+an+accurate+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection.</a> Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).</li>
<li>Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+human+plasma+xanthine+oxidase+activity+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Appl%22%5BJournal%5D)">Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography.</a> J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22">Handbook of Biochemistry and Molecular Biology</a>. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).</li>
<li>Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+15N+isotopic+enrichment+and+concentrations+of+allantoin+and+uric+acid+in+urine+by+gas+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisane tutaj metody pozwalają na ocenę noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia. Protokół ten łączy pomiary markerów deficytu energii (ATP), stresu oksydacyjnego, uszkodzeń oksydacyjnych oraz aktywności enzymatycznej, aby uzyskać ogólny obraz biochemiczny obecności, a nawet stopnia niedotlenienia i niedokrwienia. Pomimo użyteczności tej metody, istnieją pewne potencjalne ograniczenia. Po pierwsze, do pobrania wystarczającej ilości osocza w celu przeprowadzenia wszystkich analiz potrzeba około 1-2 ml krwi. Nie będzie...

<table><tbody><tr><td>Probówka 6ml K3E EDTA K3</td><td>Fisher Scientific</td><td>2204061</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5702R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05413319</td><td>Z adapterem 13&amp;amp;16MM</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówki 1.5ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1615-5599</td><td></td></tr><tr><td>2-Aminopuryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3509</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Varian Cary 100</td><td>Agilent Technologies</td><td>0010071500</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SC210A-115</td><td></td></tr><tr><td>Centryfugacyjny filtr Micron</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC501596</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Supelcosil LC-18-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58931</td><td></td></tr><tr><td>Wkład i uchwyt Supelguard Supelcosil LC-18-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59629</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolka do GCMS</td><td>Fisher Scientific</td><td>03376607</td><td></td></tr><tr><td>DL-Allantoin-5&lt;sup&gt;-13&lt;/sup&gt;C;1&lt;sup&gt;-15&lt;/sup&gt;N</td><td>CDN Isotopes</td><td>M-2307</td><td>Partia #L340P9</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>48920</td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td></td></tr><tr><td>5973E GC/MSD</td><td>Agilent Technologies</td><td>G7021A</td><td>Nr części dla 5975E GC/MS</td></tr><tr><td>3-Etoksymetakroleina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>232548</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Benzen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401765</td><td></td></tr><tr><td>Eter diizopropylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38270</td><td></td></tr><tr><td>BHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1378</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Fenylohydrazyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P26252</td><td></td></tr></tbody></table>

biochemiczny pomiar hipoksji noworodkowej

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Noworodkowe niedotlenienie niedokrwienne charakteryzuje się niewystarczającym ukrwieniem tkanki lub systematycznym brakiem tlenu. Przypuszcza się, że stan ten powoduje lub zaostrza dobrze udokumentowane schorzenia noworodkowe, w tym upośledzenie neurologiczne 1-3. Z powodu braku fosforylacji oksydacyjnej następuje spadek produkcji trifosforanu adenozyny. Aby zrekompensować ten stan deficytu energetycznego, degradowane są cząsteczki zawierające wysokoenergetyczne wiązania fosforanowe 2. Prowadzi to do zwiększenia poziomu adenozyny, która jest następnie degradowana do inozyny, hypoksantyny, ksantyny, a ostatecznie do kwasu moczowego. Dwa ostatnie etapy tego procesu degradacji są przeprowadzane przez ksantynooksydoreduktazę. Enzym ten występuje w formie dehydrogenazy ksantynowej w warunkach normoksji, lecz w warunkach niedotlenienia i reperfuzji ulega przekształceniu w oksydazę ksantynową (XO) 4, 5. W przeciwieństwie do dehydrogenazy ksantynowej, XO wytwarza nadtlenek wodoru jako produkt uboczny degradacji puryn 4, 6. Nadtlenek wodoru ten, w połączeniu z innymi reaktywnymi formami tlenu (ROS) powstającymi podczas niedotlenienia, utlenia kwas moczowy do alantoiny i reaguje z błonami lipidowymi, generując malondialdehyd (MDA) 7-9. Większość ssaków, z wyjątkiem ludzi, posiada enzym urykazę, która przekształca kwas moczowy w alantoinę. U ludzi natomiast alantoina może być tworzona wyłącznie poprzez utlenianie kwasu moczowego zapśredniczone przez ROS. Z tego powodu alantoina jest uważana za marker stresu oksydacyjnego u ludzi, ale nie u ssaków posiadających urykazę.
Opisujemy metody wykorzystujące wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) oraz chromatografię gazową sprzężoną z spektrometrią mas (GCMS) do pomiaru markerów biochemicznych noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia. Do większości badań wykorzystuje się krew ludzką. Można również stosować krew zwierzęcą, biorąc pod uwagę możliwość powstania allantoiny w wyniku działania urykazy.Metabolity puryn powiązano z hipoksją już w 1963 roku, a wiarygodność hypoksantyny, ksantyny i kwasu moczowego jako biochemicznych wskaźników hipoksji noworodkowej została potwierdzona przez wielu badaczy. 10-13Metoda HPLC stosowana do ilościowego oznaczenia związków purynowych jest szybka, niezawodna i powtarzalna. Metoda GC/MS stosowana do ilościowego oznaczenia allantoiny, stosunkowo nowego markera stresu oksydacyjnego, została opracowana na podstawie metody Grubera i wsp. 7Metoda ta pozwala uniknąć niektórych artefaktów i wymaga niewielkich objętości próbki. Metody stosowane do syntezy MMDA opisano w innym opracowaniu. 14, 15Ilościowe oznaczenie MDA metodą GC/MS zostało zaadaptowane z pracy Paroni. i wsp.oraz Cighetti i wsp.. 16, 17Aktywność oksydazy ksantynowej zmierzono metodą HPLC poprzez ilościowe oznaczenie konwersji pteryny do izoksantopteryny. 18Podejście to okazało się wystarczająco czułe i powtarzalne.

Opisano metodę pomiaru markerów biochemicznych hipoksji i niedokrwienia u noworodków. Podejście to wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) oraz chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas (GC/MS).

Biochemiczny pomiar hipoksji noworodkowej

Noworodkowe niedotlenienie i niedokrwienie charakteryzują się niewystarczającą perfuzją krwi w tkance lub systemowym niedoborem tlenu. Uważa się, że stan ten prowadzi do...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest pomiar markerów biochemicznych noworodkowego niedokrwienia niedotlenieniowego. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednie pobranie próbek krwi od niemowląt w celu wyizolowania osocza. Następnie część osocza jest filtrowana, łączona ze standardem wewnętrznym i analizowana pod kątem stężeń hypoksantyny, ksantyny i kwasu moczowego przy użyciu układu HPLC dwa.Kolejne alikwoty osocza są następnie poddawane odmiennym procesom i analizowane osobno. W przypadku oznaczania stężenia allantoiny i poziomów MDA za pomocą GCMS, ostatnim etapem procedury jest połączenie części osocza z substratem w celu zainicjowania reakcji enzymatycznej po zatrzymaniu reakcji. Aktywność ksantynooksydazy można oznaczyć za pomocą HPLC wyposażonego w detektor fluorescencyjny.W rezultacie otrzymuje się chromatogramy pól powierzchni pików, które można przeliczyć na stężenia molowe wybranych markerów biochemicznych lub aktywność enzymatyczną przy użyciu krzywych wzorcowych. Zastosowanie tej techniki obejmuje terapię i diagnostykę niedotlenienia niedokrwiennego noworodków, ponieważ metoda ta łączy pomiary markerów deficytu energetycznego, stresu oksydacyjnego, uszkodzeń oksydacyjnych oraz aktywności enzymatycznej, co pozwala uzyskać ogólny obraz biochemiczny obecności, a nawet stopnia niedotlenienia niedokrwiennego. Przed rozpoczęciem procedury, bezpośrednio po urodzeniu noworodka, w czasie krótszym niż pięć minut pobiera się próbkę krwi ludzkiej do probówki z EDTA o objętości sześciu mililitrów.Po pobraniu próbkę wiruj w temperaturze 4°C przy 1 500 ×g przez 10 minut. Przenieś plazmę znajdującą się w nad precipitates do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i wiruj przez 30 minut. Usuń nadmarz, dbając o to, aby nie zanieczyścić próbek erytrocytami.Rozdziel próbki do oddzielnych probówek typu micro centri w celu analizy puryn, MDA i ksantynooksydazy dla każdego pomiaru puryn w PLC. Przenieś 200 µL osocza do urządzenia z filtrem odśrodkowym. Odwiruj osocze w temperaturze 4 °C przy 14 000 ×g przez 1,5 godziny.Usuń filtrat i przelej go do probówki do mikrowirówki zawierającej dwa aino purine. Należy dokładnie zapisać objętość filtratu dodaną do probówki z dwoma AP, aby precyzyjnie określić stężenie. Mieszaj probówkę na wstrząsarce wortexowej przez 10 do 20 sekund.Próbki należy przeanalizować za pomocą HPLC zgodnie z opisem w protokole pisemnym, wykonując trzy wstrzyknięcia po 50 µL dla każdej próbki, a następnie analizując uzyskane chromatogramy. Należy określić stężenie puryn w próbce. Ilość hypoksantyny, ksantyny i kwasu moczowego należy wyznaczyć na podstawie pól powierzchni pików dla odpowiadających im czasów retencji i długości fal.Następnie należy określić powierzchnię piku dla dwóch ap. Na podstawie tych danych można obliczyć stosunki powierzchni hiperksantyny i kwasu moczowego do dwóch AP. Następnie należy przeliczyć te stosunki na stężenia mikromolowe przy użyciu krzywych standardowych. Aby przeprowadzić pomiar laniny, należy dodać 50 µL standardu wewnętrznego i 100 µL acetonitrylu do 50 µL osocza.Po wymieszaniu mieszaniny na vortexie przez 10 do 20 sekund. Wiruj przez 10 minut, a następnie przeprowadź wirowanie. Usuń nadsącz i umieść go w fiolce GCM S.Odparuj ciecz pod strumieniem azotu. Po odparowaniu cieczy dodaj 25 µL czynników acylujących M-T-B-S-T-F-A oraz 25 µL pirydyny. Zamknij fiolkę i inkubuj ją w temperaturze 50 °C przez dwie godziny.Następnie przenieś próbkę do innej fiolki do GCMS z wkładką o pojemności 300 µL. Próbki przeanalizuj za pomocą GCMS z użyciem autosamplera. Rozdział związków przeprowadź, stosując hel jako gaz nośny przy przepływie 1,5 mL/min.Aby rozpocząć analizę GCMS, należy wprowadzić parametry przebiegu. Ustaw początkową temperaturę kolumny na 100 °C i utrzymuj ją przez dwie minuty, a następnie zwiększ ją do 180 °C z szybkością 10 °C na minutę. Utrzymuj tę temperaturę przez cztery minuty, a następnie zwiększ ją do 260 °C z szybkością 20 °C na minutę.Utrzymuj tę temperaturę aż do końca analizy. Użyj autosaamplera do wstrzyknięcia 1 µL produktu po DERYWATYZACJI w trybie split i przeprowadź analizę pomiędzy każdym pomiarem próbki. Ustaw autosaampler tak, aby oczyścił kolumnę za pomocą dwóch wstrzyknięć 1 M M-T-B-S-T-F-A w pirydynie.Aby określić ilość LAN toin, należy wybrać tryb monitorowania jonów i monitorować jon o stosunku masy do ładunku 3 98 dla atlanto in oraz jon o stosunku masy do ładunku 400 dla ciężkiego atlanto in. Następnie przelicz stosunki obfitości jonów atlanto in do ciężkiego atlanto in na stężenia mikromolowe atlanto in, korzystając z wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej. Przed pomiarem MDA przygotuj roztwory butylohydroksytoluenu oraz 50 millimolarne roztwory fenylohydrazyny zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Dodaj M-M-D-A-B-H-T oraz cytrynian sodu do 100 microliter próbki osocza.Dopełnić końcową mieszaninę do 480 µL, dodając destylowaną wodę dejonizowaną. Przeprowadzić pochodnowanie roztworu, dodając 20 µL 50 mM fenylhydrazyny. Po zamknięciu fiolki inkubować roztwór na inkubatorze orbitalnym.Po inkubacji należy dodać 1 ml heksanu, wymieszać zawiesinę w wstrząsarce typu vortex przez 1 minutę, a następnie odwirować przy 3000 obr./min przez 10 minut. Po odwirowaniu warstwę organiczną przenosi się do probówki do mikrocentryfugi. Następnie roztwór należy zagęścić do 100 µl poprzez odparowanie pod strumieniem gazu azotowego i przenieść do fiolki A-G-C-M-S z wkładką 300 µl.Następnie analizujemy próbki na urządzeniu A-G-C-M-S przy użyciu autosamplera, przeprowadzając rozdział związków oraz kwantyfikację MDA zgodnie z opisaną procedurą pisemną. Rozpoczynamy oznaczanie aktywności oksydazy santhe poprzez przygotowanie dwóch probówek dla próbek osocza: jednej do inkubacji z substratem przez zero minut (jako kontrola) oraz drugiej do inkubacji przez cztery godziny.W ramach eksperymentu do każdej probówki należy dodać bufor i substrat. Próbki należy inkubować wstępnie w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Reakcję enzymatyczną rozpoczyna się poprzez dodanie 60 µL osocza do każdej probówki.Natychmiast dodaj 300 µL 4% kwasu nadchlorowego do probówki z czasem inkubacji zero. Z kolei pozostałą mieszaninę inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 37 °C, a następnie przerwij reakcję poprzez dodanie kwasu nadchlorowego. Wymieszaj probówkę kontrolną z czasem inkubacji zero w wortexie, a następnie odwiruj zawartość w wirówce.Odbierz 500 µL supernatu i dodaj go do probówki zawierającej 20 µL pięciomolarnego węglanu potasu w celu zneutralizowania reakcji, wymieszaj zneutralizowaną próbkę w wortexie i ponownie odwiruj. Następnie dodaj 350 µL zneutralizowanego roztworu do probówki do mikrocentryfugi zawierającej dwa ap. Po inkubacji czterogodzinnej próbki zatrzymaj reakcję, dodając 300 µL 4% kwasu nadchlorowego.Kontynuuj obróbkę próbki w taki sam sposób, jak w przypadku próbki kontrolnej. Próbki poddaj analizie za pomocą układu HPLC wyposażonego w skanujący detektor fluorescencji. Wprowadź parametry zgodnie z warunkami Socratic przy szybkości przepływu 1 mL/min.Aby uzyskać odpowiednią separację i identyfikację pików, należy ustawić długość fali wzbudzenia detektora fluorescencji na 340 nanometrów oraz długość fali emisji na 410 nanometrów. Po uruchomieniu analizy HPLC dla każdej próbki wykonuje się trzy wtryski o objętości 50 µL. Stosunek ISO terin do two AP wyznacza się na podstawie pól powierzchni pików uzyskanych ze spektrum detektora fluorescencji.Pierwszy pik w widmie, pojawiający się w około piątej minucie, odpowiada dwóm ap. Drugi i największy pik będzie odpowiadał terranowi. Pik ISO antho terin eluje jako ostatni; należy obliczyć różnicę w stosunku pól powierzchni piku ISO ANTOIN do piku dwóch AP pomiędzy punktami czasowymi inkubacji wynoszącymi zero i cztery godziny.Użyj tej wartości do obliczenia aktywności oksydazy ksantynowej na podstawie krzywych wzorcowych. Przedstawiono przykład ilościowego oznaczenia związków purynowych metodą HPLC; specyficzne czasy retencji i długości fal emisji kwasu moczowego, hypoksantyny i ksantyny umożliwiają jednoczesne oznaczenie ilościowe związków purynowych. Przy prawidłowym przeprowadzeniu analizy związki będą odpowiednio rozdzielone, a kształt pików będzie ostry i jednomodalny.Jeśli w systemie HPLC znajdują się pęcherzyki powietrza, czasy retencji ulegną przesunięciu, a ciśnienie HPLC będzie gwałtownie wahać się. W przypadku konieczności wymiany wkładu zabezpieczającego ciśnienie wzrośnie, a piki poszerzą się i staną się bimodalne lub trimodalne, jak pokazano w tym przykładzie. Przedstawiono przykład ilościowego oznaczania laniny metodą GCMS, ponieważ znane są masy pochodnej laniny oraz pochodnej ciężkiej laniny.Do identyfikacji tych związków na spektrometrze mas można wykorzystać tryb selekcji jonów. Jeśli analiza zostanie przeprowadzona prawidłowo, w tym samym czasie retencji zaobserwuje się dwa piki. Jeden pik odpowiada Alan Toin, a drugi ciężkiemu toin.Wyniki ilościowego oznaczenia MDA są podobne do wyników dla Alan Toin, z wyjątkiem tego, że dwa piki występują przy różnych czasach retencji. W tym przypadku obserwuje się pik o stosunku masy do ładunku 144 dla MDA oraz pik o stosunku masy do ładunku 158 dla MMDA. Przedstawiono przykład ilościowego oznaczenia aktywności ksantynooksydazy metodą HPLC dla czasu inkubacji wynoszącego zero minut oraz dla czasu inkubacji wynoszącego cztery godziny.Jeśli analiza zostanie przeprowadzona prawidłowo, w detektorze fluorescencyjnym powinny pojawić się trzy piki: jeden dla two ap, jeden dla Terranu i jeden dla ISO terin. Należy zauważyć, że dla czterogodzinnego czasu inkubacji pik ISO terin jest wyższy ze względu na zwiększoną aktywność enzymu santhe oksydazy. Ponieważ analiza ta mierzy funkcję enzymatyczną, wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie próbki może ją zmienić.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat dokładnego pomiaru kilku markerów biochemicznych niedotlenienia i niedokrwienia noworodka.

biochemical-measurement-of-neonatal-hypoxia

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Biochemiczny pomiar niedotlenienia noworodków

W niniejszym materiale proponujemy proste metody indukcji hipoksji w hodowlach komórkowych oraz proste testy służące do oceny stanu hipoksyjnego hodowli.

Indukcja i badanie hipoksji w hodowlach komórkowych

Modele dużych zwierząt mają wysoką wartość translacyjną w badaniu fizjologii i farmakologii niedotlenienia okołoporodowego. Wykorzystując noworodki prosiąt, opracowaliśmy eksperymentalny protokół symulacji niedotlenienia okołoporodowego, który umożliwia badanie hemodynamicznych parametrów systemowych i regionalnych, transportu tlenu wraz z szlakami biochemicznymi i patologicznymi oraz ich korelacji.

Model niedotlenienia okołoporodowego u świń

Połączyliśmy pomiary utlenowania hemoglobiny mózgowej wykonane za pomocą spektroskopii bliskiej podczerwieni w dziedzinie częstotliwości z pomiarami wskaźnika przepływu krwi mózgowej za pomocą dyfuzyjnej spektroskopii korelacyjnej, aby oszacować wskaźnik metabolizmu tlenu. Przebadaliśmy przydatność tego pomiaru jako narzędzia do przesiewowej oceny przy łóżku pacjenta w celu ewaluacji stanu zdrowia i rozwoju mózgu noworodka.

Nieinwazyjny pomiar optyczny metabolizmu mózgowego i hemodynamiki u niemowląt

encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna po uduszeniu okołoporodowym może być badana na modelach zwierzęcych. Przedstawiono procedury niezbędne do ustalenia modelu encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków u prosiąt.

Model prosięcia encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków

Ten artykuł opisuje metodologię podawania krótkich okresów przerywanego niedotlenienia młodym myszom lub szczurom w dniach 1-8 po urodzeniu. Takie podejście skutecznie wywołuje silny "efekt primingu" na poziomie tkankowym na hodowanych nerwowych komórkach progenitorowych, które są zbierane w ciągu 30 minut od ekspozycji na hipoksję.

Dostarczanie in vivo ostrej przerywanej hipoksji u noworodków gryzoni do głównych kultur neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących ze strefy podkomorowej

Chronicznie znieczulony model owcy bez znieczulenia jest używany do badania rozwoju ludzkiego płodu w zdrowiu i chorobie, ponieważ pozwala na chirurgiczne zakładanie i konserwację cewników i elektrod, powtarzalne pobieranie krwi, wstrzykiwanie substancji, rejestrowanie aktywności bioelektrycznej i obrazowanie in vivo. Opisujemy procedury wymagane do ustanowienia tego modelu.

Oprzyrządowanie owiec w okresie bliskim donoszonego do wielowymiarowych przewlekłych nagrań bez znieczulenia

Obrazowanie mikrokrążenia (MI) jest używane do monitorowania perfuzji obwodowej u krytycznie chorych lub wcześniaków. Ten manuskrypt i film pokazują optymalne podejście do uzyskiwania obrazów wysokiej jakości.

Przezskórne obrazowanie mikrokrążenia u wcześniaków

Ten protokół ma na celu pomóc klinicystom w pomiarze regionalnego natlenienia tkanek w różnych miejscach ciała u niemowląt i dzieci. Może być stosowany w sytuacjach, w których utlenowanie tkanek jest potencjalnie zagrożone, szczególnie podczas krążenia pozaustrojowego, podczas korzystania z niepulsacyjnych urządzeń wspomagających pracę serca oraz u krytycznie chorych noworodków, niemowląt i dzieci.

Jak wykonywać spektroskopię w bliskiej podczerwieni u krytycznie chorych noworodków, niemowląt i dzieci

Przedstawiamy protokół do pomiaru regionalnego wysycenia tlenem (rSO2) u pacjentów hemodializowanych (HD) za pomocą monitora spektroskopii bliskiej podczerwieni. WartośćrSO2 jest wskaźnikiem natlenienia tkanek. To nieinwazyjne monitorowanie w czasie rzeczywistym może być przydatne do potwierdzania zmian w natlenieniu narządów podczas HD.

Pomiar natlenienia tkanek za pomocą spektroskopii bliskiej podczerwieni u pacjentów poddawanych hemodializie

Przedstawiamy tutaj protokół indukujący hipoksję u noworodkowych myszy poprzez podawanie ich w kontrolowanych warunkach z różnym stężeniem tlenu. Modele mysie poddane zmianom tlenu przy urodzeniu trwało zmieniały ekspresję miRNA zaangażowanych w indukcję zmian behawioralnych fenotypowych, takich jak autyzm.

Hipoksja zmienia poziomy miRNA zaangażowane w dziedziczenie niemendelowskie zaburzeń ze spektrum autyzmu u myszy

Poznaj metodę biochemicznego pomiaru niedotlenienia noworodków z wykorzystaniem HPLC i GC/MS do analizy hipoksantyny, ksantyny i kwasu moczowego. Technika ta wspiera wczesną diagnostykę i leczenie.

Biochemiczny pomiar hipoksji noworodkowej

Przeglądaj więcej filmów