Name: Szybka diagnostyka chorób wirusowych roślin wspomagana mikrofalami za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj szybką diagnostykę chorób wirusowych roślin wspomaganą mikrofalami przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ta metoda skraca czas przygotowania próbek do dwóch godzin, umożliwiając jasną diagnozę w ciągu pół dnia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF, granty P20619 i P22988 dla B.Z.).

Przygotowanie próbek z wykorzystaniem mikrofal
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem przygotowania próbek należy zaprogramować automatyczny mikrofalowy procesor tkanek do mikroskopii elektronowej (Leica EM AMW; Leica Microsystems, Wiedeń, Austria) zgodnie z poniższymi protokołami (Tabela 1) dla mikrofalowego przygotowania próbek do TEM: 
		<img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="Wykres protokołu fiksacji i odwodnienia z informacjami o temperaturze i odczynnikach dla polimeryzacji żywicy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
		Tabela 1. Protokół przygotowania próbek z wykorzystaniem napromieniowania mikrofalowego. Poszczególne kolumny przedstawiają (od lewej do prawej): 
		<ol>
			<li>Numer probówki (Vial nr.), określający kolejność ładowania probówki do karuzeli procesora.</li>
			<li>Krok właściwego procesu.</li>
			<li>Odczynniki w probówkach.</li>
			<li>Czas trwania danego kroku.</li>
			<li>Maksymalna temperatura osiągana w probówce przed wyłączeniem napromieniowania mikrofalowego.</li>
			<li>Ustawienie napromieniowania mikrofalowego: Continuous (ciągłe) = szybki wzrost temperatury, utrzymanie zadanej temperatury; Slope (liniowe) = łagodny wzrost temperatury, temperatura końcowa osiągana na końcu; Pulsed (pulsacyjne) = szybki wzrost temperatury, wyłączenie mocy do spadku temperatury o 5°C, następnie ponowne włączenie mocy w celu osiągnięcia temperatury.</li>
			<li>Maksymalna moc napromieniowania mikrofalowego.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Należy na świeżo przygotować roztwory do poszczególnych kroków opisanych w protokole przygotowania próbek (w przypadku żywicy epoksydowej Agar 100 patrz pkt 1.7), przelać je do odpowiednich probówek zgodnie z zaprogramowanym protokołem (Tabela 1), załadować probówki do karuzeli, a następnie włożyć karuzelę do mikrofalowego procesora tkanek i na koniec wprowadzić pierwszą probówkę do komory jednomodułowej.</li>
	<li>Wykrawać małe fragmenty liści (1mm2) z Nicotiana tabacum zainfekowanej wirusem mozaiki tytoniu (TMV), używając ostrza żyletki na płytce z wosku modelarskiego, w kropli 3% glutaraldehydu (Agar Scientific Ltd., Stansted, Anglia) w 60mM buforze fosforanowym Sørensen (pH 7.2) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść fragmenty pęsetą bezpośrednio do odpowiednich koszyczków o szerokości oczek ok. 200μm. Ułożyć koszyczki jeden na drugim i włożyć je do komory jednomodułowej. Należy zadbać o to, aby podczas ładowania i układania koszyczków próbki były stale pokryte roztworem fiksacyjnym, aby nie wyschły.</li>
	<li>Uruchomić wcześniej zaprogramowany mikrofalowy protokół przygotowania próbek dla fiksacji, odwodnienia i infiltracji.</li>
	<li>Podczas automatycznego przygotowania próbek przez mikrofalowy procesor tkanek, kontynuować barwienie negatywne pozostałego materiału roślinnego zgodnie z opisem w sekcji 3 (barwienie negatywne).</li>
	<li>Na świeżo przygotować żywicę epoksydową Agar 100, mieszając poniższe składniki w opisany sposób: do plastikowego kubka wlać 24g Agar 100, 16g bezwodnika dodecenylosumczynianowego oraz 10 g bezwodnika nadycznego (wszystkie składniki: Agar Scientific Ltd., Stansted, Anglia), podgrzać do 40°C i dobrze wymieszać. Dodać 1,2g benzylodimetyloaminy i dokładnie wymieszać. Wlać żywicę epoksydową Agar 100 do odpowiednich form polimeryzacyjnych tuż przed zakończeniem protokołu przygotowania próbek (np. podczas kroku 22 w tabeli 1).</li>
	<li>Po zakończeniu protokołu (po kroku 22 w tabeli 1) przenieść ułożone koszyczki zawierające infiltrowane próbki z komory jednomodułowej do ostatniej probówki w karuzeli. Wyjąć karuzelę z urządzenia mikrofalowego, rozdzielić koszyczki i za pomocą pęsety przenieść próbki do odpowiednich form polimeryzacyjnych. Należy zadbać o to, aby podczas rozdzielania i ładowania próbki były zawsze pokryte żywicą epoksydową Agar 100, aby nie wyschły.</li>
	<li>Ułożyć formy polimeryzacyjne jedną na drugiej. Należy zadbać o to, aby podczas układania i ładowania próbki były zawsze pokryte żywicą epoksydową Agar 100, aby nie wyschły.</li>
	<li>Wyjąć wcześniej użyte probówki z karuzeli mikrofalowego procesora tkanek, załadować ją ułożonymi koszyczkami i włożyć karuzelę z powrotem do procesora.</li>
	<li>Uruchomić wcześniej zaprogramowany protokół polimeryzacji (tabela 1).</li>
	<li>Podczas automatycznego przeprowadzania polimeryzacji przez mikrofalowy procesor tkanek, badać siatki z barwieniem negatywnym za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego [np. Philips CM10 TEM, FEI (dawniej Philips), Eindhoven, Holandia] i przeprowadzić analizę obrazu zgodnie z opisem w sekcjach 3 i 4 (barwienie negatywne i analiza obrazu).</li>
	<li>Po zakończeniu protokołu wyjąć formy polimeryzacyjne z komory jednomodułowej, rozdzielić je i wyjąć spolimeryzowane bloczki zawierające próbki. Są one teraz gotowe do cięcia mikrotomem.</li>
</ol>
2. Przycinanie i krojenie
<ol>
	<li>Wstaw jeden lub więcej bloków do osobnych uchwytów na próbki do sekcjonowania ultratonkiego, tak aby próbka znajdowała się na górze i wystawała z uchwytu na około 1cm.</li>
	<li>Przytnij blok przy użyciu przyrządu do przycinania próbek do TEM (np. Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems), aby uzyskać powierzchnię bloku o maksymalnej długości 1mm i szerokości 200μm, zawierającą jak największą ilość materiału liścia (rozmiar powierzchni bloku może wymagać dostosowania do rozmiaru noża diamentowego).</li>
	<li>Wykonaj sekcje bloku za pomocą ultramikrotomu (np. Reichert Leica Ultracut S; Leica Microsystems), używając noża diamentowego pod kątem 45° (np. Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, Austria). Grubość sekcji należy ustawić na około 70 do 90nm, a prędkość cięcia na około 1mm/s. Zbierz kilka sekcji na miedzianą lub niklową siateczkę o oczkach 200, powleczoną formvarem (Agar Scientific Ltd.).</li>
	<li>Przeprowadź barwienie kontrastowe sekcji na siateczce cytrynianem ołowiu (Agar Scientific Ltd.; 1,1g cytrynianu ołowiu rozpuszczonego w 42ml wody dwukrotnie destylowanej i 8ml 1N NaOH) przez 5 minut w szalce Petri częściowo wypełnionej NaOH, aby stworzyć środowisko wolne od CO2, a następnie przez 15 minut 1% octanem uranylu (Agar Scientific Ltd.) rozpuszczonym w wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej. Pomiędzy każdym etapem barwienia kontrastowego przemywaj siateczki wodą destylowaną przez 1 minutę. Osusz siateczki na powietrzu w kasecie do siateczek.</li>
	<li>Obejrzyj sekcje w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (np. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, The Netherlands).</li>
</ol>
3. Barwienie negatywne
<ol>
	<li>Zebrać około 100mg materiału liściowego zainfekowanego TMV i przygotować surowy sok poprzez homogenizację materiału przez 2 minuty za pomocą żyletki na szkiełku przedmiotowym w 100μl 60mM buforu fosforanowego Sörensensa (pH 7,2).</li>
	<li>Przenieść 20μl otrzymanego homogenatu do pierwszej studni teflonowej płytki mikroskopowej z 4 lub więcej studniami (alternatywnie można przenieść homogenat na kawałek parafilmu).</li>
	<li>Umieścić siatkę pokrytą formvarem na wierzchu homogenatu stroną pokrytą formvarem (Agar Scientific Ltd.) skierowaną w stronę kropli i inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Przemyć siatkę 2 razy po 2 minuty, kładąc ją na dwóch kroplach po 200μl 60mM buforu fosforanowego Sörensensa (pH 7,2).</li>
	<li>Inkubować siatkę przez 1 minutę w świeżo przygotowanym 2% roztworze kwasu fosfotungstowego (Agar Scientific Ltd.) w 60mM buforze fosforanowym Sörensensa (pH 6,5).</li>
	<li>Wyjąć siatkę i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w kasetce na siatki.</li>
	<li>Obejrzeć siatkę w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (np. Philips CM10 TEM; FEI, Eindhoven, Holandia). Wykonać co najmniej 10 obrazów losowo wybranych, negatywnie barwionych wirionów (na każdym obrazie powinno być widocznych co najmniej 10 lub więcej wirionów) przy powiększeniu pierwotnym 21000X lub wyższym. Należy zadbać o to, aby wszystkie obrazy miały takie samo powiększenie.</li>
</ol>
4. Analiza obrazów
<ol>
	<li>Pomiar długości i szerokości co najmniej 100 losowo wybranych pojedynczych cząsteczek wirusa na mikrografiach wykonanych z próbek barwionych negatywnie, przy użyciu dowolnego oprogramowania do analizy obrazu [np. Cell D (Olympus, Life and Material Science Europe GmbH, Hamburg, Germany) z narzędziem do analizy cząsteczek lub Optimas 6.5.1- (Media Cybernetics Inc., Bethesda, Maryland, USA)].</li>
	<li>Obliczenie średnich i odchyleń standardowych w celu wyznaczenia średniej długości i szerokości cząsteczek wirusa zwizualizowanych metodami barwienia negatywnego oraz TEM.</li>
	<li>Porównanie długości i cech ultrastrukturalnych (uzyskanych w pkt 2.5) z rozmiarami wirusów oraz zmianami ultrastrukturalnymi wywołanymi przez choroby wirusowe znane z literatury w celu jednoznacznej identyfikacji chorób wirusowych.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Po przygotowaniu próbek z wykorzystaniem mikrofal można było zaobserwować w mikroskopie elektronowym transmisyjnym typowe zmiany ultrastrukturalne wywołane przez TMV, takie jak rozległe obszary zawierające wiriony ułożone równolegle w cytozolu zainfekowanych komórek Nicotiana tabacum (Rys. 1A). Dodatkowo w surowym soku z liści zainfekowanych TMV, po barwieniu negatywowym, cząsteczki TMV były widoczne jako giętkie struktury w kształcie pręta (Rys. 1B). Analiza obrazu 100 cząsteczek wirusa wykazała, że średni rozmiar TMV wynosi 280 nm długości i 17 nm szerokości (Rys. 2). Stwierdzono, że ultrastruktura w komórkach zainfekowanych TMV oraz rozmiar wirionów zaobserwowane w niniejszej badaniu są zgodne z właściwościami ultrastrukturalnymi wywołanymi przez TMV w tytoniu oraz z zakresem wielkości cząsteczek TMV raportowanym wcześniej w literaturze9-15.
<img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="Wiriony w strukturze komórkowej; obraz z mikroskopu elektronowego; pomiary skali w nanometrach; badanie biologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Mikrografie transmisyjne elektronowe komórek liścia zainfekowanych TMV oraz wirionów. A) Obraz przedstawia ultrastrukturę komórek mezofilu liścia Nicotiana tabacum zainfekowanych TMV po przygotowaniu próbki roślinnej z wspomaganiem mikrofalowym. Zwróć uwagę na duży obszar równolegle ułożonych wirionów nagromadzonych w cytosolu. C=chloroplast ze skrobią (St), M=mitochondrium, N=jądro komórkowe, V=wakuola, Bar=2μm. B) Obraz przedstawia wiriony wykryte metodą barwienia negatywnego w soku z zainfekowanych liści.
<img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="Rozkład wielkości cząsteczek wirusa; wykres słupkowy długości i szerokości wirionów; średnia długość 280 nm, szerokość 17 nm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Względna wielkość wirionów. Względny rozkład długości i szerokości cząsteczek TMV po barwieniu negatywowym soku z zainfekowanych liści, widziany w mikroskopie elektronowym. Wartości średnie (średnia długość/szerokość ± odchylenie standardowe) obliczono na podstawie 100 wirionów.

<ol><li>Bozzola, J. J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy%22">Electron Microscopy</a>. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).</li>
<li>Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuo%2C+J+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Electron+Microscopy%2C+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols</a>. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).</li>
<li>Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-assisted+tissue+processing+for+sameday+EM-diagnosis+of+potential+bioterrorism+and+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples.</a> Micron. 37, 577-590 (2006).</li>
<li>Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+P+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Electron+Microscopy%2C+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols</a>. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).</li>
<li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+assisted+rapid+plant+sample+preparation+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 233, 258-268 (2009).</li>
<li>Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+antigenic+preservation+of+plant+samples+by+microwave-enhanced+fixation%2C+using+dedicated+hardware%2C+minimizing+heat-related+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Micr.+Res.+Techniq%22%5BJournal%5D)">Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects.</a> Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).</li>
<li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+and+digital+imaging+technology+reduce+turnaround+times+for+diagnostic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy.</a> Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).</li>
<li>Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+polymerisation+with+microwave+irradiation+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Morph%22%5BJournal%5D)">Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy.</a> Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).</li>
<li>Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectric+spectroscopy+of+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).</li>
<li>Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+force+microscopy+study+for+the+assembly+structures+of+tobacco+mosaic+virus+and+their+size+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation.</a> Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).</li>
<li>Milne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+tobacco+mosaic+virus+in+tobacco+leaf+palisade+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells.</a> Virology. 28, 527-532 (1966).</li>
<li>Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tobacco+mosaic+virus+strains+on+the+ultrastructure+of+tobacco+leaf+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells.</a> Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).</li>
<li>Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens%3A+a+fresh+look+at+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus.</a> J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).</li>
<li>Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+tobacco+mosaic+virus+particles+as+scaffolds+for+display+of+protein+antigens+for+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications.</a> Virology. 348, 475-488 (2006).</li>
<li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+TEM+diagnosis+of+plant+virus+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases.</a> J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).</li>
<li>Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+processing+techniques+for+electron+microscopy%3A+a+four-hour+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol.</a> Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).</li>
</ol>

Brak declared konfliktów interesów.

Wykazano, że przygotowanie próbek roślinnych do TEM z wspomaganiem mikrofalowym dostarcza szybkich i wiarygodnych danych ultrastrukturalnych w ciągu zaledwie kilku godzin3,4,16. Zachowanie struktur subtelnych organelli i błon osiągnięte za pomocą metody zastosowanej w niniejszej pracy było zbliżone do próbek utrwalanych konwencjonalnie oraz kriofiksacją5,15, z tą przewagą, że czas utrwalania i zatapiania próbek został drastycznie skrócony z 3 dni lub więcej do około 2 godzin. Stanowi to najszybszy dostępny obecnie w literaturze protokół przygotowania próbek do TEM. Metoda opisana w tej pracy łączyła przygotowanie próbek roślinnych do TEM z wspomaganiem mikrofalowym z metodami barwienia negatywnego, co pozwoliło na jasną i szybką identyfikację zmian ultrastrukturalnych wywołanych przez TMV oraz samego czynnika wirusowego. Zmiany ultrastrukturalne wywołane przez TMV mogły zostać zbadane w transmisyjnym mikroskopie elektronowym po przycięciu, sekcjonowaniu i dobarwieniu w ciągu około 4 godzin od rozpoczęcia utrwalania. Wykorzystanie w pełni automatycznego trybu przygotowania preparatów pozwoliło badaczowi na przeprowadzenie w międzyczasie barwienia negatywnego w celu określenia wielkości i szerokości czynnika wirusowego. Można zatem wywnioskować, że metoda ta umożliwia jasną i szybką diagnostykę chorób wirusowych roślin w ciągu około pół dnia, co ma duże znaczenie dla przyszłego zastosowania w rolnictwie i eksperymentach naukowych w dziedzinie fitopatologii roślin. Ponieważ metoda ta mogłaby być również stosowana do szybkiej diagnostyki chorób zwierząt i ludzi, posiada ona duży potencjał do przyszłych zastosowań w patologii medycznej i weterynaryjnej.

<table><tbody><tr><td>Glutarsaldehyd</td><td>Agar Scientific</td><td>R1312</td><td></td></tr><tr><td>Tetrotransfected osmu</td><td>Agar Scientific</td><td>R1022</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Agar 100</td><td>Agar Scientific</td><td>R1043</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik bursztynowy dodecenylowy</td><td>Agar Scientific</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik nadynowy metylowy</td><td>Agar Scientific</td><td>R1081</td><td></td></tr><tr><td>Benzylodimetyloamina</td><td>Agar Scientific</td><td>R1060</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu</td><td>Agar Scientific</td><td>R1210</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Agar Scientific</td><td>R1260A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosfotungstowy</td><td>Agar Scientific</td><td>R1213</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Agar Scientific</td><td>R1202</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM AMW</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica (Reichert) Ultratrim</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Dostępny nowszy model</td></tr><tr><td>Leica (Reichert) Ultracut S</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Dostępny nowszy model</td></tr><tr><td>Diatome Ultra 45</td><td>Gr&amp;#246;pl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM10 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td>Dostępny nowszy model</td></tr><tr><td>Cell D</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimas 6.5.1</td><td>Media Cybernetics Inc.</td><td></td><td>Dostępna nowsza wersja</td></tr></tbody></table>

szybka diagnostyka chorób wirusowych roślin z wykorzystaniem wspomagania mikrofalowego za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Badania zmian ultrastrukturalnych indukowanych przez wirusy są często niezbędne do jednoznacznego zidentyfikowania chorób wirusowych roślin. Przy zastosowaniu konwencjonalnego przygotowania próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) takie badania mogą trwać kilka dni1,2, przez co nie nadają się do szybkiej diagnostyki chorób wirusowych roślin. Fixacja mikrofalowa może być wykorzystana do drastycznego skrócenia czasu przygotowania próbek do badań TEM, dając podobne wyniki ultrastrukturalne, jakie obserwuje się po konwencjonalnym przygotowaniu próbek3-5. Obecnie dostępnych jest wiele różnych, wykonanych na zamówienie urządzeń mikrofalowych, które mogą być stosowane do skutecznej fixacji i zatapiania próbek biologicznych do badań TEM5-8. W niniejszym badaniu wykazujemy na przykładzie roślin Nicotiana tabacum zainfekowanych wirusem mozaiki tytoniu (TMV), że możliwe jest zdiagnozowanie zmian ultrastrukturalnych w liściach w ciągu około pół dnia, stosując przygotowanie próbek wspomagane mikrofalowo do TEM. Zdecydowaliśmy się przeprowadzić to badanie z użyciem dostępnego komercyjnie urządzenia mikrofalowego, ponieważ przygotowuje ono próbki niemal całkowicie automatycznie5, w przeciwieństwie do innych dostępnych urządzeń, w których wiele etapów wciąż musi być wykonywanych ręcznie6-8, co czyni je bardziej czasochłonnymi i pracochłonnymi. Ponieważ przygotowanie próbek odbywa się w pełni automatycznie, podczas fixacji i zatapiania można przeprowadzić barwienie negatywne cząstek wirusowych w soku z pozostałych zainfekowanych TMV liści, a następnie zbadać ich ultrastrukturę i rozmiar.

Niniejsze badanie opisuje metodę pozwalającą na szybką i jednoznaczną diagnostykę chorób wirusowych roślin w czasie około pół dnia, wykorzystując połączenie wspomaganego mikrofalowo przygotowania próbek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej oraz metod barwienia negatywowego.

Szybka diagnostyka chorób wirusowych roślin z wykorzystaniem wspomagania mikrofalowego za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Badania zmian ultrastrukturalnych wywołanych przez wirusy są często niezbędne do jednoznacznej identyfikacji chorób wirusowych u roślin. Przy konwencjonalnym przygotowaniu próbek...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zdiagnozowanie chorób wirusowych roślin w ciągu kilku godzin za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Procedura rozpoczyna się od utrwalania i zatapiania zainfekowanego materiału roślinnego z wykorzystaniem mikrofal. Kolejnym krokiem jest wyodrębnienie i barwienie cząsteczek wirusa z próbek roślinnych metodą barwienia negatywowego, a następnie wykonywanie cienkich przekrojów z zatopionych próbek roślinnych.Próbki są następnie badane w transmisyjnym mikroskopie elektronowym, a wielkość cząsteczek wirusa jest mierzona za pomocą analizy obrazu. Ostatecznie wyniki wykazują typowe ultrastrukturalne zmiany wywołane przez wirusy oraz wielkość cząsteczek wirusa określoną za pomocą metod transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalna fiksacja i zatopienie w temperaturze pokojowej, co może trwać kilka dni, jest skrócenie czasu przygotowania próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej do około dwóch godzin, co pozwala na postawienie jasnej diagnozy choroby wirusowej w ciągu około pół dnia.W przeprowadzeniu tej procedury pomogą mi Gerhard Kaba, technik, oraz profesor Zelnik, współpracownik z naszego laboratorium. Przed rozpoczęciem programu przygotowania próbek, należy ustawić automatyczny mikrofalowy procesor tkanek do mikroskopii elektronowej LA A-E-M-A-M-W zgodnie z odpowiednimi protokołami. Przygotuj roztwory do poszczególnych etapów opisanych w zaprogramowanym protokole dla fiksacji, odwodnienia i infiltracji, wlej je do wyznaczonych fiolek zgodnie z protokołem, a następnie umieść fiolki na karuzeli. Wsuń karuzelę do mikrofalowego procesora tkanek, a następnie umieść pierwszą fiolkę w komorze trybu mono.Następnie, za pomocą żyletki na płytce z wosku modelarskiego, wytnij małe fragmenty liści tytoniu nicotiana zainfekowanego wirusem mozaiki tytoniu (TMV) w kropli glutaraldehydu w buforze Sorensena i fosforanowym w temperaturze pokojowej. Podczas pobierania i umieszczania próbek w koszyczkach należy upewnić się, że są one stale pokryte roztworem utrwalającym, aby nie uległy wysuszeniu. Za pomocą precyzyjnej pęsety natychmiast przenieś wycięte fragmenty do odpowiednich koszyczków o szerokości oczek około 200 µm.Ustaw koszyki jeden na drugim i włóż je do komory w trybie mono. Uruchom wcześniej zaprogramowany protokół przygotowania próbek wspomaganego mikrofalowo w celu utrwalenia, odwodnienia i infiltracji. Tuż przed zakończeniem protokołu przygotowania próbek wlej świeżo przygotowaną żywicę epoksydową agar 100 do odpowiednich form polimeryzacyjnych.Po zakończeniu protokołu należy zwolnić ułożone w stos koszyki zawierające infiltrowane próbki z komory w trybie mono do ostatniej probówki w karuzeli. Wyjmij karuzelę z urządzenia mikrofalowego i wyjmij z niej probówkę z próbkami. Następnie wyjmij koszyki z probówki i rozdziel je, używając precyzyjnej pęsety.Przenieś próbki do odpowiednich form do polimeryzacji. Następnie ułóż formy do polimeryzacji jedna na drugiej i wyjmij wcześniej użyte probówki z karuzeli mikrofalowego procesora tkanek. Umieść ułożone koszyki w karuzeli, a następnie wsuń karuzelę do urządzenia mikrofalowego.Teraz uruchom wcześniej zaprogramowany protokół polimeryzacji. Po zakończeniu protokołu wyjmij formy polimeryzacyjne z komory trybu mono i rozdziel je. Wyjmij spolimeryzowane bloki zawierające próbki, które są teraz gotowe do cięcia mikrotomem, aby rozpocząć procedurę krojenia bloków z próbkami.Wprowadź jeden lub więcej bloków do oddzielnych uchwytów próbek przeznaczonych doy ultrazcieńkiego skrawania. Umieść próbkę na górze, tak aby wystawała około jednego centymetra z uchwytu. Przytnij blok za pomocą trymera do próbek TEM, aby uzyskać powierzchnię bloku o maksymalnej długości 1 mm i szerokości 200 µm, zawierającą jak najwięcej materiału liścia.Ustaw ultramikrotom tak, aby wycinać sekcje o grubości od około 70 do 90 nanometrów przy prędkości cięcia około jednego milimetra na sekundę. Wykonaj sekcje bloku za pomocą noża diamentowego pod kątem 45 stopni. Pobierz kilka sekcji na miedzianą lub niklową siatkę o oczkach 200 pokrytą Formvarem; przeprowadź barwienie sekcji na siatce cytrynianem ołowiu przez pięć minut w szalce Petriego, częściowo wypełnionej NaOH w celu stworzenia środowiska wolnego od CO2.Przemywaj siatki wodą destylowaną przez jedną minutę. Na koniec przeprowadź barwienie kontrastowe przez 15 minut przy użyciu 1% octanu uranylu rozpuszczonego w wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej; po ponownym przemyciu siatek wodą destylowaną przez jedną minutę, wysusz je na powietrzu w pudełku na siatki. Barwienie negatywne pozostałego materiału roślinnego jest wykonywane w czasie, gdy przygotowanie próbek odbywa się automatycznie w mikrofalowym procesorze tkanek.W pierwszej kolejności pobierz około 100 mg materiału z liści zainfekowanych TMV i przygotuj surowy sok (SAP), homogenizując materiał przez dwie minuty za pomocą żyletki na szkiełku przedmiotowym w buforze fosforanowym. Przenieś 20 µL otrzymanego homogenatu do pierwszej studzienki pokrytego teflonem szkiełka mikroskopowego.Kuweta z czterema lub większą liczbą dołków. Następnie należy umieścić siatkę powlekaną form VAR na powierzchni homogenatu, tak aby strona powlekana form VAR była skierowana w stronę kropli, i inkubować przez pięć minut. Płukać siatkę przez dwie minuty, kładąc ją na kropli buforu fosforanowego z dodatkiem sorbitolu.Powtórzyć płukanie przez kolejne dwie minuty. Następnie inkubować siatkę przez jedną minutę w świeżo przygotowanym roztworze kwasu fosforowego. Po jednej minucie wyjąć siatkę i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.Włóż siatkę z barwieniem negatywowym do uchwytu próbek w pudełku na siatki, a następnie poddaj ją badaniu za pomocą mikroskopu elektronowego przechodzącego. Podczas gdy procesor mikrofalowy do tkanek automatycznie przeprowadza polimeryzację, wykonaj co najmniej 10 obrazów losowo wybranych jonów z barwieniem negatywowym. Na każdym obrazie widocznych powinno być co najmniej 10 jonów.Podczas korzystania z transmisyjnego mikroskopu elektronowego przy powiększeniu pierwotnym 21 000 x lub wyższym, należy zadbać o to, aby wszystkie obrazy miały takie samo powiększenie. Przekroje zawierające próbki tkanek, które zostały automatycznie przetworzone przez mikrofalowy procesor tkanek, są również badane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Analizę obrazów uzyskanych za pomocą TEM można przeprowadzić przy użyciu dowolnego programu do analizy obrazu.Oprogramowanie komputerowe z narzędziem do analizy cząstek. Zmierz długość i rozmiar co najmniej 100 losowo wybranych pojedynczych cząstek wirusów na mikrografiach uzyskanych z próbek barwionych negatywnie. Oblicz średnie i odchylenia standardowe, aby wyznaczyć średnią długość i szerokość cząstek wirusów wizualizowanych metodami barwienia negatywnego i TEM po przygotowaniu próbek z wykorzystaniem mikrofal.W cytosolu zainfekowanych komórek tytoniu (Nicotiana tobacco) za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego można było zaobserwować typowe dla TMV zmiany ultrastrukturalne, takie jak duże obszary zawierające równolegle ułożone jony. Na tym mikrografie transmisyjnym C oznacza chloroplast ze skrobią, St.M oznacza mitochondrium, a V oznacza wakuolę; oznaczenie dla jądra komórkowego jest również widoczne.Dodatkowo, w surowym soku z liści zakażonych TMV, po barwieniu negatywowym można było zaobserwować cząsteczki TMV w postaci pręcikowatych struktur. Rysunek 1B. Ten wykres przedstawia względny rozkład długości i szerokości 100 cząsteczek TMV, takimi jak pojawiły się w mikroskopie elektronowym. Po barwieniu negatywowym analiza obrazu cząsteczek wirusa w soku z zakażonych liści wykazała, że średnia wielkość TMV wynosi 280 nanometrów długości i 17 nanometrów szerokości. Po jego opracowaniu w celu szybkiej diagnostyki chorób wirusowych mózgu.Technika ta może utorować drogę badaczom z dziedziny patologii zwierząt i ludzi do szybkiego diagnozowania chorób zwierząt i ludzi za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

microwave-assisted-rapid-diagnosis-plant-virus-diseases-transmission

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikrofalowa wspomagana szybka diagnoza chorób wirusowych roślin za pomocą mikroskopii elektronowej transmisyjnej

Transport makromolekularny między komórkami roślinnymi można oceniać poprzez przejściową ekspresję białka docelowego znakowanego fluorescencyjnie oraz analizę jego rozkładu wewnątrz- i międzykomórkowego za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Analiza makromolekularnego transportu międzykomórkowego in planta z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego

Poprawa naszego zrozumienia i zdolności do zwalczania wielu wirusów roślin przenoszonych przez owady wymaga wykorzystania wektorów. Przenoszenie wirusów roślin przez owady jest interakcją tritroficzną, a zatem wymaga manipulacji owadami, wirusem i rośliną. Wektory muszą być hodowane w dużych ilościach i manipulowane w taki sposób, aby zapewnić wysoką skuteczność przenoszenia na rośliny testowe. Przedstawiono podstawy hodowli i manipulacji mączczykiem, Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae),...

Przenoszenie wirusów roślinnych za pomocą mączlików

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

Uzyskanie wysokiej jakości obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku komórek roślinnych, które mają obfite duże wakuole wypełnione wodą i napowietrzone przestrzenie. Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zastępowanie przez zamrażanie znacznie skracają czas przygotowania próbek roślinnych do TEM, jednocześnie wytwarzając próbki o doskonałej konserwacji ultrastrukturalnej.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Opisujemy tutaj najnowsze osiągnięcia w izolacji wirusów w celu scharakteryzowania nowych genotypów wirusa Faustowirusa, nowej linii gigantycznych wirusów związanej z asfarwirusem. Protokół ten może być stosowany do wysokoprzepustowej izolacji wirusów, zwłaszcza gigantycznych wirusów infekujących ameby.

Szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis

Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Negatywna plama EM to potężna technika wizualizacji struktury makromolekularnej, ale różne techniki barwienia mogą dawać różne wyniki w zależności od próbki. W tym miejscu szczegółowo opisano kilka podejść do barwienia negatywnego, aby zapewnić wstępny przepływ pracy w celu rozwiązania problemu wizualizacji trudnych systemów.

Wariacje na temat metod mikroskopii elektronowej w barwieniu ujemnym: narzędzia do radzenia sobie z trudnymi systemami

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla systemu wyciszania mikroRNA (VbMS) opartego na wirusie ziemniaka X (PVX), aby funkcjonalnie scharakteryzować endogenne mikroRNA (miRNA) u ziemniaka. Docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego nas miRNA są integrowane z wektorem PVX i przejściowo ulegają ekspresji w ziemniakach w celu wyciszenia docelowego miRNA lub rodziny miRNA.

Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.

Ten protokół immunofluorescencyjnego znakowania zarówno białek wirusa roślinnego, jak i białek wektorów owadów w wyciętych jelitach owadów może być używany do badania interakcji między wirusem a owadami-wektorami, funkcji białek owadów i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transmisji wirusa.

Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Poznaj szybką diagnostykę chorób wirusowych roślin wspomaganą mikrofalami przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ta metoda skraca czas przygotowania próbek do dwóch godzin, umożliwiając jasną diagnozę w ciągu pół dnia.

Szybka diagnostyka chorób wirusowych roślin z wykorzystaniem wspomagania mikrofalowego za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów