Wprowadzenie do techniki ukierunkowanego niszczenia mikropęcherzyków za pomocą ultradźwięków

UTMD oznacza ukierunkowaną ultradźwiękami destrukcję mikropęcherzyków (ultrasound targeted microbubble destruction). UTMD może być wykorzystywane do ukierunkowanego, miejscowego dostarczania cząsteczek bioaktywnych, w tym genów terapeutycznych, do organów dostępnych dla ultradźwięków, takich jak serce i wątroba. W procesie UTMD cząsteczki bioaktywne, takie jak ujemnie naładowane plazmidowe wektory DNA kodujące wybrany gen, są dołączane do kationowych otoczek lipidowych środków kontrastowych w postaci mikropęcherzyków; mikropęcherzyki z wiązanym wektorem mogą być podawane dożylnie lub bezpośrednio do lewej komory serca.

U większych zwierząt mogą być one również podawane za pomocą cewnika tętnicy wieńcowej, z zastosowaniem lub bez zastosowania okresu oczekiwania. Następnie transport z krwiobiegu do organu docelowego odbywa się optymalnie poprzez kawitację akustyczną przy częstotliwości rezonansowej mikropęcherzyków. Prawdopodobnie energia mechaniczna generowana podczas rozpadu mikropęcherzyków prowadzi do przejściowego tworzenia się porów w komórkach śródbłonka lub pomiędzy nimi w mikrokrążeniu docelowego obszaru.

W wyniku tego efektu sonoporacyjnego zwiększa się wydajność transfekcji do komórek śródbłonka i przez nie, a wektory kodujące transgen mogą zostać zdeponowane w otaczającej tkance docelowej. DNA osoczowe pozostające w krążeniu jest szybko degradowane przez nukleazy w preparacie mikropęcherzyków krwi. Alikwot przygotowanego roztworu zapasowego mikropęcherzyków zawierający roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem glukozy, diol glicerol-3-fosfatydylocholinę oraz diol glicerol-3.

Fosfatydyloetanolaminę inkubuje się najpierw w temperaturze 40 °C przez 15 minut. Podgrzany roztwór mikropęcherzyków przenosi się następnie do probówki typu micro 1,5 ml zawierającej glicerol oraz od 1 do 2 mg oczyszczonego plazmidowego DNA kodującego konstrukt ekspresyjny dla badanego genu. Następnie dodaje się roztwór soli fizjologicznej (PBS) do uzyskania końcowej objętości 500 µL.

Następnie powietrze w mikroprobówce zastępuje się gazem oktafluoropropanem. Mikroprobówkę energicznie wstrząsa się w amalgamatorze stomatologicznym przez 20 sekund. Kalibracja sprzętu przed pierwszym użyciem: przetwornik kawitacyjny UTMD o częstotliwości 1 MHz musi zostać skalibrowany, aby zapewnić prawidłowy indeks mechaniczny i częstotliwość powtarzania impulsów.

Przetwornik zanurzeniowy o częstotliwości 1 MHz jest połączony z generatorem przebiegów poprzez wzmacniacz mocy. Przetwornik umieszcza się w plastikowym pojemniku wypełnionym wodą, kierując go bezpośrednio na hydrofon, który został podłączony do oscyloskopu za pomocą wzmacniacza ładunkowego. Częstotliwość przebiegu, amplitudę, cykl serii oraz wzmocnienie mocy można modyfikować w celu uzyskania odpowiedniego cyklu pracy i indeksu mechanicznego optymalnego do kawitacji mikropęcherzyków. W tej konfiguracji skalibrowaliśmy system do indeksu mechanicznego wynoszącego około 1,3 przy dostarczaniu mikropęcherzyków 1 MHz i UTMD przed podaniem mikropęcherzyków oraz U-T-M-D-C 57 BL. Sześć myszy zostaje znieczulonych dawką 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny poprzez wstrzyknięcie domięśniowe (IP).

Podawanie mikropęcherzyków odbywa się dożylnie poprzez bezpośredni wtrysk do lewej komory serca lub poprzez kaniulację żyły ogonowej, co zostanie zaprezentowane później w przypadku bezpośredniego wtrysku do serca. Objętość do 100 µL roztworu mikropęcherzyków obciążonych plazmowym DNA wstrzykuje się za pomocą igły 30G wprowadzonej w czwartą przestrzeń międzyżebrową przednią, pod kontrolą ultrasonograficznej wizualizacji, do lewej komory serca. Bolus roztworu mikropęcherzyków w wyniku wtrysku do lewej komory jest wizualizowany przy użyciu wysokoczęstotliwościowego przetwornika ultradźwiękowego VisualSonic umieszczonego stacjonarnie na klatce piersiowej myszy w rzucie wzdłużnym.

Bezpośrednio po wstrzyknięciu przeprowadza się niszczenie mikropęcherzyków przez około pięć minut, używając drugiego, mniejszego przetwornika niskiej częstotliwości 1,0 MHz, umieszczonego bezpośrednio nad docelowym narządem, aby skierować niszczenie do tego obszaru. Ultradźwięki są podawane do wątroby z częstotliwością powtarzania impulsów 1,0 MHz przy indeksie mechanicznym wynoszącym około 1,3 do 1,5 i okresie powtarzania impulsów 100 ms na każde 20 cykli; alternatywnie impulsy mogą być synchronizowane z EKG myszy w postaci serii trzech ramek ultradźwięków co cztery do sześciu cykli serca. W przypadku metody podawania mikropęcherzyków do żyły ogonowej mysz jest znieczulona w ten sam sposób, jak podczas podawania strzykawki zawierającej plazmid.

Mikropęcherzyki związane z DNA są podłączone do cewnika do żyły ogonowej z igłą o rozmiarze 27 G. Cewnik do żyły ogonowej jest wprowadzany do dystalnej części prawej lub lewej żyły bocznej biegnącej wzdłuż ogona myszy. Strzykawka zawierająca mikropęcherzyki jest umieszczana w pompie infuzyjnej, która automatycznie poda jednorodną, z góry określoną objętość roztworu w zadanym czasie.

Analiza bioluminescencji UTMD: skuteczność dostarczania plazmidowego DNA za pomocą UTMD można ocenić za pomocą różnych metod, w zależności od genów zakodowanych w konstrukcie. W szczególności obrazowanie bioluminescencyjne in vivo jest jedną z metod pozwalających na monitorowanie obecności i czasu trwania ekspresji genów u myszy transfekowanych plazmidem kodującym gen reporterowy bioluminescencji, taki jak lucyferaza.

System obrazowania in vivo Enogen jest wykorzystywany do bioluminescencji. Obrazy są zazwyczaj rejestrowane u wszystkich myszy pierwszego dnia po transfekcji za pośrednictwem UTMD, a następnie czynność ta jest powtarzana co trzy do czterech dni, aż do momentu, gdy ekspresja genu bioluminescencji przestanie być wizualnie wykrywalna za pomocą systemu. Aby przygotować myszy do obrazowania bioluminescencyjnego, myszy otrzymują najpierw wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) sondy reporterowej lucyferazy Lucifer.

Następnie myszy zostają poddane znieczuleniu. Około trzy minuty później pozwala się na biodystrybucję substratu lucyferazy przez około 10 minut, po czym zwierzę lub zwierzęta są umieszczane w komorze obrazowania Xeno Gen i wykonywany jest skan obrazowy całego ciała; podczas akwizycji system określa liczbę fotonów emitowanych w wyniku reakcji fotochemicznej lucyferazy po każdym uzyskanym obrazie.

Przy użyciu systemu obrazowania in vivo Xeno, oprogramowanie systemowe służy do pomiaru i kwantyfikacji widocznego luminescencyjnego obszaru zainteresowania.