Targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na Gal4

Niniejsza metoda ilustruje, w jaki sposób połączenie dyskretnej czasowo i przestrzennie elektroporacji in vivo z liniami transgenicznymi danio przebrzmiałego pozwala na selektywne celowanie w regiony rozwijającego się zarodka w celu ekspresji transgenu. Rozpocznij od linii transgenicznej cal TA4, uzyskanej metodą pułapki enhancerowej (enhancer trap), aby ograniczyć ekspresję genów do interesujących typów komórek. W tym przypadku jest to rozwijająca się opłotka węchowa w konkretnym momencie rozwoju. Wstrzyknij plazmid raportujący GFP do przedniej części przedmózgowia in vivo, a następnie wykonaj elektroporację, aby ułatwić dostarczenie DNA. Wyniki uzyskane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo wskazują na precyzyjną lokalizację transgenu w określonym czasie i procesie rozwoju.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wstrzykiwanie plazmidu w stadium jednej komórki, jest to, że ekspresja jest ukierunkowana na konkretne typy komórek w określonym regionie rozwijającego się mózgu. Wykorzystaj transgeniczną linię zebrafish, stworzoną za pomocą metody pośredniej pułapki enhansera, aby sterować ekspresją zarówno czynnika transkrypcyjnego calt A four, jak i białka reporterowego M cherry w specyficznych regionach rozwijającego się mózgu. Przeprowadź krzyżowanie dorosłych ryb heterozygotycznych pod względem insertu transgenicznego z rybami typu dzikiego, aby uzyskać około 50% potomstwa transgenicznego.

Następnie potraktuj embriony transgeniczne 100 µM phenylthiourea (PTU), zaczynając od szóstej do ósmej godziny po zapłodnieniu, aby zablokować tworzenie się pigmentu i ułatwić obrazowanie fluorescencyjne. W 24. do 28. godzinie po zapłodnieniu przenieś embriony do wody z jaj, pozbawionej PTU i pod mikroskopem fluorescencyjnym zidentyfikuj embriony transgeniczne po ekspresji mCherry w mikrofalówce. Przygotuj 0,5% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze do elektroporacji z dodatkiem Tween-20, a następnie doprowadź roztwór do stanu równowagi.

W inkubatorze ustawionym na 34 do 37 °C nanieś dużą kroplę, około 500 µL roztworu agro, na środek 60 mm szalki Petriego. Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń błonę chorionową z embrionów transgenicznych. Przenieś uwolnione embriony do szalki Petriego zawierającej bufor do elektroporacji z dodatkiem 0,02%trica anestetyka na dwie minuty.

Następnie przenieś od sześciu do ośmiu znieczulonych embrionów do przygotowanej kropli aros, używając przyciętych końcówek pipety Michaela. Ułóż embriony tak, aby wszystkie były zwrócone w tym samym kierunku i wyrównane w pionowym rzędzie. Unieruchom embriony w tej pozycji, zestalając aros za pomocą dużej szalki Petriego z dwiema do trzech milimetrów lodu.

Zalej szalkę buforem do elektroporacji z dodatkiem trica, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa zastygłą kroplę aros. Przygotuj oczyszczony plazmid ekspresyjny GFP z barwnikiem czerwienią fenolową do wstrzyknięcia. Następnie wykonaj pipety do mikroiniekcji, używając końcówki pipety do mikroladowania.

Dodaj od jednego do dwóch mikrolitrów roztworu plazmidowego DNA do pipety wstrzykującej, następnie zamontuj i zabezpiecz załadowaną pipetę w uchwycie do pipet systemu wtryskiwania ciśnieniowego. Usuń pęcherzyki powietrza z załadowanej pipety, energicznie wkładając ją w zanurzoną chusteczkę typu Kimwipe, aż impulsy ciśnienia spowodują wypływ czerwonego roztworu DNA, kierując pipetę w stronę przedniej części rozwijającego się mózgu. Wstrzyknij roztwór plazmidowego DNA do komór rozwijającego się mózgu za pomocą wtrysku ciśnieniowego.

Wprowadź DNA w bezpośrednie sąsiedztwo przyszłej opolpachowej cebulki węchowej. Wstrzykuj DNA, aż czerwony barwnik stanie się wyraźnie widoczny w przednim końcu komory przedmózgowia. Natychmiast przejdź do etapu elektroporacji, aby zapobiec dyfuzji i rozcieńczeniu DNA.

Ustaw stymulator SD nine tak, aby generował pojedyncze pięciomilisiekundowe impulsy elektroporacyjne przy napięciu 70 V. Ustaw elektrody w taki sposób, aby elektroda dodatnia znajdowała się przy wewnętrznym końcu zarodka, a elektroda ujemna za głową zarodka.

Ręcznie zainicjuj osiem impulsów elektroporacji, używając pojedynczego przełącznika stymulatora SD nine. Zachowaj jedną sekundę przerwy między kolejnymi impulsami. Pozostaw embriony do regeneracji na co najmniej 10 minut.

Następnie, używając precyzyjnej pęsety, delikatnie obrysuj kształt embrionów, unikając bezpośredniego kontaktu z nimi. Następnie wyjmij embriony z agarozy. Przenieś embriony z powrotem do wody jajowej i przechowuj w temperaturze 28 °C do momentu analizy ekspresji GFP.

Przenieś embriony do wody jajowej z dodatkiem 0,02% anestetyku trica na kilka minut, tak jak wcześniej, ale do środka mniejszej 35 milimetrowej szalki Petriego. Dodaj dużą kroplę 0,5% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia w wodzie jajowej z dodatkiem trica. Następnie przenieś jeden znieczulony embrion do tej kropli agarozy, używając przyciętych końcówek pipety typu micro loader.

Ustaw zarodek pionowo, aby umożliwić widok grzbietowy rozwijającego się mózgu pod mikroskopem pionowym. Utwardź agar na lodzie i użyj przyciętych końcówek mikro-dozowników, aby utrzymać orientację zarodka. Na koniec zalejy naczynie wodą z jaj oraz TRIS-HCl, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa utwardzoną kroplę agaru.

Niniejszy przykład łączy rozdzielczość czasową elektroporacji in vivo ze specyficzną dla typu komórek ekspresją pośredniczoną przez transgeniczne linie z pułapką enhansera w celu ukierunkowania na rozwijającą się cebulkę węchową. Transgeniczna linia z pułapką enhansera wykazuje konstytutywną ekspresję m cherry i calt A four w tylnej części mózgu, móżdżku, przedmózgowiu oraz cebulce węchowej w embrionach w piątym dniu po zapłodnieniu. Co istotne, cztery dni po elektroporacji komórki wykazujące ekspresję GFP prezentują typowe projekcje aksonalne komórek mitralskich cebulki węchowej.

Porównanie sygnałów z mCherry i krótszego czasu ekspozycji GFP wykazuje, że ciała komórek wykazujące ekspresję GFP są rzeczywiście zlokalizowane w opłocie węchowym przy użyciu konstruktów krótko-zapętlonego RNA. Procedura ta może być również wykorzystana do indukowania utraty funkcji w konkretnych typach komórek rozwijającego się mózgu.