Name: Celowanie w neurony opuszki węchowej za pomocą połączonych linii elektroporacji in vivo i wzmacniaczy na bazie Gal4 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T14:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in vivo w połączeniu z liniami transgenicznymi Danio rerio do celowania w neurony opuszki węchowej. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę czasową i przestrzenną ekspresji genu w określonych typach komórek mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu NIH R15 AREA przyznanego Johnowi Horneowi (NIMH; R15MH083221).

1. Zarodki transgeniczne
<ol>
	<li>W niniejszym doświadczeniu wykorzystujemy transgeniczną linię danio pręgowanego, stworzoną za pomocą metody pułapki enhancerów zapośredniczonej przez transpozony 8. Wstawka transgeniczna zawiera dwie sekwencje kodujące: KalTA4, zoptymalizowaną dla danio pręgowanego wersję aktywatora transkrypcyjnego Gal4, oraz czerwone białko fluorescencyjne mCherry. Metoda pułapki enhancerów pozwala na uzyskanie linii transgenicznych danio pręgowanego, w których kaseta transgeniczna jest wyrażana pod kontrolą endogennej sekwencji enhancera. W związku z tym, w zależności od tożsamości konkretnej sekwencji enhancera, ekspresja zarówno KalTA4, jak i mCherry jest zlokalizowana w określonych obszarach rozwijającego się mózgu. Dla linii Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5, której tutaj używamy, ekspresja jest zlokalizowana w kilku miejscach w rąbie, przedmózgowiu oraz, co jest tutaj szczególnie istotne, w opuszce węchowej 8 (patrz również Ryc. 1). Biorąc pod uwagę ten wzór ekspresji oraz lokalizację kasety w genomie, przewiduje się, że transgeny znajdują się pod kontrolą promotora zic4 8 (patrz również <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main</a>.).</li>
	<li>Dorosłe ryby Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 heterozygotyczne pod kątem wstawki transgenicznej są zazwyczaj krzyżowane z rybami WT (AB), co daje około 50% potomstwa transgenicznego. (Aby uzyskać wyższy odsetek potomstwa transgenicznego, można skrzyżować dwa osobniki heterozygotyczne).</li> 
	<li>W celu zablokowania powstawania pigmentu i ułatwienia obrazowania fluorescencyjnego, należy traktować embriony transgeniczne 100 μM N-fenylotiomocznikiem (PTU), zaczynając od 6-8 hpf.</li>
</ol>
2. Montowanie zarodków
<ol>
	<li>W 24-28 hpf przenieść zarodki do wody do jaj bez PTU. Zidentyfikować zarodki transgeniczne na podstawie ekspresji mCherry przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Usunąć błonę otoczkową z zarodków transgenicznych za pomocą precyzyjnej pęsety. Przenieść zarodki uwolnione z otoczki do szalki Petri zawierającej bufor do elektroporacji z dodatkiem 0,02% trikainy [Bufor do elektroporacji: 180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,2] 4. Odczekać 2 minuty, aż środek znieczulający zacznie działać, przed przejściem do etapu montażu.</li>
	<li>Przygotować 0,5% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze do elektroporacji z trikainą, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej, a następnie umieszczając go w inkubatorze w temperaturze 34-37°C. Po wyrównaniu temperatury roztworu agarozy, nanieść dużą kroplę (˜500 μl) roztworu agarozy na środek 60 mm szalki Petri. Dodać 6-8 znieczulonych zarodków do tej kropli agarozy.</li>
	<li>Używając precyzyjnej pęsety (lub ostrych końców przeciętych końcówek pipet mikroloader), ustawić zarodki tak, aby wszystkie były skierowane w tym samym kierunku i wyrównane w pionowym rzędzie. Aby utwardzić agarozę i unieruchomić zarodki w tej pozycji, umieścić szalkę na większej szalce Petri z 2-3 mm lodu.</li>
	<li>Po utwardzeniu agarozy zalać szalkę buforem do elektroporacji z trikainą, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa utwardzoną kroplę agarozy.</li>
</ol>
3. Mikrowstrzykiwanie plazmidu ekspresyjnego DNA
<ol>
<li>Przygotować plazmid ekspresyjny GFP, używając zestawu do izolacji plazmidów midi- lub maxi-prep (np. Qiagen). Zawiesić plazmid w wodzie sterylnej z dodatkiem 0,03% czerwieni fenolowej do końcowego stężenia 0,5 μg/μl. W opisanym tutaj eksperymencie celującym w opuszki węchowe stosujemy plazmid ekspresyjny z sekwencją kodującą EGFP pod kontrolą wielu miejsc wiązania Gal4 (14 tandemowych sekwencji UAS oraz podstawowego promotora rybiego E1b). Dzięki zastosowaniu tego plazmidu tylko komórki transgenicznie ekspresyjne dla czynnika transkrypcyjnego KalTA4 będą w stanie eksprimować GFP, co umożliwia ukierunkowaną ekspresję GFP. 
Uwaga: w tym przypadku używamy czerwieni fenolowej do wizualizacji iniekcji DNA, co powinno być możliwe w przypadku celowania w inne obszary rozwijającego się mózgu, o ile obszar ten jest dostępny z komór mózgu. Do celowania w inne typy komórek wymagające wizualizacji fluorescencyjnej, do wizualizacji iniekcji w oświetleniu fluorescencyjnym można potencjalnie zastosować barwniki Bodipy lub kropki kwantowe (Quantum Dot).</li>
<li>Pipety do mikroiniekcji można wykonać za pomocą horyzontalnego lub wertykalnego wyciągacza do pipet. Ustawienia temperatury i siły wyciągania będą się różnić w zależności od typu wyciągacza, rodzaju elementu grzejnego oraz rodzaju szklanych rurek kapilarnych. 
Używając wertykalnego wyciągacza Sutter P-30, należy ustawić temperaturę na 980 i siłę wyciągania na 960, aby uzyskać długie, zwężające się, ostre pipety z cienkościennego szkła borokrzemianowego z włóknami [Sutter Instrument #BF100-78]. Pipety do mikroiniekcji wyciągnięte przy tych ustawieniach są zamknięte i muszą zostać otwarte (poprzez kontrolowane przełamanie końcówki) przed iniekcją.</li>
<li>Za pomocą końcówki pipety typu microloader dodać 1-2 μl roztworu plazmidowego DNA do pipety do iniekcji.</li>
<li>Zamontować i zabezpieczyć napełnioną pipetę w uchwycie pipety systemu iniekcji ciśnieniowej.</li>
<li>Otwierać końcówkę napełnionej pipety za pomocą precyzyjnej pęsety, aż impulsy ciśnienia spowodują wypchnięcie czerwonego roztworu DNA. Alternatywnie, końcówki można otwierać poprzez szybkie przebicie zanurzonej, złożonej chusteczki laboratoryjnej Kimwipe. 
Uwaga: ponieważ pipety do iniekcji są początkowo zamknięte i muszą być otwierane ręcznie, rozmiar końcówki i objętość iniekcji są zmienne. Idealne pipety do iniekcji powinny wymagać 3-5 impulsów iniekcyjnych do całkowitego wypełnienia rozwijającego się komory przodomózgowia embrionów w 24 hpf (impulsy iniekcyjne 100 ms przy 40 psi).</li>
<li>Wstrzyknąć roztwór plazmidowego DNA do komór rozwijającego się mózgu w taki sposób, aby DNA zostało wtłoczone w obszar przyległy do regionu mózgu przeznaczonego do utworzenia opuszki węchowej i w jego obręb. Opuszka węchowa pochodzi z komórek znajdujących się w najbardziej przedniej ścianie komory przodomózgowia. Zatem poprzez wprowadzenie pipety do iniekcji do komór w taki sposób, aby pipeta była skierowana ku przedniej części rozwijającego się mózgu, iniekcja ciśnieniowa wtłacza DNA do i w sąsiedztwo przyszłej opuszki węchowej. Wstrzykiwać DNA, aż czerwony barwnik będzie wyraźnie widoczny w przedniej części komory przodomózgowia. Ponieważ DNA zaczyna dyfundować natychmiast, rozcieńczając się, ważne jest, aby przejść do etapu elektroporacji jak najszybciej po iniekcji (np. w ciągu 10 s).</li>
</ol>
4. Elektroporacja
<ol>
	<li>Elektroporację przeprowadza się przy użyciu samodzielnie wykonanych elektrod z podskórnych elektrod platynowych Grass (Grass Technology #E2). Elektrody są przymocowane do ręcznej sondy, a końcowa odległość między elektrodami platynowymi powinna wynosić 1 mm (szczegóły konstrukcji znajdują się w 9). Impulsy elektroporacyjne o przebiegu prostokątnym są generowane poprzez podłączenie elektrod do stymulatora Grass SD-9 (Grass Technology, model SD-9).</li> 
	<li>Ustaw stymulator SD-9 tak, aby generował pojedyncze impulsy elektroporacyjne o czasie trwania 5 ms i napięciu 70 V. Ustaw elektrody w taki sposób, aby elektroda dodatnia znajdowała się przy przednim końcu zarodka, a elektroda ujemna za głową zarodka. Ręcznie wywołaj ok. 7-8 impulsów elektroporacyjnych, korzystając z przełącznika trybu pojedynczego stymulatora SD-9, zachowując odstęp ok. 1 s między każdym impulsem. Odpowiednie napięcia będą się różnić w zależności od wieku zarodków i używanego źródła napięcia. Młodsze zarodki wymagają niższych napięć, aby uniknąć ich uszkodzenia, natomiast starsze zarodki wymagają wyższych napięć do zainicjowania elektroporacji 7.</li> 
<li>Po elektroporacji pozostaw zarodki do regeneracji na co najmniej 10 min przed uwolnieniem ich z agarozy.</li>
<li>Używając precyzyjnej pęsety, uwolnij zarodki z agarozy, delikatnie prowadząc wzdłuż ich obrysu, unikając bezpośredniego kontaktu z samymi zarodkami.</li>
<li>Po uwolnieniu przenieś zarodki do wody do jaj (z dodatkiem PTU, jeśli jest wymagane). Przechowuj je w temperaturze 28°C aż do momentu obrazowania ekspresji GFP.</li>
</ol>
5. Montowanie embrionów do obrazowania
<ol>
<li>Przenieść zarodki z wody do jaj wraz z PTU do wody do jaj z dodatkiem 0,02% tricaine. Odczekać kilka minut, aż środek znieczulający zacznie działać, przed przejściem do etapu montażu.</li>
<li>Przygotować 0,5% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w wodzie do jaj z dodatkiem tricaine, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej, a następnie umieszczając go w inkubatorze w temperaturze 34-37°C. Po wyrównaniu temperatury roztworu agarozy nanieść dużą kroplę (˜300 μl) roztworu agarozy na środek szalki Petriego o średnicy 35 mm. Dodać jeden znieczulony zarodek do tej kropli agarozy.</li> 
<li>Używając precyzyjnej pęsety (lub cienkich końców przeciętych końcówek pipet mikroloader), ustawić zarodki w pozycji pionowej, tak aby możliwe było obrazowanie widoku grzbietowego rozwijającego się mózgu za pomocą mikroskopu biologicznego (mikroskopy odwrócone wymagają innego ustawienia zarodka oraz innej szalki umożliwiającej obrazowanie od dołu; patrz 12). Utwardzić agarozę, kładąc szalkę na większej szalce Petriego z 2-3 mm lodu. Podczas utwardzania prawdopodobnie konieczne będzie ponowne ustawienie zarodka precyzyjną pęsetą, aby upewnić się, że zarodek nie przechyli się na bok.</li>
<li>Po utwardzeniu agarozy zalać szalkę wodą do jaj z dodatkiem tricaine, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa utwardzoną kroplę agarozy.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki: 
Choć ekspresję GFP można zaobserwować już 6 godzin po elektroporacji, w tym przypadku przedstawiamy obrazy zarodka 4 dni po elektroporacji, aby struktura neurytów w komórkach docelowych była wystarczająco rozwinięta. Transgeniczna linia pułapki enhancerowej Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 wykazuje konstytutywną ekspresję mCherry (oraz KalTA4) w rombencefhalonie, móżdżku, przodomózgowiu i opuszce węchowej w zarodkach w 5. dniu po zapłodnieniu (Rys. 1A i 1C). Zarodki, do których za pomocą ukierunkowanej elektroporacji (opisanej powyżej) wprowadzono plazmid ekspresyjny UAS-GFP, wykazują ekspresję GFP ograniczoną do komórek rozwijającej się opuszki węchowej (Rys. 1B, 1D i 1E). Tylko komórki transgenicznie eksponujące czynnik transkrypcyjny KalTA4 są w stanie aktywować ekspresję z tego plazmidu UAS-GFP. Wprowadzenie tego plazmidu do zarodków nietransgenicznych nie prowadzi do jakiejkolwiek wykrywalnej ekspresji GFP. Zatem to połączone działanie ukierunkowanej elektroporacji UAS-GFP oraz lokalnej transgenicznej ekspresji drivera KalTA4 prowadzi do wyłącznej ekspresji GFP w komórkach rozwijającej się opuszki węchowej. Komórki wykazujące ekspresję GFP prezentują typowe projekcje aksonalne komórek mitralnych opuszki węchowej (Rys. 1B i 1D) 10. W celu wizualizacji projekcji aksonów, obrazy na Rys. 1B i 1D musiały zostać naświetlone z wysoką ekspozycją, przez co regiony ciał komórkowych zostały znacznie prześwietlone. Niższy poziom ekspozycji (Rys. 1E) pokazuje, że ciała komórkowe wykazujące ekspresję GFP są rzeczywiście zlokalizowane w opuszce węchowej (porównać Rys. 1C i 1E; szara linia oznacza granicę opuszki węchowej).
<img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="Schemat ekspresji transgenicznej; fluorescencja mCherry i GFP, obrazy mikroskopowe porównujące ekspresję genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Celowana ekspresja GFP w opuszce węchowej zarodka zebrafish w 5. dobie po zapłodnieniu (dpf). Transgeniczna linia pułapki enhancerowej Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 wykazuje konstytutywną ekspresję mCherry w rombence, móżdżku, przedmózgowiu i opuszce węchowej (A i C, fluorescencja mCherry zaznaczona kolorem czerwonym). Ekspresja mCherry jest pośredniczona przez transgeniczną ekspresję Gal4. Zarodki poddane elektroporacji wektorem ekspresyjnym UAS-GFP w 28. godzinie po zapłodnieniu (hpf) wykazują celowaną ekspresję GFP w opuszce węchowej w 5. dobie po zapłodnieniu (B, D i E, fluorescencja GFP zaznaczona kolorem zielonym; ten sam zarodek co na zdjęciach A i C). Obraz z krótszym czasem ekspozycji na dole (E) pokazuje, że ekspresja GFP jest ograniczona do ciał komórkowych opuszki węchowej. Szara linia oznacza granicę opuszki węchowej. Obrazy w jasnym polu (skala szarości), fluorescencja zielona (zielony) i fluorescencja czerwona (czerwony) zostały wykonane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Olympus BX60.

<ol><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparking+new+frontiers%3A+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev Biol. 233, 13-21 (2001).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305, 254-258 (2004).</li>
<li>Teh, C., Parinov, S., Korzh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ways+to+admire+zebrafish%3A+progress+in+functional+genomics+research+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">New ways to admire zebrafish: progress in functional genomics research methodology.</a> Biotechniques. 38, 897-906 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural Development. 15, 2-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Kera, S. A., Agerwala, S. M., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+resolution+of+in+vivo+electroporation+in+zebrafish%3A+a+method+for+time-resolved+loss-of-function%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The temporal resolution of in vivo electroporation in zebrafish: a method for time-resolved loss-of-function.</a> Zebrafish. 7, 97-108 (2010).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).</li>
<li>Hoegler, K. J., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+zebrafish+optic+tectum+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeting the zebrafish optic tectum using in vivo electroporation.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2010).</li>
<li>Nobuhiko, M., Kozo, M., Tatsuya, T., Shin-ichi, H., Hitoshi, O., Yoshihiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+olfactory+bulb+to+higher+brain+centers%3A+genetic+visualization+of+secondary+olfactory+pathways+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From the olfactory bulb to higher brain centers: genetic visualization of secondary olfactory pathways in zebrafish.</a> J. Neurosci. 29, 4756-4766 (2009).</li>
<li>Davison, J. M., Akitake, C. M., Goll, M. G., Rhee, J. M., Gosse, N., Baier, H., Halpern, M. E., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Developmental Biology. , 304-811 (2007).</li>
<li>Distel, M., Kö, ster, W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">in vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protocols. , (2007).</li>
<li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 320, 113-121 (2008).</li>
<li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiasdis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> PNAS. , 107-10 (1993).</li>
<li>Zhu, P., Narita, Y., Bundschuh, S. T., Fajardo, O., Schärer, Y. P., Chattopadhyaya, B., Bouldoires, E. A., Stepien, A. E., Deisseroth, K., Arber, S., Sprengel, R., Rijli, F. M., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Front Neural Circuits. 3, 21-21 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy opisano metodę elektroporacji in vivo u ryb zebrafish, która wykorzystuje transgeniczną linię Gal4 z pułapką wzmacniacza (enhancer trap) w celu ukierunkowania ekspresji elektroporowanego transgenu na konkretną populację komórek w rozwijającej się opłocie węchowej. Podejście to łączy doskonałą rozdzielczość czasową elektroporacji in vivo 7 z ekspresją specyficzną dla typu komórek, pośredniczoną przez transgeniczne linie z pułapką wzmacniacza 8. Chociaż w tym przypadku opisano celowanie w opłot węchowy, elektroporację in vivo można wykorzystać do celowania w inne obszary rozwijającego się układu nerwowego 2-7, a dostępne są linie z pułapką wzmacniacza z ukierunkowaną ekspresją Gal4 w wielu różnych specyficznych typach komórek lub tkankach 8, 11. Oczywiście technika elektroporacji ta powinna być odpowiednia również dla innych kombinatorycznych podejść genetycznych, takich jak systemy LexA lub Tet 13, 14, 15. Główną zaletą elektroporacji jest brak konieczności tworzenia dodatkowych linii transgenicznych, pod warunkiem dostępności odpowiedniej linii Gal4. Pozwala to zaoszczędzić sześć miesięcy. 
In vivo elektroporacja umożliwia wprowadzenie oligonukleotydów do neuronów i ich prekursorów na dowolnym, wybranym etapie rozwoju układu nerwowego 7. Taka rozdzielczość czasowa jest szczególnie korzystna w analizach utraty funkcji (loss-of-function), ponieważ pozwala uniknąć problemów związanych z celowaniem w geny pełniące kluczowe funkcje na wcześniejszych etapach rozwoju. Opisana tutaj metoda może być również wykorzystana do wprowadzania odczynników powodujących utratę funkcji, w tym oligonukleotydów lub konstruktów RNAi oraz antysensownych oligonukleotydów morfolinowych 4, 7. Odczynniki oparte na plazmidach, takie jak plazmidy do ekspresji białek dominantowo-negatywnych lub plazmidy RNAi z krótkimi spinkami (shRNA), mogą być również pod kontrolą systemu Gal4 UAS, co umożliwia precyzyjną, specyficzną dla typu komórek ekspresję, którą zaprezentowano tutaj na przykładzie ekspresji GFP.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę wprowadzić tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;Odczynniki:&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Agaroza niskotopliwa (Sigma, A9414)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Zestaw do midi- lub maxi-prep plazmidów (np. Qiagen, #12643)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Czerwień fenolowa (Sigma, P3532)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. Oczekuję na treść z JoVE, którą mam przełożyć na język polski zgodnie z Twoimi wytycznymi.&quot;&gt;Sprzęt:&lt;/p&gt;&lt;ul (mikrolitr)&gt;&lt;li&gt;Kapilara szklana z włóknem; średnica wewnętrzna (ID) = 0,78 mm; średnica zewnętrzna (OD) = 1,0 mm (Sutter Instruments, #BF100-78-10)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;stymulator Grass SD-9 (Grass Technology, Model SD-9) &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Podskórne elektrody platynowe Grass, igła prosta (Grass Technology, #E2)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Końcówki do mikrodozownika (Eppendorf, #X22703R)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Wytciągacz pipet (np. Sutter, model P-30)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Wytciągacz pipet (np. Sutter, model P-30)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na gal4

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo elektroporacja jest potężną metodą dostarczania plazmidów ekspresyjnych DNA, reagentów RNAi oraz antysensownych oligonukleotydów morfolinowych do specyficznych regionów rozwijających się embrionów, w tym C. elegans, kurczaka, Xenopus, danio pręgowanego oraz myszy 1. W przypadku danio pręgowanego wykazano, że elektroporacja in vivo zapewnia doskonałą rozdzielczość przestrzenną i czasową w dostarczaniu tych reagentów 2-7. Rozdzielczość czasowa tej metody jest istotna, ponieważ pozwala na wprowadzenie tych reagentów na konkretnych etapach rozwoju. Co więcej, ponieważ ekspresja z wektorów poddanych elektroporacji następuje w ciągu 6 godzin 7, metoda ta jest bardziej szybka niż podejścia transgeniczne. Choć rozdzielczość przestrzenna może być niezwykle precyzyjna przy celowaniu w pojedynczą komórkę 2, 6, często preferowane jest wprowadzenie reagentów do konkretnej populacji komórek w obrębie tkanki lub struktury. Przy celowaniu w wiele komórek elektroporacja in vivo jest wydajna w dostarczaniu do konkretnego regionu embrionu; jednak, szczególnie w rozwijającym się układzie nerwowym, trudno jest celować w konkretne typy komórek wyłącznie poprzez przestrzennie dyskretną elektroporację. Alternatywnie, transgeniczne linie z pułapką wzmacniaczy (enhancer trap) oferują doskonałą ekspresję transgenów specyficzną dla typu komórek 8. W niniejszej pracy opisujemy podejście, które łączy transgeniczne linie pułapki wzmacniaczy oparte na Gal4 8 z przestrzennie dyskretną elektroporacją in vivo 7, 9 w celu specyficznego celowania w rozwijające się neurony opuszki węchowej danio pręgowanego. Wcześniej opisana 8 linia pułapki wzmacniaczy Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (dawniej GA80_9) wykazuje ukierunkowaną transgeniczną ekspresję mCherry zapośredniczoną przez zoptymalizowany dla danio pręgowanego aktywator transkrypcyjny Gal4 (KalTA4) w wielu regionach rozwijającego się mózgu, w tym w rombencefalonie, móżdżku, przodomózgowiu i opuszce węchowej. Aby skierować ekspresję GFP specyficznie do opuszki węchowej, plazmid z sekwencją kodującą GFP pod kontrolą wielu miejsc wiązania Gal4 (UAS) poddano elektroporacji w przedniej części przodomózgowia w 24-28 godzinach po zapłodnieniu (hpf). Chociaż metoda ta wprowadza plazmidowe DNA do wielu regionów przodomózgowia, ekspresja GFP jest indukowana tylko w komórkach transgenicznie wykazujących ekspresję czynnika transkrypcyjnego KalTA4. Zatem, dzięki zastosowaniu linii transgenicznej GA080_9, podejście to doprowadziło do ekspresji GFP wyłącznie w rozwijającej się opuszce węchowej. Komórki wykazujące ekspresję GFP, skierowane za pomocą tej metody, wykazały typowe projekcje aksonalne, jak wcześniej opisano dla komórek mitralnych opuszki węchowej 10. Metoda ta może być również wykorzystana do ukierunkowanego dostarczania innych reagentów, w tym plazmidów ekspresyjnych do interferencji RNA z krótkimi spinkami (shRNA), co zapewniłoby metodę przestrzennie i czasowo dyskretnej analizy utraty funkcji (loss-of-function).

Rozdzielczość czasowa i przestrzenna manipulacji genetycznych determinuje spektrum zjawisk biologicznych, na które mogą one oddziaływać. W niniejszej pracy wykorzystujemy dyskretną czasowo i przestrzennie elektroporację in vivo, w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, aby indukować ekspresję transgenu GFP specyficznie w neuronach rozwijającej się opolśnij węchowej.

Targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na Gal4

Elektroporacja in vivo jest potężną metodą dostarczania plazmidów ekspresyjnych DNA, odczynników RNAi oraz antysensownych oligonukleotydów morfolinowych do specyficznych...

Niniejsza metoda ilustruje, w jaki sposób połączenie dyskretnej czasowo i przestrzennie elektroporacji in vivo z liniami transgenicznymi danio przebrzmiałego pozwala na selektywne celowanie w regiony rozwijającego się zarodka w celu ekspresji transgenu. Rozpocznij od linii transgenicznej cal TA4, uzyskanej metodą pułapki enhancerowej (enhancer trap), aby ograniczyć ekspresję genów do interesujących typów komórek. W tym przypadku jest to rozwijająca się opłotka węchowa w konkretnym momencie rozwoju. Wstrzyknij plazmid raportujący GFP do przedniej części przedmózgowia in vivo, a następnie wykonaj elektroporację, aby ułatwić dostarczenie DNA. Wyniki uzyskane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo wskazują na precyzyjną lokalizację transgenu w określonym czasie i procesie rozwoju.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wstrzykiwanie plazmidu w stadium jednej komórki, jest to, że ekspresja jest ukierunkowana na konkretne typy komórek w określonym regionie rozwijającego się mózgu. Wykorzystaj transgeniczną linię zebrafish, stworzoną za pomocą metody pośredniej pułapki enhansera, aby sterować ekspresją zarówno czynnika transkrypcyjnego calt A four, jak i białka reporterowego M cherry w specyficznych regionach rozwijającego się mózgu. Przeprowadź krzyżowanie dorosłych ryb heterozygotycznych pod względem insertu transgenicznego z rybami typu dzikiego, aby uzyskać około 50% potomstwa transgenicznego.Następnie potraktuj embriony transgeniczne 100 µM phenylthiourea (PTU), zaczynając od szóstej do ósmej godziny po zapłodnieniu, aby zablokować tworzenie się pigmentu i ułatwić obrazowanie fluorescencyjne. W 24. do 28. godzinie po zapłodnieniu przenieś embriony do wody z jaj, pozbawionej PTU i pod mikroskopem fluorescencyjnym zidentyfikuj embriony transgeniczne po ekspresji mCherry w mikrofalówce. Przygotuj 0,5% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze do elektroporacji z dodatkiem Tween-20, a następnie doprowadź roztwór do stanu równowagi.W inkubatorze ustawionym na 34 do 37 °C nanieś dużą kroplę, około 500 µL roztworu agro, na środek 60 mm szalki Petriego. Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń błonę chorionową z embrionów transgenicznych. Przenieś uwolnione embriony do szalki Petriego zawierającej bufor do elektroporacji z dodatkiem 0,02%trica anestetyka na dwie minuty.Następnie przenieś od sześciu do ośmiu znieczulonych embrionów do przygotowanej kropli aros, używając przyciętych końcówek pipety Michaela. Ułóż embriony tak, aby wszystkie były zwrócone w tym samym kierunku i wyrównane w pionowym rzędzie. Unieruchom embriony w tej pozycji, zestalając aros za pomocą dużej szalki Petriego z dwiema do trzech milimetrów lodu.Zalej szalkę buforem do elektroporacji z dodatkiem trica, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa zastygłą kroplę aros. Przygotuj oczyszczony plazmid ekspresyjny GFP z barwnikiem czerwienią fenolową do wstrzyknięcia. Następnie wykonaj pipety do mikroiniekcji, używając końcówki pipety do mikroladowania.Dodaj od jednego do dwóch mikrolitrów roztworu plazmidowego DNA do pipety wstrzykującej, następnie zamontuj i zabezpiecz załadowaną pipetę w uchwycie do pipet systemu wtryskiwania ciśnieniowego. Usuń pęcherzyki powietrza z załadowanej pipety, energicznie wkładając ją w zanurzoną chusteczkę typu Kimwipe, aż impulsy ciśnienia spowodują wypływ czerwonego roztworu DNA, kierując pipetę w stronę przedniej części rozwijającego się mózgu. Wstrzyknij roztwór plazmidowego DNA do komór rozwijającego się mózgu za pomocą wtrysku ciśnieniowego.Wprowadź DNA w bezpośrednie sąsiedztwo przyszłej opolpachowej cebulki węchowej. Wstrzykuj DNA, aż czerwony barwnik stanie się wyraźnie widoczny w przednim końcu komory przedmózgowia. Natychmiast przejdź do etapu elektroporacji, aby zapobiec dyfuzji i rozcieńczeniu DNA.Ustaw stymulator SD nine tak, aby generował pojedyncze pięciomilisiekundowe impulsy elektroporacyjne przy napięciu 70 V. Ustaw elektrody w taki sposób, aby elektroda dodatnia znajdowała się przy wewnętrznym końcu zarodka, a elektroda ujemna za głową zarodka.Ręcznie zainicjuj osiem impulsów elektroporacji, używając pojedynczego przełącznika stymulatora SD nine. Zachowaj jedną sekundę przerwy między kolejnymi impulsami. Pozostaw embriony do regeneracji na co najmniej 10 minut.Następnie, używając precyzyjnej pęsety, delikatnie obrysuj kształt embrionów, unikając bezpośredniego kontaktu z nimi. Następnie wyjmij embriony z agarozy. Przenieś embriony z powrotem do wody jajowej i przechowuj w temperaturze 28 °C do momentu analizy ekspresji GFP.Przenieś embriony do wody jajowej z dodatkiem 0,02% anestetyku trica na kilka minut, tak jak wcześniej, ale do środka mniejszej 35 milimetrowej szalki Petriego. Dodaj dużą kroplę 0,5% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia w wodzie jajowej z dodatkiem trica. Następnie przenieś jeden znieczulony embrion do tej kropli agarozy, używając przyciętych końcówek pipety typu micro loader.Ustaw zarodek pionowo, aby umożliwić widok grzbietowy rozwijającego się mózgu pod mikroskopem pionowym. Utwardź agar na lodzie i użyj przyciętych końcówek mikro-dozowników, aby utrzymać orientację zarodka. Na koniec zalejy naczynie wodą z jaj oraz TRIS-HCl, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa utwardzoną kroplę agaru.Niniejszy przykład łączy rozdzielczość czasową elektroporacji in vivo ze specyficzną dla typu komórek ekspresją pośredniczoną przez transgeniczne linie z pułapką enhansera w celu ukierunkowania na rozwijającą się cebulkę węchową. Transgeniczna linia z pułapką enhansera wykazuje konstytutywną ekspresję m cherry i calt A four w tylnej części mózgu, móżdżku, przedmózgowiu oraz cebulce węchowej w embrionach w piątym dniu po zapłodnieniu. Co istotne, cztery dni po elektroporacji komórki wykazujące ekspresję GFP prezentują typowe projekcje aksonalne komórek mitralskich cebulki węchowej.Porównanie sygnałów z mCherry i krótszego czasu ekspozycji GFP wykazuje, że ciała komórek wykazujące ekspresję GFP są rzeczywiście zlokalizowane w opłocie węchowym przy użyciu konstruktów krótko-zapętlonego RNA. Procedura ta może być również wykorzystana do indukowania utraty funkcji w konkretnych typach komórek rozwijającego się mózgu.

targeting-olfactory-bulb-neurons-using-combined-vivo-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Umieszczanie neuronów żarłacza za pomocą połączonej elektroporacji in vivo i linii ryb cebra z pułapką wzmacniacza opartej na Gal4

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Ten film opisuje techniki optogenetyczne poprzez aktywację genetycznie zmodyfikowanych neuronów somatosensorycznych i rejestrowanie wywołanych reakcji behawioralnych za pomocą szybkiej kamery wideo.

Optogenetyka danio pręgowanego: aktywacja genetycznie zmodyfikowanego neuronu somatosensorycznego w celu zbadania reakcji behawioralnych larw

Ten film demonstruje metodę badania wizualnego wykrywania zdobyczy u transgenicznych larw danio pręgowanego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego opartego na wskaźniku wapnia z ich neuronami wyrażającymi fluorescencyjne kompleksy wskaźnikowe wapnia.

Analiza aktywności neuronalnej wywołanej przez zdobycz w transgenicznej larwie danio pręgowanego

Źródło: Muto, A., et al. Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej larw danio pręgowanego. J. vis. exp. (2018) W tym filmie  Zademonstrowano procedurę dwufotonowej ablacji laserowej, umożliwiającą selektywne niszczenie neuronów fluorescencyjnych w unieruchomionych agarozą larwach danio pręgowanego. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przed i po zabiegu potwierdza skuteczne uszkodzenie neuronów, co obserwuje...

Celowana ablacja neuronów przy użyciu mikroskopii dwufotonowej u danio pręgowanego Larava

Ten protokół opisuje metodę mutagenezy insercyjnej pułapki genowej przy użyciu Gal4-VP16 jako głównego reportera i GFP/RFP jako wtórnego reportera u danio pręgowanego. Około jedna na dziesięć ryb o wysokiej ekspresji F0 daje potomstwo pułapki genowej koeksprymujące GFP i RFP. Procedurę przesiewową można łatwo przeskalować, aby dostosować ją do wielkości laboratorium wykonującego badanie przesiewowe mutagenezy insercyjnej.

Pułapkowanie genów za pomocą Gal4 u danio pręgowanego

Techniki optogenetyczne umożliwiły badanie wpływu określonych neuronów na zachowanie.  Opisujemy metodę u larw danio pręgowanego do aktywacji pojedynczych neuronów somatosensorycznych wyrażających wariant rodopsyny kanałowej (ChEF) za pomocą lasera na ciele stałym pompowanym diodą (DPSS) i rejestrowania wywołanych zachowań za pomocą szybkiej kamery wideo.

Optogenetyczna aktywacja neuronów somatosensorycznych danio pręgowanego za pomocą ChEF-tdTomato

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Przedstawiona tutaj jest metoda elektroporacji do dostarczania plazmidowego DNA i znakowania komórek ependymoglialnych u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego. Protokół ten jest szybką i skuteczną metodą wizualizacji i śledzenia pojedynczych komórek eścidendomoglialnych i otwiera nowe możliwości zastosowania elektroporacji w szerokim zakresie manipulacji genetycznych.

Metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego DNA w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Poznaj metodę elektroporacji in vivo w połączeniu z liniami transgenicznymi Danio rerio do celowania w neurony opuszki węchowej. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę czasową i przestrzenną ekspresji genu w określonych typach komórek mózgu.

Targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na Gal4

Przeglądaj więcej filmów