Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie niezawodnej metody badania odpowiedzi ruchowych zewnętrznych komórek rzęsowych (OHC), w tym elektromotoryki, powolnej motoryki oraz wyginania przy częstotliwościach akustycznych. Osiąga się to poprzez uprzednie pobranie kości skroniowych od świnek morskich, myszy lub innych ssaków oraz otwarcie łacznika w celu odsłonięcia ślimaka. W drugim kroku ślimak zanurza się w podłożu Lebovits L 15, usuwając wierzchołkową część kostnej skorupy, więzadło spiralne oraz sploty naczyń, a następnie usuwa się narząd Cortiego.

Po pięciominutowej inkubacji narządu Cortiego w roztworze kolagenazy o stężeniu 1 mg/ml, zostaje on przeniesiony do komory rejestracyjnej za pomocą strzykawki Hamiltona o objętości 50 µL, a komórki są dysocjowane poprzez kilkukrotne przepompowanie ich przez igłę. Następnie komora rejestracyjna zostaje przeniesiona pod mikroskop w celu stymulacji komórek zewnętrznym zmiennym polem elektrycznym oraz rejestracji wideo odpowiedzi ruchowych wyizolowanych zewnętrznych komórek rzęsek za pomocą kamery wysokich prędkości. Ostatecznie, za pomocą komputerowej analizy obrazu, można ocenić elektromotorykę, powolną motorykę oraz zginanie zewnętrznych komórek rzęsek przy częstotliwościach akustycznych.

Procedurę należy rozpocząć od pobrania kości skroniowych od świnek morskich, myszy lub innych ssaków służących jako modele zwierzęce. Następnie należy otworzyć kości skroniowe za pomocą cążek. Aby odsłonić ślimaka, należy ostrożnie usunąć nadmiar kości, zachowując nienaruszoną kostną otoczkę ślimaka, a następnie zanurzyć go w medium Liv-15.

Pod mikroskopem otwórz obszar szczytowy ślimaka. Usuń błonę bębenkową, naczynia VASIs oraz więzadło spiralne za pomocą ostrza skalpela, mikroigły lub precyzyjnej pęsety. Usuń organ Cortiego z modiolusa ślimaka, używając pęsety.

Następnie umieść ślimaka w roztworze kolagenazy o stężeniu 1 mg/mL w temperaturze pokojowej na pięć minut. Jeśli wymagane są komórki rzęsiste z podstawowych zwojów ślimaka, usuń kostną otoczkę pokrywającą podstawę ślimaka za pomocą zgłębika i oddziel spiralę od kości skroniowej, używając ostrza skalpela. Przed usunięciem organu Cortiego, przenieś organ Cortiego do komory rejestracyjnej za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 50 µL. Następnie zdysocjuj komórki, przepuszczając je kilkakrotnie przez igłę.

Poniżej znajduje się schemat zewnętrznego generatora zmiennego pola elektrycznego oraz połączeń z systemem przechwytywania obrazu, układami sterującymi i oprogramowaniem opracowanym specjalnie w centrum inżynieryjnym House Ear Institute. Układ doświadczalny wykorzystany w tym eksperymencie składa się z mikroskobu odwróconego Axia vert 1 3 5 TV z alternatywnym systemem oświetlenia opartym na diodach LED oraz dwóch elektronicznych mikromanipulatorów. Do mikroskopu przypisane są trzy kamery: sterowany przez komputer ultra-szybki fototron oraz kamera fast cam X 10 24 PCI w teleporcie, która posiada wysoką rozdzielczość i przechwytuje obrazy z wysoką częstotliwością do 100 000 FPS.

Obrazy dostarczane przez kamerę wysokich prędkości są obserwowane bezpośrednio na monitorze komputera PC. Dodatkowa standardowa kamera CCD w porcie okulara jest podłączona do monitora o wysokiej rozdzielczości. Konwencjonalny cyfrowy aparat fotograficzny w przednim porcie umożliwia rejestrację pojedynczych klatek; autorskie oprogramowanie uruchomione na tym samym komputerze PC steruje wyzwalaczem kamery wysokich prędkości, systemem oświetlenia oraz zewnętrznym uchwytem do generowania zmiennego pola elektrycznego.

Dwie elektrody składają się z dwóch srebrnych drutów o średnicy 0,25 milimetra, z odległością między końcówkami wynoszącą 0,8 milimetra, zamontowanych na mikro manipulatorze elektrycznym. Następnie należy skalibrować pole elektryczne za pomocą elektrody zewnętrznej. Elektroda ta mierzy potencjał elektryczny w różnych punktach, generując mapę pola elektrycznego.

Jeśli pojedyncza, wyizolowana komórka zewnętrzna słuchowa zostanie umieszczona między końcami elektrod, a jej oś podłużna będzie przebiegać równolegle do przyłożonego zmiennego pola elektrycznego, komórka ta będzie się wydłużać i skracać z taką samą częstotliwością, jak pole elektryczne. Na przykład pokazano tutaj komórkę stymulowaną częstotliwością 50 hertz i rejestrowaną w tempie 1000 klatek na sekundę. Kolejny obraz przedstawia komórkę stymulowaną częstotliwością czterech kilohertz i rejestrowaną w tempie 18 000 klatek na sekundę.

Jeśli komórka zostanie umieszczona prostopadle do pola, można zaobserwować i zbadać inny typ wygięcia odpowiedzi komórki zewnętrznej słuchowej. Ta komórka wygina się, na przykład, podczas stymulacji polem elektrycznym o częstotliwości 50 hertz, skierowanym prostopadle do jej dłuższej osi. Komórki zewnętrzne słuchowe mogą wykazywać zmiany kształtu w odpowiedzi na stymulację nieelektryczną.

Reakcja ta nazywa się spowolnioną motoryką i można ją również badać za pomocą tej techniki. Wybierz różne rodzaje stymulacji spośród czterech dostępnych protokołów. Pierwszym z nich jest ciągła stymulacja jednoczęstotliwościowa.

Należy zwrócić uwagę, że w autorskim oprogramowaniu sterującym można wybrać tryb stymulacji, częstotliwość, amplitudę oraz typ fali, co zaznaczono czerwonymi okręgami. Drugim protokołem stymulacji jest stymulacja seryjna o pojedynczej częstotliwości, w której regulowana jest długość serii oraz przerwy między nimi. Trzecim protokołem jest liniowe przesunięcie częstotliwości, w którym regulowane są częstotliwości początkowa i końcowa.

Czwartym protokołem stymulacji jest stymulacja wielokrotna, która umożliwia łączenie różnych trybów stymulacji. Po wybraniu odpowiednich parametrów oprogramowanie sterujące konfiguruje system i pozwala operatorowi na zainicjowanie zsynchronizowanego nagrywania wideo oraz stymulacji komórek poprzez kliknięcie jednego przycisku na ekranie komputera. W tym filmie izolowane komórki wł Así zewnętrzne wykazują zmiany długości lub krzywizny podczas stymulacji zewnętrznym zmiennym polem elektrycznym, które jest odpowiednio równoległe lub prostopadłe do ich osi podłużnej.

Odpowiedzi zewnętrznych komórek słuchowych są analizowane w trybie offline przy użyciu funkcji śledzenia cech w oprogramowaniu Pro Analysts; pokazano tutaj zewnętrzną komórkę słuchową stymulowaną częstotliwością 50 hertz i rejestrowaną z prędkością 1000 klatek na sekundę. Oprogramowanie dostarcza klatka po klatce odległość między dwoma punktami, co przedstawiono tutaj podczas skracania się komórki. Odległość między punktami wybranymi w wierzchołku, zaznaczonym na czerwono jako płytka kutykularna, a podstawą komórki, zaznaczoną na zielono jako biegun podstawny, jest mniejsza i zwiększa się podczas wydłużania komórki; oprogramowanie przeprowadza analizę klatka po klatce zmian długości zewnętrznej komórki słuchowej.

Panel na dole obrazu przedstawia ślad ruchu. W tym przykładzie całkowita zmiana długości wynosi około 6,5 piksela. Oto przykład pokazujący, że krawędź komórki może zostać wykryta, a pole powierzchni przekroju optycznego może zostać automatycznie zmierzone za pomocą funkcji śledzenia konturu w oprogramowaniu pro analys.

W tym doświadczeniu mikrosfery polistyrenowe są dodawane do roztworu kąpieli w sposób losowy i trwale przytwierdzane do błony plazmatycznej. Możliwy jest jednoczesny wybór różnych mikrosfer, a oprogramowanie może automatycznie śledzić je wszystkie klatka po klatce. W ten sposób komórki można podzielić na sekcje, a ruchliwość każdej z nich oceniać niezależnie.

Poprzez wybór mikrosfer znajdujących się na bocznych krawędziach komórki, można niezależnie ocenić zmiany obrazu w długości każdego segmentu oraz zmiany kąta jednego segmentu względem drugiego. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje trzy godziny.

Oczywiście niezbędny jest dodatkowy czas na analizę offline zarejestrowanych filmów. Jednak przy użyciu odpowiedniego oprogramowania analiza ta może zostać zakończona w ciągu około trzech dodatkowych godzin na jeden film. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać odpowiedzi ruchowe komórek włókien zewnętrznych, w tym elektromotylność, motylność powolną oraz wyginanie przy częstotliwościach akustycznych.