Name: Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęsatych za pomocą kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym i szybkiej analizy obrazu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj niezawodną metodę badania ruchliwości zewnętrznych komórek rzęsatych, w tym elektromotylności i wyginań, przy użyciu zewnętrznego zmiennego pola elektrycznego oraz szybkiej analizy obrazu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca wspierana przez granty National Institutes of Health R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Research Core oraz HEI. Jej treść jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie reprezentuje oficjalne stanowisko NIH lub HEI. Autorzy deklarują brak istniejącego lub potencjalnego konfliktu interesów.

1. Izolacja OHC
<ol>
<li>Procedurę należy rozpocząć od pobrania kości skroniowych od świni morskich, myszy lub innego ssaczego modelu zwierzęcego. </li>
<li>Następnie należy otworzyć kości skroniowe za pomocą kleszczyków do młoteczków, aby odsłonić ślimaka, i zanurzyć je w pożywce Leibovitz L-15. Należy ostrożnie usunąć nadmiar kości, zachowując nienaruszoną otoczkę kostną. Choć jest to ogólna procedura stosowana do kości skroniowych dowolnego gatunku ssaków, w przypadku bardzo małych zwierząt mogą być konieczne niewielkie modyfikacje techniki. U starszych zwierząt bąbelek słuchowy jest zazwyczaj zwapniały, co stanowi dodatkową komplikację w przebiegu procedury. </li>
<li>Pod obserwacją mikroskopową należy otworzyć region wierzchołkowy ślimaka i usunąć prążkowaną błonę naczyniową oraz więzadło spiralne, używając ostrza skalpela nr 11, mikroigły oraz precyzyjnej pęsety. </li>
<li>Za pomocą pęsety należy oddzielić narząd Cortiego od modiolusa ślimaka i umieścić go w roztworze kollagenazy 1mg/ml w pożywce L-15 w temperaturze pokojowej na 5 min. </li>
<li>Jeśli potrzebne są OHC z podstawowych zwojów ślimaka, należy usunąć igłą otoczkę kostną pokrywającą podstawę ślimaka, a następnie oddzielić spiralę od kości skroniowej za pomocą ostrza skalpela przed usunięciem narządu Cortiego. </li>
<li>Narząd Cortiego należy przenieść do komory rejestracyjnej za pomocą strzykawki Hamiltona 50 μL. Następnie należy zdysocjować komórki poprzez przepływ zwrotny przez igłę.</li> 
</ol>
2. Układ eksperymentalny
<ol>
<li>Schemat generatora zewnętrznego przemiennego pola elektrycznego (EAEF) oraz jego połączeń z systemem przechwytywania obrazu (Rys. 1). Układ sterujący został specjalnie opracowany w dziale inżynieryjnym (Engineering Core) House Ear Institute.</li>
<li>Układ eksperymentalny wykorzystany w naszych badaniach składa się z odwróconego mikroskopu Axiovert 135TV (Zeiss, Thornwood, NY) z alternatywnym systemem oświetlenia LED (High Power LED System-36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), dwóch elektronicznych mikromanipulatorów (Eppendorf "Patchman", Niemcy), sterowanej komputerowo ultraszybkiej kamery Photron Fastcam X 1024 PCI (Photron USA Inc.) w porcie Kellera oraz dodatkowej standardowej kamery CCD w porcie trynokularnym. Kamera Fastcam umożliwia przechwytywanie obrazów z wysoką częstotliwością (do 100 000 fps) i wysoką rozdzielczością (np. 1024 x 1024 pikseli przy 1 000 fps, 512 x 128 przy 10 000 fps, 384 x 96 przy 18 000 fps itd.). Obrazy z kamery wysokiej prędkości są obserwowane bezpośrednio na monitorze komputera, natomiast kamera CCD jest podłączona do innego monitora. System oświetlenia LED pracuje w dwóch różnych trybach: analogowym o niskiej mocy i cyfrowym o wysokiej mocy. Wszystkie procedury wstępne (pozycjonowanie elektrod, pozycjonowanie komórki, ustawianie ostrości itp.) są wykonywane w trybie analogowym o niskiej mocy. Oświetlenie o wysokiej mocy jest włączane przez otwarcie migawki kamery, a następnie wyłączane przez jej zamknięcie, co ułatwia odprowadzanie ciepła. Własnoręcznie opracowane oprogramowanie, stworzone również w dziale inżynieryjnym House Ear Institute i uruchomione na tym samym komputerze, steruje wyzwalaczem kamery wysokiej prędkości, systemem oświetlenia LED oraz EAEF. Standardowy cyfrowy aparat fotograficzny w przednim porcie umożliwia wykonywanie pojedynczych klatek w razie potrzeby (Rys. 2 A).</li>
<li>Elektrody (dwa druty Ag o średnicy 0.25 mm z odległością między końcówkami 0.8 mm) są pozycjonowane za pomocą jednego z elektronicznych mikromanipulatorów. Położenie elektrod jest monitorowane wizualnie oraz za pomocą obrazu mikroskopowego; zmiana płaszczyzny ogniskowej obrazu wskazuje, że elektrody dotknęły dna komory eksperymentalnej. Początkowo pole elektryczne jest kalibrowane za pomocą zewnętrznej elektrody. Elektroda ta mierzy potencjał elektryczny w różnych punktach, tworząc „mapę” pola elektrycznego. Jeśli pojedyncza izolowana zewnętrzna komórka rzęsata zostanie umieszczona między końcówkami elektrod w taki sposób, aby jej oś podłużna była równoległa do przyłożonego EAEF, będzie ona ulegać wydłużaniu i skracaniu z taką samą częstotliwością jak pole elektryczne. Jeśli komórka zostanie umieszczona prostopadle do pola, można zaobserwować i zbadać inny rodzaj odpowiedzi OHC (zginanie) (Rys. 2 B).</li>
</ol>
3. Stymulacja EAEF i rejestracja obrazu
<ol>
<li>Możliwy jest wybór czterech różnych protokołów stymulacji (Ryc. 3):
<ol>
	<li>ciągła pojedyncza częstotliwość (Ryc. 3 A). Należy zauważyć, że tryb bodźca, częstotliwość, amplituda i typ fali mogą zostać wybrane za pomocą autorskiego oprogramowania sterującego (czerwone okręgi). </li>
 <li>paczkowa pojedyncza częstotliwość (Ryc. 3 B). Długość paczek oraz przerwy między nimi są również konfigurowalne.</li>
 <li> liniowy sweep (Ryc. 3 C). Możliwy jest wybór częstotliwości początkowej i końcowej.</li>
		<li> wielostymulacja (Ryc. 3 D). Pojedyncza częstotliwość oraz linearne sweepy mogą zostać połączone w ramach jednego eksperymentu. Po wybraniu odpowiednich parametrów oprogramowanie sterujące konfiguruje system i umożliwia operatorowi rozpoczęcie zsynchronizowanego z oświetleniem nagrywania wideo oraz stymulację komórek za pomocą jednego kliknięcia przycisku na ekranie komputera.</li>
</ol>
</li>
<li>Obrazy są rejestrowane w formacie AVI w celu dalszej analizy przy wysokich częstotliwościach. </li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<ol>
<li>W tym filmie dwie izolowane komórki włókniątkowate zewnętrzne wykazują zmiany długości lub krzywizny podczas stymulacji zewnętrznym zmiennym polem elektrycznym, które jest odpowiednio równoległe lub poprzeczne do ich osi podłużnej. (Film #2).</li>
<li>Ruchowe odpowiedzi OHC są analizowane offline przy użyciu oprogramowania ProAnalyst (Xcitex Inc., Cambridge, MA). Funkcja „Feature Tracking” w tym oprogramowaniu określa odległość między dwoma punktami klatka po klatce (Ryc. 4). Podczas skracania się komórki odległość między punktami wybranymi na wierzchołku (blaszka kutykularna; kolor czerwony) i u podstawy komórki (biegun podstawny; kolor zielony) jest mniejsza i zwiększa się wraz z wydłużaniem komórki. Film przedstawia analizę zmian długości klatka po klatce za pomocą oprogramowania. Panel na dole obrazu pokazuje zapis ruchu. W tym przykładzie całkowita zmiana długości wynosi około 6,5 piksela.</li>
<li>Funkcja „Contour Tracking” w oprogramowaniu ProAnalyst pozwala wykryć krawędź komórki i automatycznie zmierzyć pole powierzchni przekroju optycznego (Ryc. 5).</li>
<li>Polistyrenowe mikrosfery dodane do roztworu kąpieli przylegają losowo i trwale do błony plazmatycznej (Ryc. 6 A). Można jednocześnie wybrać różne mikrosfery, a oprogramowanie może automatycznie śledzić je wszystkie klatka po klatce. W ten sposób komórki można podzielić na sekcje i niezależnie ocenić ruchliwość każdej z nich (Ryc. 6 A).</li>
<li>Poprzez wybór mikrosfer znajdujących się na bocznych krawędziach obrazu komórki, można również niezależnie ocenić zmiany długości każdego segmentu oraz zmiany kąta jednego segmentu względem drugiego (wygięcie). (Ryc. 6B)</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="Schemat eksperymentu przepływu elektroakustycznego, karta PCI, generator sygnałów, dioda LED, kamera, układ elektrod." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat generatora EAEF oraz jego połączeń z systemem przechwytywania obrazu.
<img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="Układ elektrofizjologiczny z elektrodami EAEF, kamerą CCD, źródłem LED, do badania OHC, wraz ze schematem." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. A) Zdjęcie układu eksperymentalnego. B) Detal stolika mikroskopu wraz z rysunkami przedstawiającymi elektrody i pojedynczą komórkę OHC umieszczoną pomiędzy nimi, z osią podłużną równolegle do pola elektrycznego.
<img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="Typy modulacji częstotliwości: ciągła, seryjna, liniowy sweep, schemat wielostymulacji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. A) Interfejs użytkownika autorskiego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do stymulacji jednoczęstotliwościowej. Wybrane parametry zaznaczono czerwonym okręgiem. B) Interfejs użytkownika autorskiego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do seryjnej stymulacji jednoczęstotliwościowej. C) Interfejs użytkownika autorskiego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do stymulacji liniowym sweepem. D) Interfejs użytkownika autorskiego oprogramowania sterującego skonfigurowanego do wielostymulacji.
<img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="Mikroskopia wysokiej prędkości z wykresem przebiegu; analiza od płytki kutykularnej do bieguna podstawnego; wideo 1000 fps." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Pojedyncza klatka OHC z dwoma punktami wybranymi odpowiednio u podstawy (zielony) i w wierzchołku (czerwony) komórki, przy użyciu funkcji „Feature tracking” oprogramowania ProAnalyst. Krzywa poniżej komórki przedstawia okresowe zmiany odległości między wybranymi punktami związane ze stymulacją elektryczną. Przesunięcie pionowego paska pozwala na wybór różnych klatek do indywidualnej analizy. 
<img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="Analiza śledzenia konturów mikroskopowych przy użyciu oprogramowania, podkreślająca morfologię komórki na obrazie w skali szarości." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Funkcja „Contour Tracking” w programie ProAnalyst wykrywa krawędź komórki i automatycznie mierzy pole powierzchni przekroju optycznego.
<img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="Analiza mikroskopowa bezkręgowców; porównanie interfejsu oprogramowania, wizualizacja danych, badanie ruchu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. A) Przechwycony obraz odizolowanej komórki OHC znakowanej polistyrenowymi mikrosferami (góra) oraz ten sam obraz z pięcioma indywidualnie wybranymi mikrosferami (dół). Każdej mikrosferze przypisano inny kolor, a ich przemieszczenia mogą być śledzone klatka po klatce, analizowane i porównywane w sposób indywidualny i automatyczny. B) Segmenty o dowolnej długości mogą zostać zdefiniowane poprzez wybranie mikrosfer polistyrenowych znajdujących się na krawędziach komórki; zmiany długości tych segmentów, a także zmiany ich orientacji względem siebie (wyginanie komórki), mogą być automatycznie oceniane klatka po klatce za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
Film 1. Izolacja OHC świnki morskiej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>
Film 2. Komórki włoskowate zewnętrzne (OHCs) ustawione równolegle i prostopadle do EAEF, wykazujące typową elektromobilność oraz reakcje zginania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>

<ol><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li>
<li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin%2C+a+new+type+of+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li>
<li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li>
<li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable+cochlear+amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li>
<li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li>
<li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+outer+hair+cell+motility%3A+corrections+and+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li>
<li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility%3A+effects+of+the+membrane+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInou%C3%A9%2C+S+%22Video+Microscopy%22">Video Microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1986).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda eksperymentalna umożliwia szacowanie odpowiedzi motorycznych OHC w zakresie kHz bez żadnych ograniczeń ruchu komórki. Różne protokoły stymulacji, dodatkowe markery (mikrosfery), a także zmiany w orientacji komórki względem pola elektrycznego pozwalają na badanie nowych aspektów motylości OHC z poziomem szczegółowości, który był wcześniej nieosiągalny. Inne metody, np. te wykorzystujące fotodiody 9 lub laserową wibrometrię dopplerowską 10, wymagają ścisłej kontroli położeni...

<table><tbody><tr><td>Pożywka Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21083</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza (typ 4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>1mg/mL w L-15</td></tr></tbody></table>

badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

Komórki słupkowe zewnętrzne (OHCs) to cylindryczne komórki sensoromotoryczne znajdujące się w narządzie Cortiego, organie słuchu wewnątrz ucha wewnętrznego ssaków. Nazwa „komórki słupkowe” pochodzi od charakterystycznego dla nich apikalnego pęczka stereociliów, który jest kluczowym elementem wykrywania i transdukcji energii dźwiękowej 1. OHCs potrafią zmieniać kształt — wydłużać się, skracać i wyginać — w odpowiedzi na stymulację elektryczną, mechaniczną i chemiczną; reakcja motoryczna ta jest uważana za kluczową dla wzmocnienia ślimakowego sygnałów akustycznych 2.
Stymulacja OHC indukuje dwie różne odpowiedzi ruchowe: i) elektromotylność, znaną również jako motylność szybka, czyli zmiany długości w zakresie mikrosekund wynikające z napędzanych elektrycznie zmian konformacyjnych białek motorowych gęsto upakowanych w błonie plazmatycznej OHC, oraz ii) motylność wolną, czyli zmiany kształtu w zakresie od milisekund do sekund obejmujące reorganizację cytoszkieletu 2, 3. Zginanie OHC jest związane z elektromotylnością i wynika albo z asymetrycznego rozkładu białek motorowych w bocznej błonie plazmatycznej, albo z asymetrycznej stymulacji elektrycznej tych białek motorowych (np. za pomocą pola elektrycznego prostopadłego do długiej osi komórek) 4. Bodźce mechaniczne i chemiczne indukują zasadniczo wolne odpowiedzi ruchowe, mimo że zmiany w warunkach jonowych komórek i/lub ich otoczenia mogą również stymulować białka motorowe osadzone w błonie plazmatycznej 5, 6. Ponieważ odpowiedzi ruchowe OHC są istotnym elementem wzmacniacza ślimakowego, jakościowa i ilościowa analiza tych odpowiedzi w częstotliwościach akustycznych (w przybliżeniu od 20 Hz do 20 kHz u ludzi) jest bardzo ważną kwestią w badaniach nad słuchem 7.
Rozwój nowej technologii obrazowania, łączącej szybkie kamery wideo, systemy oświetlenia oparte na diodach LED oraz zaawansowane oprogramowanie do analizy obrazu, umożliwia obecnie przeprowadzanie wiarygodnych badań jakościowych i ilościowych odpowiedzi ruchowej izolowanych OHC na zewnętrzne zmienne pole elektryczne (EAEF) 8. Jest to prosta i nieinwazyjna technika, która pozwala uniknąć większości ograniczeń występujących w poprzednich podejściach 9-11. Co więcej, system oświetlenia oparty na diodach LED zapewnia wyjątkową jasność przy nieznacznych efektach termicznych w próbkach, a dzięki zastosowaniu mikroskopii wideo rozdzielczość optyczna jest co najmniej 10-krotnie wyższa niż w przypadku konwencjonalnych technik mikroskopii świetlnej 12. Przykładowo, przy użyciu opisanego tutaj zestawu doświadczalnego, zmiany długości komórek rzędu 20 nm mogą być rutynowo i wiarygodnie wykrywane przy częstotliwościach 10 kHz, a rozdzielczość tę można dodatkowo poprawić przy niższych częstotliwościach. 
Jesteśmy przekonani, że to podejście eksperymentalne pomoże w poszerzeniu naszej wiedzy na temat komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw ruchliwości OHC.

Opisano wiarygodną metodę badania odpowiedzi ruchowych zewnętrznych komórek rzęskowych (OHC), obejmującą elektromotywność, motywność powolną oraz zginanie. Motywność OHC jest wywoływana poprzez stymulację zewnętrznym przemiennym polem elektrycznym, a metoda wykorzystuje szybką rejestrację obrazu, oświetlenie LED oraz najnowszej generacji oprogramowanie do analizy obrazu.

Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu

Komórki rzęsate zewnętrzne (OHC) są cylindrycznymi komórkami sensoromotorycznymi zlokalizowanymi w organie Cortiego, narządzie słuchu wewnątrz ucha wewnętrznego ssaków. Nazwa „komórki rzęsate” pochodzi...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie niezawodnej metody badania odpowiedzi ruchowych zewnętrznych komórek rzęsowych (OHC), w tym elektromotoryki, powolnej motoryki oraz wyginania przy częstotliwościach akustycznych. Osiąga się to poprzez uprzednie pobranie kości skroniowych od świnek morskich, myszy lub innych ssaków oraz otwarcie łacznika w celu odsłonięcia ślimaka. W drugim kroku ślimak zanurza się w podłożu Lebovits L 15, usuwając wierzchołkową część kostnej skorupy, więzadło spiralne oraz sploty naczyń, a następnie usuwa się narząd Cortiego.Po pięciominutowej inkubacji narządu Cortiego w roztworze kolagenazy o stężeniu 1 mg/ml, zostaje on przeniesiony do komory rejestracyjnej za pomocą strzykawki Hamiltona o objętości 50 µL, a komórki są dysocjowane poprzez kilkukrotne przepompowanie ich przez igłę. Następnie komora rejestracyjna zostaje przeniesiona pod mikroskop w celu stymulacji komórek zewnętrznym zmiennym polem elektrycznym oraz rejestracji wideo odpowiedzi ruchowych wyizolowanych zewnętrznych komórek rzęsek za pomocą kamery wysokich prędkości. Ostatecznie, za pomocą komputerowej analizy obrazu, można ocenić elektromotorykę, powolną motorykę oraz zginanie zewnętrznych komórek rzęsek przy częstotliwościach akustycznych.Procedurę należy rozpocząć od pobrania kości skroniowych od świnek morskich, myszy lub innych ssaków służących jako modele zwierzęce. Następnie należy otworzyć kości skroniowe za pomocą cążek. Aby odsłonić ślimaka, należy ostrożnie usunąć nadmiar kości, zachowując nienaruszoną kostną otoczkę ślimaka, a następnie zanurzyć go w medium Liv-15.Pod mikroskopem otwórz obszar szczytowy ślimaka. Usuń błonę bębenkową, naczynia VASIs oraz więzadło spiralne za pomocą ostrza skalpela, mikroigły lub precyzyjnej pęsety. Usuń organ Cortiego z modiolusa ślimaka, używając pęsety.Następnie umieść ślimaka w roztworze kolagenazy o stężeniu 1 mg/mL w temperaturze pokojowej na pięć minut. Jeśli wymagane są komórki rzęsiste z podstawowych zwojów ślimaka, usuń kostną otoczkę pokrywającą podstawę ślimaka za pomocą zgłębika i oddziel spiralę od kości skroniowej, używając ostrza skalpela. Przed usunięciem organu Cortiego, przenieś organ Cortiego do komory rejestracyjnej za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 50 µL. Następnie zdysocjuj komórki, przepuszczając je kilkakrotnie przez igłę.Poniżej znajduje się schemat zewnętrznego generatora zmiennego pola elektrycznego oraz połączeń z systemem przechwytywania obrazu, układami sterującymi i oprogramowaniem opracowanym specjalnie w centrum inżynieryjnym House Ear Institute. Układ doświadczalny wykorzystany w tym eksperymencie składa się z mikroskobu odwróconego Axia vert 1 3 5 TV z alternatywnym systemem oświetlenia opartym na diodach LED oraz dwóch elektronicznych mikromanipulatorów. Do mikroskopu przypisane są trzy kamery: sterowany przez komputer ultra-szybki fototron oraz kamera fast cam X 10 24 PCI w teleporcie, która posiada wysoką rozdzielczość i przechwytuje obrazy z wysoką częstotliwością do 100 000 FPS.Obrazy dostarczane przez kamerę wysokich prędkości są obserwowane bezpośrednio na monitorze komputera PC. Dodatkowa standardowa kamera CCD w porcie okulara jest podłączona do monitora o wysokiej rozdzielczości. Konwencjonalny cyfrowy aparat fotograficzny w przednim porcie umożliwia rejestrację pojedynczych klatek; autorskie oprogramowanie uruchomione na tym samym komputerze PC steruje wyzwalaczem kamery wysokich prędkości, systemem oświetlenia oraz zewnętrznym uchwytem do generowania zmiennego pola elektrycznego.Dwie elektrody składają się z dwóch srebrnych drutów o średnicy 0,25 milimetra, z odległością między końcówkami wynoszącą 0,8 milimetra, zamontowanych na mikro manipulatorze elektrycznym. Następnie należy skalibrować pole elektryczne za pomocą elektrody zewnętrznej. Elektroda ta mierzy potencjał elektryczny w różnych punktach, generując mapę pola elektrycznego.Jeśli pojedyncza, wyizolowana komórka zewnętrzna słuchowa zostanie umieszczona między końcami elektrod, a jej oś podłużna będzie przebiegać równolegle do przyłożonego zmiennego pola elektrycznego, komórka ta będzie się wydłużać i skracać z taką samą częstotliwością, jak pole elektryczne. Na przykład pokazano tutaj komórkę stymulowaną częstotliwością 50 hertz i rejestrowaną w tempie 1000 klatek na sekundę. Kolejny obraz przedstawia komórkę stymulowaną częstotliwością czterech kilohertz i rejestrowaną w tempie 18 000 klatek na sekundę.Jeśli komórka zostanie umieszczona prostopadle do pola, można zaobserwować i zbadać inny typ wygięcia odpowiedzi komórki zewnętrznej słuchowej. Ta komórka wygina się, na przykład, podczas stymulacji polem elektrycznym o częstotliwości 50 hertz, skierowanym prostopadle do jej dłuższej osi. Komórki zewnętrzne słuchowe mogą wykazywać zmiany kształtu w odpowiedzi na stymulację nieelektryczną.Reakcja ta nazywa się spowolnioną motoryką i można ją również badać za pomocą tej techniki. Wybierz różne rodzaje stymulacji spośród czterech dostępnych protokołów. Pierwszym z nich jest ciągła stymulacja jednoczęstotliwościowa.Należy zwrócić uwagę, że w autorskim oprogramowaniu sterującym można wybrać tryb stymulacji, częstotliwość, amplitudę oraz typ fali, co zaznaczono czerwonymi okręgami. Drugim protokołem stymulacji jest stymulacja seryjna o pojedynczej częstotliwości, w której regulowana jest długość serii oraz przerwy między nimi. Trzecim protokołem jest liniowe przesunięcie częstotliwości, w którym regulowane są częstotliwości początkowa i końcowa.Czwartym protokołem stymulacji jest stymulacja wielokrotna, która umożliwia łączenie różnych trybów stymulacji. Po wybraniu odpowiednich parametrów oprogramowanie sterujące konfiguruje system i pozwala operatorowi na zainicjowanie zsynchronizowanego nagrywania wideo oraz stymulacji komórek poprzez kliknięcie jednego przycisku na ekranie komputera. W tym filmie izolowane komórki wł Así zewnętrzne wykazują zmiany długości lub krzywizny podczas stymulacji zewnętrznym zmiennym polem elektrycznym, które jest odpowiednio równoległe lub prostopadłe do ich osi podłużnej.Odpowiedzi zewnętrznych komórek słuchowych są analizowane w trybie offline przy użyciu funkcji śledzenia cech w oprogramowaniu Pro Analysts; pokazano tutaj zewnętrzną komórkę słuchową stymulowaną częstotliwością 50 hertz i rejestrowaną z prędkością 1000 klatek na sekundę. Oprogramowanie dostarcza klatka po klatce odległość między dwoma punktami, co przedstawiono tutaj podczas skracania się komórki. Odległość między punktami wybranymi w wierzchołku, zaznaczonym na czerwono jako płytka kutykularna, a podstawą komórki, zaznaczoną na zielono jako biegun podstawny, jest mniejsza i zwiększa się podczas wydłużania komórki; oprogramowanie przeprowadza analizę klatka po klatce zmian długości zewnętrznej komórki słuchowej.Panel na dole obrazu przedstawia ślad ruchu. W tym przykładzie całkowita zmiana długości wynosi około 6,5 piksela. Oto przykład pokazujący, że krawędź komórki może zostać wykryta, a pole powierzchni przekroju optycznego może zostać automatycznie zmierzone za pomocą funkcji śledzenia konturu w oprogramowaniu pro analys.W tym doświadczeniu mikrosfery polistyrenowe są dodawane do roztworu kąpieli w sposób losowy i trwale przytwierdzane do błony plazmatycznej. Możliwy jest jednoczesny wybór różnych mikrosfer, a oprogramowanie może automatycznie śledzić je wszystkie klatka po klatce. W ten sposób komórki można podzielić na sekcje, a ruchliwość każdej z nich oceniać niezależnie.Poprzez wybór mikrosfer znajdujących się na bocznych krawędziach komórki, można niezależnie ocenić zmiany obrazu w długości każdego segmentu oraz zmiany kąta jednego segmentu względem drugiego. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje trzy godziny.Oczywiście niezbędny jest dodatkowy czas na analizę offline zarejestrowanych filmów. Jednak przy użyciu odpowiedniego oprogramowania analiza ta może zostać zakończona w ciągu około trzech dodatkowych godzin na jeden film. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać odpowiedzi ruchowe komórek włókien zewnętrznych, w tym elektromotylność, motylność powolną oraz wyginanie przy częstotliwościach akustycznych.

investigating-outer-hair-cell-motility-with-combination-external

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Badanie ruchomości zewnętrznych komórek włosków z użyciem kombinacji zewnętrznej stymulacji pola elektrycznego o zmiennym natężeniu i analizy obrazów wysokiej prędkości

Rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z dendrytów włókien nerwu słuchowego w obrębie synaps wstążkowych komórek rzęskowych wewnętrznych w ślimaku ssaków.

Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Ten film demonstruje połączone nagrywanie mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych małżowiny usznej myszy. Przedstawiono w nim etapy mechanicznej stymulacji zakończeń nerwowych mieszków włosowych przed i po ekspozycji na barwnik z membrany fluorescencyjnej, elektrofizjologię rejestrującą generowane potencjały czynnościowe oraz wizualizację znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych myszy

Źródło: Łukasz, D., et al. Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych linii bocznej u larw danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje obrazowanie na żywo napływu wapnia do komórek rzęsatych linii bocznej sparaliżowanej transgenicznej larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Mechaniczna stymulacja wiązek włosów za pomocą impulsów płynu indukuje wnikanie wapnia przez kanały mechanotransdukcji i kanały bramkowane napięciem, co jest wizualizowane w czasie...

Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach rzęsatych linii bocznej larw danio pręgowanego

Analiza funkcji przedsionkowych komórek rzęsatych jest skomplikowana przez ich lokalizację głęboko w najtwardszej części czaszki, kości skroniowej skalistej. W większości badań nad funkcjonalnymi komórkami rzęsatymi wykorzystano dokładnie izolowane komórki rzęsate. W tym artykule opisano częściowo nienaruszony preparat nabłonka przedsionkowego myszy do badań elektrofizjologicznych i mikroskopii dwufotonowej.

Izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości

W tym badaniu, szczegółowa technika mikroskopii świetlnej została zoptymalizowana do obserwacji i analizy ruchu rzęsek CPEC w czasie rzeczywistym ex vivo wraz z metodą mikroskopii elektronowej do analizy ultrastrukturalnej.

Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

Przedstawiono prostą i nowatorską technikę rejestrowania wyładowań doprowadzających z powodu mechanicznej stymulacji lancetowatych końcówek końcówek palisadowych, unerwiających mysie, skóry uszu, mieszków włosowych.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy

Tutaj opisujemy nowatorskie przygotowanie do obrazowania żywych lancetowatych końcówek czuciowych końcówek palisadowych, które unerwiają mieszki włosowe skóry uszu myszy podczas barwienia i odbarwiania barwnikami styrylowo-pirydyniowymi.

Monitorowanie optyczne znakowania żywych zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych skóry ucha myszy ex vivo

Woreczek amerykańskiej żaby (Rana catesbeiana) pozwala na bezpośrednie badanie fizjologii komórek rzęsatych. Opisano tutaj sekcję i przygotowanie worka żaby do badań biofizycznych. Pokazujemy reprezentatywne eksperymenty z tymi komórkami rzęsa, w tym obliczenie relacji siła-przemieszczenie wiązki i pomiar jej niewymuszonego ruchu.

Fizjologiczne przygotowanie komórek rzęsatych z worka żaba białopłetwego (Rana catesbeiana)

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Danio pręgowany to modelowy system, który posiada wiele cennych cech, w tym przejrzystość optyczną, szybki rozwój zewnętrzny oraz, co szczególnie ważne dla dziedziny słuchu i równowagi, zewnętrznie zlokalizowane czuciowe komórki rzęsate. W tym artykule opisano, w jaki sposób transgeniczny danio pręgowany może być używany do oznaczania zarówno mechanosensacji komórek rzęsatych, jak i funkcji presynaptycznych in toto.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych w linii bocznej u larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół dla Mikroskopii Konduktancji Jonów Sondy Skaczącej (HPICM), techniki bezkontaktowej sondy skanującej, która umożliwia nanoskalowe obrazowanie wiązek stereorzęsek w żywych słuchowych komórkach rzęsatych.

Obrazowanie wiązki stereocilii z rozdzielczością w nanoskali w żywych słuchowych komórkach rzęsatych ssaków

Poznaj niezawodną metodę badania ruchliwości zewnętrznych komórek rzęsatych, w tym elektromotylności i wyginań, przy użyciu zewnętrznego zmiennego pola elektrycznego oraz szybkiej analizy obrazu.

Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęsatych za pomocą kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym i szybkiej analizy obrazu (Wideo) | JoVE Journal

Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu

Przeglądaj więcej filmów