Name: Sekcja zwłok diagnostyczna oraz pobieranie wybranych tkanek i próbek u szczurów i myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Naucz się wykonywać sekcję zwłok u szczurów i myszy w celu oceny stanu zdrowia zwierząt. Poznaj techniki pobierania narządów, węzłów chłonnych i próbek do analizy histopatologicznej oraz mikrobiologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie do nekropsji
<ol>
 <li>Ważnymi elementami każdego makroskopowego badania pośmiertnego (nekropsji makroskopowej) są wywiad dotyczący zwierzęcia oraz opis znalezisk.</li>
 <li>Patolog weterynaryjny analizujący preparaty histopatologiczne mógł nie widzieć zwierzęcia i polega na dostarczonych przez Państwa informacjach wstępnych.</li>
 <li>Dokładnie opiszcie to, co widzicie przed eutanazją zwierzęcia. Na przykład: „mysz żeńska; jedna z pięciu w klatce; C57BL/6N; głowa przechylona w prawo” lub „szczur samiec brązowy; szczep nieznany; zwierzę drapie się; występuje plamowa utrata włosa na grzbiecie, w pobliżu ogona i głowy”.</li>
 <li>Stosujcie jasny, opisowy i obiektywny język. Określenia takie jak „łagodny”, „umiarkowany” i „ciężki” mogą być przydatne, jeśli granice między tymi poziomami są wyraźnie określone. Opisywanie zmian za pomocą porównań do jedzenia lub przedmiotów domowych jest zazwyczaj niewskazane.</li>
 <li>Ważenie i mierzenie zwierząt, zmian lub narządów jest często przydatne. To, co dla jednego obserwatora jest „powiększoną śledzioną”, dla innego może być śledzioną o prawidłowych rozmiarach. Podanie informacji, że śledziona ma wymiary 3cm x 1.5cm, dostarcza bardziej obiektywnych danych.</li>
 <li>Dokumentacja fotograficzna może okazać się nieoceniona.</li>
 <li>Należy przestrzegać wszystkich odpowiednich zasad BHP oraz stosować środki ochrony osobistej wymagane podczas pracy z żywymi zwierzętami, potencjalnie zakaźnymi truchłami lub odczynnikami chemicznymi, takimi jak formalina.</li>
</ol>
2. Makroskopowa lokalizacja pośmiertna i badanie serca, płuc, wątroby, nerek i śledziony
<ol>
 <li>Przed przeprowadzeniem eutanazji zwierzęcia należy przygotować niezbędne materiały. W minimalnym zakresie powinny one obejmować deskę sekcyjną lub podobną powierzchnię roboczą, pęsetę, nożyczki, etykiety do pojemników, utrwalacz oraz wszelkie pożywki lub probówki/kubki do pobierania próbek, które mogą być potrzebne.</li>
 <li>Krótko oceń stan, zachowanie i ruchy zwierzęcia. Obserwuj i zapisuj wzorce oddychania (np. szybkie, płytkie) oraz zdolność poruszania się i chód (np. utykanie, krążenie, drżenia).</li>
 <li>Przeprowadź eutanazję zwierzęcia zgodnie ze standardowymi procedurami obowiązującymi w Twojej instytucji, zawsze przestrzegając wytycznych AVMA.</li>
 <li>Oceń kondycję ciała zwierzęcia pod kątem nieprawidłowości skóry i sierści, wyniszczenia lub odwodnienia. Odnotuj wszelkie sztuczne manipulacje, implanty lub blizny pooperacyjne.</li>
 <li>Zbadaj wszystkie otwory zewnętrzne (uszy, oczy, nos, odbyt, otwory narządów płciowych oraz jamę ustną). Do dokładniejszej obserwacji zaleca się użycie stereomikroskopu sekcyjnego.</li>
 <li>Połóż truchło uśpionej myszy lub szczura w pozycji grzbietnej na czystej desce sekcyjnej lub podobnej powierzchni roboczej.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie skóry na całej długości brzucha, od odbytu do podbródka, odchyl skórę i nacinając ścianę brzuszną, aby odsłonić otrzewną, gruczoły ślinowe i przedprątkowe/sromowe oraz węzły chłonne szyjne i pachowe. Przetnij klatkę piersiową, aby odsłonić i zbadać narządy klatki piersiowej, wykonując dwa nacięcia bocznie po każdej stronie żeber, a następnie jedno nacięcie poprzeczne u góry mostka, aby otworzyć przestrzeń wystarczająco szeroką do dokładnego zbadania wszystkich płatów płuc.</li>
 <li>Oceń wygląd układu mięśniowo-szkieletowego.</li>
 <li>Oceń wszystkie organy pod kątem nieprawidłowości. W jamie klatki piersiowej zlokalizuj i zidentyfikuj serce oraz płuca. W jamie brzusznej zlokalizuj i zidentyfikuj wątrobę, nerki i śledzionę. Odnotuj wszelkie zmiany koloru, różnice w wielkości oraz brakujące lub nieprawidłowo umiejscowione organy. Zwróć uwagę na konsystencję powierzchni, obecność dodatkowej tkanki (np. mas), kieszonek z płynem lub obecność płynu w jamie brzusznej/opłucnej.</li>
 <li>Obejrzyj przewód pokarmowy pod kątem zawartości lub jej braku, zwracając szczególną uwagę na pogrubienie ścian, masy i/lub krwawienia. Przetnij nerki (lewą w przekroju podłużnym, prawą w przekroju poprzecznym, w linii środkowej, ale poza centrum) skalpelem lub żyletką, aby sprawdzić miąższ pod kątem nieprawidłowości. Sprawdź krezkę pod kątem powiększonych węzłów chłonnych i/lub mas.</li>
 <li>Zbadaj układ moczowo-płciowy, szukając niedrożności, kieszonek z płynem, krwawień lub innych nieprawidłowości.</li>
</ol>
3. Pobieranie serca, wątroby, nerek i śledziony po śmierci w celu przeprowadzenia badania histopatologicznego
<ol>
 <li>Przygotować odpowiednio dobrane i oznakowane pojemniki wypełnione właściwą ilością 10% neutralnej soli buforowej formaliny (NBF). Dostosować ilość 10% NBF tak, aby uzyskać stosunek utrwalacza do tkanki wynoszący 20:1.</li>
 <li>Umieścić truchło myszy lub szczura w pozycji grzbietnej na czystej desce sekcyjnej lub podobnej powierzchni roboczej i odsłonić interesującą tkankę.</li>
 <li>Usunąć tkankę z truchła za pomocą pęsety i nożyczek.</li>
 <li>Tkankę należy dokładnie przyciąć, aby usunąć tłuszcz i zbędną tkankę łączną. Tkanka powinna być oczyszczona z krwi; w razie potrzeby przepłukać ją solą fizjologiczną. Do płukania tkanek nigdy nie należy używać wody destylowanej ani wodociągowej.</li>
 <li>Umieścić tkankę w pojemniku z 10% NBF.</li>
</ol>
4. Pobieranie i perfuzja tkanki płucnej po śmierci
<ol>
 <li>Przygotować odpowiedniej wielkości, oznakowane pojemniki wypełnione odpowiednią ilością 10% NBF. Dostosować ilość 10% NBF tak, aby uzyskać stosunek utrwalacza do tkanki 20:1.</li>
 <li>Umieścić truchło myszy lub szczura w pozycji grzbietowej na czystej desce sekcyjnej lub podobnej powierzchni roboczej.</li>
 <li>Odsłonić tchawicę, serce i płuca.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek i pincety usunąć skórę i mięśnie pokrywające brzuszne obszary klatki piersiowej i szyi.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek i pincety usunąć klatkę piersiową, odsłaniając serce i płuca, wykonując 2 cięcia boczne wzdłuż każdej strony klatki piersiowej, a następnie jedno cięcie poprzeczne w pobliżu obojczyka, aby otworzyć przestrzeń wystarczająco szeroką do dokładnego zbadania wszystkich płatów płuc.</li>
 <li>Wyciąć mięśnie szyi rozciągające się od mostka i żeber do żuchwy, w tym mięśnie pokrywające tchawicę.</li>
 <li>Wsunąć nożyczki pod przednią krawędź klatki piersiowej i wykonać 2 cięcia, po jednej stronie, aby usunąć fragment kości pokrywający tchawicę.</li>
 <li>Chwycić tchawicę w pobliżu żuchwy pincetą i całkowicie przeciąć tchawicę nożyczkami umieszczonymi powyżej pincety.</li>
 <li>Delikatnie pociągnąć tchawicę w górę za pomocą pincety, odcinając nożyczkami brzuszne połączenia tkankowe, aż cały zestaw tkanek klatki piersiowej (tchawica, płuca i serce; zestaw ten jest czasami nazywany „pluckiem”) zostanie usunięty z ciała.</li>
 <li>Położyć płuca płasko na powierzchni roboczej.</li>
 <li>Luźno obwiązać tchawicę nicią chirurgiczną lub sznurkiem kuchennym, dbając o to, aby nie zacisnąć go zbyt mocno.</li>
 <li>Napełnić strzykawkę utrwalaczem i założyć igłę wystarczająco małą, aby mogła wejść do tchawicy. Dla myszy odpowiednia będzie strzykawka 1 ml lub 3 ml z igłą 26 G. Dla szczurów odpowiednia będzie strzykawka 5 ml z igłą 18 G.</li>
 <li>Wprowadzić igłę do otworu tchawicy i użyć pincety do przytrzymania tchawicy wokół igły. Powoli rozpocząć napełnianie płuc utrwalaczem.</li>
 <li>Napełniać płuca, aż będą całkowicie rozdęte. Nie doprowadzić do nadmiernego ani niewystarczającego rozdęcia. Ilość utrwalacza potrzebna do pełnego rozdęcia płuc różni się w zależności od wieku, szczepu i stanu zdrowia zwierzęcia.
 <ol>
 <li>Nadmierne rozdęcie rozpoznaje się po przesączaniu i pienieniu się płynu z tkanki płucnej.</li>
 <li>Niewystarczające rozdęcie rozpoznaje się po tym, że płuca wydają się płaskie i nie są pełne we wszystkich obszarach.</li>
 </ol>
 
 </li>
 <li>Wyjąć igłę z tchawicy.</li>
 <li>Zacisnąć nić chirurgiczną lub sznurek wokół tchawicy, aby zapobiec cofaniu się utrwalacza z płuc.</li>
 <li>Umieścić rozdęte płuca w utrwalaczu, stosując przybliżony stosunek utrwalacza do tkanki 20:1.</li>
</ol>
5. Pobieranie mózgu po śmierci
<ol>
 <li>Przygotować odpowiednio duże, oznakowane pojemniki wypełnione odpowiednią ilością 10% NBF. Dostosować ilość 10% NBF tak, aby uzyskać stosunek utrwalacza do tkanki wynoszący 20:1.</li>
 <li>Położyć uśmierconą mysz lub szczura w pozycji brzusznej na czystej desce sekcyjnej lub podobnej powierzchni roboczej.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek i pęsety usunąć skórę oraz mięśnie pokrywające calvarię.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek całkowicie oddzielić głowę od tułowia.</li>
 <li>Używając małych nożyczek, wprowadzić dolne ostrze do foramen magnum (otworu wielkiego, w którym czaszka łączy się z kanałem kręgowym) i, trzymając końcówki nożyczek skierowane do góry, zacząć wycinać wzdłuż linii środkowej calvarii.</li>
 <li>Za pomocą pęsety odchylić obie połowy calvarii, odsłaniając mózg.
 <ol>
<li>Jeśli to możliwe, umieścić odsłonięty mózg w utrwalaczu, gdy wciąż znajduje się on w czaszce. Pozwoli to tkance stwardnieć przed usunięciem z czaszki, jeśli jest to wymagane. Wielu patologów preferuje wykonywanie przekrojów mózgu, gdy znajduje się on nadal w czaszce.</li>
</ol>
 </li>
 <li>Ostrożnie odwrócić czaszkę do góry dnem, aby grawitacja pomogła tkance wysunąć się z czaszki.</li>
 <li>Używając zakrzywionej pęsety, ostrożnie przesunąć ją wzdłuż zewnętrznej krawędzi mózgu i pod niego, zaczynając od płatów węchowych, przesuwając się pod mózgowiem w stronę móżdżku. Delikatnie chwycić pęsetą każdą tkankę łączną lub nerwy, które utrudniają wypadnięcie mózgu z czaszki.</li>
 <li>Umieścić mózg w utrwalaczu, zachowując przybliżony stosunek tkanki do utrwalacza 1:20.</li>
</ol>
6. Pobieranie węzłów chłonnych krezkowych (MLN) po śmierci
<ol>
 <li>Pobieranie tkanek do analizy PCR należy przeprowadzić z zachowaniem zasad aseptyki. Należy używać narzędzi wysterylizowanych płomieniem, w autoklawie lub w inny równoważny sposób.</li>
 <li>Przygotować sterylne probówki Eppendorfa oraz sterylne nożyczki i pęsetę.</li>
 <li>Trup myszy lub szczura po eutanazji należy ułożyć na plecach na czystej desce sekcyjnej lub podobnej powierzchni roboczej.</li>
 <li>Za pomocą wysterylizowanych nożyczek i pęsety należy naciąć brzuszną ścianę jamy brzusznej od okolic narządów płciowych do podstawy klatki piersiowej, usuwając skórę oraz mięśnie i odsłaniając jelita.</li>
 <li>Węzły chłonne krezkowe (MLN) znajdują się w jamie brzusznej w tkance krezkowej wzdłuż okrężnicy, bezpośrednio przy kątnicy.</li>
 <li>Aby zlokalizować MLN, należy najpierw odnaleźć kątnicę, która jest dużym, zakrzywionym w kształcie przecinka odcinkiem jelita. Okrężnica odchodzi od kątnicy i często można ją zidentyfikować po obecności grudek kału. MLN znajdują się w krezce wzdłuż okrężnicy, w sąsiedztwie kątnicy. Można je rozpoznać jako żółtawe, owalne lub sferyczne małe grudki tkanki w białej tkance krezkowej; są one często nieco grubsze i twardsze w dotyku niż otaczająca krezka i tłuszcz. W razie potrzeby należy korzystać z podręczników anatomii w celu orientacji.</li>
 <li>Stosując technikę aseptyczną i sterylne narzędzia, należy usunąć MLN i umieścić je w probówce Eppendorfa z odpowiednią etykietą identyfikacyjną.</li>
</ol>
7. Pobieranie aspiratu z dróg oddechowych po śmierci
<ol>
 <li>Przygotuj niezbędne materiały: sterylną pipetę, sterylne nożyczki i pęsetę, sterylne roztwory do płukania dróg oddechowych oraz czystą deskę sekcyjną lub podobną powierzchnię roboczą.</li>
 <li>Połóż truchło uśpionej myszy lub szczura w pozycji grzbietowej na desce sekcyjnej.</li>
 <li>W przypadku aspiratu oskrzelowego u szczurów dostęp do dróg oddechowych uzyskaj poprzez tchawicę. W przypadku aspiratu nosowego u szczurów dostęp uzyskaj albo przez tchawicę, albo przez otwór nosogardzielowy. W przypadku aspiratów oskrzelowych lub nosowych u myszy dostęp do dróg oddechowych uzyskaj przez otwór nosogardzielowy.</li>
 <li>Jeśli wymagane są zarówno aspiraty nosowe, jak i oskrzelowe, w pierwszej kolejności wykonaj aspirat oskrzelowy. Aspirat nosowy pobierz za pomocą nowej sterylnej pipety.</li>
 <li>Dostęp przez tchawicę (metoda zalecana dla szczurów):
 <ol>
 <li>Odchyl skórę z obszaru szyjnego, aby odsłonić tkanki podskórne.</li>
 <li>Usuń gruczoły ślinowe i mięśnie szyjne, aby odsłonić tchawicę.</li>
 <li>Za pomocą sterylnych narzędzi nacinaj tchawicę, aby uzyskać dostęp do jej światła. Przez cały proces pobierania zachowaj aseptykę (przejdź do kroku 7.7).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Dostęp przez otwór nosogardzielowy (aspirat nosowy i oskrzelowy, metoda zalecana dla myszy ze względu na mniejszy rozmiar tchawicy):
 <ol>
 <li>Tę procedurę można zastosować zarówno dla aspiratu nosowego, jak i oskrzelowego.</li>
 <li>Używając narzędzi wysterylizowanych w płomieniu lub w autoklawie, przetnij staw skroniowo-żuchwowy i odchyl żuchwę od szczęki, odsłaniając otwór nosogardzielowy. Przez cały proces pobierania zachowaj aseptykę (przejdź do kroku 7.7).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Pobierz do sterylnej pipety około 1ml płynu do próbkowania. Może to być sól fizjologiczna, bufor fosforanowy (PBS) lub bulion sojowy z tryptonem (TSB). (Przejdź do kroku 7.8 lub 7.9, w zależności od rodzaju pobieranego aspiratu).</li>
 <li>Aspirat oskrzelowy:
 <ol>
<li>Aseptycznie wprowadź pipetę do światła tchawicy, kierując ją ku dołowi, i powoli wstrzyknij płyn do próbkowania do oskrzeli i płuc. Odciągnij płyn z oskrzeli i płuc do pipety, a następnie wyjmij pipetę z tchawicy. Nie cały płyn powróci do pipety. Powtórz czynność, jeśli do badań potrzebna jest większa ilość płynu.</li>
</ol>
 </li>
 <li>Aspirat nosowy:
 <ol>
 <li>Aseptycznie wprowadź pipetę do otworu nosogardzielowego (myszy) lub światła tchawicy (szczury), kierując ją ku górze, i powoli wstrzyknij płyn do próbkowania do jamy nosowej.</li>
 <li>Upewnij się, że jama nosowa została osiągnięta poprzez kontakt koniuszka pipety z podniebieniem nosowym lub poprzez obserwację płynu wtłaczanego do jamy, co objawia się tworzeniem się menisków w otworach nosowych (nozdrzach) lub widocznością płynu przez półprzezroczyste podniebienie jamowe. Płyn nie powinien wypływać przez pysk. W przeciwnym razie zmień orientację pipety.</li>
 <li>Odciągnij płyn z jamy nosowej do pipety i wyjmij pipetę z otworu lub tchawicy.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Aseptycznie przenieś próbkę do odpowiedniego medium lub pojemnika do badań.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2966/2966fig1.jpg" alt="Schemat organów wewnętrznych szczura: grasica, serce, płuca, przepona, wątroba, jelita, kątnica, pęcherz moczowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Narządy jamy brzusznej i klatki piersiowej u myszy. Narządy te są zazwyczaj widoczne bezpośrednio po otwarciu zwierzęcia (żaden z organów nie został przesunięty, aby odsłonić inne narządy obecne w jamie brzusznej). a) grasica, b) serce, c) płuca, d) przepona, e) wątroba, f) jelito cienkie, g) kątnica, h) pęcherz moczowy.
<img src="/files/ftp_upload/2966/2966fig2.jpg" alt="Schemat sekcji anatomicznej myszy; oznaczone organy: wątroba, jelita, żołądek, śledziona, nerki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Organy jamy brzusznej i przestrzeni zaotrzewnowej u myszy. Organy te stają się widoczne po uniesieniu i przesunięciu (lub usunięciu) jelit i wątroby. a) wątroba (dla odniesienia), b) jelita (dla odniesienia), c) żołądek, d) śledziona, e) nerki, f) jelito grube zstępujące, g) macica.
<img src="/files/ftp_upload/2966/2966fig3.jpg" alt="Schemat anatomii rozsektowanego gryzonia z zaznaczonymi elementami układu rozrodczego do celów edukacyjnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Męskie organy rozrodcze. Mogą być one większe u większych, dojrzałych płciowo samców. a) pęcherzyki nasienne i gruczoły koagulacyjne, b) jądro (przepchnięte do jamy brzusznej z moszny przez pierścienie pachwinowe, które pozostają otwarte u myszy i szczurów), c) pęcherz moczowy, d) gruczoły napierstkowe, e) najądek. 
<img src="/files/ftp_upload/2966/2966fig4.jpg" alt="Schemat anatomii szczura, oznaczone organy: macica, jajnik, pęcherz moczowy, gruczoł sromowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. żeńskie organy rozrodcze. a) macica nieciężarna (myszy i szczury mają macicę dwurożną), b) jajnik zatopiony w tkance tłuszczowej jajnika, c) pęcherz moczowy, d) gruczoły sromowe (analogiczne do męskich gruczołów napletkowych).

<ol><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22AVMA+Guidelines+on+Euthanasia%22">AVMA Guidelines on Euthanasia</a>. , (2007).</li>
<li>Feldman, D. B., Seely, J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeldman%2C+DB+%22Necropsy+Guide%3A+Rodents+and+the+rabbit%22">Necropsy Guide: Rodents and the rabbit</a>. , CRC Press. (1988).</li>
<li>King, J. M., Dodd, D. C., Roth, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+JM+%22The+Necropsy+Book%22">The Necropsy Book</a>. , 4th edn, C.L. Davis Foundation. (2006).</li>
<li>Kittel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li>
<li>Fox, J. G. Chapter 1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKomarek%2C+V+%22The+Mouse+in+Biomedical+Research%22">The Mouse in Biomedical Research</a>. , Elsevier. Vol. 3: Normative biology, husbandry, and models 1-22 (2007).</li>
<li>Morawietz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+3.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li>
<li>Popesko, P., Raijtová, V., Horák, J. Colour Atlas of Anatomy of Small Laboratory Animals. 2, 1st edn, Saunders. vol. 2: Rat, mouse, hamster 91-106 (2002).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami laboratorium diagnostyki gryzoni laboratoryjnych firmy Charles River, w którym usługi te są oferowane komercyjnie.

Gromadzenie danych pod koniec badania może wymagać przeprowadzenia badania pośmiertnego zwierząt. Należy dokładnie opisać wszystkie zaobserwowane zmiany i pamiętać o zbadaniu wszystkich tkanek. Procedury te zostały opracowane przede wszystkim w celu optymalizacji sekcji zwłok i pobierania próbek do nadzoru nad chorobami zakaźnymi, jednak większość z nich można łatwo dostosować do ukierunkowanych dochodzeń w sprawach podejrzeń wystąpienia chorób lub ognisk epidemicznych, w których zastosowany może zostać jedynie podzbiór ...

<table><tbody><tr><td>Deska do krojenia</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Kat #36114</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5910, G204</td><td>ostrza 23mm, długość 3,5&quot;, proste</td></tr><tr><td>Średnie nożyczki</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6808, G207</td><td>5&quot;</td></tr><tr><td>Duże nożyczki</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6826, G65&quot;</td><td>6,25&quot;</td></tr><tr><td>Pinceta zakrzywiona</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-8254 (M1/21004)</td><td>4,5&quot;, ząbkowana, lekko zakrzywiona</td></tr><tr><td>Pinceta mikrodysekcyjna</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5238</td><td>Hudson-(EWALD)</td></tr><tr><td>Pinceta tkankowa</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS--8160</td><td>typ „ząb szczura”</td></tr><tr><td>Sterylizator płomieniowy</td><td>Oxford Labware</td><td>Bacti-Cinerator #5889-001007</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Cancer Diagnostics, Inc.</td><td>Finger Scalpels #60, Kat#FS0060</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>VWR international</td><td>Pipeta Pasteura 5 3/4&quot;, Kat#14672-400</td><td></td></tr><tr><td>Worki do autoklawu</td><td>Propper Manufacturing Company</td><td>Sterilizer Bag Paper Pouches Kat#021002(3100923)E09110</td><td>Do pipet Pasteura</td></tr><tr><td>Gruszka do pipety</td><td>VWR international</td><td>Kat#56310-240</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>SafeSeal microtube 2mL, Ref#72.695</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td>Argos</td><td>5mL microtube Kat#T20765-C</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD Biosciences</td><td>1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL Kat#309604 20mL Kat#309661</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td>BD Biosciences</td><td>26G-309625 18G-305195</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna formalinowa sól buforowana</td><td>VWR international</td><td>20L 10% NBF, Kat#16004-128</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Buffered Blood Bank Saline, Kat#23-309-178</td><td></td></tr><tr><td>Bulion sojowy z tryptonem</td><td>BD Biosciences</td><td>TSB: liofilizowany, Kat#211825</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan buforowany roztwór soli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HA Buffer, Kat#P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Kubki do formaliny</td><td>VWR international</td><td>4oz Kat#36318-852 8oz Kat#36318-860 16oz Kat#36318-858</td><td></td></tr><tr><td>Duże kubki do formaliny</td><td>OakRidge Products</td><td>pojemnik 32oz Kat#0432-1100</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo duże kubki do formaliny</td><td>VWR international</td><td>HDPE pojemnik wieloelementowy 160oz Kat#89038-282</td><td></td></tr><tr><td>Materiał szewny</td><td>Henry Schein</td><td>Pleciona jedwabna nici chirurgiczna, Ref#100-5000, M766750</td><td>Do napowietrzania płuc myszy</td></tr><tr><td>Sznurek</td><td>Staples</td><td>Kat#QUA-46173</td><td>Do napowietrzania płuc szczura</td></tr></tbody></table>

diagnostyczna sekcja zwłok oraz pobieranie wybranych tkanek i próbek u szczurów i myszy

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

W celu zdiagnozowania lub wykrycia czynników zakaźnych w kolonii zwierząt można pobrać wiele rodzajów próbek od uśpionego zwierzęcia. Prawidłowe pobranie tkanek do dalszej obróbki histologicznej może wpłynąć na jakość wyników badań. Niniejszy artykuł opisuje sposób przeprowadzenia podstawowego badania makroskopowego, w tym identyfikację serca, wątroby, płuc, nerek i śledziony, a także sposób pobierania tych organów. Ponadto zaprezentowano cztery trudniejsze techniki pobierania tkanek/próbek. Pobieranie i perfuzja płuc mogą być szczególnie wymagające, ponieważ tkanka musi zostać odpowiednio wypełniona utrwalaczem, aby wnętrze tkanki zostało właściwie utrwalone i umożliwiło dokładną ocenę histologiczną. Artykuł ten przedstawia krok po kroku technikę usuwania płuc i ich wypełniania utrwalaczem w celu uzyskania optymalnej fiksacji tkanki w ciągu 24 godzin. Pobieranie mózgu może być równie trudne, ponieważ tkanka jest miękka i łatwo ulega uszkodzeniu. Niniejszy artykuł demonstruje krok po kroku technikę odsłaniania i usuwania mózgu z czaszki przy minimalnym uszkodzeniu tkanki. Węzeł chłonny krezkowy jest odpowiednim rodzajem próbki do wykrywania wielu powszechnych czynników zakaźnych, ponieważ wirusy jelitowe utrzymują się w węzłach chłonnych dłużej niż są wydalane z kałem. Artykuł ten przedstawia krok po kroku procedurę lokalizacji i aseptycznego usuwania węzła chłonnego krezkowego. Na koniec, identyfikację czynników zakaźnych dróg oddechowych można przeprowadzić za pomocą hodowli bakteryjnej lub testu PCR aspiratów z nosa i/lub oskrzeli pobranych podczas sekcji. Niniejsza procedura opisuje sposób pozyskiwania i przygotowywania próbki aspiratu z dróg oddechowych do hodowli bakteryjnej i testu PCR.

Niniejszy artykuł opisuje procedury przeprowadzania podstawowego badania pośmiertnego myszy lub szczura oraz pobierania podstawowych organów, a także trudniejszych do pozyskania typów próbek do oceny histologicznej, mikrobiologicznej i PCR.

Diagnostyczna sekcja zwłok oraz pobieranie wybranych tkanek i próbek u szczurów i myszy

Istnieje wiele rodzajów próbek, które można pobrać od uśpionego zwierzęcia, aby pomóc w zdiagnozowaniu lub wykryciu czynników zakaźnych u zwierzęcia...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie podstawowej nekropsji gryzonia. Realizuje się to w pierwszej kolejności poprzez zapisanie podstawowych informacji o zwierzęciu. Drugim krokiem procedury jest zbadanie organów wewnętrznych.Trzecim krokiem jest pobranie próbek, takich jak organy lub węzły chłonne krezkowe. Ostatecznie stan zdrowia zwierzęcia można określić za pomocą histopatologii lub innych technik. Zazwyczaj osoby początkujące w przeprowadzaniu nekropsji napotykają trudności, ponieważ anatomia gryzoni jest poznawana w praktyce.Metody te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące stanu zdrowia zwierząt w kolonii badawczej. Wizualna demonstracja tych technik jest niezbędna, ponieważ opanowanie lokalizacji poszczególnych tkanek oraz umiejętność odróżnienia tkanki prawidłowej od patologicznej wymaga czasu. Przed eutanazją zwierzęcia należy zebrać informacje o jego historii oraz odnotować aktualne parametry, takie jak kondycja fizyczna, zachowanie, płeć, wiek, masa ciała, linia i tym podobne.Zapis ten jest kluczowy dla osoby, która będzie badać tkanki przed eutanazją zwierzęcia. Należy upewnić się, że stosowany jest odpowiedni sprzęt ochrony osobistej. Przygotować deskę sekcyjną, pęsetę, nożyczki, etykiety do pojemników, utrwalacz, podłoża oraz naczynia do pobierania próbek.Po eutanazji zwierzęcia należy ocenić jego kondycję fizyczną, sprawdzić obecność nieprawidłowości skóry i okrywy włosowej, wyniszczenia organizmu oraz odwodnienia. Należy również poszukać dowodów na manipulacje sztuczne, implanty lub blizny pooperacyjne u zwierzęcia. Następnie, przy użyciu mikroskopu sekcyjnego, należy szczegółowo zbadać wszystkie otwory naturalne.Obejmują one uszy, oczy, nos, pysk, odbyt oraz narządy płciowe. Teraz połóż zwierzę na plecach na stole sekcyjnym, unieś skórę pęsetą i za pomocą nożyczek rozetnij skórę od odbytu aż do podbródka. Następnie odchyl skórę na boki i przetnij ścianę brzuszną oraz klatkę piersiową.Odsłoń narządy klatki piersiowej, wykonując dwa nacięcia boczne wzdłuż każdej strony klatki piersiowej. Przetnij przeponę. Następnie usuń klatkę piersiową, przecinając górną część mostka.Następnie obejrzyj odsłonięte organy klatki piersiowej i jamy brzusznej. Zwróć uwagę na wszelkie zmiany w kolorze, nietypowe zapachy, rozmiary, różnice oraz brakujące lub przemieszczone organy. Oceń konsystencję powierzchni organów i odnotuj obecność mas tkankowych lub kieszonek wypełnionych płynem.Należy również odnotować obecność płynu w którejkolwiek z jam. Kontynuuj badanie, przechodząc do przewodu pokarmowego. Sprawdź krezkę pod kątem powiększonych węzłów chłonnych lub mas tkankowych.Opisz zawartość przewodu pokarmowego i dokładnie sprawdź, czy nie występują pogrubienia ścian, masy lub krwotoki. Aby zbadać wnętrze nerek, użyj ostrza do wykonania cięcia podłużnego lewej nerki oraz cięcia poprzecznego prawej nerki, poza osią środkową. Sprawdź miąższ pod kątem wszelkich nieprawidłowości.Następnie należy zbadać układ moczowo-płciowy u samców. Zidentyfikuj pęcherzyki nasienne, jądra, najogony oraz moczowody. W przypadku samic zidentyfikuj gruczoły peryuralne, macicę, jajniki oraz moczowody.Zbadaj układ moczowo-płciowy pod kątem zatorów, zbiorników płynu, krwotoków lub innych nieprawidłowości. Po zakończeniu tych badań wyizoluj i wycinij organy docelowe do dalszej analizy. Zazwyczaj podczas wycinania pobiera się serce, wątrobę, nerki i śledzionę.Zanurz każdy narząd w utrwalaczu lub wykonaj pierwsze kroki protokołu wymagającego tych tkanek, takiego jak zamrażanie lub immunohistochemia, aby uzyskać odpowiednią fiksację. Zazwyczaj tkanki zanurza się w konserwancie, np. 10%NBF, zachowując stosunek 20 objętości utrwalacza na jedną objętość tkanki. W przypadku pracy ze szczurami, pobierz aspirat oskrzelowy przed aspiratem nosowym.Zacznij od odciągnięcia skóry i tkanek podskórnych od obszaru szyjnego, odsłaniając w ten sposób gruczoły ślinowe i mięśnie szyi. Następnie usuń te tkanki, aby odsłonić tchawicę. Wykonaj nacięcie o długości 3 mm w tchawicy i wprowadź do światła tchawicy, kierując się w stronę kwatery, pipetę z 1 mL płynu do pobierania próbek.Powoli przepłucz tchawicę i płuca płynem pobierającym trzy razy. Następnie odessaj płyn pobierający i wyjmij pipetę z tchawicy. Nie cały płyn powróci do pipety.W związku z tym należy powtórzyć ten proces, jeśli potrzebne jest więcej płynu. Do badań na myszach. Aby pobrać próbkę aspiratu z nosa lub aspiratu z oskrzeli, należy uzyskać dostęp do jednostki ATU nosogardzielnej za pomocą wysterylizowanych nożyczek.Przetnij staw skroniowo-żuchwowy i odchyl żuchwę od szczęki, odsłaniając wejście do nosogardzieli w celu pobrania aspiratu z nosa. Wprowadź pipetę z jednym mililitrem płynu pobierającego do nosogardzieli myszy lub do światła tchawicy szczura. Pipeta powinna być skierowana kranialnie i wsunięta do środka.Następnie końcówka styka się z podniebieniem nosowym. Po osiągnięciu tej pozycji powoli wstrzyknij płyn pobierający. W miarę wprowadzania płynu do jamy nosowej, w otworze nosowym utworzą się meniski, które powinny być również widoczne przez półprzezroczyste podniebienie jamowe.Jeśli jednak płyn wydostaje się przez pyszczek, należy zmienić orientację pipety. Po całkowitym wstrzyknięciu wciągnąć płyn pobrany z jamy nosowej do pipety, a następnie wyjąć pipetę. Następnie chwycić tchawicę pęsetą i przeciąć ją tuż powyżej pęsety.Następnie delikatnie pociągnij tchawicę do góry, przecinając połączenia tkankowe, aż do momentu, gdy cały zestaw tkanek klatki piersiowej będzie mógł zostać wycięty. Teraz połóż płuca płasko na powierzchni roboczej i luźno zawiąż fragment szwy lub sznurka wokół tchawicy. Nie zaciśnij węzła, w przeciwnym razie nie będziesz w stanie wprowadzić igły do tchawicy.Następnie należy napełnić strzykawkę utrwalaczem i wprowadzić igłę do otworu tchawicy, mocując tchawicę do igły. Za pomocą pęsety powoli wypełniać płuca utrwalaczem, aż zostaną całkowicie rozprężone. Objętość utrwalacza będzie zależeć od wieku, szczepu i stanu zdrowia zwierzęcia.Jeśli niedopompowane tkanki będą wydawać się płaskie, a w przypadku nadmiernego napompowania z tkanki po napełnieniu będzie wyciekać spieniony płyn, należy mocniej zawiązać szew lub sznurek wokół tchawicy, aby zapobiec cofaniu się utrwalacza z płuc. Następnie napompowane płuca należy umieścić w utrwalaczu. Zwierzę należy położyć na czystej desce sekcyjnej w pozycji brzusznej i za pomocą nożyczek oraz pincety usunąć skórę i mięśnie pokrywające jamę klatki piersiowej.Następnie należy odciąć głowę truchła za pomocą małych nożyczek. Wprowadź dolne ostrze do otworu wielkiego (foramen magnum) i przetnij linię środkową czaszki, wykonując ruch ku górze. Teraz, używając pincety, odsłoń mózg, rozchylając czaszkę.Jeśli patolog preferuje wycinanie przekrojów mózgu bezpośrednio w czaszce, należy niezwłocznie umieścić czaszkę z odsłoniętym mózgiem w 10%NBF. W przeciwnym razie należy chwycić głowę w okolicy nosa pęsetą lub palcami i delikatnie odwrócić czaszkę tak, aby grawitacja pomogła tkance wysunąć się z czaszki. Ostrożnie wsuń pęsetę zakrzywioną wzdłuż zewnętrznej krawędzi mózgu, zaczynając od płatów węchowych.Przesuwaj pęsetę wzdłuż czaszki w kierunku móżdżku, delikatnie ściskając nerwy tą samą pęsetą. Po wyjęciu mózgu umieść go w utrwalaczu. Aby zlokalizować węzły chłonne krezkowe, najpierw odnajdź dużą, kształtna w kształt przecinka ślepa jelita grubego. Węzły chłonne krezkowe to żółte, owalne lub kuliste grudki tkanki w krezce sąsiadującej z kątnicą.Są one często nieco grubsze i mają twardszą strukturę niż otaczająca krezka i tkanka tłuszczowa. Na początku pomocne może być użycie okularu dyssekcyjnego w celu rozróżnienia tkanek, jednak z doświadczeniem nie będzie ono konieczne. Za pomocą pęsety i nożyczek wyizoluj węzły chłonne krezkowe, a następnie przenieś je do probówki do przechowywania w celu wykorzystania w hodowli, reakcji PCR lub badaniu histopatologicznym.Po zakończeniu protokołu patolog lub naukowiec otrzymuje następujące materiały: pisemny raport dotyczący obiektywnego i subiektywnego stanu zwierzęcia w momencie eutanazji, obiektywny opis tkanek przed ich utrwaleniem, wszystkie główne narządy jamy brzusznej i klatki piersiowej w utrwalaczu, mózg i węzły chłonne krezkowe oraz próbki aspiratu z nosa i oskrzeli. Po opanowaniu techniki, skrócona nekropsja może zająć mniej niż 30 minut.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zapisywaniu obserwacji dotyczących stanu zwierzęcia oraz jego tkanek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania pełnej nekropsji gryzonia, w tym pobierania perfundowanych płuc, węzłów chłonnych krezkowych oraz mózgu.

diagnostic-necropsy-selected-tissue-sample-collection-rats

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Diagnostyka sekcyjna i wybrane pobieranie tkanek i próbek u szczurów i myszy

Niniejszy artykuł opisuje różne procedury przesiewowe u szczurów i myszy w celu wykrycia endo- lub ektopasożytnictwa. Przedstawiono kilka testów diagnostycznych, zarówno tych odpowiednich do stosowania u żywych zwierząt, jak i tych wykonywanych po eutanazji zwierzęcia. Dołączono zdjęcia pomagające w identyfikacji pasożytów szczurów i myszy.

Diagnostyka ektopasożytów i endopasożytów u laboratoryjnych szczurów i myszy

Wideo demonstruje procedurę ilościowego oznaczania wirusa Zika w wielu narządach myszy za pomocą testu tworzącego ognisko. Proces ten polega na zakażeniu monowarstw komórek ssaków homogenatami tkanek zakażonych wirusem, a następnie zastosowaniu metylocelulozy w celu zapobieżenia rozprzestrzenianiu się wirusa. Następnie stosuje się barwienie immunologiczne, aby umożliwić precyzyjną kwantyfikację i pomiar zakaźności specyficznej dla narządów.

Test skupiający się do ilościowego określania mian wirusa w narządach zakażonej myszy

Ten film pokazuje dysocjację zamrożonej tkanki mózgowej szczura na zawiesinę jednokomórkową przy użyciu trawienia enzymatycznego i mechanicznego rozcierania. Przygotowane komórki są utrwalane i przepuszczane etanolem do dalszych zastosowań, takich jak cytometria przepływowa lub analiza ekspresji genów.

Uzyskiwanie zawiesiny jednokomórkowej z zamrożonej tkanki mózgowej szczura

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany, szczegółowy protokół podwójnego barwienia immunologicznego w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i obwodowych węzłów chłonnych (LN).

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Neurochemia mózgu ssaków ulega zmianie w wielu chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Profile charakterystyczne metabolitów mózgowych można skutecznie uzyskać na podstawie surowych ekstraktów tkanki mózgowej. W tym celu stosuje się wysokorozdzielczą spektroskopię NMR, umożliwiającą szczegółową analizę ilościową stężeń metabolitów (metabolomika).

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie bezpiecznych technik sekcji zwłok na małych i dużych zwierzętach, aby uzyskać zadowalające próbki tkanek do badania wścieklizny.

Techniki sekcji zwłok wścieklizny u dużych i małych zwierząt

Ten manuskrypt wprowadza ustandaryzowany protokół dla nefrektomii 5/6 poprzez ostrą bipolektomię poprzez laparotomię w linii środkowej na modelu szczurzym, mający na celu wywołanie stanu niewydolności nerek poprzez redukcję miąższu nerki z dużą precyzją metodyczną i niskim ryzykiem błędu technicznego.

5/6 Nefrektomia przy użyciu ostrej bipolektomii przez laparotomię w linii środkowej u szczurów

Badanie to oferuje powtarzalną i standaryzowaną metodę mająca na celu ustalenie modeli otyłych szczurów wykazujących prostą otyłość, często charakteryzującą się stłuszczeniem trzustki. Zawiera również szczegółowe protokoły pobierania próbek tkanki trzustki oraz immunohistochemii.

Opracowanie i walidacja metodologii ustalania modeli otyłych szczurów z typową stłuszczeniową trzustką

Wykorzystanie mikroelektromechanicznych systemów (MEMS) do opracowywania narzędzi diagnostycznych

Naucz się wykonywać sekcję zwłok u szczurów i myszy w celu oceny stanu zdrowia zwierząt. Poznaj techniki pobierania narządów, węzłów chłonnych i próbek do analizy histopatologicznej oraz mikrobiologicznej.

Diagnostyczna sekcja zwłok oraz pobieranie wybranych tkanek i próbek u szczurów i myszy

Przeglądaj więcej filmów