Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych
26 października 2011
Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie jednorodnych poziomów ludzkich hepatocytów w celu zbadania biologii ludzkiej wątroby in vitro. Jest to inicjowane przez doprowadzenie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub ludzkich ESC do ostatecznej endodermy za pomocą bodźców fizjologicznych aktywnych w A i WINT trzy A.As drugim krokiem ostateczna endoderma jest bardzo skutecznie kierowana do endodermy wątrobowej. Następnie ludzka endoderma wątrobowa pochodząca z ESC jest dojrzewana in vitro w celu wytworzenia funkcjonalnych ludzkich hepatocytów.
Wyniki PCR Western blot, immunofluorescencji, metabolizmu Elizy i leków wskazują, że metoda ta wyprowadza hepatocyty z ludzkich ESC z wydajnością około 90%Dzięki tej technice możemy teoretycznie wygenerować niewyczerpane zapasy pierwotnych ludzkich hepatocytów, które wykazują znaczny poziom funkcji ludzkiej wątroby. W przyszłości przyniesie to korzyści w dokładnym przewidywaniu toksyczności leków i zapewni wsparcie dla ludzkiej wątroby. Sztuczka polega na tym, aby napędzać różnicowanie słoneczne i gęstość rdzenia ludzkich komórek.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ gęstość komórek rdzenia jest niezbędna do wygenerowania jednorodnej populacji komórek. Przeszkoliliśmy ponad 15 osób w czterech lokalizacjach na całym świecie, aby skutecznie stosować tę technikę. Rozpocznij od hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i rozmnażaj je na płytkach pokrytych matryżelem z mysimi fibroblastami embrionalnymi kondycjonowanymi pożywką ORM cm uzupełnioną zasadowym FGF.
Ważne jest, aby dokładnie scharakteryzować ludzkie komórki macierzyste zachowane przed różnicowaniem wątroby. Na przykład komórki te wykazują ludzką morfologię ESC. Wykazują również ekspresję markerów pluripotencjalnych komórek macierzystych, OCT four i nano w poziomach porównywalnych z ludzką linią ESC kontroli pozytywnej H seven.
Dodatkowo, ludzkie ESC są dodatnie dla SS EEA cztery. Gdy ludzkie ESC E osiągną płynność od 30 do 60%, zastąp ME CM świeżo przygotowanym podłożem różnicującym. Aby zainicjować różnicowanie wątrobowe, pożywkę należy wymieniać co 24 godziny przez trzy dni.
Po trzech dniach komórki przybierają trójkątny wygląd, gdy zaczynają różnicować się w kierunku fenotypu endodermalnego. Przełącz medium na różnicowanie SR DMSO. Pożywka kultura przez cztery do pięciu dni.
Wymiana pożywki co 48 godzin. Po tym pięciodniowym okresie komórki zaczęłyby przybierać wielokątny wygląd charakterystyczny dla komórek wątroby. Różnicowanie ludzkiego ESC do endodermy wątrobowej znajduje odzwierciedlenie w serii głębokich zmian morfologicznych do dziewiątego dnia.
Co więcej, ekspresja Octa four w ciągu dziewięciodniowego kursu czasu stopniowo maleje. W przeciwieństwie do tego, transkrypcje wątrobowe FP i albuminy zwiększają się od siódmego dnia. Kontynuuj, dojrzewając komórki i utrzymując fenotyp wątroby w końcowej pożywce przez dziewięć dni ze świeżą pożywką co 48 godzin.
Na koniec monitoruj hodowane komórki za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego pod kątem stopniowych zmian morfologicznych od kolczastego trójkątnego kształtu do charakterystycznej morfologii wątroby wykazującej wielokątny wygląd, aby ilościowo ocenić test funkcji endodermy wątroby. Dla cytochromu P cztery 50 aktywność enzymatyczna, w szczególności SIP trzy A cztery lub SIP jeden A dwa. Pierwszy dzień inkubacji 17.
Ludzkie komórki endodermy wątroby pochodzące z ESC ze specyficznym substratem przeprowadzające reakcje w trzech powtórzeniach. Pamiętaj, aby użyć pożywki do hodowli tkankowej jako inkubacji kontroli ujemnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Zebrać supernatanty i zmierzyć względne poziomy podstawowej aktywności enzymatycznej zgodnie z instrukcjami producenta.
Teraz dla każdej próbki oblicz aktywność enzymatyczną na miligram białka określoną przez A-B-C-A-S. Barwienie immunologiczne typowych kultur otrzymanych tą metodą dojrzewania in vitro endodermy wątroby. Wykazać jednorodną ekspresję trzech markerów wątroby ludzkiej, albuminy FP i ein.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie różnicować ludzkie i uczyć się komórek macierzystych do hepatocytów. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonywać codziennie z zaangażowaniem około dwóch i pół minuty na milion komórek. Bardzo ważne jest, aby w procesie różnicowania codziennie sprawdzać zmiany morfologiczne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł koncentruje się na generowaniu ludzkiego endodermu wątrobowego z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ESCs). Proces ten ma na celu wytworzenie funkcjonalnych ludzkich hepatocytów do badania biologii wątroby in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Różnicowanie hepatocytów
- Modele wątroby in vitro
Wstęp
- Ludzkie embrionalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Definitywna endoderma jest prekursorem endodermy wątrobowej.
- Efektywne generowanie hepatocytów ma kluczowe znaczenie dla badań nad wątrobą.
- Obecne metody mają na celu zwiększenie wydajności otrzymywania funkcjonalnych hepatocytów.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody otrzymywania ludzkich hepatocytów z ESC.
- Badanie funkcji ludzkiej wątroby oraz metabolizmu leków in vitro.
- Zapewnienie źródła pierwotnych ludzkich hepatocytów do celów badawczych.
Zastosowane metody
- Indukowanie różnicowania ESC w kierunku ostatecznej endodermy przy użyciu bodźców fizjologicznych.
- Efektywna konwersja ostatecznej endodermy w endodermę wątrobową.
- Dojrzewanie endodermy wątrobowej in vitro w celu otrzymania hepatocytów.
- Wykorzystanie metod PCR, Western blotting, immunofluorescencji i ELISA do analizy.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na uzyskanie wydajności rzędu 90% w różnicowaniu hepatocytów.
- Wygenerowane hepatocyty wykazują znaczną funkcjonalność charakterystyczną dla ludzkiej wątroby.
- Technika ta może zapewnić niewyczerpalne źródło hepatocytów.
- Potencjalne zastosowania obejmują przewidywanie toksyczności leków oraz wsparcie funkcji wątroby.
Wnioski
- Badanie przedstawia wykonalne podejście do generowania funkcjonalnych ludzkich hepatocytów.
- To osiągnięcie może usprawnić badania nad wątrobą i testowanie leków.
- Przyszłe badania mogą zgłębiać dalsze zastosowania tej techniki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Skalowalna produkcja funkcjonalnych ludzkich hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych rozwiązuje krytyczny problem w toksykologii predykcyjnej, zapewniając odnawialny, istotny dla człowieka model do wczesnej oceny bezpieczeństwa leków. Podejście to zmniejsza zależność od zmiennych hepatocytów pierwotnych i systemów pozaludzkich, zwiększając wiarygodność translacyjną przedklinicznych danych dotyczących bezpieczeństwa wątroby. Efektywne protokoły różnicowania umożliwiają integrację z kaskadami wysokoprzepustowych przesiewów w celu optymalizacji wiodących związków i mechanistycznego ograniczania ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie specyficznych dla hepatocytów szlaków sygnałowych oraz podatności metabolicznych w ludzkim kontekście komórkowym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia jednolity substrat komórkowy do oceny mechanizmów hepatotoksyczności indukowanej przez związki chemiczne.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie komórek o fenotypie hepatocytów z mierzalną aktywnością cytochromu P450 do funkcjonalnego profilowania metabolicznego.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację analiz dzięki wysokiej wydajności różnicowania (~90%) i jednorodnej ekspresji markerów (albumina, AFP, ENaC).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy biologię komórek macierzystych z badaniami bezpieczeństwa przedklinicznego poprzez uzyskanie komórek o znaczącej funkcji ludzkiej wątroby do identyfikacji metabolitów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną ocenę dojrzewania i stabilności hepatocytów in vitro w określonych warunkach hodowli.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsza metoda pozycjonuje produkcję hepatocytów pochodzących z ludzkich ESC jako skalowalny etap wstępny dla biologii odkrywczej, opracowywania testów oraz przedklinicznej oceny bezpieczeństwa, zapewniając ciągłość procesu od walidacji celu po optymalizację wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących specyficznych dla wątroby celów i szlaków metabolicznych z wykorzystaniem zróżnicowanego modelu ludzkich komórek.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy komórki hepatocyto-podobne o powtarzalnej morfologii i ekspresji markerów do przesiewania bibliotek związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe odczyty metabolizmu leków (np. aktywność CYP3A4, CYP1A2) oraz funkcji wątroby za pomocą metod ELISA, PCR i immunofluorescencji.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość z modelami przedklinicznymi, zapewniając istotny dla człowieka system do mechanistycznego ograniczania ryzyka w przypadku związków hepatotoksycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy system produkcji komórek oparty na protokole i podatny na różnicowanie, który można zastosować w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Przewidywalność oceny hepatotoksyczności dzięki metabolicznym funkcjom istotnym dla organizmu człowieka.
- Wartość operacyjna: Znormalizowany protokół różnicowania o wysokiej wydajności i minimalnym nakładzie pracy ręcznej (~2,5 minuty na milion komórek).
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w profilowaniu bezpieczeństwa wątroby.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dane dotyczące metabolizmu ludzkich hepatocytów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach hodowli i różnicowania komórek macierzystych.
- Zależne od zdefiniowanych składników pożywek (np. podstawowy FGF, SR/DMSO) oraz macierzy zewnątrzkomórkowej (Matrigel).
- Wymaga standaryzowanych protokołów dotyczących gęstości wysiewu komórek oraz czasu wymiany pożywek.
- Kwestie adaptacyjne obejmują zmienność w odpowiedzi linii ESC oraz efektywność indukcji endodermy.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność walidacji funkcjonalnej (np. aktywność CYP, sekrecja albuminy) w celu potwierdzenia dojrzałości hepatocytów.
