JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:17 min. • April 30th, 2023
Zmiel tkankę nowotworową na małe kawałki. Przenieś kawałki do probówki z buforem do wytrawiania. Włókna kolagenowe otaczające komórki ulegają rozpadowi, degradując macierz tkanki. Następnie rozdrobnić strawione kawałki i wyrzucić większość buforu do wytrawiania. Przesuń rurkę, aby rozbić granulkę.
Rozwiązanie składa się teraz z grudek komórek o różnej wielkości. Ponownie zawiesić grudki komórek w roztworze trypsyny i inhibitora ROCK. Trypsyna kontynuuje rozkład guza, a inhibitor zapobiega śmierci komórki. W regularnych odstępach czasu pipetować roztwór, aby rozbić grudki i rozproszyć komórki. Następnie ponownie zawiesić komórki w roztworze matrycowym o odpowiednim stężeniu.
Umieść krople roztworu na płytce hodowlanej, aby utworzyć kopuły matrycy. Umieść płytki do góry nogami w inkubatorze i poczekaj, aż matryca całkowicie zastygnie. Następnie dodaj pożywkę do hodowli komórkowych i inkubuj prawą stroną do góry. Matryca stanowi rusztowanie wspierające trójwymiarowy wzrost organoidu.
Po zmieleniu umieść kawałki guza w 15-mililitrowej probówce buforu wytrawiającego na 1,5 do 2 godzin trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec trawienia rozsiać strawioną tkankę przez odwirowanie i wyrzucić supernatant.
Przesuń rurkę, aby poluzować osad komórkowy. Ponownie zawiesić komórki w 1 mililitrze wstępnie podgrzanej trypsyny uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem Y-27632 ROCK na 5 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji należy pięciokrotnie rozcierać zawiesinę tkanki za pomocą standardowej końcówki do pipety P1000. Umieść probówkę z powrotem w łaźni wodnej na dodatkowe 5 minut inkubacji i rozcierania.
W przypadku posiewu kopuły matrycy umyj strawione komórki w 9 mililitrach zimnego podłoża, a następnie zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić komórki w 1 mililitrze świeżej pożywki w celu policzenia, a po policzeniu ponownie zebrać komórki przez odwirowanie. Rozcieńczyć komórki nowotworowe w odpowiedniej objętości macierzy.
Ostrożnie wrzuć 200 mikrolitrów roztworu komórek matrycowych do każdej studzienki 6-dołkowej płytki o temperaturze 55 stopni Celsjusza. Pozwól kopułom zestalić się w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut.
Gdy kopuły całkowicie zastygną, dodaj 2 mililitry pożywki organoidowej prostaty uzupełnionej androgenem R1881 i inhibitorem ROCK do każdej studzienki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.