Przygotowanie organoidów z guzów: model guza 3D in vitro

Zmiel tkankę nowotworową na małe kawałki. Przenieś kawałki do probówki z buforem do wytrawiania. Włókna kolagenowe otaczające komórki ulegają rozpadowi, degradując macierz tkanki. Następnie rozdrobnić strawione kawałki i wyrzucić większość buforu do wytrawiania. Przesuń rurkę, aby rozbić granulkę.

Rozwiązanie składa się teraz z grudek komórek o różnej wielkości. Ponownie zawiesić grudki komórek w roztworze trypsyny i inhibitora ROCK. Trypsyna kontynuuje rozkład guza, a inhibitor zapobiega śmierci komórki. W regularnych odstępach czasu pipetować roztwór, aby rozbić grudki i rozproszyć komórki. Następnie ponownie zawiesić komórki w roztworze matrycowym o odpowiednim stężeniu.

Umieść krople roztworu na płytce hodowlanej, aby utworzyć kopuły matrycy. Umieść płytki do góry nogami w inkubatorze i poczekaj, aż matryca całkowicie zastygnie. Następnie dodaj pożywkę do hodowli komórkowych i inkubuj prawą stroną do góry. Matryca stanowi rusztowanie wspierające trójwymiarowy wzrost organoidu.

Po zmieleniu umieść kawałki guza w 15-mililitrowej probówce buforu wytrawiającego na 1,5 do 2 godzin trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec trawienia rozsiać strawioną tkankę przez odwirowanie i wyrzucić supernatant.

Przesuń rurkę, aby poluzować osad komórkowy. Ponownie zawiesić komórki w 1 mililitrze wstępnie podgrzanej trypsyny uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem Y-27632 ROCK na 5 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji należy pięciokrotnie rozcierać zawiesinę tkanki za pomocą standardowej końcówki do pipety P1000. Umieść probówkę z powrotem w łaźni wodnej na dodatkowe 5 minut inkubacji i rozcierania.

W przypadku posiewu kopuły matrycy umyj strawione komórki w 9 mililitrach zimnego podłoża, a następnie zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić komórki w 1 mililitrze świeżej pożywki w celu policzenia, a po policzeniu ponownie zebrać komórki przez odwirowanie. Rozcieńczyć komórki nowotworowe w odpowiedniej objętości macierzy.

Ostrożnie wrzuć 200 mikrolitrów roztworu komórek matrycowych do każdej studzienki 6-dołkowej płytki o temperaturze 55 stopni Celsjusza. Pozwól kopułom zestalić się w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut.

Gdy kopuły całkowicie zastygną, dodaj 2 mililitry pożywki organoidowej prostaty uzupełnionej androgenem R1881 i inhibitorem ROCK do każdej studzienki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.

• In vitro tumor models - Methods for studying tumor behavior in lab-controlled conditions.
• PeproTech Noggin - A protein used to regulate cellular processes in tissue culture.
• Tumor model - A method or process used to replicate tumor environment and behavior for scientific studies.
• Cell pellet - Cluster of cells collected at the bottom of a tube after centrifugation.
• ROCK inhibitor organoids - Compounds that prevent cell apoptosis during organoid creation.
• Noggin conditioned media - Media enriched with Noggin protein, used in cellular culture and experiments.
• Cell pellet in tube - Term refers to cells that have been concentrated by centrifugation in a sample tube.

• Introduce In vitro tumor models by defining this as a replicate of tumor behavior (e.g., in vitro tumor models).
• Key Concepts by summarizing principles involved in cell pellet creation (e.g., cell pellet).
• Underlying Mechanisms through visualizing the process of using ROCK inhibitor in organoid creation.
• Connect the process of tumor tissue mincing to the creation of a cell pellet and suspension in a matrix solution.

• What are in vitro tumor models and how to create a cell pellet in lab conditions?
• What role does the PeproTech Noggin play in the tumor model creation?
• How does the ROCK inhibitor assist in the creation of organoids?

• Practical Applications - Tumor models help study cancer growth and potential cures (e.g., in vitro tumor models).
• Industry Impact - Lab studies benefit the healthcare industry and the field of oncology (e.g., ROCK inhibitor organoids).
• Societal Importance - The research contributes to advancements in cancer treatment options (e.g., Noggin conditioned media).
• Link to Scientific Advancements - Understanding tumor behavior facilitates innovative treatment approaches.